bước đầu tìm hiểu vai trò của vi khuẩn trong hiện tượng chết hàng loạt của ấu trùng cua biển (scylla spp) giai đoạn zoea3 – zoea5 trong các trại sản xuất giống tại nha trang, khánh hoà

Nguồn cua giống có được chủ yếu là do khai thác từ tự nhiên, nguồn cua giốâng có được trong việc sản xuất nhân tạo vẫn còn rất hạn chế vì tỷ lệ sống của ấu trùng cua trong các đợt ương n

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

Nuôi trồng Thuỷ sản (NTTS) đã và đang là nghành kinh tế mũi nhọn góp phần không nhỏ vào sự tăng trưởng kinh tế của Việt Nam Với diện tích nuôi trồng rộng lớn cùng với thời tiết, khí hậu thuận lợi nên nuôi trồng thuỷ sản nước ta phát triển khá mạnh với nhiều hình thức nuôi và nhiều đối tượng nuôi

Vùng ven biển nước ta trước nay thường nuôi đối tượng có giá trị kinh tế lớn là tôm, nhưng với tình hình khó khăn của tôm như hiện nay thì người nuôi đã chuyển hướng sang nuôi cua biển Cua biển là một trong những loài có giá trị kinh tế cao và là loại thực phẩm đươc ưa chuộng trên thị trường trong và ngoài nước vì vậy nên có giá trị xuất khẩu rất cao

Hiện nay nghề nuôi cua ở nước ta đang phát triển mạnh ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, các tỉnh và thành phố như Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Thái Bình, Huế, Phú Yên, Khánh Hoà… Hình thức nuôi chủ yếu chỉ dừng lại ở nuôi quảng canh hoặc quảng canh cải tiến Tuy nhiên người nuôi cũng gặp rất nhiều khó khăn về con giống cũng như sự hao hụt nhiều trong quá trình nuôi Nguồn cua giống có được chủ yếu là do khai thác từ tự nhiên, nguồn cua giốâng có được trong việc sản xuất nhân tạo vẫn còn rất hạn chế vì tỷ lệ sống của ấu trùng cua trong các đợt ương nuôi ấu trùng là rất thấp

Việc sản xuất giống cua biển thành công và việc phát triển rộng rãi nghề sản xuất cua giống nhân tạo trên toàn quốc hiện nay là một thành tựu lớn góp phần phát triển đa dạng nghề nuôi thuỷ sản ở Việt Nam Tuy nhiên, cần có những nghiên cứu tiếp theo nhằm hoàn thiện quy trình sản xuất nhân tạo giống cua biển Có nhiều nguyên nhân khiến cho tỷ lệ sống đến cua giống còn thấp, trong đó nguyên nhân quan trọng là tỷ lệ chết cao ở giai đoạn Zoea3 – Zoea5 Theo một số tác giả ấu

trùng Zoea3 – Zoea5 chết đã phân lập được nhiều chủng vi khuẩn nhưng chưa xác lập được mối quan hệ Sự hoạt động của vi khuẩn đã ảnh hưởng tới ấu trùng cua khiến ấu trùng cua chết hàng loạt Như vậy vai trò của vi khuẩn đến hiện tượng chết

hàng loạt ở các giai đoạn phát triển của ấu trùng cua biển từ Zoea3 – Zoea5 trong các trại sản xuất giống hiện nay như thế nào? Xuất phát từ các yêu cầu thực tế và các lý do trên, khoa Nuôi trồng thuỷ sản trường Đại học Thuỷ sản cùng với sự giúp đỡ của phòng Bệnh thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản III tôi đã được thực hiện đề tài:

“Bước đầu tìm hiểu vai trò của vi khuẩn trong hiện tượng chết hàng loạt của ấu

trùngcua biển (Scylla spp) giai đoạn Zoea3 – Zoea5 trong các trại sản xuất giống tại

Nha Trang, Khánh Hoà.”

* Đề tài thực hiện với các nội dung sau:

• Điều tra tình hình bệnh ở ấu trùng trong các trại sản xuất cua giống tại Nha Trang _ Khánh Hoà

• Xác định thành phần loài vi sinh vật phân lập từ ấu trùng cua giai đoạn Zoea3 – Zoea5

• Xác định khả năng gây bệnh của cá loài vi khuẩn phân lập được từ ấu trùng cua (Zoea3 – Zoea5) với tần số phân lập cao trong quá trình nghiên cứu

Do khối lượng thông tin, thời gian và khả năng nghiên cứu cùng với trang thiết bị, cơ sở vật chất còn hạn chế nên đề tài này không tránh khỏi những khuyếm khuyết Tôi rất mong được sự góp ý của quý thầy cô cùng các bạn sinh viên để đề tài này hoàn thiện hơn

Nha Trang, tháng 11 năm 2005 Sinh viên thực hiện

Bùi Thị Hiên

PHẦN 2: TỔNG LUẬN

2.1.Vài nét về đối tượng nghiên cứu

Hệ thống phân loại của cua biển

Tên tiếng Anh : Blue crab, Mud crab, Mangrove crab…

Tên tiếng Việt : Cua xanh, cua bùn, cua biển

2.1.1 Đặc điểm hình thái:

Cua Xanh (còn gọi là cua biển) có kích thước tương đối lớn có thể đạt khối lượng 2kg cua có màu xanh lục hoặc mầu vàng sẫm, mặt bụng thường có màu sáng hơn mặt lưng Cơ thể dẹp theo hướng lưng bụng và chia thành hai phần: phần đầu ngực lớn nằm trong giáp đầu ngực (mai cua), phần bụng nhỏ và gập lại dưới giáp đầu ngực (yếm cua) (Hoàng Đức Đạt 1995)

Hình 1: Hình thái bên ngoài của cua

Scylla serrata

S paramamosain

S olivacea

S tranquebarica

1 - Anten I 3 - Mắt 5 - Chân bò 7 – Bụng ( yếm)

2 - Anten II 4 - Càng 6 - Chân bơi 8 – Vùng dạ dày

9 - vùng gan tụy 10 - Vùng tim 11 - Vùng mang 12 - vùng tuyến sinh dục

- Giai đoạn cua con: Sống ẩn trong các vật nằm ở đáy, bắt mồi tích cực ăn động thực vật thủy sinh nhỏ, thức ăn chế biến Cua lột xác nhiều lần để sinh trưởng và phát triển

- Giai đoạn trưởng thành: Cua sống trong hang đất ăn thức ăn chế biến và thức ăn tươi sống Cua có tập tính trú ẩn vào ban đêm, di cư vào vùng nước mặn ven biển để sinh sản

Từ ấu trùng đến cua trưởng thành phải trải qua nhiều lần lột xác, cua vừa sinh trưởng vừa biến thái thay đổi về kích thước, hình thái cấu tạo để đạt được hình dạng và cấu tạo thực thụ.(Hoàng Đức Đạt, 1995)

• Điều kiện sinh thái của cua biển

Cua sống ở vùng nước lợ có pH từ 7,5 – 9,2 Thích hợp nhất từ 7,5 – 8,2 Tuy nhiên cua có thể chịu đựng được pH thấp hơn 6,5

- Cua có thể thích ứng cao với sự thay đổi độ mặn của nước Độ măn thích hợp nhất từ 28-30ppt

- Nhiệt độ thích hợp nhất là từ 25-290C Nhiệt độ cao có ảnh hưởng xấu đến hoạt động sinh lý của cua và là một trong những nguyên nhân gây chết cua

- Cua thích sống ở những nơi có nhiều thực vật thủy sinh, có bờ để đào hang trú ẩn Rừng ngập mặn ven biển là nơi thích hợp cho cua sinh trưởng và phát triển

• Tập tính hoạt động

- Tập tính đào hang: Cua thường đào hang làm nơi trú ẩn, cua đào hang rất giỏi có hang dài đến 1m, có thể xuyên qua bờ ao (đây là một trong những nguyên nhân gây hao hụt cua trong quá trình nuôi )

- Bò qua bờ, rào cản: Cua có thể bò trên cạn, qua rào chắn để thoát khỏi ao, đầm nhất là thời kỳ thành thục

- Tính hung dữ và khả năng tự vệ: Tính hung dữ có từ ấu trùng Megalope đến cua trưởng thành Khi đói, thiếu thức ăn chúng có thể ăn lẫn nhau Con khỏe tấn công con yếu, con mới lột xác Bộ phận phần phụ bị mất đi của cua có thể được tái sinh sau lần lột xác mới

- Hoạt động bắt mồi: Cua là loài ăn thịt và thường kiếm ăn vào ban đêm, cua bắt tích cực nhưng cũng có thể nhịn đói nhiều ngày trong điều kiện bất lợi

• Đặc điểm sinh sản

- Kích thước thành thục: Hầu như toàn bộ những cá thể có chiều rộng giáp đầu ngực ≥ 10cm, tương ứng với trọng lượng trung bình toàn thân ≥276g đều thành thục và có khả năng tham gia sinh sản (Nguyễn Cơ Thạch, 1998)

- Mùa vụ sinh sản: Cua xanh có thể đẻ trứng quanh năm tuy nhiên mùa vụ sinh sản chính tập chung từ tháng 2 đến tháng 3 và từ tháng 7 đến tháng 8 trong năm (Nguyễn Cơ Thạch, 1998)

- Di cư sinh sản: Cua có tập tính di cư ra vùng biển có độ mặn cao 30 – 35ppt, để giao vĩ đẻ trứng, ấp nở ấu trùng

2.2 Sơ lược về tình hình sản xuất giống cua biển nhân tạo:

2.2.1 Tình hình sản xuất cua giống trên thế giới

Trên thế giới đã có những công trình nghiên cứu về: vòng đời, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, kỹ thuật sinh sản nhân tạo, sự tác động của các yếu tố môi trường như: nhiệt độ, độ mặn…đến sinh trưởng và phát triển của cua xanh

Từ những kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học sinh sản nhiều tác giả đã thử nghiệm cho cua xanh đẻ và ương nuôi ấu trùng trong điều kiện nhân tạo Năm

1974 Brick đã thử nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng của chất lượng nước, thuốc kháng

sinh, phytoplankton và thức ăn đến tỷ lệ sống của ấu trùng cua xanh Scylla cerrata

(Forskal) và thu được kết quả là: ấu trùng cua xanh đã được nuôi thành công khi sử dụng phối hợp giữa thuốc kháng sinh – Phytoplankton – Nauphius của Artermia Tảo chlorella có tác dụng làm tăng tỷ lệ sống của ấu trùng Zoae, Nauplius của Artemia được coi là thức ăn thích hợp nhất, lọc nước và khử nước bằng tia cực tím không làm thay đổi tỷ lệ sống của ấu trùng Nhiệt độ nước từ 260C – 300C, độ mặn 25 –30ppt và pH từ 7,0 – 8,5 được coi là những điều kiện thích hợp để ương ấu trùng cua xanh (Cheng; Teng 1980)

Năm 1983 Heasman và Fielder đã thử nghiệm cho đẻ ở phòng thí nghiệm và nuôi đại trà cua xanh từ giai đoạn Zoae đến cua bột, tác giả cho rằng: cần duy trì chất lượng nước bằng hệ thống lọc nước tuần hoàn, các điều kiện nhiệt độ nước

270C, độ mặn 28 – 30ppt, mật độ thức ăn (Nauplius của Artemia) từ 5 – 30 con/lít được coi là các điều kiện thích hợp cho quá trình ương nuôi ấu trùng Với các điều kiện như trên thời gian chuyển từ Zoae đến cua bột là 30 ngày, tỷ lệ sống ở giai đoạn Zoae là 1- 4%

Các nhà khoa học Đài Loan ương nuôi ấu trùng cua đạt tỷ lệ sống 60% do sử dụng kháng sinh, bổ sung thức ăn bằng ấu trùng veliger của nhuyễn thểå, copepoda, rotifer (Cowan Lynda,1984)

2.2.2.Tình hình sản xuất cua giống tại Việt Nam

Những năm gần đây nghề nuôi tôm gặp phải nhiều khó khăn như dịch bệnh, giá cả thị trường bấp bênh… người nuôi tôm có hướng chuyển dần sang nuôi cua hoặc xen canh một vụ tôm một vụ cua Mô hình nuôi một vụ cua và một vụ tôm sú được ứng dụng rộng rãi, và đã đem lại hiệu quả kinh tế cao, phần nào hạn chế dịch bệnh tôm Song do nhu cầu phát triển nghề nuôi cua đã nẩy sinh khó khăn lớn là giải quyết nguồn cua giống Nguồn cua giống chủ yếu là do khai thác ngoài tự

nhiên, nếu chúng ta tiếp tục khai thác nguồn cua giống tự nhiên thì có thể ảnh hưởng đến nguồn lợi cua tự nhiên

Để giải quyết vấn đề cua giống, Bộ Khoa Học Công Nghệ - Môi trường và Bộ Thủy sản đã quan tâm và giao nhiệm vụ cho các viện nghiên cứu triển khai thực hiện từ năm 1980

Trong những năm 1980, Nguyễn Văn Chung tập trung nghiên cứu định loại loài và một số đặc điểm sinh học làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này Trong những năm 1990, Hoàng Đức Đạt, Đoàn Văn Đẩu và Nguyễn Cơ Thạch đã nghiên cứu các đặc điểm sinh học và sản xuất giống nhằm xây dựng quy trình sản xuất cua giống nhân tạo, song kết quả vẫn còn nhiều hạn chế Từ năm 1998, Bộ KHCN –

MT đã giao cho trung tâm NCTS III nay là Viện NCTS III thực hiện đề tài “Nghiên cứu sinh sản nhân tạo và xây dựng quy trình kỹ thuật sản xuất giống cua xanh

Scylla paramamosain” Kết quả nghiên cứu của đề tài này được ứng dụng vào sản

xuất, nhằm tạo ra nhiều con giống để phát triển nghề nuôi cua trong cả nước

Năm 2003, Nguyễn Cơ Thạch đã công bố quy trình sản xuất cua giống loài

S.paramamosain Estampado (1949) Công nghệ sản xuất giống nhân tạo cua xanh

đã được chuyển giao tới các trung tâm khuyến ngư của nhiều địa phương: Nam Định, Ninh Bình, Hải Dương, Khánh Hoà, Cà Mau… và bắt đầu lan rộng, phát triển rộng khắp trên cả nước Người dân bắt đầu làm quen và sản xuất đối tượng mới này Tuy nhiên trong quá trình sản xuất gặp không ít khó khăn đặc biệt là tình hình dịch bệnh xẩy ra đã làm cho tỷ lệ sống của ấu trùng thấp, ảnh hưởng không nhỏ tới hiệu quả sản xuất Một vấn đề đặt ra là phải nghiên cứu để tìm ra biện pháp phòng và trị bệnh cho ấu trùng cua từ đó sẽ nâng cao được tỷ lệ sống của ấu trùng cũng như tăng hiệu quả sản xuất

2.3 Tình hình nghiên cứu bệnh cua

2.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cua trên thế giới

Bảng 1: Danh mục các bệnh trên cua xanh (Sindermann 1983)

Tác nhân gây

bệnh

cảm nhiễm

Có thể gây chết trong 3 ngày Vịnh Chincoteague

Chesapeake

Johnson & Bodammese

Có thể gây chết hàng loạt

Dương Mê-Hi-Cô

Jharomi,

1977 Hình 2: Các giai đoạn phát triển của ấu trùng cua xanh (Scylla spp)

Vịnh Chesapeake Johnson, 1983

Herpes-like virus

(HLV) Tế bào máu Tỷ lệ cảm nhiễm rất cao, gây chết

trong 1-2 tháng

Vịnh Chincoteague Asswoman

Johnson,

1983

2 Vi khuẩn

Vibrio

parahemolyticus Hệ bạch huyết Gây chết cao ở giai đoạn lột xác

trong thời gian ngắn

Vịnh

Các loài vi khuẩn Hệ bạch

huyết Nhiễm cao Vịnh Chesapeake Colwell 1975

bạch huyết

Nhiễm cao, gây chết trong khoảng

perezi Hệ bạch huyết Nhiễm cao, ở giai đoạn tiền trưởng

thành có thể gây chết 100%

Dương Mê- hi- cô

Newman & Johnson,

Mê-hi-cô

Overstret, 1978;

• Bệnh do virus:

Virus là tác nhân vô cùng nguy hiểm, khi cua bị nhiễm virus tuỳ từng loài virus mà thời gian phát hiện bệnh dài hay ngắn có thể từ 3 ngày cho đến 3 tháng Cua chết hàng loạt khi bệnh xảy ra Theo các nghiên cứu ở nước ngoài thì có 8 loại virus gây bệnh cho cho cua Trong 8 loại virus được tìm thấy ở cua xanh có 4 loài được biết như là nguyên nhân gây nên dịch bệnh ở vịnh Chesapeake và Chincoteague (Johnson, 1983)

Picorna-like virus (CBV) khi nhiễm ở cua với số lượng lớn làm cho cua bị tress và chết, biểu hiện ra bên ngoài như chân run nhẹ, tê liệt hoặc bị mù, vận động không bình thường Bệnh phát triển chậm cua nhiễm bệnh có thể chết sau 2 tuần đến 2 tháng

Reolike virus (RLV) có kích thước vô cùng nhỏ, vòng đời rất ngắn và có thể gây bệnh cấp, thí nghiệm cho thấy cua bị nhiễm sẽ bị chết trong vòng 3 ngày (Johnson và Bodanmser 1975) Virus này tác động lên hệ thần kinh, làm giảm chức năng của hệ miễn dịch làm cua hoạt động kém và hệ bạch huyết bị phá huỷ Bệnh này trong tự nhiên không kiểm tra được nhưng sự lây nhiễm trong thời gian dài của RLV sẽ là một sự quan tâm lớn và quan trọng của nghề nuôi cua công nghiệp (Johnson, 1983)

Herpeslike virus (HLV), virus này thuộc giống Baculavirus dạng không có thể ẩn nhiễm vào hệ thống sinh dục, phá huỷ biểu mô và cơ quan cảm giác xâm nhập vào tế bào máu và gây chết trong vòng 1-2 tháng (Anderson and Prior 1992)

• Bệnh do vi khuẩn

Vi khuẩn là một trong những tác nhân gây hại rất lớn đến cua nuôi cũng như các loại động vật thủy sản khác Vi khuẩn có thể là tác nhân trực tiếp hoặc gián tiếp làm cho đối tượng nuôi bị chết Bệnh do vi khuẩn là nhóm đối tượng phổ biến đối với nuôi trồng, làm ảnh hưởng tới năng suất cũng như sản lượng nuôi Bệnh do vi khuẩn phổ biến ở các loài giáp xác là sự bào mòn vỏ kitin, phá hủy vỏ kitin (Benton 1935; Zoobell & Kittenberg 1938, Hock 1940, 1941; Hood & Meyrs 1974) Nhiều

nghiên cứu đã xác định được hơn 30 loài vi khuẩn là tác nhân gây bệnh hoại tử lớp vỏ kitin của nhiều loài giáp xác, trong đó có cua

Theo Kantz (1969) vi khuẩn có tác hại lớn nhất cho cua và thường gây nên dịch bệnh cho cua là vi khuẩn Vibrio, chúng thường nhiễm vào máu vật chủ dẫn đến tỷ lệ hao hụt từ 50 ÷70% có khi lên tới 100% Vibrio parahaemolyticus tác dụng lên máu và tế bào thần kinh của cua và gây chết chỉ trong 72h Theo tác giả thì Vibrio parahaemolyticus là tác nhân chính gây bệnh hoại tử và thối mai ở cua Vibrio là

chủng vi khuẩn có khả năng tiết ra các men Kitinase, Lipase, Protease gây hiện tượng ăn mòn, hoại tử Khi lớp vỏ cứng bị ăn mòn mở đường cho vi khuẩn, tác nhân

khác xâm nhập và gây bệnh cho cua Vibrio có mặt ở khắp mọi nơi trong môi trường

biển và một vài loài động vật không xương sống bị nhiễm bởi mầm bệnh hoặc bị

truyền nhiễm từ các động vật khác Vibrio parahemolyticus được tìm thấy khi bùng

nổ dịch bệnh trong khi cua mới lột xác là điều kiện thuận lợi để mầm bệnh xâm nhập khi vỏ cua còn mềm và gây chết cua Mầm bệnh vi khuẩn xâm nhập vào máu qua những chỗ bị tổn thương ở lớp vỏ kitin của cua và sinh sản trong môi trường giàu dinh dưỡng như máu cua

Johnson (1974), Nilson cùng ctv (1975), và Fisher (1976) mô tả loại bệnh khác có tên là bệnh “đóng rong” ở cua và nhiều loài giáp xác khác nguyên nhân là tập hợp quần thể gồm vi khuẩn có dạng sợi và không có dạng sợi cùng với Lighner (1977) khi nghiên cứu bệnh này khẳng định thêm rằng tác nhân chính gây bệnh

“đóng rong” là vi khuẩn dạng sợi Leucothrixmurco còn các tác nhân khác chỉ là loài

cơ hội

Trong 50% mẫu cua nuôi thu vào mùa hè khi phân tích mẫu cua đã tìm thấy

Vibrio parahaemolyticus chiếm 30% mẫu nghiên cứu, V vulnificus chiếm 9,5%, V cholerae chiếm 3,5% nhiễm ở trong máu của cua xanh V parahaemolyticus và V vulnificus thường phân lập được từ cùng một mẫu cua, còn V parahaemolyticus và V.cholerae không khi nào thấy trong cùng mẫu cua V parahaemolyticus là nguyên

nhân gây chết ở cua và khi con người ăn phải cua nhiễm bệnh có thể bị ngộ độc thức ăn (Overstreet 1978)

Vài loài Vibrio cũng được phân lập từ cua xanh, David và Sizmore (1982) đã

phân loại được các loài V cholerae, V vulnificus, và V parahaemolyticus từ cua

xanh thu từ vịnh Galveston, Texas

Bower (1996) thông báo rằng bệnh ăn mòn vỏ kitin ở giáp xác là do một số giống loài vi khuẩn có khả năng tiết ra các men phân hủy như chitinase, protease, lipase Các vi khuẩn này có thể thuộc giống Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas…

• Bệnh do nấm

Một số loài nấm đã được tìm thấy trên cua biển Nấm gây tác hại khác nhau

ở các giai đoạn khác nhau của cua biển Trứng và ấu trùng chịu ảnh hưởng nặng của nấm

Johnson (1983) đã tìm thấy giống nấm Fusarium trên loài cua xanh nuôi thương phẩm ở Mỹ

Hatai (2000), đã phân lập từ trứng, ấu trùng cua Scylla serata ở Indonesia một số loài nấm bậc thấp: Lagenidium callinectes và Haliacrusida baliensis

• Bệnh do ký sinh trùng

Có một số ký sinh trùng đã được tìm thấy ở cua như: Giun tròn Nectonema spp, làm vật chủ rối loạn chức năng sinh lý thoái hóa tuyến sinh dục; Bào tử nhỏ

(Microsporidia) ở trong cơ, gan tụy , tuyến sinh dục; Trùng roi Hematodinium ký sinh trên máu; Trùng loa kèn (Zoothamnium) ký sinh trên mang cua trưởng thành và trên toàn bộ cơ thể ấu trùng cua

Newman and Johnson, 1975; Couch,1983 và Messick, 1994 cho rằng

Hematodinium perezi là một loài trùng roi ký sinh rất ít khi gặp nhưng cũng có thể xảy ra dịch bệnh trên cua Hematodinium perezi sống trong máu và tăng số lượng rất

nhanh.Trong suốt thời gian dịch bệnh thì cua lột xác chết tới 70% còn cua bình thường chết 50% Dịch bệnh thường bùng phát vào mùa hè và mùa thu Khi cua bị

nhiễm bệnh ký sinh trùng này cua trở nên lờ đờ, ở cua bị nhiễm nặng máu có màu trắng sữa

Bower (2003) cũng báo cáo loại bệnh ký sinh trùng do Hematodinium perezi và Hematodinium sp gây bệnh trong máu cua Có rất nhiều loài cua cũng như giáp

xác khác bị nhiễm bởi ký sinh trùng này

2.3.2 Tình hình nghiên cứu bệnh cua ở Việt Nam

Hiện nay ở Việt Nam chưa có một công trình nghiên cứu nào về bệnh cua được công bố chính thức

Theo Hoàng Đức Đạt (1995) thì những biến đổi bất lợi của môi trường nước như: nhiệt độ nước, lượng oxy hòa tan, pH, các yếu tố hóa học như kim loại nặng, biến đổi qua giới hạn, đều là tác nhân gây bệnh cho cua Kỹ thuật nuôi không phù hợp, mật độ quá cao, chăm sóc quản lý kém, vận chuyển lâu và xa làm cua yếu, không thay nước làm nước bị nhiễm bẩn, có thể làm cua bị bệnh và chết Trong những năm gần đây cua nuôi trong các ao đất với mật độ cao đã xuất hiện một số loại bệnh: trên mai cua có nhiều đốm trắng, hoặc xám, đỏ, đường kính khoảng 0,2 – 0,3 cm Bệnh phát triển làm cho cả phần vỏ lẫn phần thịt bị ung thối, bệnh lây lan nhanh và cua chết hàng loạt

2.4 Những nghiên cứu về bệnh trên ấu trùng cua xanh

* Theo Pitogo và Delapena (2004) thì trên ấu trùng cua thường gặp một số các bệnh như sau:

- Bệnh do vi khuẩn phát sáng nhóm Vibrio Do nhiễm vi khuẩn Vibrio phát

sáng, thường gặp Vibrio harvey, ảnh hưởng tới trứng và ấu trùng cua, khi nhiễm

nặng tỷ lệ chết có thể lên tới 100%

- Bệnh do vi khuẩn dạng sợi Chúng phân bố rộng rãi trong môi trường nước và chúng tấn công vào vỏ trứng, và các giai đoạn khác nhau của ấu trùng cua Sự có mặt của vi khuẩn dạng sợi là dấu hiệu của sự giảm sút chất lượng nước hay sức khoẻ của động vật Số ngày của mỗi giai đoạn một phần quyết định để phát hiện ra những sinh vật gây đóng cáu trên ấu trùng, giai đoạn phát triển của ấu trùng kéo dài hơn

bình thường thì sự đóng cáu sẽ tăng theo Sự đóng cáu tăng làm ảnh hưởng đến sự ấp nở trứng Vi khuẩn dạng sợi làm cản trở quá trình hô hấp khi chúng bám trong mang cua và một số vùng khác trên bề mặt, nó còn làm cho ấu trùng bơi khó khăn hơn Những đám sợi là nơi cư trú của các tác nhân gây bệnh là vi trùng và thực vật hoại sinh (nấm) Nhiều cáu bẩn bám góp phần khó khăn trong quá trình lột xác

- Bệnh vỏ: Bệnh vỏ được đặc trưng bởi sự ăn mòn của lớp vỏ bên ngoài có liên quan đến hoạt động của vi khuẩn Tỷ lệ ăn mòn trên vỏ cua càng lớn gây tác hại càng lớn Bệnh vỏ làm cho chuỳ có thể bị ngắn đi do mô bị ăn mòn, có một số trường hợp ấu trùng bị mất luôn cả phần phụ Khi lột xác những phần bị ăn mòn ban đầu cùng với lớp vỏ cũ được loại bỏ

- Bệnh do nấm bao gồm tác nhân: Lagenidium; Halocrusticida và Haliphthros Nấm thường có mặt ở khắp mọi nơi trong nguồn nước, chúng rất rộng muối Do bởi toàn bộ lượng trứng phải ngâm và tiếp xúc trực tiếp trong môi trường nước trong quá trình đẻ trứng và ấp trứng với thời gian rất dài, trứng ít được bảo vệ và dễ bị tấn công bởi các tác nhân gây bệnh có nguồn gốc từ môi trường nuôi cua mẹ Bệnh do nấm ở trứng trong thời kỳ ấp và ấu trùng cua biển là một trong những bệnh rất nguy hiểm, trong nhiều trường hợp có thể phá huỷ toàn bộ số lượng trứng và cả bể hoặc cả đợt sản xuất Trứng bị nhiễm nấm với số lượng lớn có thể đưa bào tử nấm vào môi trường ương nuôi làm ấu trùng sau này có thể bị nhiễm bệnh Đối với ấu trùng thì hầu hết ấu trùng bị nhiễm nấm đều bị chết Các giai đoạn đầu của ấu trùng dễ bị nhiễm nấm do bởi vỏ ấu trùng còn non và còn mỏng Khả năng điều trị của bệnh này hầu hết không có hiệu quả, chất lượng của những ấu trùng còn sống sót rất thấp

- Bệnh do chất huyền phù: Chất huyền phù bao gồm những xác chết của vi khuẩn hoặc vi trùng và các chất phù dơ bẩn trong môi trườngnước, hoặc các chất lắng đọng dưới đáy bể Chất huyền phù bám lên trứng của cua và ấu trùng cua Sự tích tụ của các chất cặn bã lên trứng có thể là nguyên nhân dẫn đến việc ấp nở trứng

bị hư Chúng tích tụ trên mang gây ảnh hưởng đến qúa trình hô hấp và chúng có thể

sẽ chết bởi sự làm ngạt Sự có mặt của chất cặn bã có thể là nguyên nhân phát sinh mầm bệnh tiềm ẩn trong môi trường ương nuôi Chất huyền phù còn làm cản trở tới quá trình lột xác của ấu trùng

- Bệnh lôït xác không hoàn toàn Sự lột xác không hoàn toàn là một bệnh không lây lan giữa các bể ương nuôi ấu trùng mà có thể do nguyên nhân là sự thay đổi nhiệt độ ở mức thấp Sự lột xác không đều của lớp vỏ bên ngoài là nguyên nhân của việc bơi không bình thường và làm tổn thương đến ấu trùng đồng thời chúng rất dễ bị ăn thịt Sự lột xác không hoàn toàn cũng có thể là nguyên nhân gây chết cho ấu trùng

