Nghiên cứu chiết xuất dịch chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp

Gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy, chlorophyll có tác dụng như một chất chống oxy hoá của cơ thể, có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá khả năng: quét các gốc DPPH, Hydroxyl, các anion

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này, trước tiên tôi xin gửi đến Ban giám hiệu_Trường Đại học Nha Trang, lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học và Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm lời cảm ơn và lòng tự hào được học tập tại Trường trong những năm qua

Lời cảm ơn sâu sắc xin được giành cho cô Th.S Nguyễn Thị Mỹ Trang_Bộ môn Đảm bảo Chất lượng và An toàn Thực phẩm và Th.S Đặng Xuân Cường_ Phòng Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ_Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đồ án này

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ Thực phẩm, các cán bộ Phòng Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ_Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian vừa qua

Xin giành lòng biết ơn đến cha mẹ đã tạo điều kiện cho tôi được học tập trong suốt thời gian qua

Xin cảm ơn bạn bè đã chia sẽ cùng tôi những khó khăn trong quá trình học tập tại trường

Nha Trang, ngày tháng năm 2012

Người thực hiện

Nguyễn Thị Minh Trang

MỤC LỤC Trang

LỜI CẢM ƠN -i

MỤC LỤC -ii

DANH MỤC BẢNG -iv

DANH MỤC HÌNH -vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về cây ngô (cây bắp) 4

1.1.1 Đặc điểm hình thái cây ngô 4

1.1.2 Đặc tính trồng trọt 5

1.1.3 Sản lượng ngô trong nước và trên thế giới 5

1.2 Chlorophyll, hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng 8

1.2.1 Đặc tính của chlorophyll 8

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu chlorophyll 8

1.2.3 Cấu trúc và quá trình sinh tổng hợp chlorophyll 9

1.2.4 Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll -11

1.2.5 Tác dụng của chlorophyll -13

1.2.6 Một số sản phẩm về chlorophyll trên thị trường: 14

1.3 Tình hình nghiên cứu chlorophyll trong nước và trên thế giới 16

1.3.1 Trong nước 16

1.3.2 Trên thế giới 16

1.4 Các phương pháp chiết tách và xác định chlorophyll, ưu nhược điểm 22

1.4.1 Các phương pháp chiết tách chlorophyll 23

1.4.2 Các phương pháp xác định chlorophyll 26

1.5 Mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken 28

1.5.1 Cơ sở lý thuyết 28

1.5.2 Các bước tiến hành 30

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -32

2.1 Nguyên liệu 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Phương pháp định lượng 33

2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 34

2.2.3 Phân tích và xử lý số liệu 34

2.2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 35

2.2.5 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa -41

2.3 Dụng cụ và hóa chất -42

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll 44

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll 46

3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên liệu đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll 48 3.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll sau chlorophyll 50 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll 53 3.6 Tối ưu hóa công đoạn chiết dịch chlorophyll chống oxy hóa 55 3.7 Đề xuất qui trình chiết rút chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp -61 3.8 Đánh giá sơ bộ hiệu suất thu nhận chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

2 Bảng 1.2 Sản xuất ngô Việt Nam (1961-2007) 7

3 Bảng 1.3 Các cấu trúc khác nhau của phân tử

chlorophyll

10

4 Bảng 2.1 Bảng quy đổi biến mã và biến thực 41

5 Bảng 2.2.Thiết kế thí nghiệm theo biến mã và biến thực

sử dụng mô hình Box-Behnken

41

6 Bảng 3.1 Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa 55

7 Bảng 3.2 Bảng thể hiện độ lệch chuẩn, độ tương tác và

Hình 3.2 Ảnh hưởng của loại dung môi đến hoạt tính

chống oxy hóa của chlorophyll

tính chống oxy hóa chlorophyll

Hình 3.6 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi đến

hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính

chống oxy hóa của chlorophyll

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính

chống oxy hóa của chlorophyll

54

21 Hình 3.11 Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y1 57

22 Hình 3.12 Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y2 58

26 Hình 3.15 Quy trình đề xuất chiết chlorophyll từ lá bắp 61

27 Hình 3.16 Hàm lượng chlorophyll sau mỗi lần chiết 63

28 Hình 3.17 Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll sau

mỗi lần chiết

63

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay sự biến đổi khí hậu và môi trường toàn cầu đang ở mức đáng báo động cao Con người luôn có thể phải tiếp xúc với phóng xạ, các bức xạ năng lượng cao, ngộ độc, nhiễm độc thức ăn, nấm mốc, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc diệt cỏ (dioxin), tia tử ngoại, khói thuốc lá (mỗi hơi thuốc lá sản sinh khoảng 114 gốc tự do), stress, dư thừa chất béo… Chính các yếu tố trên đã làm tăng nhanh quá trình lão hóa và mắc bệnh cho con người, như ung thư, Alzehmer,…

Chuyên gia nghiên cứu về hồng huyết cầu và khoa học gia từng đoạt giải Nobel, Bác Sĩ Hans Frischer, đã khám phá ra cấu trúc của hồng huyết cầu rất giống như cấu trúc của Chlorophyll Trong cơ thể con người, hồng huyết cầu có nhiệm vụ chuyển tải dưỡng khí cho cơ thể với chất sắt (Fe) là nhân tố của hồng huyết cầu trong khi magnesium (Mg) là nhân tố của Chlorophyll Chính điều này giúp cơ thể chúng ta biến đổi chlorophyll thành hồng huyết cầu làm gia tăng chỉ số hồng huyết cầu trong cơ thể, bổ gan, hoá giải các độc tố và tiêu trừ các chất độc trong máu Gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy, chlorophyll có tác dụng như một chất

chống oxy hoá của cơ thể, có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá (khả năng: quét các gốc DPPH, Hydroxyl, các anion, khử sắt, tạo phức chelat với các iôn hóa trị, oxy hóa lipid), ngừa ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, trị vết thương…

Cây bắp là một trong năm loại cây lương thực chủ đạo trên thế giới cũng như

ở Việt Nam Năm 2009 chỉ tính riêng huyện Khánh Vĩnh, trong tổng số 2.680 ha cây lương thực, diện tích trồng bắp trên địa bàn huyện đạt hơn 1.500 ha với năng suất 32 – 35 tạ/ ha

Ở nước ta cây bắp chủ yếu được trồng để lấy hạt, còn thân cây, lá cây, vỏ bắp và lụa bắp chủ yếu được làm thức ăn gia súc hoặc tồn tại ở dạng phế liệu nông nghiệp gây ô nhiễm môi trường Từ lá bắp, vỏ bắp,…thu nhận chlorophyll, sau vẫn

có thể sử dụng phần còn lại để sản xuất nhiên liệu sinh học từ bã chiết

Do vậy, tôi được Khoa Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nha Trang

phân công nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chiết xuất dịch chlorophyll chống oxy

hóa từ lá bắp”, với mục đích tận dụng lá bắp để thu nhận chlorophyll dùng trong

thực phẩm

Nội dung đề tài:

1) Xác định một số thông số cho quá trình chiết rút chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp: loại và nồng độ dung môi chiết, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian và nhiệt độ chiết;

2) Đề xuất qui trình chiết rút chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp;

3) Sơ bộ đánh giá hiệu suất thu nhận chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp;

Do thời gian nghiên cứu có hạn và lần đầu làm quen với nghiên cứu chlorophyll Do vậy đồ án này chắc hẳn sẽ còn có những hạn chế Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thấy cô và bạn bè để nghiên cứu này thêm hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về cây ngô (cây bắp)

Ngô, bắp hay bẹ (danh pháp khoa học: Zea mays L ssp mays) là loại cây

lương thực thuần canh bắt nguồn ở Trung Mỹ, sau đó được trồng phổ biến ở châu

Mỹ Cuối thế kỷ 15 đầu thế kỷ 16, khi có tiếp xúc của người châu Âu với châu Mỹ, bắp đã được trồng phổ biến trên toàn thế giới

1.1.1 Đặc điểm hình thái cây ngô [39]

Một vài giống ngô có thể cao tới 7m, còn chiều cao các giống ngô thương phẩm chỉ khoảng 2,5m và ngô ngọt (Zea mays var rugosa hay Zea mays var

saccharata) thường thấp hơn

Cây ngô có hình thái phát triển rất khác biệt; các lá hình mũi mác rộng bản, dài 50 – 100cm, rộng 5 - 10cm; thân thẳng, thường cao 2–3 m, nhiều mấu, với các

lá tỏa ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn Bắp ngô ôm sát thân cây và nằm dưới lá Khi còn non chúng dài ra khoảng 3cm mỗi ngày Từ các đốt ở phía dưới sinh ra một số rễ Thân cây ngô có đốt với các khớp (mấu hay mắt), các khớp cách nhau khoảng 20 – 30cm, trông tương tự thân cây tre

Các bắp ngô (bẹ ngô) là các cụm hoa cái hình bông, được bao bọc trong một

số lớp lá, và bao chặt vào thân Chúng không lộ ra cho đến khi xuất hiện các râu ngô màu vàng hung từ vòng lá vào cuối của bắp ngô Râu ngô là các núm nhụy thuôn dài trông giống như một búi tóc, ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng

Trên đỉnh của thân cây là cụm hoa đuôi sóc hình chùy chứa các hoa đực, được gọi là cờ ngô Mỗi râu ngô đều có thể được thụ phấn để tạo ra một hạt ngô trên bắp Các bắp ngô non có thể dùng làm rau ăn với toàn bộ lõi và râu, nhưng khi bắp đã già (thường là vài tháng sau khi trổ hoa) thì lõi ngô trở nên cứng và râu thì khô đi nên không ăn được

Các hạt ngô là các dạng quả thóc với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt, là kiểu

quả thông thường ở họ Hòa thảo (Poaceae), gần giống loại quả phức về cấu trúc,

ngoại trừ là các hạt riêng biệt không bao giờ hợp nhất thành một khối Hạt ngô có kích thước cỡ hạt đậu Hà Lan, bám chặt thành hàng tương đối đều xung quanh một

lõi trắng để tạo ra bắp ngô Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 – 25cm, có khoảng 200 -

400 hạt Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng, khi được nghiền thành bột, ngô tạo ra nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì Tuy nhiên, chúng không

có gluten như lúa mì nên có độ trương nở nhỏ hơn khi sử dụng cho các thức ăn dạng

nướng [39]

1.1.2 Đặc tính trồng trọt [39]

Ngô cần thời gian ban đêm dài và ra hoa trong môi trường phù hợp với nhiệt

độ lớn hơn 10°C (50°F) và biên độ ảnh hưởng này được quyết định theo di truyền

và được điều chỉnh bởi hệ thống sắc tố thực vật Tính chu kỳ theo ánh sáng có thể bị

sai lệch đối với các giống cây trồng ở khu vực nhiệt đới (thời gian ban ngày kéo dài làm cho cây phát triển rất cao và không đủ thời gian ra hoa, tạo hạt trước khi bị chết

vì sương giá) Tuy nhiên, đặc tính này hữu ích khi sử dụng ngô làm nguồn cung cấp nhiên liệu sinh học

Do ngô chịu lạnh kém nên ở khu vực ôn đới, ngô thường được trồng vào mùa xuân Hệ thống rễ nông, nên phụ thuộc nhiều vào độ ẩm của đất Là một loại thực vật C4 (thực vật có cơ chế quang hợp C4), nên chúng sử dụng nước hiệu quả hơn so với thực vật C3 như (cỏ linh lăng hay đậu tương) Chúng nhạy cảm nhất với khô hạn khi trổ bắp, lúc hoa (râu) ngô đã sẵn sàng cho việc thụ phấn Tại Hoa Kỳ,

vụ thu hoạch bội thu theo truyền thống được dự đoán là khi ngô "cao ngang đầu gối vào ngày 4 tháng 7", mặc dù các giống lai ghép hiện nay nói chung đều vượt quá tỷ

lệ phát triển này Ngô sử dụng để làm cỏ ủ chua được thu hoạch khi cây còn non và bắp chưa già Ngô ngọt được thu hoạch khi hạt ở "giai đoạn sữa", sau khi thụ phấn nhưng trước khi hình thành tinh bột, ở Mỹ là vào khoảng cuối mùa hè, đầu đến giữa

mùa thu [39]

1.1.3 Sản lượng ngô trong nước và trên thế giới [38]

 Trên thế giới

Ngô là cây lương thực được gieo trồng nhiều nhất tại châu Mỹ (riêng tại Hoa

Kỳ, sản lượng là khoảng 270 triệu tấn/ năm) Các giống ngô lai được ưa chuộng hơn

so với các giống ngô thông thường, do năng suất cao

Ngành sản xuất ngô trên thế giới tăng liên tục từ đầu thế kỉ 20 đến nay, nhất

là trong hơn 40 năm gần đây, ngô là cây trồng có tốc độ tăng trưởng về năng suất là cao nhất trong các cây lương thực chủ yếu Năm 1961, năng suất ngô trung bình của thế giới chỉ chưa đến 20 tạ/ha, năm 2004 đã đạt 49,9 tạ/ha Năm 2007, theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kì (USDA), diện tích ngô đã vượt qua lúa nước với 157 triệu ha, năng suất 4.9 tấn/ha và sản lượng đạt kỉ lục với 766,2 triệu tấn

Kết quả trên có được trước hết là nhờ ứng dụng rộng rãi lý thuyết ưu thế lai trong chọn tạo giống, đồng thời không ngừng cải thiện các biện pháp kĩ thuật canh tác Đặc biệt, từ 10 năm nay, cùng với những thành tựu mới trong chọn tạo giống lai nhờ kết hợp phương pháp truyền thống với công nghệ sinh học thì việc ứng dụng công nghệ cao trong canh tác ngô đã góp phần đưa sản lượng ngô thế giới vượt lên trên lúa mì và lúa nước Với 52% diện tích trồng bằng giống được tạo ra bằng công nghệ sinh học, năng suất ngô nước Mỹ năm 2005 đạt hơn 10 tấn/ha trên diện tích 30 triệu hecta Năm 2007, diện tích trồng ngô chuyển gen trên thế giới đã đạt 35,2 triệu

ha, riêng ở Mỹ đã lên đến 27,4 triệu ha, chiếm 73% trong tổng số hơn 37,5 triệu ha

ngô của nước này [38]

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng ngô trên thế giới (1961-2007)

(1000 ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (1000 tấn)

thuật canh tác lạc hậu Từ những năm 1980, nhờ hợp tác với Trung tâm cải tạo Ngô

và Lúa mì Quốc tế (CIMMYT), nhiều giống ngô cải tiến đã được đưa vào trồng ở nước ta, góp phần nâng năng suất lên gần 1,5 tấn/ha vào đầu những năm 1990 Tuy nhiên, ngành sản xuất ngô ở nước ta thật sự có những bước tiến nhảy vọt là từ đầu những năm 1990 đến nay, gắn liền với việc không ngừng mở rộng giống ngô lai ra sản xuất, đồng thời cải thiện các biện pháp kĩ thuật canh tác theo đòi hỏi của giống mới

Năm 1991, diện tích trồng ngô lai chưa đến 1% trên hơn 400.000 hecta trồng ngô Năm 2007, giống lai đã chiếm khoảng 95% trong số hơn 1 triệu hecta Năng suất ngô nước ta tăng nhanh liên tục với tốc độ cao hơn trung bình thế giới trong suốt hơn 20 năm qua Năm 1980, năng suất ngô nước ta chỉ bằng 34% so với trung bình thế giới (11/32 tạ/ha), năm 1990 bằng 42% (15,5/37 tạ/ha), năm 2000 bằng 60% (25/42 tạ/ha), năm 2005 đạt 73% (36/49 tạ/ha) và năm 2007 đã đạt 81% (39,6/49 tạ/ha) Năm 1994, sản lượng ngô của Việt Nam vượt ngưỡng 1 triệu tấn, năm 2000 vượt ngưỡng 2 triệu tấn và năm 2007, chúng ta đạt diện tích, năng suất và sản lượng cao nhất từ trước tới nay Diện tích là 1.072.800 ha, năng suất là 39,6

tạ/ha, sản lượng vượt ngưỡng 4 triệu tấn là 4.250.900 tấn [38]

Bảng 1.2 Sản xuất ngô của Việt Nam (1961-2007)

1.2 Chlorophyll, hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng

1.2.1 Đặc tính của chlorophyll

Chất diệp lục (diệp lục tố, chlorophyll) là sắc tố quang tổng hợp màu xanh lá cây có ở thực vật, tảo, vi khuẩn lam Lượng chlorophyll có trong tế bào phụ thuộc

vào lượng sinh khối [25] Chúng là phân tử sinh học rất quan trọng, quyết định đến

quá trình quang hợp của cây, giúp cây tổng hợp năng lượng từ ánh sáng Chlorophyll hấp thụ mạnh ánh sáng màu xanh dương, tiếp đến màu đỏ nhưng kém hấp thụ ánh sáng màu lục trong dải quang phổ ánh sáng Do đó, màu các mô chứa

chlorophyll có màu xanh lá cây [30]

Hình 1.1 Sự phân bố chlorophyll trung bình trên bề mặt nước biển

(mg chl m -3 )

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu chlorophyll

Chlorophyll được phân lập lần đầu bởi Joseph Bienaimé Caventou and Pierre

Joseph Pelletier vào năm 1817 [6]

Năm 1913, Richard Willstatter, nhà hóa học người Đức đã chỉ ra tất cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời Cây xanh có một cách nào đó để giữ năng lượng mặt trời Năm 1919, ông đã giải thích được chức năng của chất giữ năng lượng mặt

trời chính là Chlorophyll Thực vật bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ được năng lượng bức xạ và chuyển hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể

Cấu trúc tổng quát của chlorophyll được Hans Fischer tìm ra vào năm 1940

và đến năm 1960 cấu trúc lập thể của chlorophyll a đã được làm sáng tỏ hoàn toàn

1.2.3 Cấu trúc và quá trình sinh tổng hợp chlorophyll

 Cấu trúc chlorophyll

Cấu trúc chung của chlorophyll được làm sáng tỏ bởi Hans Fischer vào năm

1940 Năm 1960, hầu hết các lập thể của chlorophyll đã được biết đến, Robert Burns Woodward đã xuất bản một tổng hợp tổng số về phân tử Năm 1967, việc giải

thích lập thể còn lại cuối cùng đã được hoàn thành bởi Ian Fleming [9] Chlorophyll

f được công bố tồn tại ở vi khuẩn lam và các vi sinh vật hiếu khí khác có khả năng

hình thành stromatolites, năm 2010 [5] Chlorophyll có công thức phân tử là

C55H70O6N4Mg và cấu trúc 2-formyl-chlorophyll đã được phân tích dựa trên NMR,

quang học và phổ khối [24]

Chlorophyll có nhân porphyrin Nhân porphyrin do 4 vòng pyrol liên kết nhau qua cầu nối ethyl tạo thành vòng kín với tâm là Mg Bên cạnh đó còn có vòng phụ thứ 5 Nhân porphyrin có 2 gốc rượu methanol (CH3OH) và fythol (C20H39OH) nối nhau tại vị trí C10 và C7, và 10 nối đôi tạo cơ sở cho quá trình quang hóa

Sự khác nhau giữa chlorophyll a và chlorophyll b là tại vị trí C7 ở chlorophyll a là nhóm -CH3, còn ở chlorophyll b là nhóm -CHO [33]

Cấu trúc chlorophyll a Cấu trúc chlorophyll b Cấu trúc chlorophyll d

Hình 1.2 Cấu trúc các phân tử chlorophyll

Một số cấu trúc khác nhau của chlorophyll được tóm tắt dưới bảng sau:

Bảng 1.3 Các cấu trúc khác nhau của phân tử chlorophyll

Diệp lục tố a Diệp lục tố b

Diệp lục tố c1

Diệp lục tố c2

-H

CH=CHCOO

-H

-CH2CH2COO-Phytyl

Các loại tảo khác nhau

Các loại tảo khác nhau

Vi khuẩn lam

(cyanobacteri

a)

 Quá trình sinh tổng hợp chlorophyll

Ở thực vật, chlorophyll có thể được tổng hợp từ succinyl-CoA và glycine, mặc dù tiền chất trước đó để hình thành chlorophyll a và b là protochlorophyllide Trong thực vật hạt kín, bước cuối cùng trong quá trình chuyển đổi protochlorophyllide thành chlorophyll, có sự phụ thuộc vào ánh sáng và thực vật có màu nhạt nếu được trồng trong bóng tối Thực vật không mạch và các loại tảo xanh,

có một enzyme bổ sung không phụ thuộc vào ánh sáng và phát triển màu xanh ngay

cả trong bóng tối Chlorophyll được gắn kết với protein và có thể chuyển năng

lượng hấp thụ theo hướng yêu cầu [13]

1.2.4 Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll

Chlorophyll và các dẫn xuất của nó được biết đến là các chất có hoạt động chống oxy hóa Việc tiêu thụ các loại rau lá, giàu chlorophyll và các dẫn xuất của nó như chlorophyllin, có liên quan đến việc giảm một số loại bệnh ung thư Vì vậy, việc áp dụng một chế độ ăn uống giàu chlorophyll có thể ngăn ngừa hoặc trì hoãn

sự khởi đầu của một số bệnh như ung thư, đó là các biểu hiện lão hóa được gây ra bởi các gốc tự do.Các nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng, các dẫn xuất của

chlorophyll, như chlorophyllin, đã cho thấy hoạt tính chống oxy hóa ít nhất là như vitamin C Các chức năng của chlorophyll đối với động vật được biết đến là giúp ức chế quá trình peoroxy hóa lipid và bảo vệ ty thể khỏi sự hư hại gây ra bởi các gốc tự

do khác nhau và các loại phản ứng oxy hóa khác Chlorophyllin cũng được báo cáo

là giúp ngăn chặn các bức xạ gây biến đổi DNA và tổn thương màng ty thể [37]

Chất chống oxy hóa và hoạt động antimutagenic của các dẫn xuất của chlorophyll trong chế độ ăn uống đã được đánh giá Hoạt tính chống oxy hóa được xác định bằng khả năng của mỗi hợp chất sau đây trong việc nhặt gốc tự do như 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS +) Hoạt động Antimutagenic đã được khảo nghiệm với một chủng vi khuẩn vi hình gây đột biến đảo ngược, bằng cách sử dụng vi khuẩn Salmonella typhimurium TA100 và benzo[a]pyrene như một chủng thử nghiệm và gây đột biến tương ứng Các chất dẫn xuất của chlorophyll a đã cho thấy là có khả năng bắt gốc tự do hiệu quả hơn so với các dẫn xuất của chlorophyll b Hơn nữa, các dẫn xuất kim loại tự do của chlorophyll như chlorins, pheophytins, và pyropheophytins cho thấy có khả năng chống oxy hóa thấp hơn các dẫn xuất kim loại như Mg-chlorophyll, Zn-pheophytins, Zn-pyropheophytins, Cu-pheophytina, and Cu-chlorophyllins Những kết quả này đã chứng minh rằng các dẫn xuất của chlorophyll trong chế độ ăn uống ở cả hai loại thực phẩm tươi và thực phẩm chế biến, chế độ ăn uống bổ sung có tác dụng chống oxy hóa và hoạt động

antimutagenic [22]

Nghiên cứu về chlorophyll từ bột Spirulina (Spirulina sp.) đã được thực hiện

để xác định hàm lượng chlorophyll a, so sánh mô hình suy thoái và suy thoái động học của chlorophyll a và chiết xuất thô, cũng như điều tra sự khác biệt của hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll khi có chiếu xạ hoặc không có chiếu xạ Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll a được xác định bằng cách phương pháp DPPH Kết quả cho thấy rằng hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll a được tăng lên sau 60

phút chiếu xạ [28]

Hoạt động của chất chống oxy hóa của chiết xuất trà xanh hoặc trà có nguồn gốc polyphenol đã được nghiên cứu rộng rãi Tuy nhiên, hoạt động của chất chống oxy hóa trong các phần không có polyphenolic của trà xanh thì ít được phân tích Trong nghiên cứu này, họ đã phân tích hoạt động chống oxy hóa của các phần không chứa polyphenolic của phần trà xanh còn lại (Camellia sinensis) sau khi chiết xuất bằng nước nóng bằng việc sử dụng phương pháp clorua nhôm Phần không chứa polyphenolic của trà xanh còn lại gây ra sự ức chế đáng kể đối với hydroperoxide từ sự oxy hóa axit linoleic theo cách phụ thuộc vào liều Khi tập trung các phần không chứa polyphenolic được áp dụng cho tấm silicagel TLC và phát triển, sáu điểm màu đã được quan sát, chúng được cho là chlorophyll a và b, pheophytins a và b, carotenoid, như beta-carotene và lutein Mặc dù tất cả các sắc tố đều biểu hiện hoạt động của các chất chống oxy hóa quan trọng, mức độ của hoạt động ức chế chống lại hydroperoxide của chlorophyll a> lutein> pheophytin a> chlorophyll b> beta-carotene > pheophytin b Những kết quả này cho thấy rằng phần không chứa polyphenolic trong phần trà xanh còn lại, có hoạt tính ức chế mạnh chống lại hệ hydroperoxide từ sự oxy hóa axit linoleic, nó có nguồn gốc từ hoạt động chống oxy hóa của chlorophyll a và b, pheophytins a và b, beta-carotene

và lutein Phát hiện này cũng có nghĩa là sự kết hợp của các phần polyphenol tan trong nước với các sắc tố chống oxy hóa có trong phần không chứa polyphenolic

của trà xanh, sẽ có hiệu quả hơn để ngăn chặn các bệnh mãn tính [14]

1.2.5 Tác dụng của chlorophyll

Chlorophyll được đăng kí như một phụ gia thực phẩm ( chất nhuộm màu) và

số E của nó là E140 Các đầu bếp sử dụng chlorophyll để tạo màu sắc đa dạng cho

thực phẩm và các loại đồ uống có màu xanh lá cây như mì ống và absinthe [2]

Chlorophyll không tan trong nước nên đầu tiên nó được trộn với một lượng nhỏ dầu thực vật để có được những giải pháp mong muốn Chiết xuất chlorophyll lỏng được coi là không ổn định và luôn luôn biến đổi cho đến năm 1997, khi Frank S.& Lisa Sagliano sử dụng việc làm đông khô chlorophyll lỏng tại trường đại học tại Florida,

ổn định nó ở dạng bột, bảo quản và để sử dụng trong tương lai

Ngoài ra, chlorophyll còn có nhiều tác dụng trong y học [36] :

- Giúp cải thiện tính năng tinh lọc máu tự nhiên của cơ thể

- Chống thiếu máu ,vi chất trong quá trình tạo hemoglobin

- Tăng số tế bào hồng cầu, làm các tế bào mạnh thêm

- Tăng lượng máu

- Tăng cường các phản ứng miễn dịch chủ yếu trong cơ thể

- Chống lại các chất độc tố/ Chống lại chất gây ung thư

- Giúp cơ thể thải loại các chất cặn bã

- Ngăn ngừa sự suy hô hấp

- Làm dịu thấp khớp

- Giúp phòng chống các bệnh tim mạch, các dấu hiệu sớm tuổi già

- Tăng cường chức năng thận và bàng quan

- Giảm giãn tĩnh mạch

- Tăng cường chức năng tiêu hoá

- Chống táo bón bằng việc tăng cường sự lưu thông của đường mật

- Cải thiện tình trang đái tháo đường

- Chống các bệnh về tuyến giáp

- Tăng cường chức năng gan và cải thiện vấn đề gan

- Giảm chóng mặt

- Chống mất ngủ

- Giảm thiếu máu não

1.2.6 Một số sản phẩm về chlorophyll trên thị trường:

 Chlorophyll Fibersol Plus:

Diệp lục trong sản phẩm Chlorophyll Fibersol Plus được lấy từ cỏ linh lăng Trong tiếng Arab cỏ linh lăng nghĩa là "cha của thực phẩm", vì nó tốt cho sức khỏe, rễ

cây đâm sâu xuống lòng đất 30feet do vậy có thể hút rất nhiều loại chất khoáng: Canxi, sắt, magie

- 1 gói= dinh dưỡng chứa trong 1kg rau xanh

- Cỏ linh lăng chứa hàm lượng diệp lục cao gấp 4 lần so với các loại rau thông thường, 1 gói Chlorophyll Fibersol Plus chứa lượng dinh dưỡng có trong 1 kg rau xanh, do vậy có thể nói rằng đây là phương pháp tự nhiên tuyệt vời để cải thiện sức khỏe con người

 Chiết xuất diệp lục (Liquid chlorophyll- synerry):

- Sản phẩm được nghiên cứu và sản xuất tại Mỹ Tập đoàn Synergy - Nature's Sunshine là nhà nhập khẩu cỏ Linh Lăng lớn nhất

toàn cầu Tập đoàn sử dụng cỏ Linh Lăng để chiết xuất ra

chất diệp lục

- Sản phẩm của tập đoàn chứa 8 loại Enzym cơ bản

ở dạng tự nhiên, các vi lượng và khoáng chất, hoàn toàn

không có hoá chất, chất bảo quản và độc tố gây hại cho cơ

thể người

Ngoài ra còn một số sản phẩm khác như:

Hình 1.3 Các sản phẩm về chlorophyll trên thị trường

1.3 Tình hình nghiên cứu chlorophyll trong nước và trên thế giới

1.3.1 Trong nước

Nghiên cứu chlorophyll trong nước chủ yếu áp dụng cho việc đánh giá năng suất sinh học sơ cấp ở vùng sinh thái biển ven bờ, thông qua việc đánh giá hàm lượng chlorophyll a, số liệu được thu thập thông qua các đơn vị gam Chlorophyll a/m3 hay gam Chlorophyll a/m2

1.3.2 Trên thế giới

Methanol được biết đến là dung môi thích hợp nhất để trích xuất chlorophyll

từ dòng Nannochloropsis gaditana, bằng cách áp dụng Lichtenthaler 1983 [21], sau

24 giờ chiết tách Hơn nữa, ngoài khả năng ly giải của dung môi còn có việc sử dụng các kỹ thuật bổ sung phá vỡ vách tế bào, giúp tăng năng suất chiết tách Kĩ thuật làm đông hay không làm đông với N2 lỏng được cho thấy là hiệu quả hơn so với việc sử dụng siêu âm trong 15 phút để giải nén các sắc tố bền hơn, chẳng hạn như carotenoid Dung môi ưa nước như methanol đóng vai trò chính trong việc chiết tách, mà không chịu ảnh hưởng của việc sử dụng các phương pháp gián đoạn vật lý hay cơ học

Hầu hết các phương pháp để đánh giá chlorophyll được tìm thấy đã được phát triển để đánh giá mức độ dinh dưỡng của các vùng biển Chlorophyll thường là các tham số được sử dụng như các chỉ số dinh dưỡng, chủ yếu là do mối quan hệ giữa hàm lượng các sắc tố này với số lượng của sinh khối tảo là khá trực tiếp Sinh khối tảo được liên kết mạnh mẽ để có thể nhìn thấy bằng chứng của hiện tượng phú

dưỡng Định lượng chlorophyll a sẽ dễ dàng hơn sinh khối tảo của chính nó [3, 7]và

có thể được sử dụng như một phương pháp gián tiếp để xác định số lượng sinh khối tảo

Nhưng khó khăn của sự đánh giá này là sự biến đổi của hàm lượng chlorophyll a trong mỗi loài (từ 0,1 đến 9,7% trọng lượng khô tế bào), cững như việc lựa chọn phương pháp định lượng phù hợp, có tính đến sự khác biệt về sức đề

kháng của vách tế bào Trong thực tế, nguồn gốc của vật liệu sinh học quyết định

đến việc lựa chọn phương pháp tốt nhất

Hình 1.4 Thống kê các phương pháp nghiên cứu chlorophyll

Mackinney (1941)

Porra (1989)

Lichtenthaler (1983)

Jeffrey (1975)

Strickland (1968)

Unesco (1968)

Dung môi chiết

Pepe và cộng sự [23] đã giới thiệu hai phương pháp chiết tách khác nhau cho

việc định lượng chlorophyll a Một có liên quan đến ethanol và một là việc sử dụng methanol lạnh Sự khác biệt được quan sát vào năng suất chiết tách đã được giải thích bởi các thành phần thực vật tảo phù du, theo các chủng vi tảo chiếm ưu thế Các phương pháp chiết tách bằng ethanol đã cho kết quả tốt hơn đối với chủng chiếm ưu thế Chlorophyceae và Dinophyceae, trong khi phương pháp chiết tách bằng methanol lại cho thấy là thuận lợi hơn đối với các chủng khác như Bacillariophyceae Điều này có nghĩa là khả năng chiết tách của dung môi phụ thuộc vào khả năng hydrat hóa và tính thấm của thành tế bào vi tảo Một phần từ sự ảnh hưởng của cấu tạo thành tế bào trong sự đánh giá chlorophyll, sự biến đổi của

sắc tố trong quá trình chiết tách [21] cũng như sự ảnh hưởng của các sắc tố khác lên

sắc tố chlorophyll, có thể gây ra sự phức tạp trong việc xác định nó và dẫn đến sai sót trong ước tính

Louda và Monghkonsri đã so sánh ước tính quang phổ hàm lượng chlorophyll với các kết quả thu được bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Họ

kết luận rằng đánh giá quang phổ chlorophyll bằng việc sử dụng UNESCO [32] và phương trình của Jeffrey và Humphrey [16] đã cho kết quả tuyệt vời Những cộng

sự trong hai nghiên cứu này cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa hai phương pháp được giới thiệu Phân tích quang phổ là ít tốn kém và nhanh hơn nhiều

so với phân tích HPLC, là một công cụ tốt để đánh giá thường xuyên chlorophyll Nannochloropsis gaditana chỉ có chlorophyll a, do đó việc đánh giá tổng số

chlorophyll là tương đương với việc đánh giá cụ thể một loại sắc tố Có một số phương pháp có sẵn để định lượng chlorophyll Các bước thông thường của việc tiến hành dựa trên quang phổ bao gồm:

1 tách các tế bào vi tảo nổi trên mặt nước

2 chiết tách các sắc tố với một dung môi hữu cơ

3 sử dụng quang phổ để xác định nồng độ của chlorophyll trong chiết tách

Việc lựa chọn dung môi để thúc đẩy quá trình chiết tách là một vấn đề rất quan trọng vì nó quyết định mức độ của mối quan hệ với các thành phần hóa học của các chất được chiết tách Ngoài khả năng hòa tan các hợp chất được chiết tách

và định lượng, dung môi còn đóng vai trò quan trọng trong ly giải tế bào Dung môi tích cực hơn có thể làm tăng năng suất chiết tách đối với cả vách tế bào cứng Methanol là dung môi đầu tiên được sử dụng để chiết tách, nhưng do độc tính của

nó, nó đã được thay thế bằng các dung môi khác Theo khuyến nghị Edler [20], đến

năm 1995, việc đánh giá hàm lượng chlorophyll được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp chiết tách với acetone Kể từ đó, việc sử dụng ethanol như một dung môi chiết tách đã được đề xuất

Trong kĩ thuật phá vỡ vách tế bào, hai nhóm chính có thể được sử dụng là:

cơ học và phi cơ học Trong nhóm đầu tiên, siêu âm được sử dụng trong một số các phương pháp thử nghiệm Trong số các kĩ thuật phi cơ học của ly giải tế bào, có quá trình hóa học liên quan đến đến dung môi sử dụng và phương pháp vật lý, chẳng

hạn quá trình làm đông hay không làm đông [5] Quá trình cuối cùng này có thể

được thực hiện chậm hay nhanh chóng (bằng cách sử dụng nitơ lỏng) để tạo ra một

cú sốc nhiệt lớn trong vật liệu sinh học, làm tăng hiệu quả phá vỡ thành tế bào Thời gian tiếp xúc giữa các hợp chất tế bào được chiết tách với dung môi có thể là yếu tố quyết định đến số lượng sản phẩm chiết Khi ly giải tế bào, nồng độ của dung môi không nên quá cao để tránh gây thiệt hại đến các hợp chất cần được chiết tách Một khoảng thời gian chiết tách dài hơn sẽ làm tăng hiệu quả của quá trình này

Để đơn giản hóa việc so sánh các phương pháp khác nhau và việc xác định các ảnh hưởng của mỗi bước trong một phương pháp chiết tách, các định nghĩa sau đây được đề xuất:

- Một phương pháp phân tích được thực hiện bởi một tập hợp các hạng mục khác nhau hoặc các thủ tục cần thiết để hoàn thành việc đánh giá các sắc tố được nghiên cứu

- Mỗi hạng mục hoặc thủ tục được mô tả bởi một thời gian cụ thể được rút ngắn

 Kết quả:

Sử dụng methanol như một dung môi chiết tách để định lượng nồng độ chlorophyll a, kết quả thu được đối với Mackinney 1941, là tốt hơn so với Porra và cộng sự Theo cả hai nghiên cứu trên, một sự gia tăng trong năng suất chiết tách chlorophyll a được quan sát thấy khi có sự tham gia của quá trình cơ học hoặc vật lý

để phá vỡ vách tế bào, quá trình đóng băng hay không đóng băng cho kết quả cao nhất, còn siêu âm dẫn đến sự lây lan kết quả

Khi sử dụng dung môi acetone, kết quả năng suất chiết tách chlorophyll a thấp hơn nhiều so với mẫu sử dụng dung môi methanol Đối với acetone, chỉ có các mẫu làm đông/không làm đông mới cho kết quả gần với các mẫu thu được với methanol, nhưng với tương quan kém thuận lợi của Porra và cộng sự Nó được khẳng định là một bước ly giải tế bào dẫn đến sự lây lan kết quả

Khi các mẫu được áp dụng với các điều kiện như nhau, ba nghiên cứu này được sử dụng cho kết quả gần giống nhau, chúng được mong đợi để tính đến sự tương tự của các phương trình thực nghiệm liên quan

Ethanol là dung môi ít được sử dụng cho việc chiết tách và định lượng các sắc tố Ở đây chỉ có Kaczmar đã được thử nghiệm Kết quả thu được cho thấy phương pháp này là khá tốt hơn so với mẫu thu được với acetone, nhưng chúng có cùng bậc độ lớn với mẫu thu được với methanol Trong trường hợp này, các kỹ thuật phá vỡ vách tế bào không góp phần đáng kể vào việc chiết tách chlorophyll, cho các giá trị tương tự nhau với nồng độ của nó Thủ tục tiêu chuẩn này cho thấy kết quả có sự phân tán, có lẽ là do sự không đồng nhất của các mẫu

Theo các thí nghiệm trên, phương pháp tốt nhất cho việc đánh giá hàm lượng chlorophyll a trong tế bào vi tảo biển, cho giá trị nồng độ sắc tố cao là việc sử dụng methanol là dung môi chiêt tách đối với Mackinney 1941 hoặc ethanol đối với Kaczmar

Trong thực tế, phương pháp đầu tiên có thuận lợi hơn vì thời gian chiết ngắn (20 phút), cho phép đánh giá hàm lượng chlorophyll trong cùng một ngày Với ethanol thì thời gian cần thiết để hoàn thành việc chiết tách là 24 giờ Acetone không cho thấy có hiệu quả để chiết tách chlorophyll trong loại vi tảo này, giá trị thu được là rất thấp Kết quả này không được mong đợi vì phương pháp sử dụng acetone được biết đến là phương pháp phổ biến nhất để định lượng chlorophyll trong nước như một tham số dinh dưỡng

Một khía cạnh quan trọng khác được tính đến là khả năng đề kháng tốt của vách tế bào Nannochloropsis gaditana Đã có khẳng định rằng chủng vi tảo này có một cấu trúc vững chắc mà rất khó để phá vỡ kể từ khi việc sử dụng phương pháp phá vỡ vách tế bào giúp thuận lợi cho quá trình chiết tách chlorophyll được tiết lộ

