- Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 độ pha loãng thập phân được ủ trong ống nghiệm có chứa môi trường Brilliant green bile broth 2% có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện của vi khuẩn trong từng ống thử nghiệm, đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1ml mẫu ban đầu.
- Môi trường và hoá chất:
+ Môi trường Brilliant green Bile 2% Broth được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Chuẩn bị mẫu
- Chuẩn bị dịch pha loãng (nước muối sinh lý 0,9%), mỗi ống 9ml.
- Cách tiến hành:
+ Dùng pipet hút 1ml mẫu gốc cho vào ống pha loãng, trộn đều, được dung dịch đồng nhất ở nồng độ 10-1. Tiếp tục pha loãng mẫu bằng cách dùng pipet hút tiếp 1ml chuyển sang ống tiếp theo, đến ống pha loãng cuối cùng hút bỏ đi 1ml. Ta được các nồng độ pha loãng 10-1
, 10-2...
+ Tuần tự cấy 1ml dung dịch mẫu pha loãng 100, 10-1, 10-2, vào 3 ống nghiệm khác nhau, mỗi ống chứa 5ml môi trường Brilliant Green Bile 2% Broth. Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3x3 hay 9 ống nghiệm). Chú ý thay đầu pipet sau mỗi khi cấy 1 mẫu và phải ghi lý lịch, đánh số thứ tự cho các ống nghiệm.
+ Sau khi cấy, các ống nghiệm được bồi dưỡng ở 370
C/24-48h.
- Đọc kết quả: Các ống sinh hơi trong ống Durham và đổi màu môi trường là các ống dương tính.
VD: + 3 ống cấy 1ml mẫu nguyên đều dương tính, ghi 3. + 3 ống cấy 1ml mẫu pha loãng 10-1
đều dương tính, ghi 3. + 3 ống cấy 1ml mẫu pha loãng 10-2
chỉ dương tính 1, ghi 1. Chọn 3 3 1 để tra bảng MPN. Kết quả tra bảng MPN được 43/100ml có nghĩa đã xác định 4.300 vi khuẩn nhóm Coliform/1ml mẫu nước. [4], [31]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn