coli phân lập đƣợc [7]
- Pha môi trường Macconkey:
+ Cách pha: Cân 50 gam môi trường vào 1000ml nước cất Lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn
Hấp vô trùng ở nhiệt độ 121o
C trong 15 phút
Đổ nhanh ra các đĩa thạch, để nguội trong phòng vô trùng Bảo quản ở nhiệt độ 4o
C
+ Sau khi nuôi cấy E. coli phân lập được trên đĩa thạch Macconkey ở 37oC trong 24h, thấy hình thành khuẩn lạc màu hồng cánh sen, tròn, gọn, nhẵn, hơi lồi.
- Môi trường Brilliant Green Bile Broth 2%:
+ Cách pha: Cân 40gam môi trường vào 1000ml nước cất lắc cho đến khi tan hoàn toàn.
Chia ra các ống nghiệm vô trùng (5ml/1 ống). Hấp vô trùng ở 121o
C trong 15 phút Để nguội trong phòng vô trùng Bảo quản ở nhiệt độ 4o
C
+ Sau nuôi cấy ở 44,4oC/24h môi trường đục đều, có khi làm môi trường chuyển sang màu xanh nhạt, xuất hiện bọt khí trong ống durham.
- Nhuộm Gram xác định hình thái và tính chất bắt màu thuốc nhuộm của vi khuẩn E. coli:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng nước cất vô trùng đặt vào giữa phiến kính. Lấy một lượng nhỏ vi khuẩn từ khuẩn lạc và dàn mỏng với nước cất trên phiến kính. Để dịch khuẩn tự khô hoàn toàn. Sau đó hơ mặt dưới của phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 đến 3 lần (không để tiêu bản quá nóng).
+ Nhỏ 1 giọt dung dịch Gentian lên lam kính để lưu lại trong thời gian 1 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất.
+ Cố định màu vi khuẩn bằng cách phủ dung dịch lugol lên lam kính trong thời gian 1 phút rồí rửa lại bằng nước cất.
+ Tẩy mầu nhanh bằng cồn Axeton trong vòng 15 - 20 giây. Sau rửa lại bằng nước cất nhẹ nhàng.
+ Nhỏ 1 giọt dung dịch fucsin lên lam kính trong thời gian 2 phút. Sau đó rửa sạch bằng nước cất.
+ Để khô tự nhiên.
+ Nhỏ 1 giọt dầu bạch dương lên lam kính, quan sát hình thái và tính chất bắt mầu của vi khuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu (100).
Dưới kính hiển vi với vật kính dầu 100, sau khi nhuộm Gram vi khuẩn
E. coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, tròn 2 đầu, bắt màu đỏ của thuốc nhuộm fucsin (gram âm).
- Môi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar):
+ Cách pha: Cân 65 gam môi trường vào 1000ml nước cất. Lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn.
Chia ra các ống nghiệm vô trùng. Hấp 121o
C trong 15 phút.
Để nghiêng ống thạch đến khi khô. Bảo quản ở nhiệt độ 4o
C.
Dùng que cấy vô trùng chọn các khuẩn lạc đặc trưng từ môi trường Macconkey, cấy lên môi trường TSI. Đưa que cấy sâu thẳng dưới đáy ống nghiệm, phần thạch nghiêng phía trên cấy theo đường rích rắc, bồi dưỡng ở tủ ấm 37o
C trong 18 - 24 giờ. Sau đó mang ra quan sát và đọc kết quả: + Phản ứng lên men đường:
Phần thạch nghiêng: Sau khi cấy 24h môi trường chuyển màu vàng chanh là do lên men đường lactose.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phần thạch đứng: Sau khi cấy 24h môi trường chuyển màu vàng chanh là do lên men đường glucose.
Nguyên lý: Vi khuẩn E. coli có khả năng sử dụng lactose, glucose để tăng trưởng. Trong quá trình sử dụng đường tạo ra các sản phẩm CO2, axit hữu cơ, làm giảm pH môi trường. Do vậy khả năng lên men đường được đánh giá làm giảm pH của môi trường, dẫn đến sự thay đổi màu chỉ thị pH (phenol). Phản ứng dương tính là khi môi trường chuyển sang màu vàng, âm tính khi không chuyển màu.
+ Phản ứng sinh H2S: Sau 24h ở 37oC phần thạch đứng chuyển màu đen là phản ứng dương tính (+), không tạo màu đen là phản ứng âm tính (-).
+ Phản ứng sinh hơi:
Sau 24h ở 37oC phần thạch đứng bị vỡ hoặc bị đẩy lên là dương tính (+), ngược lại là âm tính (-).
Nguyên lý: E.coli là một vi khuẩn vừa hiếu khí, vừa kỵ khí không bắt buộc. Nó có khả năng lên men đường glucose trong điều kiện yếm khí để sinh trưởng, đồng thời tạo ra CO2 làm nứt mặt thạch đứng sau khi nuôi cấy chích sâu, bồi dưỡng ở 37o
C/24h.
- Môi trường Nutrient Broth
Cách pha: Cân 8 gam môi trường vào 1000ml nước cất. Lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn.
Chia ra các ống nghiệm vô trùng. Hấp ướt 121o
C/15 phút. Bảo quản ở nhiệt độ 4o
C.
Sau khi nuôi cấy 37oC/24h nhỏ 1 - 2 giọt dung dịch Kovac’s vào môi trường. Nếu xuất hiện vòng nhẫn màu đỏ trên bề mặt môi trường thì đó là phản ứng sinh Indol dương tính (+). Nếu không xuất hiện thì là âm tính.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn