Khảo sát các điều kiện tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học asiaticoside trong rau má (centella asiatica)

Từ xa xưa con người đã biết biết tận dụng nguồn thực vật phong phú trong thiên nhiên để làm dược thảo chữa các bệnh thông thường. Theo thời gian cùng với sự phát triển của các ngành khoa học kĩ thuật thì dược tính của các bài thuốc từ thực vật ngày càng được chứng tỏ và càng sử dụng rộng rãi. Với tính chất dễ kiếm lại ít gây tác dụng phụ cho con người các loài thực vật trong thiên nhiên đã thu hút được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực. Trong các loài thực vật được quan tâm nghiên cứu có rau má. Rau má (Centella asiatica) hay còn gọi là tích tuyết thảo, thường được chế biến theo nhiều cách khác nhau để làm ra các món ăn thức uống bổ mát như ép nước hoặc các loại trà giải khát có tác dụng thanh nhiệt, giải độc dùng rất tốt trong mùa hè hay để chế biến thành những món ăn hằng ngày. Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, có tác dụng dưỡng âm, thanh nhiệt, nhuận gan, giải độc, lợi tiểu. Rau má thường được dùng để làm thuốc bổ dưỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí hư, bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy, giúp vết thương mau lành [4], [23]. Theo những nghiên cứu của y học hiện đại từ những năm 1940 đã nêu ra thì rau má có chứa nhiều những hoạt chất thuộc nhóm saponins (còn được gọi là tripernoids) bao gồm asiaticoside, madecassoside, madecassic acid và asiatic acid có thể chữa được nhiều bệnh như tim mạch, các bệnh về da hay một số loại bênh ung bướu…[17], [23]. Trong đó hoạt chất asiaticoside đã được ứng dụng trong điều trị bệnh phong và bệnh lao [23]. Ngoài ra, trong rau má còn còn chứa một số các hợp chất ursolic, oleanolic và boswellic acid, các triterpenes liên hệ đến asiatic acid (là chất terpene chính có trong rau má) mà các nghiên cứu về tác dụng của chúng trong vấn đề ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư cũng đã được tiến hành (Journal of Ethnopharmacology Số 48-1995).. Mặt khác, rau má do có đặc điểm dễ trồng khả năng phát triển nhanh nên việc mở rộng diện tích và tăng năng suất tương đối lớn. Hiện nay một vài nơi trồng đại trà rau má để bán làm rau ăn, làm thuốc và nguyên liệu chế biến nước giải khát. Khả năng phát triển về sản lượng cùng với những lợi ích mà cây rau má có thể đem tới cho con người nói chung và các ngành khoa học nói riêng thì việc tiến hành những nghiên cứu nhằm gia tăng lợi ích sử dụng của cây rau má là hết sức cần thiết.

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ xa xưa con người đã biết biết tận dụng nguồn thực vật phong phútrong thiên nhiên để làm dược thảo chữa các bệnh thông thường

Theo thời gian cùng với sự phát triển của các ngành khoa học kĩ thuậtthì dược tính của các bài thuốc từ thực vật ngày càng được chứng tỏ và càng

sử dụng rộng rãi Với tính chất dễ kiếm lại ít gây tác dụng phụ cho con ngườicác loài thực vật trong thiên nhiên đã thu hút được sự quan tâm của các nhànghiên cứu trong nhiều lĩnh vực Trong các loài thực vật được quan tâmnghiên cứu có rau má

Rau má (Centella asiatica) hay còn gọi là tích tuyết thảo, thường được

chế biến theo nhiều cách khác nhau để làm ra các món ăn thức uống bổ mátnhư ép nước hoặc các loại trà giải khát có tác dụng thanh nhiệt, giải độc dùngrất tốt trong mùa hè hay để chế biến thành những món ăn hằng ngày

Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, có tácdụng dưỡng âm, thanh nhiệt, nhuận gan, giải độc, lợi tiểu Rau má thườngđược dùng để làm thuốc bổ dưỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí hư,bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy, giúp vết thương mau lành [4], [23]

Theo những nghiên cứu của y học hiện đại từ những năm 1940 đã nêu

ra thì rau má có chứa nhiều những hoạt chất thuộc nhóm saponins (còn đượcgọi là tripernoids) bao gồm asiaticoside, madecassoside, madecassic acid vàasiatic acid có thể chữa được nhiều bệnh như tim mạch, các bệnh về da haymột số loại bênh ung bướu…[17], [23] Trong đó hoạt chất asiaticoside đãđược ứng dụng trong điều trị bệnh phong và bệnh lao [23]

Ngoài ra, trong rau má còn còn chứa một số các hợp chất ursolic,oleanolic và boswellic acid, các triterpenes liên hệ đến asiatic acid (là chấtterpene chính có trong rau má) mà các nghiên cứu về tác dụng của chúngtrong vấn đề ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư cũng đã được tiến hành

(Journal of Ethnopharmacology Số 48-1995)

Mặt khác, rau má do có đặc điểm dễ trồng khả năng phát triển nhanhnên việc mở rộng diện tích và tăng năng suất tương đối lớn Hiện nay một vàinơi trồng đại trà rau má để bán làm rau ăn, làm thuốc và nguyên liệu chế biếnnước giải khát.

Khả năng phát triển về sản lượng cùng với những lợi ích mà cây rau má

có thể đem tới cho con người nói chung và các ngành khoa học nói riêng thìviệc tiến hành những nghiên cứu nhằm gia tăng lợi ích sử dụng của cây rau

má là hết sức cần thiết

Từ những vấn đề trên chúng tôi đã chọn đề tài: “Khảo sát các điều kiện tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học asiaticoside trong rau má

(Centella asiatica)” với nguồn nguyên liệu từ xã Quảng Thọ, huyện Quảng

Điền, tỉnh Thừa Thiên Huế để thu nhận hợp chất sinh học có lợi này trong rau

má với mục đích chính tìm hướng sản xuất nguyên liệu bổ sung và góp phầnphát triển các loại thực phẩm chức năng sau này

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây rau má

Rau má Centella asiatica là loài rau dại mọc tương đối phổ biến ở các

vùng đất nhiệt đới đặc biệt là ở Châu Á Mỗi vùng thường có một cái tênriêng biệt như: Tích tuyết thảo (Trung Quốc), Phanok (Lào), Trachiek - kranh(Miên), và Gotu-kola (SriLanka), Pegagan (Indonesia), Takip - kohol(Philippine), hay Bua-bok (Thái Lan) Tiếng Anh gọi là Pennywort Tuy tên

gọi mỗi vùng khác nhau nhưng chúng đều thuộc loài Centella asiatica và có

nhiều tác dụng tốt đối với con người [4], [31]

1.1.2 Đặc điểm phân bố Hình 1.1 Cây rau má

Rau má Centella asiatica là loài thực vật mọc bò lan trên mặt đất có lá

trông giống như những đồng tiền tròn được xếp nối tiếp nhau nên còn gọi là

Liên tiền thảo, thích hợp mọc ở những nơi ẩm ướt như thung lủng, bờ

mương, ruộng thuộc những vùng đất nhiệt đới

Ở Việt Nam, rau má mọc hoang khắp nơi, thường gặp ở các bãi cỏ,

bờ ruộng, ven suối, sườn đồi, quanh các làng bản, những vùng ẩm ướt.Rau má có thể thu hái cả bốn mùa nên khả năng nhân rộng diện tích vàtăng năng suất dễ dàng

Việc trồng rau má không đòi hỏi đầu tư nhiều và việc chăm sóc tươngđối nhẹ nhàng Người ta thường chỉ trồng rau má một lần là có thể thu hoạchtrung bình trong 10 năm Ở chân đất bùn, rau má có thể đạt năng suất 1-1.2tấn/ 500m2/ lứa thu hoạch, ở chân đất cao thì năng suất chừng 500kg/ 500m2/

lứa Mỗi năm có thể thu hoạch 7-10 lứa, và thường thời gian còn lại thì nôngdân tiến hành làm cỏ Giá bán rau má khoảng 4000- 8000 đồng/ kg [29].

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Thân cây rau má gầy và nhẵn, thuộc loại thân bò lan, màu xanh lục haylục ánh đỏ, có rễ ở các mấu Nó có các lá hình thận, màu xanh với cuống dài vàphần đỉnh lá tròn, kết cấu trơn nhẵn với các gân lá dạng lưới hình chân vịt Các

lá mọc ra từ cuống dài khoảng 5-20 cm Bộ rễ bao gồm các thân rễ, mọc thẳngđứng có màu trắng kem và được che phủ bằng các lông tơ ở rễ [2], [4], [7]

Hoa rau má có màu từ ánh hồng tới đỏ, mọc thành các tán nhỏ, tròn gầnmặt đất Mỗi hoa được bao phủ một phần trong 2 lá bắc màu xanh Các hoalưỡng tính này khá nhỏ (nhỏ hơn 3mm), với 5-6 thùy tràng hoa Hoa có 5 nhị

và 2 vòi nhụy, quả có hình mắt lưới dày đặc Quả của nó chín sau 3 tháng vàtoàn bộ cây, bao gồm cả rễ, được thu hái thủ công [2]

Toàn bộ cây rau má đều chứa tinh dầu, dầu béo Chất béo chủ yếu

là glyceride của các loại acid: oleic, linolic, linolenic, lignoceric, palmitic

và stearic Trong rau má còn chứa một lượng alkaloid hydrocotylin, chấtđắng vellarin và đặc biệt là glucoside asiaticoside Lượng asiaticoside nàykhi thủy phân cho asiatic acid và glucose, rhamnose [2] [4] [7] Hàmlượng asiaticoside trong mô rau má theo từng bộ phận khác nhau sẽ chiếmcác tỷ lệ khác nhau

Trong thành phần hóa học của rau má, nhóm saponin hay còn gọi làtriterpene được xem là nhóm chất đặc biệt có ý nghĩa nhất, nó bao gồm triterpeneacid và triterpene glycoside Triterpene acid có chứa asiatic acid, brahmic acid,isobrahmic acid, madecassic acid, và betulinic acid Còn hợp chất triterpene

glycoside có chứa asiaticoside, madecassoside, brahmoside, brahminoside vàthankuniside [21] Đây là nhóm những hoạt chất được nghiên cứu khá nhiều tronglĩnh vực y dược nhằm phục vụ việc chữa bệnh cho con người.

1.1.5 Tác dụng dược lý và công dụng của cây rau má

Rau má là loại rau tương đối phổ biến thường thu hái loại rau má riêng

lẻ, cả lá và dây, rửa sạch, làm món rau sống trong bữa ăn hoặc có thể giã nát(hoặc xay) vắt lấy nước, bỏ thêm ít đường uống giải nhiệt, giải khát trongnhững ngày nắng nóng, hay dùng để làm các bài thuốc trị bệnh thông thườngcảm cúm, sốt, nhức đầu, viêm họng, cổ đau

Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, vào Can,

Tỳ Vị có tác dụng dưỡng âm, thanh nhiệt, nhuận gan, giải độc, lợi tiểu Rau

má thường dùng để làm thuốc bổ dưỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí

hư, bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy

Rau má có chứa nhiều hoạt chất rất tốt có thể chữa được nhiều bệnh:

Đối với thần kinh

Một số hoạt chất trong rau má như bracoside B có tác dụng lên hoạtđộng của hệ thần kinh trung ương, tăng cường các chất chuyển hóa(neurotransmitters), làm giảm căng thẳng tâm lý, tăng cường khả năng tậptrung tư tưởng và giúp cải thiện trí nhớ của người già Người ta cho rằng dịchchiết rau má có hiệu quả tốt với bệnh Alzheimer nhờ vào những dẫn xuất củachất asiaticoside có khả năng bảo vệ các tế bào thần kinh khỏi tác động củacác độc tố beta-amyloid [2] [10]

Đối với tim mạch

Hoạt chất bracoside A kích thích sự bài tiết nitric oxide của mô để làmdãn nở vi động mạch cùng mao quản, nên lượng máu di chuyển qua mô đượcnhiều hơn nên có khả năng chấm dứt được các cơn đau tim, đồng thời cácchất độc dễ được đào thải giúp tế bào sống thoải mái trong một môi trườnglành mạnh Khám phá quan trọng này mang lại giải thưởng Nobel về Y năm

1998 cho 3 Giáo Sư Hoa Kỳ R Furchgott, L Ignarro và F Murad [31]

Trong tuần hoàn huyết, những hoạt chất của rau má có tác dụng cảithiện vi tuần hoàn ở các tĩnh mạch, mao mạch, bảo vệ lớp áo trong của thànhmạch và làm gia tăng tính đàn hồi của mạch máu Do đó rau má cũng thường

được dùng trong các chứng tăng áp lực tĩnh mạch ở các chi dưới Trong thực

tế người ta thường uống dịch rau má để trị các bệnh về tĩnh mạch như sa tĩnhmạch hoặc sưng phù ở chân

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các hoạt chất nằm ở trong chất xơ(cellulose) của rau má, nếu chúng ta chỉ giã vắt lấy nước, bỏ phần bả thì sẽmất đi các hoạt chất này Một số công trình nghiên cứu khác còn cho thấy cácchất xơ có thể "kéo" cholesterol ra khỏi cơ thể nên cũng có tác dụng rất tốtvới tim mạch, vì vậy nếu ăn các loại rau có nhiều chất xơ sẽ giúp cơ thể đàothải dần lượng cholesterol ra khỏi cơ thể [2]

Đối với da

Vì tác dụng vào tuần hoàn và làm tế bào da vững mạnh nên rau mácũng được ứng dụng dùng làm kem bôi mặt ở Pháp để làm bớt những vếtnhăn cho nét mặt được trẻ trung

Theo nhiều công trình nghiên cứu và kết quả lâm sàng đều cho thấy dịchchiết rau má có khả năng kích hoạt các tiến trình sinh học trong việc phân chia tếbào và tái tạo mô liên kết giúp vết thương chóng lành và mau lên da non Hiệnnay các chế phẩm từ rau má đã được sử dụng rất đa dạng dưới nhiều hình thứcthuốc tiêm, thuốc bột, thuốc mở để điều trị tất cả các chứng bệnh về da như vếtbỏng, vết thương do chấn thương, do giải phẩu, cấy ghép da, những vết lở loétlâu lành, vết lở do ung thư, bệnh phong, vẩy nến [2] [20] [27]…

Đối với bệnh ung thư

Phần dịch chiết chứa các triterpenoids của rau má được cho là có khảnăng tiêu diệt được các tế bào ung thư loại lymphoma Dalton và Ehrlich,nhưng vẫn chưa xác định chính xác là loại triterpenoid nào Và các nghiêncứu về cấu trúc hóa học của các triterpenoid trong Centella cũng được đánhgiá có thể chống được ung thư (nhờ vào hoạt tính đối kháng hoạt độngcollagen )[30] [32]

Trong rau má, các triterpenoids loại ursane như ursolic và oleanolicacid có hoạt tính diệt bào mạnh Các nghiên cứu ‘in vitro’ về ursolic vàoleanolic acid ghi nhận khả năng ngăn chặn sự phát triển của một số dòng tế

bào ung thư có liên quan tới hoạt tính diệt bào của các acid này (Anticancer Research Số 16-1996 và Cancer Letter Số 10-1996)

Cả oleanolic acid và ursolic acid đều làm giảm sự sinh sản của tế bào

nội mạc (Planta Medica Số 64-1998) nên có thể sẽ hữu dụng để trị ung thư

bằng cách ngăn chặn tiến trình angiogenesis (tiến trình tăng trưởng của cácmạch máu tân tạo để nuôi dưỡng tế bào tân sinh) cần đến sự sinh sản của các

tế bào nội mạc để tạo ra các mạch máu mới

Các acid oleanolic và ursolic cũng có các tác động chống u bướu (in

vivo) (Cancer Letter Số 111-1997) Vì vậy ở Nhật một đặc chế của các chất

này được dùng để trị ung thư máu loại leukemia nonlymphatic

Một acid khác cũng được xếp vào nhóm hợp chất triterpenoid (nhưasiatic acid) có trong rau má là boswellic acid Acid này đã được nghiên cứukhá nhiều và đã được ghi nhận về khả năng ức chế sự sinh sôi nẩy nở và tạo

ra sự phân cắt của các dòng tế bào ung thư hệ thần kinh trung ương và ungthư leukemia [30]

Thực tế có một nghiên cứu xác định được tính chất diệt bào củaboswellic acid Có ít nhất ba nghiên cứu trên các u bướu thú vật ghi nhậnboswellic acid có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư não

và ung thư leukemia được chuyển sang cho loài gậm nhấm Có 2 nghiên cứuthực hiện nơi người cho thấy dịch chiết từ Boswellia hay boswellic acid cókhả năng làm giảm sự phù nơi não nên có thể có hoạt tính điều trị bổ sungtrong các trường hợp ung thư não [30]

Asiaticoside một hoạt chất chiếm hàm lượng tương đối lớn trong rau

má cũng đã góp phần không nhỏ ngặn chặn sự phát triển của các tế bào ungthư Người ta cho rằng khi hấp thụ vào cơ thể asiaticosie sẽ phân cắt tạo thànhkhoảng 62% asiatic acid và các glycosid Asiatic acid này cũng có thể có cáchoạt tính tốt như oleanolic acid và ursolic [31]

Ngoài những tác dụng trên thì rau má còn có tác dụng trị khớp Trongnhững năm gần đây, nhiều phương tiện thông tin đã phổ biến cách chữa bệnhthấp khớp mãn tính bằng cách ăn hai lá rau má tươi mỗi ngày Một chươngtrình phóng sự của đài truyền hình số 9 ở Sydney công bố vào tháng 12/2003cũng cho biết một số người ở Úc đã chữa khỏi bệnh thấp khớp bằng cách

này Phương pháp này phát xuất từ quyển sách “Arthritis and Paradoxycal Pennywort” (Bệnh thấp khớp và lá rau má) của ông Russ Maslen [24] [32]

Ở Việt Nam, hiện nay các công ty dược phẩm đã nghiên cứu và sảnxuất nhiều loại thuốc có nguồn gốc từ rau má, đặc biệt là hàm lượng vitamintrong rau má có tác dụng chữa trị nhiều loại bệnh, ứng dụng vào lĩnh vựcdược phẩm, thực phẩm, kết quả định luợng vitamin trong rau má được phântích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao áp, hàm lượng vitamin trong rau má trồngtại Việt Nam là: 128.6 mg vitamin B1, 73.6mg vitamin B2, 384.1 mg vitaminB6, 532.9 mg vitamin C, 741.5 mg vitamin PP [7].

1.2 Tổng quan về các hoạt chất sinh học asiaticoside

1.2.1 Khái niệm về asiaticoside

Theo nhiều nguồn tài liệu nghiên cứu thì rau má có chứa rất nhiều hoạtchất sinh học có lợi cho con người trong đó asiaticoside được xem một chấtđiển hình với nhiều công dụng

Asiaticoside có [25] [17]:

Công thức phân tử: C48H78O19Khối lượng phân tử: 959.12 g/molCấu trúc phân tử

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của asiaticoside 1.2.2 Tính chất lý hóa của asiaticoside

Asiaticoside tan tốt trong cồn, sản phẩm tinh thể hình kim màu trắng,nhiệt độ nóng chảy là 230÷233oC [4] [14]

1.2.3 Tác dụng dược học của asiaticoside

Từ những năm 1940, y học hiện đại bắt đầu nghiên cứu những tác dụngcủa rau má Những hợp chất chính có giá trị ở rau má là asiaticoside,

madecassoside và asiatic acid đã được phát hiện, nghiên cứu và ứng dụng.Trong đó có asiaticoside là một triterpene glycoside nó được xem như mộtkháng sinh Asiatociside giúp chữa lành vết thương nhanh chóng nhờ vào cơchế kích thích tạo collagen và sự tổng hợp glycosaminoglycan [2] [14]

Hoạt chất asiaticoside cũng đã được ứng dụng trong điều trị bệnhphong và bệnh lao Người ta cho rằng trong những bệnh này, vi khuẩn đượcbao phủ bởi một màng ngoài giống như sáp khiến cho hệ kháng nhiễm của cơthể không thể tiếp cận Chất asiaticoside trong dịch chiết rau má có thể làmtan lớp màng bao này để hệ thống miễn dịch của cơ thể tiêu diệt chúng [2][14] [27]

Năm 1990, Maquart và cs đã có công trình nghiên cứu công bố khảnăng làm lành vết thương bị lở loét của asiaticoside Dược tính đáng kể củahoạt chất này là giảm bớt kích thước của vùng vết thương trên da ở lưngchuột sau 9 ngày thử nghiệm [14]

Theo nghiên cứu của Inhee và cs (1999) cho thấy, các dẫn xuất củachất asiaticoside có khả năng bảo vệ thần kinh, chống lại độc tố β-amyloidgây hại đối với nơtron thần kinh Ba trong số 28 dẫn xuất của asiaticoside cóthể được đưa vào nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer nhờ khả năng bảo vệcác tế bào thần kinh khỏi tác động của β-amyloid Một số báo cáo được xuấtbản từ 1967 đến 1999 mô tả việc sử dụng thuốc mỡ chứa đựng những liều cao

từ 0,1-0,2% dịch chiết của rau má để tăng cường phục hồi vết thương bị bỏng[11] [13]

Asiaticoside kích thích hệ reticuloendothelial nên sức miễn nhiễm của

cơ thể được mạnh hơn Asiaticoside giúp tế bào da chống oxy hóa, phát triển

mô liên kết, nên làm mạnh tế bào da, mô da căng trẻ, và giúp cho vết mổ, vếtloét mau lành [31]

Trong kết quả nghiên cứu của Boiteau và cs (2001), tác dụng củaasiaticoside được tìm thấy đó là tiềm năng làm giảm trầm cảm ở chuột.Những thử nghiệm được tiến hành trên chuột và những kết quả cho thấy rằngasiaticoside có thể có hoạt động giống như chất chống trầm cảm, giúp chuộthoạt động, nhận và xử lý thông tin nhanh hơn [20]

Nghiên cứu của Mahato (2000) và cs đã thí nghiệm tác dụng củaasiaticoside trên chứng bệnh sưng phù và viêm khớp Asiaticoside có trongdịch chiết đã làm giảm bớt bàn chân phình của chuột thử nghiệm Kiểm trahoạt dịch tại điểm viêm khớp trên chân chuột cho thấy sự thoái hóa sụn khớp

do sự tăng sản sinh những tế bào viêm ở chuột được ức chế bởi asiaticoside

Cơ chế tích cực của asiaticoside có thể liên quan đến việc ngăn chặn sự tăngnhanh của bạch cầu [14] [20]

1.3 Tổng quan về tách chiết hoạt chất sinh học

1.3.1.Khái niệm

Tách chiết còn gọi là trích ly là quá trình tách một hay một số chất tantrong chất lỏng hay chất rắn bằng một chất lỏng khác còn gọi là dung môi.Nếu quá trình tách chất hòa tan trong chất lỏng bằng một chất lỏng khác gọi

là trích ly lỏng - lỏng Nếu quá trình tách chất hòa tan trong chất rắn bằng mộtchất lỏng thì gọi là trích ly rắn- lỏng [1] [8]

1.3.2 Mục đích của quá trình trích ly

Tách được các cấu tử quý

Thu được dung môi có nồng độ đậm đặc (đối với trích ly lỏng- lỏng)

Cũng như chưng luyện trích ly là một trong những phương pháp chủyếu để phân tách một hỗn hợp đồng nhất thành các cấu tử thành phần

Trích ly kết hợp với quá trình khác như ép nhằm nâng cao hiệu suất thuhồi sản phẩm

1.2.3.3 Yêu cầu của dung môi trong trích ly

Chất lượng và hiệu quả của quá trình trích ly phụ thuộc chủ yếu vàodung môi, nên yêu cầu dung môi:

Có tính hòa tan chọn lọc, nghĩa là chỉ hòa tan cấu tử cần tách,không hoặc hòa tan rất ít các cấu tử khác

Không độc, không ăn mòn thiết bị

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly

1.3.4.1 Nồng độ của dịch trích ly

Thực chất quá trình trích ly là quá trình khuyếch tán, nên đòi hỏi có sựchênh lệch nồng độ giữa pha lỏng (dung môi) với pha chứa chất cần trích ly

Khi nồng độ các chất hòa tan trong dung môi thấp thì lượng chất trích

ly từ nguyên liệu tăng, thời gian trích ly giảm Vì vậy để đảm bảo quá trìnhtrích ly tốt người ta thường thực hiện tăng tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu

1.3.4.2 Đặc điểm của nguyên liệu

Vật liệu rắn có kích thước càng nhỏ thì khả năng trích ly càng lớn dodiện tích tiếp xúc giữa chúng và dung môi tăng lên tạo điều kiện cho quá trìnhtrích ly dễ dàng hơn Phương pháp nghiền nhỏ hay băm nhỏ là phương phápthường áp dụng, tuy nhiên nếu kích thước vật liệu quá nhỏ cũng gây trở ngạicho quá trình trích ly vì nó có thể làm tắc các ống mao dẫn và làm phức tạpcho các quá trình xử lý tiếp theo

Ngoài ra cấu trúc bên trong hay thành phần hóa học, tính chất của vậtliệu cũng ảnh hưởng đến quá trình trích ly, nếu độ ẩm cao thì nước có thểtác dụng với thành phần protein và các chất háo nước khác có thể ngăn cản

sự di chuyển của dung môi thấm sâu vào nguyên liệu làm chậm quá trìnhkhuyếch tán Hay đối với vật liệu non, mềm thì dung môi thấm vào dễ dàngnên khi xay chỉ cần xay thô không cần xay mịn để tránh trích ly nhiều tạpchất vào dịch chiết…

1.3.4.3 Nhiệt độ

Nhiệt độ có tác dụng làm tăng khả năng khuyếch tán và giảm độ nhớtcủa dung môi, phần tử hòa tan có thể chuyển động khuyếch tán dễ dàng giữacác phân tử dung môi Tuy nhiên nhiệt độ là một yếu tố giới hạn vì có khảnăng gây ra các phản ứng không mong muốn

Đối với những chất kém bền ở nhiệt độ cao: nhiệt độ tăng cao sẽ gâyphá hủy một số chất như vitamin, glycosid, akaloid…

Đối với tạp chất: khi nhiệt độ tăng không những độ tan của hoạt chấttăng mà độ tan của các tạp chất cũng tăng, dịch chiết sẽ có nhiều tạp Nhất làđối với một số hợp chất như các chất nhầy… khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương

nở, tinh bột hồ hóa, độ nhớt của dịch sẽ tăng gây khó khăn cho quá quá trìnhchiết xuất và tinh chế

Đối với dung môi dễ bay hơi khi nhiệt độ tăng thì dung môi dễ hao hụtkhi đó để khắc phục thiết bị phải kín và có có bộ phận thu hồi dung môi.

Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt: khi nhiệt độtăng độ hòa tan của chúng giảm do đó để tăng độ hòa tan ta phải giảm nhiệt độ

Tùy thuộc vào loại nguyên liệu, loại dung môi, phương pháp chiếtxuất… mà lựa chọn nhiệt độ chiết thích hợp

1.3.4.4.Thời gian

Thời gian trích ly dài thì hàm lượng chất trích ly tăng nhưng việc kéodài thời gian phải có giới hạn, nếu để mức độ trích ly đạt mức tối đa mà kéodài thời gian có thể sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế, và nếu trích ly ở điềukiện nhiệt độ cao trong thời gian dài thì cũng gây ảnh hưởng đến sản phẩmcần thu hồi Thời gian chiết xuất chịu sự chi phối của loại nguyên liệu,phương pháp chiết, nhiệt độ chiết, loại dung môi…

1.3.4.5 Khuấy trộn

Khi dung môi tiếp xúc với nguyên liệu dung môi sẽ thấm vào nguyênliệu, hòa tan chất tan, chất tan sẽ khuyếch tán từ nguyên liệu vào dung môiqua màng tế bào Sau một thời gian khuyếch tán nồng độ chất tan trong tế bàogiảm, nồng độ chất tan trong dung môi tăng lên, chênh lệch nồng độ bên trong

và bên ngoài tế bào giảm dần làm cho quá trình khuyếch tán cũng giảm nênquá trình trích ly chậm dần Lúc này cần phải khuấy trộn để di chuyển lớpdịch chiết ở phía sát màng tế bào ra xa và dung môi ở phía xa vào sát màng tếbào để tạo ra sự chênh lệch nồng độ cho quá trình khuyếch tán

1.3.5 Một số phương pháp chiết xuất dược liệu

Chiết xuất dược liệu nhằm mục đích thu nhận các hoạt chất có lợi tồntại trong dược liệu ở dạng tinh khiết có thể, để tạo nguồn nguyên liệu cungcấp cho quá trình bán tổng hợp một số thuốc mới nhằm tăng ưu điểm chothuốc: Tăng tác dụng điều trị, giảm bớt các tác dụng phụ của thuốc hay tạo ranhững tác dụng mới Ngoài ra nó còn làm cho việc bảo quản dược liệu dễdàng và lâu hơn, phương pháp kiểm nghiệm rõ ràng và có thể làm gia tăngmục đích sử dụng

1.3.5.1 Phân loại phương pháp chiết xuất

Có nhiều cách phân loại dựa vào các yếu tố sau:

Dựa vào nhiệt độ

Chiết nóng

Chiết nguội (chiết ở nhiệt độ thường)

Dựa vào chế độ làm việc của quá trình chiết

Chiết gián đoạn

Áp suất giảm (áp suất chân kông)

Áp suất cao (làm việc có áp lực)

Dựa vào trạng thái của hai pha

Ngâm

Ngấm kiệt

Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt

Phương pháp siêu âm

Phương pháp tạo dòng xoáy

Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn

1.3.5.2 Một số phương pháp chiết xuất điển hình

Ngâm [3]

Là phương pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ xưa Dược liệu đã xử

lý sơ bộ người ta cho vào bình chiết xuất sau đó đổ dung môi ngập dược liệu,ngâm một thời gian nhất định (tùy loại dược liệu), lấy dịch chiết rồi rửa lại bãbằng dung môi thích hợp Để tăng cường hiệu quả chiết rút có thể tiến hànhkhuâý trộn hoặc tuần hoàn cưỡng bức dung môi

Có nhiều cách ngâm: ngâm tĩnh, ngâm động, ngâm nóng, ngâm lạnh,ngâm một hoặc nhiều lần

Phương pháp này có ưu điểm thiết bị đơn giản, rẽ tiền, dễ thực hiệnnhưng nó cũng có nhiều nhược điểm như năng suất thấp, phải thao tác thủcông Nếu chỉ chiết xuất một lần thì hiệu suất thu hồi thấp, còn nếu chiếtnhiều lần thì tốn dung môi và thời gian.

Phương pháp chiết xuất ngấm kiệt [3]

Ngâm dược liệu vào dung môi trong bình ngấm kiệt sau một thời gianxác định ta rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dưới, đồng thời bổ sung thêm dungmôi ở phía trên bằng cách cho dung môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp vậtliệu nằm yên Lớp dung môi trong bình chiết thường phải ngập lớp vật liệukhoảng 3-4 cm

Ngấm kiệt đơn giản: là phương pháp ngấm kiệt luôn sử dụng dung môimới để chiết đến kiệt hợp chất trong nguyên liệu

Ngấm kiệt phân đoạn (tái ngấm kiệt): là phương pháp ngấm kiệt có sửdụng dịch chiết loãng để chiết mẻ mới hoặc chiết các mẻ chiết có mức độchiết khác nhau

Ưu điểm của phương pháp này là dược liệu được chiết kiệt hơn, đỡ tốndung môi hơn phương pháp ngâm

Nhược điểm là năng suất thấp, phải thao tác thủ công, thao tác phức táphơn phương pháp ngâm Đối với ngấm kiệt đơn giảm thì tốn nhiều dung môi

Phương pháp chiết xuất ngược dòng [3]

Phương pháp chiết xuất ngược dòng: Là phương pháp sử dụng một sốchuỗi thiết bị chiết xuất, cho dung môi và dược liệu chuyển động ngược chiềunhau trong thiết bị Dịch chiết di chuyển trong thiết bị nhờ những cơ cấuchuyên dùng khác nhau Dược liệu trước khi lấy ra khỏi thiết bị được tiếp xúcvới dược liệu mới nên dịch chiết thu được đậm đặc hơn, bã dược liệu trước khi

ra khỏi thiết bị được tiếp xúc với dung môi mới nên bã được tách kiệt hơn

Ưu điểm:

Năng suất làm việc cao, không phải thao tác thủ công

Dịch chiết thu được đậm đặc

Dược liệu được chiết kiệt, ít tốn dung môi

Có thể cơ giới hóa, tự động hóa được quá trình

Nhược điểm:

Thiết bị có cấu tạo phức tạp, đắt tiền, khó vận hành

Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn [23]

Phương pháp chiết xuất chất lưu siêu tới hạn (SFE): Là phương pháptận dụng chất lưu ở trạng thái siêu tới hạn làm chất chiết xuất, chiết xuấtthành phần hiệu quả trong dược liệu từ trong chất rắn hoặc chất lỏng rồi tiếnhành phân tách

Chất lỏng siêu tới hạn hình thành khi nhiệt độ và áp suất vượt quá điểmtới hạn (critical point) Ở trạng thái này, tỷ trọng của pha lỏng và pha khí bằngnhau, ranh giới phân biệt giữa 2 pha biến mất

CO2 nhờ có các đặc điểm là bản thân không độc, không ăn mòn, điềukiện tới hạn thích hợp nên trở thành chất lưu siêu tới hạn được dùng phổ biếnnhất trong phương pháp chiết xuất này

CO2 khi ở điểm tới hạn có nhiệt độ cao và áp suất cao sẽ chịu haikhuynh hướng Nhiệt độ cao thì sẽ bay hơi, áp suất cao thì hóa lỏng Thế nên

ở khoảng nhiệt độ và áp suất nào đó, 2 pha khí và lỏng cùng tồn tại, đó làtrạng thái siêu tới hạn Khi mang tính chất của chất khí (dễ khuyếch tán vàochất rắn) và chất lỏng (hòa tan chất khác) Người ta thường cho CO2 hóa lỏng

ở áp suất cao để tạo điều kiện trích ly các chất trong nguyên liệu rồi sau đógiảm áp suất để CO2 hóa khí để thu hồi tái sử dụng

Phương pháp chiết này có ưu điểm:

Khả năng chiết tách cao

Tốc độ phản ứng lớn

Có khả năng tái sử dụng vì vậy chi phí rẻ hơn

An toàn, độ tinh khiết cao

Chiết siêu âm [3][29]

Phương pháp chiết xuất siêu âm: Là phương pháp ngâm chiết tận dụngsóng siêu thanh tăng tần số và tốc độ vận động phân tử của vật chất, tăng khảnăng thẩm thấu, tăng tốc độ và số lần thấm ra, rút ngắn thời gian chiết xuất.Tác dụng của sóng siêu âm:

Làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúngthành hạt nhỏ

1.4 Một số nghiên cứu về tách chiết asiaticoside trong rau má

Việc nghiên cứu quá trình chiết để thu hồi asiaticoside có trong rau má

đã được khá nhiều nhà nghiên cứu ở nước ngoài tiến hành và công bố nhưng

ở nước ta thì chưa thấy có nghiên cứu nào được công bố

Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của dung môi và phương pháp chiếtxuất asiaticoside đã được các tác giả Wan Joo Kim và các đồng sự ở HànQuốc (KIST: Korea institute of Science and Technology) tiến hành Các ông

đã khảo sát khả năng tách asiaticoside của các dung môi ethanol, methanol, vànước riêng lẻ ở nhiệt độ sôi của dung môi bằng phương pháp chiết ngượcdòng với thời gian 5h và kết quả thu được ở phương pháp này là sử dụngethanol sẽ cho hiệu quả tốt nhất [22]

Tuy nhiên, một nghiên cứu khác về khảo sát khả năng chiết asiaticosidebằng phương pháp ngâm lắc trong 4h với các loại dung môi Chloroform, etyl

các đồng sự ở Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, POCIMAP, Lucknow 226015, India tiến hành lại không cho như vậy Và kết kếtquả họ đưa ra đã cho rằng khả năng thu hồi asiaticoside khi chiết bằngmethanol là tốt nhất với hàm lượng 0.36% theo khối lượng chất khô cònethanol chỉ đạt mức 0,04% [18] Điều này đã nói lên việc lựa chọn dung môitối ưu cho quá trình quả trình chiết chưa có một sự thống nhất

Nhóm nghiên cứu của Wan Joo Kim còn so sánh khả năng chiết khi sử

trợ của dung môi chiết, và họ cho rằng việc sử dụng phương pháp phương

hơn Việc so sánh hàm lượng asiticosde chiết ra bằng soxhlet khi sử dụngethanol tinh khiết và hỗn hợp của ethnol- nước cũng được nhóm này thực hiệnvới kết quả thu được là sự có mặt của nước trong dung môi ethanol làm chohiệu suất chiết tăng lên [22]

Bên cạnh các nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các yếu tố trong quátrình chiết một số nhà nghiên cứu cũng đã tiến hành nghiên cứu hàm lượngasiticoside trong rau má ở các bộ phận khác nhau:

với hàm lượng asiaticoside ở phần lá chiếm 82,6%, phần rễ 1,5%, phần cuống

lá 15,9% còn các mấu ở thân 0% so với hàm lượng asiaticoside tổng số [14]

Qua kết quả này thì các ông đã khả định hàm lượng asiaticoside trong phần láchiếm tỉ lệ cao nhất so với các phần khác Năm 2008 một kết quả tương tự donhà nghiên cứu N.A.Zainol, S.C.Voo tiến hành cũng đã được công bố [16].