- Bệnh do sinh vật đơn bào kí sinh Do Zoothamnium, Acineta và một vài đối tượng khác Chúng phân bố rất rộng ở biển và môi trường nước mặn, lợ và chúng có thể phát triển phủ kín bề mặt vật bám Chúng làm cản trở quá trình trao đổi khí trên bề mặt của trứng và ấu trùng, còn làm cho quá trình ấp kéo dài, nhiều sinh vật khác nhau gắn trên bề mặt trứng Khi mà nhiễm nặng trên các phần phụ thì làm cho ấutrùng rất khó bơi lội Sự lột xác đã loại bỏ hầu hết các sinh vật bám ngoài vỏ Quá trình lột xác chậm sẽ là cơ hội để sinh vật phát triển ở lớp vỏ

- Bệnh do sinh vật hoại sinh và giun tròn Các sinh vật đơn bào sống tự do

trong nước như Euphlotes sp và thường những loài giun tròn hoại sinh sống hầu hết

ở trứng của cua Sự di chuyển của sinh vật đơn bào và giun tròn bên trong trứng có thể là lý do dẫn đến hư hỏng tới việc ấp nở trứng Dù giun tròn là động vật ăn thịt và xuất hiện tương đối cao trong vỏ bọc của cua, nói chung chúng đều có thể gây hạn chế bằng cách sinh sản với mức độ cao với số lượng lớn Sự có mặt của sinh vật đơn bào và giun tròn ở trứng, ấu trùng cho biết sự giảm sút về chất lượng nước đồng thời tích luỹ các hợp chất hữu cơ Đúng hơn là sự tự tạo lên đóng cáu, chất lượng nước kém có thể làm tổn hại cho ấu trùng

* Theo Hoàng Đức Đạt (1995), trên ấu trùng cua thường gặp hai loại bệnh sau:

- Ấu trùng thường bị bệnh trùng loa kèn: Zoothamium, Epistylis… bám vào thân, trên đầu Khi số lượng Zoothamium tăng lên làm cho ấu trùng không co duỗi thân được, bơi chậm chạp không bắt được thức ăn yếu dần và chết

- Bệnh phát sáng do Vibrio parahaemolyticus, trong giai đoạn ấu trùng Zoea

ương trong bể, nguồn nước nhiễm khuẩn dẫn đến gây bệnh cho ấu trùng Khi ấu trùng mắc bệnh, trong bóng tối phát ra ánh sáng màu xanh nhạt Ấu trùng yếu, bỏ ăn, lắng xuống đáy, chết, có thể chết hàng loạt

Trên đây ta thấy được ấu trùng cua xanh bị nhiễm rất nhiều bệnh, nhìn chung là ấu trùng cua khi đã mắc bệnh thường khó khắc phục kết quả làm ấu trùng chết từ rải rác đến hàng loạt Đặc biệt là các bệnh do vi khuẩn gây ra thì rất nguy hiểm cho ấu trùng, khi nhiễm nặng thì tỷ lệ chết có thể lên tới 100%

PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Ấu trùng cua xanh (Scylla spp) thu từ các trại sản

xuất cua giống tại Nha Trang

Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 09/08/2005 đến ngày 30/11/2005

Địa điểm nghiên cứu: Công tác điều tra là phỏng vấn trực tiếp hộ sản xuất

cua giống tại Nha Trang

Phân tích mẫu tại phòng Bệnh thuộc Viện Nghiên cứu Thuỷ sản III

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Điều tra hiện trạng bệnh ấu trùng

cua Mẫu bệnh phẩm ấu trùng cua (Zoea3 – Zoea5)

Mùa vụ xuất hiện bệnh

Mức độ thiệt hại của bệnh

Dấu hiệu bệnh lý

Phân lập vi khuẩn

Thí nghiệm gây nhiễm trở lại

Các biện pháp phòng trị bệnh

Xác định tác nhân gây bệnh

ĐÁNH GIÁ, NHẬN XÉT VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN

Định danh

vi khuẩn

3.2.1 Phương pháp điều tra hiện trạng bệnh ở ấu trùng trong các trại sản xuất cua giống tại Nha Trang, Khánh Hoà

- Số liệu thứ cấp: Thông qua các báo cáo tổng kết ngành Thuỷ sản địa phương và các cơ quan có liên quan

- Số liệu sơ cấp: Phỏng vấn trực tiếp các cán bộ kỹ thuật của trại theo mẫu phiếu điều tra

3.2.2 Phương pháp thu thập, xử lý và phân tích mẫu bệnh phẩm

* Phương pháp thu mẫu:

Mẫu thu từ những bể ấu trùng Zoea3 – Zoea5 có dấu hiệu bệnh như là yếu, bỏ ăn, lắng đáy và chết nhiều Mẫu ấu trùng thu là còn sống và được vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm nơi tiến hành phân tích mẫu

* Phương pháp xử lý mẫu:

Mẫu thu được ghi rõ về dấu hiệu bệnh lý, tình trạng sức khoẻ cũng như tỷ lệ chết của mẫu

