Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase từ lõi ngô dùng trong sản xuất đường xylose

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI --- NGUYỄN TIẾN NAM NGHIÊN CứU TUYểN CHọN CHủNG VI SINH VậT SINH TổNG HợP XYLANASE Từ LÕI NGÔ DÙNG TRONG SảN XUấT ðƯờNG XYLOS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

NGUYỄN TIẾN NAM

NGHIÊN CứU TUYểN CHọN CHủNG VI SINH VậT SINH TổNG HợP XYLANASE Từ LÕI NGÔ DÙNG TRONG SảN

XUấT ðƯờNG XYLOSE

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02 01

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS NGUYỄN VĂN GIANG

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

2 TS NGUYỄN TẤT THẮNG

Viện Cơ ñiện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

HÀ NỘI, 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số

liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử dụng trong bất kỳ một nghiên cứu nào

Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñều ñã ñược chỉ

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành ñề tài tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân

Trước tiên, tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Giang – Khoa công nghệ sinh học - Trường ñại học nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận văn này

ðồng thời, tôi xin ñược cảm ơn TS Nguyễn Tất Thắng - Viện cơ ñiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch ñã nhiệt tình giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Tôi xin ñược gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong Khoa công nghệ sinh học, Viện ñào tại sau ñại học – Trường ðại học Nông nghiệp

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

PHẦN I MỞ ðẦU 1

I ðặt vấn ñề 1

II Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 2

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.2 Enzyme xylanase 4

2.2.1 Cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzyme xylanase 4

2.2.2 Nguồn enzyme xylanase 7

2.2.3 Ứng dụng thực tiễn của enzyme xylanase 9

2.3 Lõi ngô - nguồn xylan 11

2.4 Giới thiệu chung về ñường xylose 14

2.4.1 ðặc ñiểm của ñường xylose 14

2.4.2 Các phương pháp sản xuất ñường xylose 17

2.4.3 Ứng dụng của ñường xylose 21

2.5 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñường xylose trên thế giới và ở Việt Nam 22

2.5.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñường xylose trên thế giới 22

2.5.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñường xylose ở Việt Nam 23

PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Vật liệu, hóa chất nghiên cứu 25

3.1.1 Vật liệu và ñối tượng nghiên cứu 25

3.1.2 Thiết bị, hóa chất dùng trong nghiên cứu 25

3.2 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 27

3.3 Nội dung nghiên cứu: 28

3.4 Phương pháp nghiên cứu 29

3.4.1 Sơ ñồ quy trình công nghệ sản xuất enzyme xylanse quy mô phòng thí nghiệm 29

3.4.2 Phương pháp vi sinh 31

3.4.3 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu vật lý 32

3.4.4 Phương pháp phân tích chỉ tiêu hoá học 33

3.4.5 Phương pháp tách chiết eyme xylanase 35

3.4.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm 37

3.4.7 Nghiên cứu ứng dụng enzyme xylanase ñể thu nhận ñường xylose từ xy lan quy mô phòng thí nghiệm 41

3.4.8 Nghiên cứu công nghệ tách chiết, làm sạch và thu hồi ñường xylose quy mô thí nghiệm 43

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 44

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

4.1 Tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase ñạt hiệu quả cao 45

4.1.1 Kết quả tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase 45

4.1.2 Nghiên cứu một số ñặc ñiểm hình thái của chủng nấm mốc An NVT3 tuyển chọn 46

4.2 Nghiên cứu xác ñịnh một số ñiều kiện (nhiệt ñộ, pH, dinh dưỡng, …) ñể sinh tổng hợp enzyme xylanase ñạt hiệu quả cao 48

4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban ñầu ñến khả nắng sinh tổng hợp enzyme xylanase 48

4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase 49

4.2.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ ñến khả năng sinh tổng hợp xylanase 50

4.2.4 Xác ñịnh nguồn và nồng ñộ nitơ vô cơ thích hợp ñến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase 52

4.3 Nghiên cứu ñiều kiện thu hồi enzyme xylanase quy mô phòng thí nghiệm 53

4.3.1 Cô ñặc dịch xylanase bằng màng siêu lọc Amicon (PM10) 53

4.3.2 Nghiên cứu công nghệ tách chiết enzyme xylanase 54

4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH, nhiệt ñộ ñến hoạt lực của enzyme xylanase 56

4.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính enzyme xylanase 56

4.4.2 Ảnh hưởng của ñộ bền nhiệt ñến hoạt tính enzyme xylanase 57

4.4.3 Ảnh hưởng của pH và ñộ bền pH ñến hoạt tính enzyme xylanase 58

4.5 Nghiên cứu ứng dụng enzyme xylanase ñể thu nhận ñường xylose từ xylan quy mô phòng thí nghiệm 60

4.5.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ enzyme xylanase ñến hiệu quả thủy phân xylan 60

4.5.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ cơ chất ñến hiệu quả thủy phân xylan 61

4.5.3 Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân ñến hiệu quả thủy phân xylan 63

4.5.4 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hiệu quả thủy phân xylan 65

4.5.5 Ảnh hưởng của pH ñến hiệu quả thủy phân xylan 66

4.5.6 Nghiên cứu thu hồi ñường xylose quy mô phòng thí nghiệm 67

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 72

5.1 Kết luận 72

5.2 ðề nghị 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

PHỤ LỤC 80

Chữ viết thường

Aspergillus niger

Công nghiệp thực phẩm gam

Sắc ký lỏng cao áp lít

mililit miligam ðường khử ðường tổng số Vòng/phút Xylose

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Khả năng sinh enzyme xylanase trên phế phụ phẩm

nông nghiệp của một số chủng Aspergillus 8

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất ngô tại Việt Nam (2007 - 2011) 12

Bảng 2.3 Thành phần các hợp chất của lõi ngô 13

Bảng 2.4 Thành phần hemicellulose trong sinh khối thực vật 14

Bảng 2.5 Lượng sản xuất và giá cả các loại ñường trên thế giới 23

Bảng 4.1 Kết quả tuyển chọn chủng nấm mốc sinh xylanase 45

Bảng 4.2 Một số ñặc ñiểm hình thái của chủng nấm mốc An NVT3 47

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của pH ban ñầu ñến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase 49

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến khả năng sinh tổng hợpxylanase 50

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ ñến khả năng sinh tổng hợp xylanase 51

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng ñộ các nguồn nitơ vô cơ ñến khả năg sinh tổng hợp enzyme xylanase 52

Bảng 4.7 Các bước tinh sạch xylanase quy mô phòng thí nghiệm 54

Bảng 4.8 Hiệu quả của một số phương pháp tách chiết enzyme 55

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính của enzyme xylanase 56

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của ñộ bền nhiệt ñến hoạt tính của enzyme xylanase 57

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính enzyme xylanase 58

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của ñộ bền nhiệt ñến hoạt tính của enzyme xylanase 59

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của nồng ñộ enzyme xylanase ñến hiệu quả

thủy phân dịch xylan 60

Bảng 4.14 Ảnh hưởng của nồng ñộ cơ chất ñến hiệu quả thủy phân

dịch xylan lõi ngô 62

Bảng 4.15 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ñến hiệu quả thủy phân

dịch xylan 64

Bảng 4.16 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hiệu quả thủy phân xylan 65