Ngoài ra, người ta còn tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của các khuvực trồng khác nhau tới sự tích lũy của asiaticoside trong rau má Nghiên cứunày được nhóm nghiên cứu của Denis Randriamampionoma thực hiện ởMadagascar, các kết quả đưa ra cho thấy ở các vùng có khí hậu khác nhau thìhàm lượng asiaticosidetích lũy trong rau má sẽ khác nhau Theo các tác giảnày thì ở những vùng có nhiệt độ và độ ẩm lớn thường sẽ có hàm lượngasiaticoside cao hơn các vùng có nhiệt độ và độ ẩm thấp [13]

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Rau má

Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là cây rau má (Centella asiatica L)

lấy từ làng Phước Yên xã Quãng Thọ huyện Quãng Điền tỉnh Thừa Thiên Huế

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất trong quá trình nghiên cứu Thiết bị:

Hệ thống soxhlet Gerhadt 6 chỗ dùng cho loại bình 500ml

Máy lắc của Trung Quốc.

Máy sắc kí

Hình 2.6 Hệ thống sắc kí Dụng cụ: Phễu Beune, bình tam giác (100ml, 250ml, 500ml), cốc

đong (250ml, 500ml), ống nghiệm, rây 0.5mm…

Hóa chất:

Methanol: Merck (HPLC)

Màng lọc: 0.45µm (Whaman)

Asiaticoside chuẩn của Sigma (Singaphore)

Các loại hóa chất khác: ethanol, methanol, ethyl acetat…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Tất cả các thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 thí nghiệmsong song Sau đó các mẫu khảo sát của cùng một yếu tố sẽ được gọp lại đểtiến hành cô cạn, định lượng bằng sắc kí HPLC và so sánh với mẫu chuẩnasiaticoside của Sigma (Singaphore)

Khảo sát lựa chọn dung môi với 3 công thức:

Công thức 1: CT1= MethanolCông thức 2: CT2= EthanolCông thức 3: CT3= Ethyl acetat

Khảo sát tỉ lệ dung môi với 6 công thức:

Công thức 1: CT4= 40:60Công thức 2: CT5= 50:50Công thức 3: CT6= 60:40Công thức 4: CT7= 70:30Công thức 5: CT8= 80:20Công thức 6: CT9= 90:10Khảo sát thời gian chiết với 5 công thức:

Công thức 1: CT10= 3hCông thức 2: CT11= 4hCông thức 3: CT12= 5hCông thức 4: CT13= 6hCông thức 5: CT14= 7hKhảo sát nhiệt độ chiết với 3 công thức:

Công thức 1: CT15= 710CCông thức 2: CT16= 760CCông thức 3: CT17= 810CKhảo sát hàm lượng asiaticoside trong từng bộ phận rau má

Công thức 1: CT18= Rễ Công thức 2: CT19= Thân Công thức 3: CT20= Lá

Tiến hành

Tiến hành cân 9 cốc sấy, đem sấy khô ở nhiệt độ 100-150oC đến khốilượng không đổi Để nguội trong bình hút ẩm.

Cân chính xác 9 mẫu, mỗi mẫu có khối lượng 5g cho vào 9 cốc sấy Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở 60-80oC trong vòng 2 giờ Sau đó nângnhiệt độ lên 100-150oC, sấy khô liên tục trong 3h Lấy ra để nguội trong bìnhhút ẩm, đem cân ghi kết quả lần 1 Cho lại tủ sấy 100-150oC trong 30 phút,lặp lại như trên đến khối lượng không đổi

Tính kết quả

Độ ẩm theo % ( X) tính bằng công thức:

X = [(G1 - G2 ) * 100]/ (G1 – G)

Trong đó: X: Độ ẩm của thực phẩm (%)

G: Khối lượng cốc sấy (g)

G1: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử trước khi sấy (g)

G2: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử sau khi sấy (g)

2.2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng tro tổng số [6]

G2: Khối lượng chén nung và tro trắng (g)

2.2.2.3 Phương pháp chiết bằng Soxhlet

Nguyên lý

Nguyên tắc tách chiết bằng soxhlet là dung môi được đun sôi đến nhiệt

độ bay hơi đi lên trên gặp ống sinh hàn thì hơi được làm lạnh và ngưng tụ lạingấm dần vào nguyên liệu tạo điều kiện trích li các chất trong rau má Dịchtrích ly theo thời gian tăng dần lên chứa ở phần thân nhờ hệ thống thông nhaugiữa phần thân và bình cầu mà khi dịch chiết đạt độ cao nhất định sẽ chảy trở

lại bình cầu và tiếp tục được đun sôi để bay hơi Quá trình này tuần hoàn liêntục trong thời gian khảo sát Dịch chiết thu được lấy ra ở bình cầu.

Tiến hành

Cân 2g bột rau má cho vào giấy lọc buộc kĩ để tránh bột rau chảy rangoài Sau đó cho gói bột vào phần thân của bình soxhlet, còn dung môi chokhoảng 250ml vào bình cầu bên dưới rồi tiến hành tách chiết ở nhiệt độ sôicủa dung môi

Ưu, nhược điểm

Hệ thống soxhlet cho phép thu hồi lại dung môi, tiết kiện được thờigian chiết và dung môi sử dung cho quá trình chiết do dung môi bay hơi vàngưng tụ liên tục làm cho dịch chiết thay đổi tránh được sự bão hòa trong dịchchiết Tuy nhiên dịch chiết thu hồi ở bình cầu luôn chịu tác dụng của nhiệtđun sôi nên các hoạt chất có thể thay đổi tính chất và làm giảm hàm lượng thuhồi

2.2.2.4 Phương pháp sắc kí

Mẫu sau khi chiết được xử lý qua các công đoạn lọc tinh sẽ cho dịchchiết bay hơi bớt hàm lượng dung môi còn khoảng 30ml, tiến hành pha loãngdịch chiết 30 lần và lấy 50µl để chạy HPLC pha ngược