Mẫu được kiểm tra nhanh bằng phương pháp soi tươi trên kính hiển vi

Mẫu ấu trùng cua được đưa vào ống nghiệm thuỷ tinh, rồi được rửa qua nước muối 2% NaCl vô trùng 2 lần, nghiền nát mẫu bằng đũa thuỷ tinh đã tiệt trùng

3.2.3 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn

a/ Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh:

* Các loại môi trường phân lập vi khuẩn gây bệnh ở ấu trùng cua

+ Môi trường tổng hợp:

- Môi trường Trypticase Soya Agar (TSA) + 2% NaCl

- Môi trường Trypticase Soya Broth (TSB) +2% NaCl

- Môi trường Nutrient Agar (NA) +2% NaCl

+ Môi trường chọn lọc:

- Môi trường Thiosulphate Citrate Bilesalt Sucrose Agar (TCBS) Đây là môi trường đặc thù, chọn lọc của vi khuẩn Vibrio

Mẫu ấu trùng cua bệnh Zoea3 – Zoea5

Phân lập trên môi

Nuôi cấy thuần chủng

Thực hiện các phản ứng sinh hoá Nhuộm Gram

Định danh vi khuẩn

Gây nhiễm trở lại ấu trùng cua khoẻXác định tác

nhân gây bệnh

- Môi trường Cytophage Aga (CA) là môi trường đặc thù của vi khuẩn Pseudomonas + 2% NaCl

+ Môi trường tăng sinh: Môi trường Peptone + 2% NaCl

+ Môi trường nuôi cấy thuần chủng: Môi trường NA

b/ Phương pháp định danh vi khuẩn

Từ các kết quả có được từ việc thực hiện các phản ứng sinh hóa, vi khuẩn sẽ được xác định dựa vào một số tài liệu sau

- “Hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey” (1994)

- “ Đặc điểm của một số vi khuẩn Vibrio” Nguyễn Lân Dũng

3.2.4 Thí nghiệm gây cảm nhiễm

a/ Ấu trùng đem cảm nhiễm

Ấu trùng cua khoẻ mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý

Thí nghiệm có lô đối chứng, cũng nuôi ấu trùng như các lô thí nghiệm khác nhưng không cảm nhiễm vi khuẩn

Chủng vi khuẩn đem cảm nhiễm được nuôi cấy trên môi trường TSA trước 24h Chủng đem cảm nhiễm là những chủng vi khuẩn có tần số bắt gặp cao trong các lần thí nghiệm

Mật độ vi khuẩn được xác định bằng phương pháp so độ đục chuẩn của Mc Farland

Số lượng ấu trùng đưa vào cảm nhiễm: 100 con/lô/1 lít

b/ Sơ đồ thí nghiệm:

- Sau khi chuẩn bị xong mô hình thí nghiệm, lấy một số khuẩn lạc của vi khuẩn cần nghiên cứu cho vào một ống nghiệm chứa NaCl 2% vô trùng, lắc nhiều lần cho vi khuẩn phân tán đều trong nước Sau đó so độ đục của dung dịch huyền phù này với ống có độ đục chuẩn của Mefarlands standards để xác định mật độ khuẩn có trong ống nghiệm Dùng một ống hút vô trùng đưa vi khuẩn vào các lô thí nghiệm vơi mật độ khác nhau, sau đó chăm sóc, quản lý và theo dõi sự xuất hiện bệnh lý

- Pha các dung dịch bao gồm: Nước biển tiệt trùng + các chủng vi khuẩn có tần số bắt gặp cao từ mẫu bệnh với các nồng độ ở trên

- Ngâm ấu trùng cua biển trong các dung dịch trên

- Lô đối chứng chỉ gồm ấu trùng và nước biển tiệt trùng

Chủng vi khuẩn cần nghiên cứu

100 ấu trùng

106 tbvk/lít

100 ấu trùng

107tbvk/lít

100 ấu trùngNaCl 2%

Hình 3: Phương pháp gây nuôi cảm nhiễm

- Duy trì chế độ xục khí trong suốt quá trình thí nghiệm, tiến hành cho ấu trùng ăn trong thời gian thí nghiệm

3.2.5 Phương pháp nghiên cứu độ nhạy kháng sinh (kháng sinh đồ) của vi khuẩn gây bệnh:

- Dùng phương pháp đĩa nhạy kháng sinh có cải tiến của Kirby Bauer (1986) cho phù hợp với các nghiên cứu về vi khuẩn biển

3.3 Phương pháp xử lý số liệu:

Sử dụng phương pháp thống kê thông dụng hiện hành

3.4 Các công thức sử dụng:

- Sử dụng phương pháp tính giá trị trung bình:

∑

=

i i

x n

X

1 1

Trong đó: n – Số lần kiểm tra của một yếu tố nào đó (n = 1,2,3 )

Xi – Giá trị của lần kiểm tra thứ i

X – Giá trị trung bình của một yếu tố nào đó

- Tính tỷ lệ sống của ấu trùng theo công thức:

Trong đó : A – Tỷ lệ sống (%)

N1 – số ấu trùng còn sống trong mỗi lô sau khi kết thúc thí nghiệm

N2 – Số ấu trùng đưa vào thí nghiệm trong mỗi lô