Có lẽ do hydrophylicity của nó, chỉ có một dung môi với khả năng chiết tách cao, chẳng hạn như methanol mới cho hiệu quả và khả năng phục hồi chlorophyll nhanh Các kỹ thuật phá vỡ vách tế bào khác nhau đã được thử nghiệm trong phần trước, mặc dù mục tiêu chính là đánh giá sự ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau trong việc chiết tách chlorophyll từ vi tảo Nannochloropsis gaditana Ở đây, sự chú ý được đặt vào hiệu quả của kĩ thuật phá vỡ vách tế bào cơ học và vật lý, cũng như ảnh hưởng của thời gian chiết tách đến năng suất

từ các tế bào tự dưỡng Trước đây, hầu hết các phương pháp đều sử dụng acetone làm dung môi chiết tách, và họ đã chỉ ra như là phương pháp tốt để đánh giá mức độ

ding dưỡng vùng biển [3] Tuy nhiên, việc này khẳng định dữ liệu Pepe và cộng sự

[23] và Dere và cộng sự, đã cho thấy rằng, đối với định lượng chlorophyll trong

Nannochloropsis gaditana (Eustigmatophyceae), dung môi tốt nhất là methanol

Một phương pháp quang phổ để định lượng chlorophyll là sử dụng methanol với Mackinney 1941, ngay cả không có sự có mặt của quá trình phá vỡ vách tế bào, có lợi thế hơn so với việc sử dụng ethanol với Kaczmar, thời gian đánh giá ngắn (20 phút)

Tuy nhiên năng suất chiết tách chlorophyll với methanol có thể được cải thiện bằng cách:

- Tăng thời gian chiết

- Sử dụng Lichtenthaler 1983 thay vì Mackinney 1941

- Áp dụng 15 phút siêu âm

- Sử dụng các phương pháp làm đông/không làm đông với nitơ lỏng

Ngoài ra còn có rất nhiều phương pháp tách chiết chlorophyll đã được công

bố Một số tác gia Karsten, U.,Schumann, R., Haubner, N., & Klausch, S (2005)

[18] đã dùng acetone 90% để trích ly chlorophyll trên tảo Các tác gia này đã dùng

hạt micro-bead trong quá trình đồng hóa để tăng khả năng phá vách tế bào lên gấp 3 lần các phương pháp khác Hiệu suất thu hồi chlorophyll trong nghiên cứu này đạt 39-85%

Trong một nghiên cứu khác Ronen, R., & Galun, M, (1984) [29], các tác giả

đã dùng dimethyl sulfoxide ( DMSO) để chiết tách chlorophyll từ địa y (Ramalina duriaei) Ronen cùng các cộng sự cũng sử dụng acetone 90% có bổ sung MgCO3 để tách chlorophyll ở nhiệt độ lạnh và ánh sáng mờ

Bên cạnh đó các nhà nghiên cứu Nhật bản Irijama, K., Shiraki, M., &

Yoshiuma, M (2011) [15] cũng tiến hành nghiên cứu tách chiết chlorophyll từ rau

chân vịt (spinach) bằng acetone, methanol trong điều kiện lạnh và tối

1.4 Các phương pháp chiết tách và xác định chlorophyll, ưu nhược điểm

 Cơ sở lý thuyết của phương pháp tách chiết chlorophyll

Do nhân Mg trong vòng pyron mang tính tan trong nước và kết hợp với protein màng, trong khi đó đuôi dài cacbon của gốc rượu phytol lại mang tính kị nước và hướng tới cấu trúc lipid của màng tilacoit, nên phân tử chlorophyll chủ yếu hòa tan trong các dung môi hữu cơ Tuy nhiên để tách tốt chlorophyll ra khỏi lá,

người ta không dùng ether petrol hay benzen mà dùng cồn hoặc acetone pha với một ít nước để tách được hết phân tử chlorophyll từ lá Các sắc tố thuộc nhóm carotenoit cũng được chiết tách theo phương pháp này

Chlorophyll tách rời khỏi phức hệ sắc tố vẫn có khả năng hoạt động quang hóa, tức là vẫn có khả năng bị kích thích bởi ánh sáng và khi đó có thể làm được vai trò chuyển H+ và e trung gian Hiện tượng này gọi là tính chất cảm quang của chlorophyll

1.4.1 Các phương pháp chiết tách chlorophyll

1.4.1.1 Chiết xuất với phương pháp siêu âm

Khi áp dụng âm thanh vào trong chất lỏng, các sóng âm thanh sẽ được tạo thành và di chuyển trong nước, thay đổi đều từ tình trạng áp xuất cao qua áp xuất thấp Ở giai đoạn áp xuất thấp, trong nước hình thành các bọt chân không chứa nhiều năng lượng Khi bọt chân không đủ lớn chúng sẽ nổ bùng vào bên trong (implode) trong giai đoạn áp xuất cao Khi nổ, các lực có năng lượng cao được giải phóng và sẽ tạo ra các khoảng không bị ép Tại vùng bị phát nổ sẽ hình thành áp xuất rất cao, các lực ép sẽ làm vỡ tế bào và tạo điều kiện trao đổi chất dễ dàng hơn Hiệu ứng này hỗ trợ sự chiết xuất chất lipide của tảo được dễ dàng hơn

Nếu áp dụng phương pháp chiết xuất bằng enzyme, thì lực áp siêu âm có thể

hỗ trợ enzyme thâm nhập vào tế bào một cách dễ dàng Qua đó, giải pháp này sẽ cho ra kết quả tốt hơn và nước sẽ đóng vai trò hòa tan như các dung dịch khác trong khi enzyme phân hủy các thành tế bào

1.4.1.2 Chiết soxhlet

Bộ chiết soxhlet là một loại máy móc ở phòng thí nghiệm được phát minh

năm 1879 bởi Franz Von Soxhlet [10] Ban đầu nó được thiết kế để chiết tách lipid

từ vật liệu rắn Thông thường bộ chiết soxhlet chỉ cần được yêu cầu là nơi để hòa tan các hợp chất mong muốn vào dung môi, và không hòa tan các tạp chất vào dung môi đó Nếu các hợp chất mong muốn có mức hòa tan đáng kể vào trong dung môi thì sau đó chỉ cần một quá trình lọc đơn giản là có thể phân tách các hợp chất từ các chất không hòa tan

Thông thường thì một loại nguyên liệu rắn có chứa một vài hợp chất cần tách chiết, sẽ được gói vào trong một loại giấy được làm từ giấy lọc dày, rồi được nạp vào buồng chính của bộ soxhlet (bình trụ chiết)

 Nguyên tắc hoạt động

Bộ soxhlet sẽ được đặt vào một bình có chứa dung môi để chiết tách Sau đó,

bộ soxhlet được lắp với một bình ngưng Dung môi được làm nóng để bay hơi Hơi dung môi sẽ đi lên theo ống dẫn hơi và tràn vào bình trụ chiết Bình ngưng đảm bảo hơi dung môi được làm mát, ngưng tụ rồi rơi lại xuống bình trụ chiết chứa gói mẫu Bình trụ chiết chứa mẫu sẽ từ từ được làm đầy bởi dung môi ấm, một vài hợp chất mong muốn sẽ được hòa tan vào dung môi ấm Khi bình trụ chiết gần như được làm đầy bởi dung môi, thì tự động dung môi sẽ theo ống xi-phông chạy xuống trở lại bình chứa dung môi Chu kì này được cho phép lặp lại nhiều lần trong giờ hoặc trong ngày