Bảng 4.17 Ảnh hưởng của pH ñến hiệu quả thủy phân xylan 66

Bảng 4.18 Ảnh hưởng của tỷ lệ than hoạt tính ñến hiệu quả tinh sạch

dịch ñường sau thủy phân 68

Bảng 4.19 Ảnh hưởng của tỷ lệ mầm tinh thể ñường xylose bổ sung

ñể làm mồi ñến hiệu suất kết tinh 69

Bảng 4.20 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ tới quá trình sấy khô ñường 71

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Tác ñộng của các loại enzyme xylanase lên mạch xylan 6

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của ñường xylose 14

Hình 2.3 Công thức cấu tạo của xylan 15

Hình 2.4 Công thức cấu tạo hóa học của một số loại xylan 16

Hình 4.1 Bào tử của chủng nấm mốc A niger NVT3 48

Hình 4.2 Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm mốc A niger NVT3 trên môi trường PDA sau 7 ngày nuôi cấy 48

Hình 4.3 Nấm mốc A niger trên môi trường giữ giống 48

PHẦN I MỞ ðẦU

I ðặt vấn ñề

Hiện nay trên thế giới nguồn thực phẩm chức năng ñóng vai trò quan trọng Nó giúp cho con người duy trì và tăng cường sức khỏe, kéo dài tuổi thọ, phòng và chữa ñược nhiều bệnh hiểm nghèo nhất là trong giai ñoạn hiện nay, khi ñời sống con người ngày càng tăng cao và yêu cầu về sức khỏe ngày càng ñược xem trọng Thực phẩm chức năng là loại thực phẩm ñược chế biến

từ các nguyên liệu tự nhiên như các nguồn thực vật và ñộng vật giàu hoạt chất sinh học Thực phẩm chức năng giúp cho con người duy trì và tăng cường sức khỏe, kéo dài tuổi thọ, phòng và chữa ñược nhiều bệnh hiểm nghèo [10] Những năm gần ñây một loại ñường chức năng ñang có xu hướng gia tăng ở nhiều quốc gia trên thế giới với các ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm như là chất phụ gia, bổ sung vào ñồ uống dinh dưỡng, là nguyên liệu ñầu của thuốc trổng hợp ñiều trị bệnh ung thư, phòng chống một số bệnh (tiểu ñường, mất ngủ, ñường ruột…) ñó là ñường xylose Trong công nghiệp thực phẩm, xylose ñược sử dụng ñể sản xuất bánh kẹo, dùng làm chất phụ gia thực phẩm và là sản phẩm ñược bổ sung vào các loại ñồ uống Nhờ xylose có ñộ ngọt tương ñương với ñường sucrose và do ñặc ñiểm mất nhiệt khi hoà tan nên tạo cảm giác mát lạnh trong miệng ðặc tính này làm cho xylose rất hấp dẫn trong một số sản phẩm thực phẩm, ñặc biệt là ñồ uống Trong lĩnh vực y dược, xylose ñược biết ñến như một trong những nguyên liệu ñầu của việc tổng hợp thuốc trị bệnh ung thư, AIDS và

một số bệnh khác (Trương Thị Minh Hải và cs., 2008)[9] Có 2 phương pháp

chính ñể sản xuất ñường xylose là phương pháp hóa học và phương pháp lên men nhờ vi sinh vật Trong ñó sản xuất xylose theo phương pháp lên men từ xylan nhờ vi sinh vật tỏ ra có nhiều ưu ñiểm trong việc khắc phục các nhược ñiểm của phương pháp hóa học

Tuy nhiên, ở Việt Nam vấn ñề này vẫn còn rất mới Trong khi ñó, nước ta là

một nước nông nghiệp, cùng với lượng nông sản tạo ra khá lớn là các phế phụ

phẩm và các phế thải mà ngành nông nghiệp thải ra, trong ñó có lõi ngô Việc

xử lý các phế thải nông nghiệp này không hợp lý không những gây ra ô nhiễm

môi trường trầm trọng mà còn làm giảm hiệu quả sản xuất của ngành công

nghệ sau thu hoạch Vì vậy, việc nghiên cứu công nghệ sản xuất ñường xylose

từ lõi ngô bằng enzyme xylanase sẽ giúp nâng cao giá trị nông sản, giảm thiểu

ô nhiễm môi trường trong việc tận dụng loại phế phụ phẩm nông nghiệp này

Xuất phát từ vấn ñề nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài:

“Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase từ lõi

ngô dùng trong sản xuất ñường Xylose”

II Mục ñích và yêu cầu của ñề tài

1 Mục ñích của ñề tài

Tuyển chọn ñược một số chủng nấm mốc có hoạt lực sinh tổng hợp

enzyme xylanase cao từ lõi ngô

2 Yêu cầu của ñề tài

- Tuyển chọn ñược một số chủng nấm mốc có hoạt lực sinh tổng hợp

enzyme xylanase với hoạt lực cao (ñạt 400 IU/ ml)

- Xác ñịnh các ñiều kiện (nhiệt ñộ, pH, dinh dưỡng,…) ñể sinh tổng

hợp enzyme xylanase ñạt hiệu quả cao

- Ứng dụng enzyme xylanase ñể thủy phân xylan từ lõi ngô thành

ñường xylose quy mô phòng thí nghiệm

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt lực sinh tổng hợp enzyme xylanse cao

Aspergillus là một chi nấm có ý nghĩa công nghiệp cao do có khả năng

sản sinh nhiều loại enzyme thủy phân ngoại bào có giá trị công nghiệp, trong

ñó có xylanase Với khả năng sinh ñồng thời nhiều loại enzyme thủy phân ngoại bào (cenllulase, protease, pectinase, amylase, xylanse) nên ña số các loài của chi nấm này ñều có khả năng sinh mạnh xylanase trên nhiều cơ chất

tự nhiên khác nhau bao gồm cả các phụ phẩm nông nghiệp chứa lignocellulo trong ñó có lõi ngô Tuy nhiên khả năng sản sinh ra xylanase còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: chủng giống, chất lượng lõi ngô, nhiệt ñộ, pH, ñộ ẩm,… Trong ñó yếu tố ñầu tiên ñóng vai trò quyết ñịnh là chất lượng chủng vi

sinh vật Chính vì vậy việc tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt lực sinh tổng

hợp enzyme xylanase cao là một vấn ñề vô cùng cần thiết

Trong quá trình nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase trên phế phụ phẩm nông nghiệp phục vụ chăn nuôi, từ 129 chủng vi khuẩn và nấm sợi có nguồn gốc từ rừng ngập mặn, tác giả Phương Phú Công

(2009) ñã tuyển chọn ñược chủng Aspergillus Gm56 có khả năng sinh mạnh

xylanase (ñạt 485,05 IU/g khi lên men chìm và 1329,9 IU/g khi lên men rắn với cơ chất lõi ngô Enzyme xylanase ñược sinh ra từ chủng Gm56 có thể hoạt ñộng tốt và bền ở acid ở ngưỡng từ 2,0-6,0, nhiệt ñộ gần với hoạt ñộng của bộ máy tiêu hóa vật nuôi [6]

Tác giả Trần Hữu Phong (2007) [22] khi nghiên cứu một số ñặc ñiểm

xylanase từ chủng Aspergillus niger ðB106 cho biết chủng Aspergillus niger

ðB106 có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân polysaccharide (amylase, cellulase, xylanase, α-galactosidase), không sinh protease và phytase Có khả năng sinh enzyme xylanase mạnh (endoxylanase: 3105,5

IU/g cơ chất khô và β-xylosidase: 2,432 IU/g cơ chất khô) đây là chủng an toàn (không sinh ựộc tố Aflatoxin và Ochratoxin), không ảnh hưởng xấu lên ựộng vật thắ nghiệm

Khi nghiên cứu về xylanase nấm mốc dùng cho chăn nuôi, tác giả đào

Thị Hải Lý (2006) ựã tuyển chọn ựược chủng Aspergillus oryzae NM1 có hoạt tắnh xylanase mạnh, ựạt 667 IU/g cơ chất lõi ngô Chủng Aspergillus

oryzae NM1 không sinh các ựộc tố aflatoxin khi lên men bề mặt trên cơ chất

lõi ngô, không gây bệnh trên ựộng vật thắ nghiệm nên hoàn toàn yên tâm sử dụng ựể sản xuất enzyme xylanase Enzyme xylanase ựược sinh tổng hợp từ

chủng Aspergillus oryzae NM1 có pH tối ưu là 5.0, hoạt ựộng ổn ựịnh trong

khoảng pH 4.0-7.0; Nhiệt ựộ tối ưu là 500C và dưới nhiệt ựộ này hoạt tắnh vẫn giữ ựược trên 90%; Enzyme xylanase có khả năng phân cắt xylan trong cơ chất chăn nuôi giải phóng xylose và oligoxylose

2.2 Enzyme xylanase

2.2.1 Cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzyme xylanase

2.2.1.1 Cấu tạo của enzyme xylanase

Các xylanase có cấu tạo gồm nhiều chuỗi polypeptide xoắn lại với nhau tạo cấu trúc bậc 2 và tiếp tục cuộn xoắn trong không gian ựể tạo thành cấu trúc bậc 3 Các chuỗi có cấu trúc bậc 3 kết hợp với nhau tạo cấu trúc bậc 4 [31] Ở mức phân tử protein, xylanase gồm vùng chức năng, vùng không chức năng và vùng nối Vùng nối thường có nhiều amino axit, hydroxyl ựược glycosyl hóa ở vị trắ O Sự glycosyl hóa này giúp chúng không bị enzyme protease phân cắt Vùng chức năng ựược chia thành vùng xúc tác và vùng bám cơ chất, hai vùng này có thể tách biệt nhau về cấu trúc hoặc không Tắnh chất của xylanase có mối tương quan rất lớn ựến các gốc hydro liên kết với các xylanase Nếu xylanase có tắnh bazơ thì amino axit là asparagines, xylanase có tắnh axit thì amino axit là aspartic [30]

2.2.1.2 Cơ chế xúc tác của enzyme xylanase

Cơ chế hoạt ñộng của xylanase bao gồm các bước sau [6, 29]:

Bước 1: Enzyme xylanase nhận mặt xylan và liên kết với nó bằng cách thay ñổi cấu hình ở phần cánh trái cuộn xoắn lại 3 lần

Bước 2: Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc tác, liên kết glycoside bị kéo căng và bị bẻ gãy và tạo thành dạng trung gian ñồng hóa trị enzyme - cơ chất

Bước 3: Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt ñộng Phân tử nước này tách thành ion H+ và OH- Ion H+ gắn vào gốc glycosyl vừa ñược tách ra trong khi ion OH- gắn vào ñầu khử của mạch xylan vừa tạo ra theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ ñó sản phẩm ñược giải phóng, ñồng thời enzyme tiếp tục xúc tác cho phản ứng khác

Sơ ñồ tóm tắt của quá trình như sau:

Xylanase + xylan xylan-xylanase xylanase + sản phẩm ðầu tiên cơ chất xylan xoắn ốc ñược ñặt vào vị trí ñối diện với khe giữ Tyr 65 và Tyr 69 Axit glutamic 172 là chất xúc tác axit/bazơ và axit Glutamic 78 là chất cho ñiện tử (nucleophile) Cơ chất bám vào vị trí Glutamic 78 tạo thành dạng sản phẩm trung gian và ñược giữ vững trong suốt quá trình phản ứng chuyển glycosylate Một phân tử nước thay thế vị trí của chất cho ñiện tử (nucleophile) Có sự phân tách và phân tán các ñường (xylobiose) cho phép enzyme di chuyển ñến một vị trí mới trên cơ chất [3]

2.2.1.3 Enzyme xylanase và sự thuỷ phân xylan

Thủy phân xylan bằng enzyme là quá trình ñể phá vỡ chuỗi xylan thu ñược từ quá trình tiền xử lý lõi ngô thành các phân tử ñường xylose bằng tác dụng của các enzyme thủy phân Quá trình này còn ñược gọi là quá trình ñường hóa Xylan có cấu tạo phức tạp và nguồn xylan phong phú nên các enzyme xylanase có cấu tạo cũng rất phức tạp Mỗi loại vi sinh vật khác nhau

sẽ thu ñược sẽ khác nhau Hầu hết enzyme xylanase từ các chủng vi sinh vật

ñều chứa trên một hoạt tính ðể phân giải xylan thành xylose cần tác dụng ñồng thời của 2 loại enzyme chính bao gồm: endoxylanase (còn ñược gọi là β-1,4-xylanase, β-D-xylanase hay Endo-1,4-β-D-xylanase) và β-xylosidase Endo-xylanase thường cắt mạch chính của xylan ở những ñiểm bất kỳ tại giữa mạch và giải phóng olygoxylose Sau ñó, β-xylosidase cắt các ñoạn olygoxylose ñể giải phóng ñường ñơn xylose Ngoài ra còn cần thêm các loại enzyme ñể phân cắt ñường chuỗi bên như α-L-arabinofuranosidase, α-glucuronidase,…[29] Nguyên tắc các enzyme thuỷ phân mạch xylan ñược

mô tả trong hình 2.1

Hình 2.1 Tác ñộng của các loại enzyme xylanase lên mạch xylan

2.2.2 Nguồn enzyme xylanase

Trong thời gian gần ñây việc nghiên cứu sản xuất enzyme xylanase ñã thu hút ñược sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, trong ñó các công trình nghiên cứu sản xuất enzyme xylanase chủ yếu từ vi sinh vật như nấm và vi khuẩn [6]

* Enzyme xylanase từ vi khuẩn: Là một trong số rất nhiều enzyme

xylanase ñược nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp Trong số ñó, chi

Bacillus và Streptomyces là hai chi sản sinh enzyme xylanase khá phổ biến ñã

ñược công bố và sử dụng rộng rãi Xylanase của các họ vi khuẩn thường hoạt ñộng tối ưu ở pH từ 5,0 - 8,0, ở nhiệt ñộ 50 - 80oC Nakamura và cs khi

nghiên cứu enzyme xylanase của Bacillus sp 41-1 cho thấy chúng hoạt ñộng

tốt ở nhiệt ñộ 50oC [54]

* Enzyme xylanase từ nấm: Enzyme xylanase ñược sản xuất từ nấm

ñặc biệt là các loại nấm sợi ñược ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp Khả năng sinh enzyme xylanase của nấm sợi cao hơn nhiều so với khả năng sinh enzyme xylanase của vi khuẩn và nấm men Ngoài ra, nấm sợi thường sản sinh một hệ enzyme phân giải xylan bao gồm endoxylanase, β-xylosidase và các enzyme phân cắt nhóm thế khác Các enzyme xylanase của nấm sợi thường là các enzyme ngoại bào Với những ưu thế về khả năng sinh enzyme xylanase như vậy nên hiện nay trên thị trường các chế phẩm enzyme xylanase chủ yếu sản xuất từ nấm sợi ðặc tính chung của ña số các xylanase từ nấm là hoạt ñộng hiệu quả nhất ở nhiệt ñộ 35 - 50oC, pH 3,0 - 5,5 và bền ở dải pH từ 4,0 - 8,0 [5]

Trong số các chi nấm sợi thì các chi Aspergillus và Trichoderma là hai chi sinh enzyme xylanase ñược nghiên cứu nhiều nhất ðặc biệt Aspergillus là

một chi nấm sợi có ý nghĩa công nghiệp cao do có khả năng sinh nhiều loại

enzyme thủy phân ngoại bào Chính vì khả năng sinh ñồng thời nhiều loại

enzyme thủy phân ngoại bào nên ña số các loài của các chi nấm này ñều có

khả năng sinh ra nhiều enzyme xylanase trên các cơ chất tự nhiên, phế phụ

phẩm nông nghiệp chứa lignocellulose như bã dầu cọ, lõi ngô, vỏ lúa mì,…

Khả năng sinh enzyme xylanase trên phế phụ phẩm nông nghiệp của một số

chủng Aspergillus ñược thể hiện ở bảng 2.6 [6]

Christov và cs [43] khi cấy các chủng A foetidus, A oryzae, A niger và

A phoenicis trên môi trường chứa lõi ngô ñã thu ñược hàm lượng xylanase

tương ứng là 82,3 IU/g; 547,4 IU/g; 99,9 IU/g và 225,6 IU/g [33] Khả năng

sinh enzyme xylanase từ nấm cao hơn rất nhiều so với khả năng sinh enzyme

xylanase từ vi khuẩn ðể sản xuất enzyme xylanase từ nấm người ta có thể sử

dụng các phương pháp truyền thống ñể nâng cao hoạt tính của enzyme như

chọn lọc chủng ñầu dòng, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, gây ñột biến bằng

tác nhân vật lý, hóa học ñể có thể thu ñược chủng mong muốn

Bảng 2.1 Khả năng sinh enzyme xylanase trên phế phụ phẩm

nông nghiệp của một số chủng Aspergillus

Chủng

Khối lượng (%)

ðiều kiện nuôi cấy ( 0 C/h)

IU/g khối lượng khô

2.2.3 Ứng dụng thực tiễn của enzyme xylanase

2.2.3.1 Tình hình sản xuất và thương mại enzyme xylanase

Những thành tựu nổi bật trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng xylanase ựược sản xuất và ngày càng ựược sử dụng phổ biến Trên thế giới có khoảng 10 công ty sản xuất lớn và hàng loạt các công ty nhỏ sản xuất enzyme công nghiệp, nhưng công ty của Novo- Nordisk của đan Mạch là công ty sản xuất enzyme lớn nhất trên thế giới Chỉ tắnh ựến năm 1994 họ ựã sản xuất ựến 32% enzyme tẩy rửa, chế biến các sản phẩm từ sữa 14%, dệt 10%, thuỷ phân tinh bột 15% và các enzyme khác khoảng 29% Nhưng thành tựu nổi bật nhất trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng xylanase chắnh là các chế phẩm xylanase phục vụ cho công nghiệp giấy, dược phẩm ựã ựược sản xuất và ngày càng ựược sử dụng rộng rãi Hiện nay ựã có một số sản phẩm ựang lưu hành

trên thị trường như: enzyme xylanase X2753-50G từ Thermomyces

lanuginosus của hãng Sigma, enzyme xylanase X400 OL từ Trichoderma longibrachiatum của hãng Gramma Chemie GMbH (đức), Novoenzyme 431

từ Trichoderma longibrachiatum của hãng Novo Nordisk và Grydazym GP

5000 (đan Mạch) [31, 42]

Trung Quốc ựã sản xuất một số enzyme thương mại trong ựó có

xylanase như: DKN xylanase 10000 dry của hãng Qingdao Continent Industry Co., sản phẩm có hoạt tắnh xylanase không dưới 10000 IU/g; xylanase XCB

của hãng Hunan New Century BioChemical Co., sản phẩm có hoạt tắnh xylanase 5000 IU/g; Green enzyme có tổ hợp enzyme gồm: β-glucanase (50000 U/g); protease (1000 U/g), xylanase (60000 U/g); pectinase (6000 U/g); cellulase (12000 U/g) [31]

Các nước đông Nam Á như Singapore cũng có hàng loạt các sản phẩm enzyme xylanase như: Kemzyme dry KM-24-10/99 ựược sản xuất bởi công ty Kemin Industries (Asia) Pte Limited; Rovabio Excel AP AA-54-2/01 ựược sản xuất bởi công ty Adisseo

Ở Việt Nam ñã có một số công trình nghiên cứu về xylanase từ vi sinh vật Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức ñộ tìm hiểu hoạt tính enzyme xylanase của các chủng vi sinh vật ñược sản xuất trong nước Chúng ta chưa tự sản xuất ñược enzyme xylanase ñể phục vụ cho nhu cầu nghiên cứu và sản xuất trong nước Các enzyme hầu hết ñều ñược nhập khẩu về nước ở dạng thành phẩm và bán thành phẩm [6]

2.2.3.2 Ứng dụng trong chuyển hóa các chất lignocenlulose

Xylan còn là cơ chất dùng ñể sản xuất các loại ñường charide Xylo-oligosaccharide là một trong số các oligo-saccharide chức năng (prebiotic) có cấu tạo từ 2 ñến 7 phân tử ñường β-xylose liên kết với nhau bằng liên kết 1,4- β-xyloside Prebiotic có nhiều lợi ích về mặt dược phẩm cũng như có ảnh hưởng tốt ñến sức khỏe Khi ñược bổ sung vào cơ thể người, prebiotic có nhiều tác ñộng sinh lý quan trọng như ngăn cản quá trình gây bệnh của vi khuẩn và các tác nhân gây tiêu chảy, tăng khả năng miễn dịch của

xylo-oligosac-cơ thể, kháng lại bệnh ung thư, cản trở sự phát triển của các vi sinh vật trong khoang miệng Các sản phẩm phụ nông nghiệp như lõi ngô, cám gạo, vỏ trấu

là cơ chất lý tưởng cho việc sản xuất xylo-oligosaccharide Các enzyme tốt nhất sử dụng cho quá trình này là các enzyme từ nấm mốc Hiện nay nhu cầu

về oligosaccharide trên thế giới là rất lớn Tại Nhật Bản, nhu cầu hàng năm về oligosaccharide vào khoảng 1000 - 2000 tấn/năm [16]

2.2.3.3 Ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

Việc sử dụng enzyme xylanase cho thức ăn của ñộng vật ñã thu hút sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học Bổ sung enzyme xylanase vào thức ăn của gà con làm giảm ñộ nhớt trong ruột gà, tăng hiệu quả hấp thu thức ăn của

gà con và kết quả là cải thiện ñáng kể trọng lượng của chúng Theo Feoli và cộng sự thì việc bổ xung enzyme xylanase vào bột mì và bột ñậu tương trong

thức ăn gia súc với một tỷ lệ nhất ñịnh cải thiện ñược năng suất và khả năng tiêu thụ thức ăn của lợn

Các nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng việc bổ sung enzyme xylanase vào thức

ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ thực vật (cỏ linh lăng, ngũ cốc ) ñã làm tăng hiệu quả tiêu thụ chất dinh dưỡng và năng suất trong chăn nuôi [34]

2.2.3.4 Ứng dụng trong sản xuất bánh và các ứng dụng khác

Các enzyme xylanase có khả năng cải thiện chất lượng của bánh mì bởi

vì nó làm tăng thể tích của bánh Chất lượng của bánh ñược cải thiện tốt hơn khi sử dụng enzyme xylanase kết hợp với enzyme amylase Enzyme xylanase

có tính axit từ nấm Aspergillus oryzae ñược sử dụng ñể sản xuất các sản phẩm

thương mại truyền thống của Nhật như sake và shoyu koji Hiện nay một số enzyme xylanase ñược thương mại hoá và sử dụng trong công nghệ làm bánh với các tên như Multifect và Enzeko Novozyme ñưa ra một số các enzyme xylanase mới, có thể là kết hợp với các enzym khác, ñể cải thiện tính chất của bột nhào, ñặc biệt là trong các nhà máy bánh mỳ [36]

2.3 Lõi ngô - nguồn xylan

Cây ngô (Zea Mays L.) với vai trò là cây lương thực cho con người Ngô

góp phần nuôi sống gần 1/3 dân số thế giới và là nguồn lương thực không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày ñối với một số nước như Peru, Kenia, Mexico… Ngô chiếm 17% tổng sản lượng lương thực, là nguồn thức ăn chăn nuôi (66,8%), nguyên liệu cho ngành công nghiệp (5%), và phục vụ cho xuất khẩu (hơn 10%) Cây ngô hiện nay ñã trở thành cây trồng góp phần ñảm bảo an ninh lương thực, góp phần chuyển ñổi cơ cấu nông nghiệp từ trồng trọt sang chăn nuôi, cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp và sản phẩm hàng hóa xuất khẩu ở nhiều nước trên thế giới

Trong những năm qua, cây ngô ở nước ta ñã có những bước tiến dài cả

về diện tích, năng suất và sản lượng nhờ ứng dụng khoa học kỹ thuật tiên tiến trong sản xuất, chuyển ñổi cơ cấu giống, thâm canh Tình hình sản xuất ngô của nước ta trong những năm gần ñây ñược thể hiện qua bảng 2.7 [24]

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất ngô tại Việt Nam (2007 - 2011)

(1000 ha)

Sản lượng (1000 Tấn)

Năng suất (Tạ/ ha)

(Nguồn: Niên giám thống kê năm 2011)

Số liệu bảng 2.2 cho thấy diện tích và năng suất và sản lượng ngô của nước ta từ năm 2007 ñến năm 2010 liên tục tăng Diện tích ngô năm 2011 giảm so với năm 2010 là 44,2 nghìn ha (giảm 3,9%), giảm chủ yếu ở vụ ñông Miền Bắc, nhưng năng suất ngô vẫn ñạt 43,0 tạ/ha Sản lượng ngô năm 2011 vẫn tăng nhẹ so với năm trước Cùng với sản lượng ngô liên tục tăng ñó là những phế thải mà quá trình sản xuất ngô tạo ra như thân ngô, lá ngô, lõi ngô Trong ñó lõi ngô chiếm tỷ lệ khá lớn Hiện nay các giống ngô thường có tỷ lệ lõi/hạt chiếm từ 30 - 40% Như vậy với sản lượng ngô khoảng 4,5 triệu tấn mỗi năm thì lượng lõi ngô thải ra tương ñương mỗi năm khoảng 1,35 - 1,8 triệu tấn, ñây là một con số rất lớn Thành phần các hợp chất trong lõi ngô ñược thể hiện qua bảng 2.3 [4]

Bảng 2.3 Thành phần các hợp chất của lõi ngô

Các chất hoà tan trong nước ở 50oC 2,41

3

Các chất hoà tan trong nước ở 90oC 0,97

4 Các polysaccharide dễ thuỷ phân 38,13

5 Các polysaccharide khó thuỷ phân 34,03

Sản lượng ngô ngày càng lớn thì lượng lõi ngô thải ra ngày càng cao Việc nghiên cứu và áp dụng sản xuất ñường xylose từ lõi ngô không chỉ giúp tận dụng tốt hơn nguồn phế thải này mà còn góp phần cải thiện kinh tế cho người trồng ngô, phát triển ngành công nghiệp thực phẩm trong nước, ñồng thời làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường [4]

Theo các nghiên cứu thì lõi ngô chính là nguồn xylan phong phú Lõi ngô có hàm lượng xylan khá lớn (khoảng 19 - 23% khối lượng chất khô) Hàm lượng xylan trong một số loại thực vật ñược thể hiện qua bảng 2.9 [4,7]

Bảng 2.4 Thành phần hemicellulose trong sinh khối thực vật

Thành phần hemicellulose (% khối lượng khô)

Thân ngô, lõi ngô khô 1,0 - 1,2 19,0 - 23,0 1,8 - 3,4 0,3 - 0,7

Cỏ Switchgass khô 1,0 - 1,1 23,0 - 25,0 3,0 - 3,4 0,1 - 0,8 Cây gỗ ngắn ngày 0,7 - 1,2 13,0 – 17,0 0,4 - 1,1 0,9 - 1,3

2.4 Giới thiệu chung về ñường xylose

2.4.1 ðặc ñiểm của ñường xylose

Xylose là một ñường 5 cacbon, có công thức phân tử là C5H10O5 Xylose còn có tên gọi là “ñường gỗ”, là ñường có mặt trong nhiều loại gỗ Khi thủy phân hemicellulose trong thân lúa mì người ta thu ñược 31% xylose, 59% glucose và khoảng vài phần trăm các ñường khác (arabinose, galactose, mannose…) Khi thuỷ phân rơm rạ thu ñược khoảng 18% pentose và 26,8% hexose [1] Công thức cấu tạo của ñường xylose ñược thể hiện ở hình 2.1

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của ñường xylose

Xylose là thành phần chủ yếu thuộc ñường pentose, cùng với glucose

là hai nhóm ñường chính thu ñược khi thủy phân hemicellulose trong nguyên liệu gỗ và chất thải nông nghiệp Khi thủy phân hemicellulose bằng axit có thể giải phóng ra nhiều loại ñường khác nhau ngoài ñường xylose như D - galactose, D - glucose, D - mannose và L - arabinose Kèm theo ñó còn là các sản phẩm thủy phân khác như fucfural, 5 - hydroxymethyl fucfural, axit acetic, axit syringic [28]

Khi một chuỗi các nhóm xylose liên kết với nhau qua liên kết β - (1 - 4) glycoside và phân nhánh bởi các chuỗi carbonhydrate ngắn như axit D - glucuronic hoặc ñồng phân của nó 4 - O - methylether, α - arabinose hoặc các Oligosaccharide tạo thành từ D - xylose, L - arabinose, D - hay L - galactose

và D - glucose sẽ tạo thành xylan Cấu tạo của xylan ñược thể hiện qua hình 2.2

Hình 2.3 Công thức cấu tạo của xylan

Xylan là thành phần chính cấu tạo nên hemicellulose Xylan ñược tìm thấy chủ yếu trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật và tạo thành pha giữa giữa lignin và các hợp chất polysaccharide khác

Xylan gồm nhiều loại khác nhau, có thể ñược chia thành homoxylan và heteroxylan bao gồm: glucuronoxylan, (arabino) glucuronoxylan, (glucurono) arabinoxylan, arabinoxylan và tổ hợp heteroxylan Homoxylan có cấu tạo bao gồm các xylopyranose ñược liên kết với nhau bởi liên kết β - (1 - 3) glycoside hoặc hỗn hợp β - (1 - 3, 1 - 4) glycoside Cấu tạo kiểu homoxylan ñược tìm

thấy trong tảo biển Palmariales và Nemaliales Heteroxylan có cấu tạo là các

mạng lưới β - (1 - 4) - D xylopyranose gắn với chuỗi mono và oligoglycosy Heteroxylan có mặt ở trong các loại ngũ cốc, hạt cây, mủ và nhựa cây

Xylan ña dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử Trong tự nhiên, chúng ñược thay thế một phần bằng acetyl 4 - 0 - methyl - d - glucuronosyl và arabinofuranosyl tạo thành cấu trúc polymer không ñồng nhất Việc tách chiết xylan từ các nguyên liệu trong tự nhiên không thể tránh khỏi những biến ñổi

về cầu trúc vì vậy tác ñộng của xylan về mặt cấu trúc vẫn chưa ñược xác ñịnh

2.4.2 Các phương pháp sản xuất ñường xylose

Có hai phương pháp chủ yếu ñể sản xuất ñường xylose là phương pháp hóa học và phương pháp lên men nhờ vi sinh vật [2,4]

2.4.2.1 Sản xuất xylose bằng phương pháp hoá học

Sản xuất xylose bằng phương pháp hoá học dựa trên quá trình hydro hóa dịch thủy phân hemicellulose (chứa thành phần chủ yếu là xylan) thành xylose Trong quá trình hydro hoá có khoảng 60% lượng xylan ban ñầu chuyển thành xylose Sau phản ứng dịch hydro hóa ñược kết tinh ñể thu hồi ñường xylose Phương pháp này có ưu ñiểm là hiệu suất thuỷ phân cao, ít yêu cầu về công nghệ nhưng có nhược ñiểm là gây hao mòn thiết bị, tạo sản phẩm có ñộ tinh khiết thấp và không an toàn cho người sử dụng nếu chưa xử lý hết lượng acid dùng ñể thuỷ phân, gây ô nhiễm môi trường bởi lượng acid thải ra

Các nghiên cứu trước ñây ñưa ra quy trình sản xuất ñường xylose từ nguyên liệu lignocellulose có chứa hemicellulose, quy trình bao gồm các bước như sau:

- Thủy phân lignocellulose với nước ñể tạo ra phần hoà tan và phần không hoà tan Phần hoà tan có chứa ñường xylose, phần không hoà tan có chứa lignin và cellulose

- Tách phần không tan từ dịch thuỷ phân

- Xử lý phần hoà tan có chứa ñường xylose ñể dịch chuyển các chất hữu cơ và các ion ra ngoài

- Tập trung phần có chứa ñường xylose thành dạng sirô có chứa 20% - 40% nước

- Trộn sirô với ethanol ñể tạo thành dạng ethanolic hòa tan và kết tinh ñường xylose từ dạng ethanolic hòa tan

Trong sản xuất xylose từ nguyên liệu lignocellulose quy mô thương mại, vấn ñề quan trọng là phải giảm thiểu tối ña lượng xylose bị mất ñi khi tách xylose ra khỏi sản phẩm sau thủy phân Quy trình sản xuất ñường xylose

từ nguyên liệu lignocellulose quy mô thương mại gồm các bước như sau: Bước 1: Thủy phân nguyên liệu bằng dung dịch axit ñể tạo ra hai phần Phần hoà tan chứa xylose và phần không hòa tan chứa lignin và cellulose Dung dịch axit nên ñược sử dụng ở nồng ñộ 0,5 - 5% Có thể sử dụng axit vô

cơ (như axit H2SO4, HCl hoặc H3PO4) hoặc axit hữu cơ (như acetic hoặc trifluoracetic) Trong quá trình thủy phân hỗn hợp phản ứng ñược duy trì ở nhiệt ñộ từ 70 - 270oC Thời gian thủy phân từ 2 phút ñến 2 giờ Quá trình thủy phân ñược tiến hành trong sự kết hợp của cả 3 yếu tố: nhiệt ñộ, nồng ñộ axit và thời gian

Bước 2: Tách phần không hòa tan

Bước 3: Xử lý phần dung dịch xylose ñể loại bỏ những hợp chất hữu cơ (gồm protein, lipit và chất màu) Các hợp chất này ñược loại bỏ bằng phương pháp xử lý với thuốc thử (như than hoạt tính hoặc chất hấp phụ polymer) Những tạp chất ion chủ yếu là axit sử dụng ở bước 1 ñược loại bỏ bằng thiết

bị ñiện phân, sau ñó ñược cho qua thiết bị có chứa nhựa trao ñổi ion

Bước 4: Dung dịch xylose ñược cô ñặc thành dạng siro có hàm lượng nước dao ñộng từ 20 - 40 % về khối lượng Cô ñặc xylose ở hàm lượng vừa

ñủ ñể xylose có thể kết tinh khi nó ñược trộn với ethanol ở bước 5 ðiều kiện

cô ñặc thích hợp nhất là sử dụng quá trình bay hơi bằng thiết bị bay hơi có màng hay quay Siro thu ñược sau bước 4 này ñem bảo quản và sử dụng cho bước 5

Bước 5: Trộn siro với ethanol ñể tạo dung dịch hòa tan và kết tinh ñường xylose từ dạng ethanolic hòa tan Tiến hành kết tinh ở ñiều kiện nhiệt

ñộ thường Bổ sung ethanol ở nồng ñộ không quá 2 lần ethanol so với lượng

dịch (nên chọn lượng ethanol bằng lượng dịch siro) Hỗn hợp ethanol và siro ñược giữ trong thời gian 10 - 18 giờ, thỉnh thoảng lắc ñể xylose kết tinh

Phản ứng thủy phân ở bước 1 có thể ñược tiến hành ở dạng liên tục hoặc gián ñoạn Sự có mặt của những oligosaccharide có thể ảnh hưởng ñến quá trình kết tinh của xylose Chính vì vậy, dịch thuỷ phân cần phải loại bỏ hoặc khử bớt lượng oligosaccharide có trong dịch bằng cách gia nhiệt dịch xylose ñến nhiệt ñộ 50 - 150oC duy trì trong khoảng 2 phút ñến 2 giờ có bổ dung axit ở nồng ñộ 0,5 - 5% Tinh thể xylose ñược sản xuất ra từ bước 5 ñược rửa sạch bằng dung dịch ethanol có nồng ñộ 90% ñể nâng cao ñộ tinh sạch và ñáp ứng tiêu chuẩn chế biến tốt hơn

2.4.2.2 Sản xuất ñường xylose bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh vật

* Sản xuất xylose bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh

Với phương pháp sản xuất xylose bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh vật xylose ñược sản xuất từ các nguyên liệu giàu xylan Nguyên liệu trước hết ñược thủy phân ñể tạo thành dung dịch chứa xylan Sau ñó các vi sinh vật sử dụng xylan làm nguồn cacbon ñể lên men dịch thủy phân [33] ðường xylose ñược thu hồi bằng phương pháp cô quay chân không và sấy phun Sản xuất xylose theo phương pháp lên men xylan nhờ vi sinh vật có nhiều ưu ñiểm hơn

so với phương pháp hóa học như tạo ra sản phẩm an toàn hơn, không gây ô nhiễm môi trường hay làm hao mòn thiết bị Phương pháp này có nhược ñiểm

là công nghệ yêu cầu cao hơn, hiệu suất thuỷ phân thấp hơn so với phương pháp hoá học Việc thu nhận và tinh sạch ñường xylose gặp nhiều khó khăn

do dịch lên men ngoài ñường xylose còn lẫn rất nhiều tạp chất như ñạm, muối

vô cơ, acid amin ðường xylose lại dễ tạo phản ứng Maillard với axit amin tạo sản phẩm có màu sẫm

