Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase từ lõi ngô dùng trong sản xuất đường xylose

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN TIẾN NAM NGHIÊN CứU TUYểN CHọN CHủNG VI SINH VậT SINH TổNG HợP XYLANASE Từ LÕI NGÔ DÙNG TRONG SảN XUấT ðƯờNG XYLOSE LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. NGUYỄN VĂN GIANG Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 2. TS. NGUYỄN TẤT THẮNG Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch HÀ NỘI, 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử dụng trong bất kỳ một nghiên cứu nào. Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả Nguyễn Tiến Nam Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành ñề tài tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân. Trước tiên, tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Giang – Khoa công nghệ sinh học - Trường ñại học nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận văn này. ðồng thời, tôi xin ñược cảm ơn TS. Nguyễn Tất Thắng - Viện cơ ñiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch ñã nhiệt tình giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi xin ñược gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong Khoa công nghệ sinh học, Viện ñào tại sau ñại học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả Nguyễn Tiến Nam Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix PHẦN I. MỞ ĐẦU 1 I. Đặt vấn đề 1 II. Mục đích và yêu cầu của đề tài 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.2. Enzyme xylanase 4 2.2.1. Cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzyme xylanase 4 2.2.2. Nguồn enzyme xylanase 7 2.2.3. Ứng dụng thực tiễn của enzyme xylanase 9 2.3. Lõi ngô - nguồn xylan 11 2.4. Giới thiệu chung về đường xylose 14 2.4.1. Đặc điểm của đường xylose 14 2.4.2. Các phương pháp sản xuất đường xylose 17 2.4.3. Ứng dụng của đường xylose 21 2.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đường xylose trên thế giới và ở Việt Nam 22 2.5.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đường xylose trên thế giới 22 2.5.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đường xylose ở Việt Nam 23 PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1. Vật liệu, hóa chất nghiên cứu 25 3.1.1. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 25 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv 3.1.2. Thiết bị, hóa chất dùng trong nghiên cứu 25 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27 3.3. Nội dung nghiên cứu: 28 3.4. Phương pháp nghiên cứu 29 3.4.1. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất enzyme xylanse quy mô phòng thí nghiệm 29 3.4.2. Phương pháp vi sinh 31 3.4.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu vật lý 32 3.4.4. Phương pháp phân tích chỉ tiêu hoá học 33 3.4.5. Phương pháp tách chiết eyme xylanase 35 3.4.6. Phương pháp bố trí thí nghiệm 37 3.4.7. Nghiên cứu ứng dụng enzyme xylanase để thu nhận đường xylose từ xy lan quy mô phòng thí nghiệm 41 3.4.8. Nghiên cứu công nghệ tách chiết, làm sạch và thu hồi đường xylose quy mô thí nghiệm 43 3.5. Phương pháp xử lý số liệu 44 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 4.1. Tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase đạt hiệu quả cao 45 4.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase 45 4.1.2. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của chủng nấm mốc An NVT3 tuyển chọn 46 4.2. Nghiên cứu xác định một số điều kiện (nhiệt độ, pH, dinh dưỡng, …) để sinh tổng hợp enzyme xylanase đạt hiệu quả cao 48 4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả nắng sinh tổng hợp enzyme xylanase 48 4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase 49 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 4.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp xylanase 50 4.2.4. Xác định nguồn và nồng độ nitơ vô cơ thích hợp đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase 52 4.3. Nghiên cứu điều kiện thu hồi enzyme xylanase quy mô phòng thí nghiệm 53 4.3.1. Cô đặc dịch xylanase bằng màng siêu lọc Amicon (PM10) 53 4.3.2. Nghiên cứu công nghệ tách chiết enzyme xylanase 54 4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH, nhiệt độ đến hoạt lực của enzyme xylanase 56 4.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme xylanase 56 4.4.2. Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme xylanase 57 4.4.3. Ảnh hưởng của pH và độ bền pH đến hoạt tính enzyme xylanase 58 4.5. Nghiên cứu ứng dụng enzyme xylanase để thu nhận đường xylose từ xylan quy mô phòng thí nghiệm 60 4.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme xylanase đến hiệu quả thủy phân xylan 60 4.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hiệu quả thủy phân xylan 61 4.5.3. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến hiệu quả thủy phân xylan 63 4.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả thủy phân xylan 65 4.5.5. Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả thủy phân xylan 66 4.5.6. Nghiên cứu thu hồi đường xylose quy mô phòng thí nghiệm 67 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72 5.1. Kết luận 72 5.2. Đề nghị 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ LỤC 80 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt A. niger CNTP g HPLC l ml mg RS TS V/ph Xyl Chữ viết thường Aspergillus niger Công nghiệp thực phẩm gam Sắc ký lỏng cao áp lít mililit miligam Đường khử Đường tổng số Vòng/phút Xylose Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang Bảng 2.1. Khả năng sinh enzyme xylanase trên phế phụ phẩm nông nghiệp của một số chủng Aspergillus 8 Bảng 2.2. Tình hình sản xuất ngô tại Việt Nam (2007 - 2011) 12 Bảng 2.3. Thành phần các hợp chất của lõi ngô 13 Bảng 2.4. Thành phần hemicellulose trong sinh khối thực vật 14 Bảng 2.5. Lượng sản xuất và giá cả các loại đường trên thế giới 23 Bảng 4.1. Kết quả tuyển chọn chủng nấm mốc sinh xylanase 45 Bảng 4.2. Một số đặc điểm hình thái của chủng nấm mốc An NVT3 47 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase 49 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợpxylanase 50 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp xylanase 51 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ các nguồn nitơ vô cơ đến khả năg sinh tổng hợp enzyme xylanase 52 Bảng 4.7. Các bước tinh sạch xylanase quy mô phòng thí nghiệm 54 Bảng 4.8. Hiệu quả của một số phương pháp tách chiết enzyme 55 Bảng 4.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme xylanase 56 Bảng 4.10. Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính của enzyme xylanase 57 Bảng 4.11. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme xylanase 58 Bảng 4.12. Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính của enzyme xylanase 59 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii Bảng 4.13. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme xylanase đến hiệu quả thủy phân dịch xylan 60 Bảng 4.14. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hiệu quả thủy phân dịch xylan lõi ngô 62 Bảng 4.15. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu quả thủy phân dịch xylan 64 Bảng 4.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả thủy phân xylan 65 Bảng 4.17. Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả thủy phân xylan 66 Bảng 4.18. Ảnh hưởng của tỷ lệ than hoạt tính đến hiệu quả tinh sạch dịch đường sau thủy phân 68 Bảng 4.19. Ảnh hưởng của tỷ lệ mầm tinh thể đường xylose bổ sung để làm mồi đến hiệu suất kết tinh 69 Bảng 4.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sấy khô đường 71 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ix DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang Hình 2.1. Tác động của các loại enzyme xylanase lên mạch xylan 6 Hình 2.2. Công thức cấu tạo của đường xylose 14 Hình 2.3. Công thức cấu tạo của xylan 15 Hình 2.4. Công thức cấu tạo hóa học của một số loại xylan 16 Hình 4.1. Bào tử của chủng nấm mốc A. niger NVT3 48 Hình 4.2. Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm mốc A. niger NVT3 trên môi trường PDA sau 7 ngày nuôi cấy 48 Hình 4.3. Nấm mốc A. niger trên môi trường giữ giống 48 [...]... ng, ch t lư ng lõi ngô, nhi t ñ , pH, ñ m,… Trong ñó y u t ñ u tiên ñóng vai trò quy t ñ nh là ch t lư ng ch ng vi sinh v t Chính vì v y vi c tuy n ch n ch ng vi sinh v t có ho t l c sinh t ng h p enzyme xylanase cao là m t v n ñ vô cùng c n thi t Trong quá trình nghiên c u tuy n ch n ch ng vi sinh v t sinh t ng h p xylanase trên ph ph ph m nông nghi p ph c v chăn nuôi, t 129 ch ng vi khu n và n m... ti n hành th c hi n ñ tài: Nghiên c u tuy n ch n ch ng vi sinh v t sinh t ng h p xylanase t lõi ngô dùng trong s n xu t ñư ng Xylose II M c ñích và yêu c u c a ñ tài 1 M c ñích c a ñ tài Tuy n ch n ñư c m t s ch ng n m m c có ho t l c sinh t ng h p enzyme xylanase cao t lõi ngô 2 Yêu c u c a ñ tài - Tuy n ch n ñư c m t s ch ng n m m c có ho t l c sinh t ng h p enzyme xylanase v i ho t l c cao (ñ... enzyme xylanase lên m ch xylan Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 6 2.2.2 Ngu n enzyme xylanase Trong th i gian g n ñây vi c nghiên c u s n xu t enzyme xylanase ñã thu hút ñư c s quan tâm c a nhi u nhà khoa h c, trong ñó các công trình nghiên c u s n xu t enzyme xylanase ch y u t vi sinh v t như n m và vi khu n [6] * Enzyme xylanase t vi khu n: Là m t trong s... s n lư ng ngô c a nư c ta t năm 2007 ñ n năm 2010 liên t c tăng Di n tích ngô năm 2011 gi m so v i năm 2010 là 44,2 nghìn ha (gi m 3,9%), gi m ch y u v ñông Mi n B c, nhưng năng su t ngô v n ñ t 43,0 t /ha S n lư ng ngô năm 2011 v n tăng nh so v i năm trư c Cùng v i s n lư ng ngô liên t c tăng ñó là nh ng ph th i mà quá trình s n xu t ngô t o ra như thân ngô, lá ngô, lõi ngô Trong ñó lõi ngô chi m... ít ñ n môi trư ng n u lõi ngô không ñư c x lý (nh t là ñ i v i các vùng tr ng ngô t p trung có di n tích l n) S n lư ng ngô ngày càng l n thì lư ng lõi ngô th i ra ngày càng cao Vi c nghiên c u và áp d ng s n xu t ñư ng xylose t lõi ngô không ch giúp t n d ng t t hơn ngu n ph th i này mà còn góp ph n c i thi n kinh t cho ngư i tr ng ngô, phát tri n ngành công nghi p th c ph m trong nư c, ñ ng th i... nghiên c u v xylanase n m m c dùng cho chăn nuôi, tác gi ðào Th H i Lý (2006) ñã tuy n ch n ñư c ch ng Aspergillus oryzae NM1 có ho t tính xylanase m nh, ñ t 667 IU/g cơ ch t lõi ngô Ch ng Aspergillus oryzae NM1 không sinh các ñ c t aflatoxin khi lên men b m t trên cơ ch t lõi ngô, không gây b nh trên ñ ng v t thí nghi m nên hoàn toàn yên tâm s d ng ñ s n xu t enzyme xylanase Enzyme xylanase ñư c sinh. .. mà ngành nông nghi p th i ra, trong ñó có lõi ngô Vi c x lý các ph th i nông nghi p này không h p lý không nh ng gây ra ô nhi m môi trư ng tr m tr ng mà còn làm gi m hi u qu s n xu t c a ngành công ngh sau thu ho ch Vì v y, vi c nghiên c u công ngh s n xu t ñư ng xylose t lõi ngô b ng enzyme xylanase s giúp nâng cao giá tr nông s n, gi m thi u ô nhi m môi trư ng trong vi c t n d ng lo i ph ph ph m... b ng phương pháp lên men nh vi sinh v t * S n xu t xylose b ng phương pháp lên men nh vi sinh V i phương pháp s n xu t xylose b ng phương pháp lên men nh vi sinh v t xylose ñư c s n xu t t các nguyên li u giàu xylan Nguyên li u trư c h t ñư c th y phân ñ t o thành dung d ch ch a xylan Sau ñó các vi sinh v t s d ng xylan làm ngu n cacbon ñ lên men d ch th y phân [33] ðư ng xylose ñư c thu h i b ng phương... lipid và cholesterol trong máu [10] 2.5 Tình hình nghiên c u và s n xu t ñư ng xylose trên th gi i và Vi t Nam 2.5.1 Tình hình nghiên c u và s n xu t ñư ng xylose trên th gi i Hi n nay, trên th gi i ñã có nhi u công trình khoa h c nghiên c u phương pháp s n xu t ñư ng xylose b ng cách lên men các nguyên li u có ngu n g c th c v t giàu xylan (như thân, lõi ngô, bã mía,…) nh vi sinh v t và b ng phương... ng: m t s ch ng n m m c ñư c tuy n ch n, enzyme xylanase - V t li u: Lõi ngô thu mua t i các h gia ñình Vĩnh Tư ng, Vĩnh Phúc và Mê Linh, Hà N i Lõi ngô ñư c thu gom, lo i b nh ng ph n lõi b h ng, m c và ñem phơi khô Lõi ngô ñư c nghi n nh (kích thư c kho ng 0,10,5mm), ñư c b o qu n trong các bao ni lông nhi t ñ thư ng 3.1.2 Thi t b , hóa ch t dùng trong nghiên c u 3.1.2.1 Thi t b T l nh, chi t quang . NGHIÊN CứU TUYểN CHọN CHủNG VI SINH VậT SINH TổNG HợP XYLANASE Từ LÕI NGÔ DÙNG TRONG SảN XUấT ðƯờNG XYLOSE LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học. hình nghiên cứu và sản xuất đường xylose trên thế giới 22 2.5.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đường xylose ở Vi t Nam 23 PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1. Vật. trường trong vi c tận dụng loại phế phụ phẩm nông nghiệp này. Xuất phát từ vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase từ