Điều kiện chạy HPLC như sau: cột C18 (150×4.6mm), pha động ethanol100%, tốc độ dòng 1.0ml/phút, tốc độ hấp phụ quang được đo ở 254nm, nhiệt

độ cột là nhiệt độ phòng Mẫu chuẩn là asiaticoside có nồng độ 2mg/ml trongethanol

Mẫu được phân tích trên hệ thống HPLC LC-20 Prominence củaShimadzu (Nhật Bản) Với đầu dò 2000, sử dụng phần mêm LC- Solution.Hóa chất để chạy sắc kí HPLC là hóa chất của Merck ( Đức) và chất chuẩncủa hãng Sigma (Singapore)

Hàm lượng asiaticoside (X) được tính theo công thức:

M AS

S

S



Trong đó: SAS: diện tích peak của asiaticoside chuẩn

SM: diện tích peak của asiaticoside trong mẫu

A: nồng độ mẫu asiaticoside chuẩn

K: hệ số pha loãng của mẫu khi chạy HPLC.

2.2.3 Phương pháp hóa sinh

2.2.3.1 Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl

Nguyên lý

Dùng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác đặc biệt để vô cơ hóa, chuyểntoàn bộ nitơ trong nguyên liệu về dạng muối (NH4)2SO4 Sau đó dùng NaOHđẩy NH3 ra và dùng hơi nước lôi cuốn NH3 ra khỏi thiết bị chưng cất vào cốchứng chứa H2SO4 0,1N dư, cuối cùng dùng NaOH 0,1N chuẩn độ lại H2SO4

dư, từ đó ta tính được hàm lượng nitơ tổng số

Tính kết quả

Nitơ toàn phần (%) = V.1,42.100/P

Trong đó:

V: số ml H2SO4 0.1N chuẩn độ

1,42: Số mg N tương ứng với 1 ml H2SO4 0.1N

P: Lượng mẫu phân tích tính bằng mg

2.2.3.2 Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand Nguyên lý

Gluxit trực tiếp khử oxy có tính chất khử Cu(OH)2 ở môi trường kiềmmạnh, làm cho nó kết tủa dưới dạng Cu2O màu đỏ gạch Số lượng Cu2O tươngứng với số lượng gluxit khử oxy

Cu2O có tính chất khử oxy, tác dụng với muối Fe3+ làm cho muối nàychuyển hóa thành muối Fe2+ ở môi trường axit

Fe2+ có tính chất khử, nên dùng KMnO4 để chuẩn độ ở môi trường axit

Từ số ml KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ Fe2+ hình thành, tra bảng để

có số mg đường glucose, maltose, lactose hoặc saccarose, nhân với hệ số phaloãng, ta có hàm lượng đường trong 100g nguyên liệu

Tóm tắt quá trình định lượng đường khử theo sơ đồ sau:

RCHO + Cu(OH)2  RCOOH + Cu2O + H2O

Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4  2FeSO4 + 2CuSO4 + H2O

10FeSO4 + KMnO4 + 8H2SO4  5Fe2(SO4)3 + 2MnSO4 + K2SO4 + 8H2OCác phương pháp định lượng glucid bằng phương pháp hoá học đềudựa vào tính chất khử của nhóm aldehy hay aceton tự do trong phân tử glucid,

cho nên muốn định lượng glucid rất phức tạp phải thuỷ phân các chất nàythành các monaosaccharid Mặt khác, các hợp chất protêin, lipid, đều ảnhhưởng đến định lượng glucid nên cần phải được khử trước khi chuẩn độglucid Do đó, trong chuẩn bị dịch thử có hai khâu kỹ thuật quan trọng cầnchú ý là:

Cách thuỷ phân: Cho 5g mẫu đã nghiền vào bình tam giác 250ml, sau

đó cho thêm 50ml nước cất vào, 5ml HCl tinh khiết và thuỷ phân trên nồicách thuỷ như sau: thuỷ phân đường saccharose duy trì nhiệt độ 700C trong 5phút

Sau khi thuỷ phân cần làm lạnh ngay dưới vòi nước nóng

Trung hoà lại bằng NaOH 30%, sau đó bằng NaOH 1N, rồi NaOH 0,1Nvới dung dịch phenolphtalein cho tới khi dung dịch chuyển màu hồng

Trong đó: G2: Khối lượng thực phẩm cân lúc đầu

1000: hệ số chuyển đổi từ mg sang g G1: Khối lượng đường nghịch chuyển hoặc đường glucose (mg)tương ứng với số ml KMnO4 0,1N đọc ở bảng

2.2.3.3 Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet

Nguyên lý

Dùng ete nóng để hòa tan và chiết rút tất cả lipid tự do trong nguyên liệutrong thiết bị Soxhlet Sau khi làm bay hơi hết ete, sấy mẫu đến khối lượng khôngđổi, cân và tính ra hàm lượng lipid trong thực phẩm

Tính kết quả

Hàm lượng lipid có trong 100g mẫu nguyên liệu như sau:

X = (a – b)*100/ c

Trong đó: X : Hàm lượng chất béo lipid tính bằng %

a : Khối lượng túi mẫu nguyên liệu trước khi chiết (gam)

b : Khối lượng túi mẫu nguyên liệu sau khi đã chiết (gam)

c : Lượng nguyên liệu để xác định các chỉ số của chất béo

2.2.3.4 Xác định hàm lượng vitamin C bằng phương pháp chuẩn độ I2 Nguyên lý

Vitamin C có thể khử dung dịch iot Dựa vào lượng iot bị khử bởivitamin C có trong mẫu, suy ra hàm lượng vitamin C

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xác định một số thành phần hóa học có trong rau má

Sự tồn tại của một số thành phần hóa học trong rau má có thể gây bấtlợi cho quá trình chiết, tinh chế asiaticoside cũnng như quá trình bảo quản sảnphẩm thu hồi sau này Với lý do đó chúng tôi tiến hành xác định một số thànhphần hóa học có trong rau má để tạo điều kiện đánh giá ảnh hưởng của cácthành phần này đối với việc thu hồi asiaticoside từ đó có biện pháp xử lý vàloại trừ sự ảnh hưởng xấu của các thành phần đó

Sau đây là kết quả một số thành phần mà chúng tôi đã xác định tínhtheo khối lượng chất khô

Bảng 3.1 Thành phần hóa học có trong rau má

STT Tên thành phần hóa học Đơn vị Hàm lượng