Haltric và cs ñã chỉ ra một số vi sinh vật có thể sử dụng ñể lên men xylan

bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc như Aspergillus, Trichoderma,

Bacillus, Cryptococcus, Penicillium, Aureobasidium, Fusa-rium,Chaetomium, Phanerochaete, Rhizomucor, Humicola, Talaromyces [33] Các loại vi sinh

vật này có khả năng sinh enzyme xylanase vào môi trường lên men có chứa nhiều xylan Hiện nay ñã có khá nhiều nghiên cứu về các chủng vi sinh vật trên trong ñó các nghiên cứu tập chung chủ yếu vào sử dụng nấm mốc

Aspergillus niger ñể lên men xylan [33] Pang Pei Kheng và cs ñã sử dụng

phần mềm của thực vật ngọt làm chất nền ñể phân lập và tuyển chọn ñược

chủng nấm mốc Aspergillus niger USA AI 1 Sau ñó sử dụng chủng nấm mốc này ñể lên men xylan Theo Pang Pei Kheng, sử dụng Aspergillus niger ñể lên

men không những nâng cao ñược năng suất, hiệu quả lên men mà còn tận dụng ñược các phế phụ phẩm của ngành nông nghiệp như lõi ngô, bã mía, rơm rạ [35]

* Sản xuất xylose bằng phương pháp enzyme

Phương pháp sản xuất ñường xylose bằng enzyme tách riêng hai quá trình là tổng hợp và thu nhận enzyme qua lên men Sau ñó dùng enzyme ñể thuỷ phân dịch xylan thành ñường xylose Với phương pháp này ta có thể khắc phục ñược nhược ñiểm của phương pháp sản xuất ñường xylose nhờ vi sinh vật

Xylanase là enzyme thủy phân xylan nó có thể ñược tách chiết, thu hồi

từ vi khuẩn (Clostridium, Cellulomonas, Bacillus và Thermonospora…) hoặc nấm (Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum và Penicillium…) Tuy nhiên,

do phát triển trong ñiều kiện yếm khí nên enzyme xylanase do vi khuẩn sinh

ra thường có hàm lượng và hoạt tính thấp hơn enzyme xylanase sinh ra bởi nấm mốc Hiện nay người ta thường sử dụng enzyme xylanase sinh ra từ các chủng mấm mốc ñể sản xuất ñường xylose

Năm 1986, Allenza và cs ñã nghiên cứu sản xuất xylose bằng enzyme

xylanase sinh ra từ chủng Aureobasidium plll/ulam Y-2JII·1 trên hai dạng

enzyme xylanase cố ñịnh và tự do ở nhiệt ñộ 40oC, pH =4,5 - 4,75 [32] Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng thủy phân xylan thành xylose ở cả hai dạng

là gần như nhau (0,16% khối lượng ñối với xylanase ở dạng tự do và 0,21% khối lượng ñối với xylanase ở dạng cố ñịnh) Hoạt tính enzyme ở dạng tự do sau 16 giờ còn 54% trong khi hoạt tính của xylanase dạng cố ñịnh chỉ còn

47% sau 16 giờ

Năm 2009, Goldman ñã nghiên cứu quá trình thủy phân xylan thành ñường xylose bằng enzyme xylanase [31] Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme xylanase từ các chủng nấm mốc khác nhau ảnh hưởng khác nhau ñến

khả năng thuỷ phân xylan Enzyme xylanase sinh ra bởi chủng Aspergillus

niger AN-1.15, sau 5 giờ có 70% saccharide chuyển thành xylan Enzyme

xylanase sinh ra bởi chủng Thermobifida fusca sau 30 phút ở 700C chuyển

hóa ñược 10% xylan Enzyme xylanase sinh ra bởi chủng Trichoderma sp

K930 chỉ có 1,4% saccharide chuyển thành xylan [31]

2.4.3 Ứng dụng của ñường xylose

Xylose là một loại ñường tự nhiên có nhiều ứng dụng trong thực tế Hiện nay, xylose ñã và ñang ñược sử dụng rộng rãi trong nhiều loại sản phẩm khác nhau ở nhiều quốc gia trên thế giới Phạm vi ứng dụng của xylose chủ yếu thuộc về hai lĩnh vực chính là công nghiệp thực phẩm và dược phẩm [13]

2.4.3.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Xylose ñược sử dụng ñể sản xuất bánh kẹo, dùng làm chất phụ gia thực phẩm và là sản phẩm ñược bổ sung vào các loại ñồ uống Nhờ xylose có ñộ ngọt tương ñương với ñường sucrose (Vị ngọt của ñường xylose tương ứng khoảng 67% so với ñường sucrose) và do ñặc ñiểm mất nhiệt khi hoà tan nên tạo cảm giác mát lạnh trong miệng ðặc tính này làm cho xylose rất hấp dẫn trong một số sản phẩm thực phẩm, ñặc biệt là ñồ uống Xylose còn ñược sử dụng làm tăng hương vị trong chế biến một số sản phẩm cao cấp như: trong

chế biến thịt quay, bánh mì… Vì xylose là một nguồn saccharide lý tưởng cho các phản ứng Maillard ñể sản xuất các chất tăng cường hương vị với thời gian phản ứng ngắn hơn so với các ñường 6 cacbon khác [9]

2.4.3.2 Trong lĩnh vực y dược

Không giống như ñường glucose và fructose, ñường xylose là nguồn năng lượng lý tưởng ñể sản xuất nước uống giàu năng lượng không gây cao ñường huyết Xylose bị hấp thu rất ít ở ruột non, ñến ruột già xylose bị hấp thu vào tế bào của vi sinh vật ñường ruột Tại ruột già xảy ra phản ứng lên men lên sinh ra axit hữu cơ khiến pH hạ thấp ức chế nhóm vi khuẩn có hại,

kích thích vi khuẩn có lợi Bifidobacteria phát triển giúp cải thiện hệ tiêu hoá

của con người, giảm huyết áp, lipid và cholesterol trong máu [10]

2.5 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñường xylose trên thế giới và ở Việt Nam

2.5.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñường xylose trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới ñã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu phương pháp sản xuất ñường xylose bằng cách lên men các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật giàu xylan (như thân, lõi ngô, bã mía,…) nhờ vi sinh vật

và bằng phương pháp hóa học Theo thống kê năm 2005 của Frieder W Lichtenthaler, lượng xylose ñược sản xuất hàng năm trên thế giới là 25.000 tấn Con số này so với ñường mía (130.000.000 tấn/ năm) còn rất thấp Xét về mặt hiệu quả kinh tế thì sản xuất ñường xylose mang lại hiệu quả cao hơn rất nhiều so với ñường sucrose (giá ñường xylose cao gấp 15 lần ñường sucrose) ðến năm 2012 ñường xylose ñược bán trên thị trường với giá khoảng 6,2 (Euro/kg), trong khi ñó ñường sucrose có giá khoảng 0,8 (Euro/kg) Lượng sản xuất và giá cả của các loại ñường trên thế giới năm 2005 ñược thể hiện ở bảng 2.11 [4]

Bảng 2.5 Lượng sản xuất và giá cả các loại ñường trên thế giới

(tấn/ năm)

Giá thành (Euro/ kg)

(Theo số liệu thống kê năm 2005)

Sản xuất xylose có thể dùng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền như phế thải nông nghiệp (kể cả phế thải của ngành công nghiệp mía ñường) trong khi giá thành của xylose trên thị trường cao hơn tới 15 lần so với ñường mía Vì vậy

mà trong những năm gần ñây xu hướng sản xuất xylose có chiều hướng tăng

ở nhiều quốc gia trên thế giới

2.5.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñường xylose ở Việt Nam

Hiện nay ở trong nước ñã có một số công trình nghiên cứu sản xuất các loại ñường chức năng như fructooligosaccharides, xylooligosaccharide Việc nghiên cứu và sản xuất ñường xylose vẫn còn là vấn ñề rất mới

Nguyễn Thị Minh Hạnh và cs năm 2008 tiến hành nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại ñường chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm Kết quả của ñề tài tuyển chọn ñược 47 chủng nấm men có khả năng chuyển hóa xyloze thành xylitol từ 23 mẫu ñất và hoa quả Trong ñó có 9 chủng nấm men có hiệu suất chuyển hóa lớn hơn 45%, hiệu suất cao nhất ñạt ñược là 70,1% ðề tài ñã tìm ra nguyên liệu thích hợp cho quá trình sản xuất xylitol từ phế thải nông nghiệp là lõi ngô Tác giả ñưa

ra quy trình sản xuất ñường xylitol với ñộ tinh khiết lớn hơn 98% sau ñó ứng dụng chế phẩm xylitol vào sản xuất kẹo cao su, kẹo cứng, bánh gato và thuốc ñánh răng [1]

Bùi Kim Thúy và cs (2008) khi nghiên cứu công nghệ sản xuất

Fructooligosaccharides (FOS) làm thực phẩm chức năng ñã thu ñược kết quả

như sau: Trong quá trình xử lý nguyên liệu sử dụng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi nước là 1/2, nhiệt ñộ 800C trong thời gian 1 giờ Thủy phân ñường sacaroza thành ñường FOS sử dụng enzyme fructosyltranferaza có nồng ñộ 0,3%; pH=5, thời gian thuỷ phân là 12h ở nhiệt ñộ 500C Tác giả ñã xây dựng ñược quy trình công nghệ sản xuất ñường FOS từ chuối tiêu và tạo ra sản phẩm ñường FOS với ñộ tinh khiết 55,12% [3]

Năm 2009, Nguyễn Tất Thắng và cs bước ñầu tiến hành nghiên cứu công nghệ sản xuất ñường xylose từ lõi ngô Kết quả ñã phân lập, tuyển chọn

ñược 27 chủng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng chuyển hóa xylan thành ñường xylose Trong ñó chủng Aspergillus niger DL1 có khả năng thuỷ

phân xylan tốt nhất Khi ứng dụng chủng nấm này ñể thuỷ phân xylan thành ñường xylose cho hiệu suất thuỷ phân ñạt 70,38% [4]

PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu, hóa chất nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu và ñối tượng nghiên cứu

- ðối tượng: một số chủng nấm mốc ñược tuyển chọn, enzyme xylanase

- Vật liệu: Lõi ngô thu mua tại các hộ gia ñình ở Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc

và Mê Linh, Hà Nội Lõi ngô ñược thu gom, loại bỏ những phần lõi bị hỏng,

mốc và ñem phơi khô Lõi ngô ñược nghiền nhỏ (kích thước khoảng

0,1-0,5mm), ñược bảo quản trong các bao ni lông ở nhiệt ñộ thường

3.1.2 Thiết bị, hóa chất dùng trong nghiên cứu

3.1.2.1 Thiết bị

Tủ lạnh, chiết quang kế, box cấy, máy ño pH, máy ly tâm, máy lắc từ,

máy sắc ký, máy so màu, nồi hấp, thiết bị lọc chân không, máy cô quay

chân không

3.1.2.2 Dụng cụ

Nhiệt kế, bếp ñiện, dụng cụ thủy tinh các loại (ống nghiệm, bình tam

giác, cốc thủy tinh, ống ñong, bình ñịnh mức, phễu thủy tinh, pipet, buret, )

3.1.2.3 Hóa chất

- Ca(OH)2 tinh khiết của Trung Quốc

- ðường xylose chuẩn của ðan Mạch (dạng bột)

- H2SO4 , HCl của Trung Quốc

- Giấy thử pH, phenolphtalein, glycerin của Trung Quốc

- Thuốc thử DNS: 3,5 axit dinitro salicylic, NaOH, Muối K-Na tactrat

kép, phenol (nóng chảy ở 68oC), natri metabi sunfit (Na2S2O5) của Trung Quốc

- Than hoạt tính, ethanol của Việt Nam

- Enzyme xylanase: ðược tách chiết từ một số chủng nấm mốc tuyển chọn

3.1.2.4 Một số môi trường sử dụng trong nghiên cứu

- Môi trường giữ giống (MT1)

- Môi trường nhân giống (MT2)

- Môi trường thử khả năng sinh xylose (MT3)

Dịch thủy phân lõi ngô ñược hấp riêng sau ñó trộn ñều với các thành phần còn lại trong box cấy vô trùng

- Thành phần của khoáng (mg/l)

CaCl2

K2HPO4

KH2PO4 MgSO4 7H2O NaCl

H3BO4

KI MnSO4 4H2O

Na2MoO4 2H2O ZnSO4 7H2O

3.3 Nội dung nghiên cứu:

Nội dung 1: Tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase cao

Nội dung 2: Xác ñịnh một số ñiều kiện (nhiệt ñộ, pH, dinh dưỡng,…) ñể sinh tổng hợp enzyme xylanase ñạt hiệu quả cao

Nội dung 3: Nghiên cứu ñiều kiện tách chiết, thu hồi enzyme xylanase quy mô phòng thí nghiệm

Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH, nhiệt ñộ ñến hoạt lực của enzyme xylanase

Nội dung 5: Nghiên cứu ứng dụng enzyme xylanase ñể thu nhận ñường xylose từ xylan quy mô phòng thí nghiệm

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Sơ ñồ quy trình công nghệ sản xuất enzyme xylanse quy mô phòng thí nghiệm

Bảo quản

Tuyển chọn

Cô ñặc dịch enzyme bằng màng siêu lọc Amicon

Bộ chủng giống VSV ( nấm mốc)

Thuyết minh quy trình

Bước 1 Bộ chủng giống

Nguồn giống ñược lấy từ trong bộ chủng giống VSV của Bộ môn nghiên cứu công nghệ sinh học - Viện Cơ ñiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, phân lập từ nguồn lõi ngô ( ñược thu thập ở Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc

và Mê Linh, Hà Nội

Bước 2 Tuyển chọn

Từ các chủng trong bộ sưu tập và các chủng phân lập tiến hành tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme xylanse, sử dụng môi trường khoáng Czapek – Dox thay nguồn cacbon bằng 1% lõi ngô, thanh trùng ở

1210C, 1 atm trong 20 phút, ñể nguội, bổ sung giống, nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở 300C

Bước 3 Nuôi cấy chủng

Tiến hành nuôi cấy chủng A.niger NVT3 trên môi trường dịch lõi ngô

(2%) , pH = 6,0, nhiệt ñộ 300C, nguồn nitơ = 1%

Bước 4 Cô ñặc dịch enzyme

Sử dụng màng siêu lọc Amicon (PM10) có kích thước lỗ cho phép các phân tử nhỏ dưới 10kDa ñi qua Màng siêu lọc có tác dụng làm enzyme ñược tinh sạch một phần nhưng tác dụng chính là ñể cô ñặc dịch enzyme

Bước 5 Tách chiết bằng sunfat amon 95%

Sau quá trình cô ñặc ta tiến hành tách chiết enzyme xylanse bằng muối sunfat amôn Khi ñưa muối sunfat amôn vào dung dịch chiết enzyme thì làm