Trong mỗi chu kì, một phần các hợp chất không bay hơi sẽ hòa tan vào dung môi Sau nhiều chu kì, các hợp chất mong muốn sẽ được tập trung vào bình chưng cất

1.4.1.3 Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn

 Nguyên tắc

Bất kỳ dung môi nào cũng sẽ ở trạng thái siêu tới hạn nếu tồn tại ở nhiệt độ

và áp suất trên giá trị tới hạn

Đối với mỗi chất thông thường, dưới mỗi một điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở một trạng thái nào đó trong 3 trạng thái rắn, lỏng và khí Nếu nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở

đó, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical) Vật chất ở trạng thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung môi đó mang tính trung gian giữa khí và lỏng

Vì vậy khi CO2 được đưa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ, áp suất tới hạn của nó (trên TC = 310C, PC = 73,8 bar), CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn

Tại trạng thái này CO2 mang hai đặc tính: Đặc tính phân tách của quá trình

trích ly và đặc tính phân tách của quá trình chưng cất

Nó có khả năng hoà tan rất tốt các đối tượng cần tách ra khỏi mẫu ở cả 3 dạng rắn, lỏng, khí Sau quá trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần giảm áp suất thấp hơn áp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngoài còn sản phẩm được thoát ra ở bình hứng

Ở mỗi điều kiện nhiệt độ, áp suất khác nhau sẽ tương ứng với mỗi một đối tượng cần chiết tách khác nhau

 Ưu điểm của phương pháp so với các phương pháp truyền thống

 Sản phẩm có chất lượng cao: đối với tinh dầu thì có màu, mùi tự nhiên, không lẫn nhiều thành phần không mong muốn, với các hợp chất tự nhiên thì tách được các chất có hoạt tính cao

 Không còn lượng dung môi dư

 Tách các hoạt chất với hàm lượng cao

 Không gây ô nhiễm môi trường

 Là một phương pháp có công nghệ cao và an toàn với các sản phẩm tự nhiên

1.4.1.4 Một số loại dung môi chiết chlorophyll

 Acetone

Dung môi acetone được sử dụng rộng rãi trong cả hai phương pháp trắc quang và huỳnh quang Đối với phương pháp trắc quang cần ly tâm để loại bỏ ảnh hưởng của độ đục của dung dịch, nhưng với phương pháp huỳnh quang thì có thể bỏ qua vì kĩ thuật này không nhạy với độ đục ở mức độ bình thường Nếu mẫu trắng (blank) có giá trị đo huỳnh quang cao hoặc không thể xét giá trị bằng 0 cho máy huỳnh quang bằng một dung môi acetone trắng, thì có nghĩa là acetone đã bị nhiễm bẩn Sự nhiễm bẩn thông thường là do sự sánh dầu từ quá trình chế tạo các bình chứa kim loại

 Methanol

Methanol có hiệu quả hơn acetone trong một vài trường hợp Phương pháp này có thể đo huỳnh quang trực tiếp khi không cần độ chính xác cao và hàm lượng pheophitin thấp Khi cần độ chính xác cao hơn và pheophitin có mặt với lượng đáng

kể, dịch chiết methanol được làm khô và chuyển sang acetone 90% Phổ pheophitin

a và b khá nhạy với pH của môi trường trong dung môi methanol nhưng không nhạy trong dung môi acetone 90% Nếu có thể loại bỏ ảnh hưởng của pH thì có thể hiệu chỉnh trong quá trình tính toán nhưng không thể Kết quả của những ảnh hưởng này là những biểu hiện không theo qui tắc nào trong các phép xác định trắc quang cũng như phương pháp đo huỳnh quang

 DMSO (dimethyl sunfoxide)

Dung môi này có hiệu quả khi ngâm chiết các loại tảo nâu, một loại không bị ngâm chiết bởi các dung môi khác Dung môi này cho phép ngâm chiết hầu như hoàn toàn các loại tảo, chúng không để lại một chút sắc tố nào trong bã thải Dường

như DMSO phá vỡ các thể hạt bên trong và cấu trúc màng của tảo nâu và tảo lam

1.4.2 Các phương pháp xác định chlorophyll

Có 4 phương pháp xác định chlorophyll

+ Phương pháp trắc quang

+ Phương pháp huỳnh quang

+ Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng ( HPLC)

+ Phương pháp điện hóa

Phương pháp huỳnh quang có độ nhạy cao hơn phương pháp trắc quang, do

đó, đối với các mẫu có hàm lượng chlorophyll nhỏ, phương pháp huỳnh quang sẽ

ưu tiên được sử dụng

HPLC là thiết bị phức tạp hơn nhưng vẫn dựa trên nguyên tắc của phương pháp huỳnh quang và trắc quang

Phương pháp điện hóa xác định chlorophyll a bằng cực phổ tuần hoàn trực tiếp thông qua điện cực màng carbon (SPCE) thu được mũi đơn thuận nghịch oxy hóa tại cực dương ở EV = +400 mV, điện cực so sánh là Ag/AgCl Theo kết quả

nghiên cứu cho thấy là chlorophyll a hấp thụ trên bề mặt màng SPCE Hiện tượng hút bám này cho phép phát triển phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll a dựa trên sự trao đổi trung gian bằng cực phổ tích góp hòa tan (AdSV) Phương thức cuối cùng để tối ưu phương pháp là khảo sát pH của dung dịch đệm tích góp, thời gian tích góp và lượng acetone của đệm tích góp Sử dụng phương pháp tối ưu này

để xác định hàm lượng chlorophyll a trong dung dịch đệm phosphate với nồng độ khoảng 0,014-2,24µM

1.4.2.1 Phương pháp huỳnh quang

a Phương pháp đo trực tiếp: phương pháp này cho phép xác định chlorophyll trong

phiêu sinh vật mà không cần chiết hay xử lí hóa học

Phương pháp đo huỳnh quang trực tiếp này có thể thực hiện theo 2 cách:

- Đo trên dòng chảy liên tục áp dụng cho giám sát môi trường

- Đo trên mẫu nước riêng lẻ tại hiện trường hoặc phòng thí nghiệm

Thiết bị cho phương pháp đo trực tiếp này là máy đo huỳnh quang hiện trường 10-AU hay máy huỳnh quang cho phòng thí nghiệm DT-700

b Phương pháp ngâm chiết (gián tiếp):

Các phép đo huỳnh quang trong dung môi ngâm chiết từ các tế bào bị phá vỡ thường được dùng để xác định lượng tuyệt đối của chlorophyll hiện diện và lượng sản phẩm phân hủy chính pheophytin (chlorophyll bị mất ion Mg)

Hầu hết các thí nghiệm thông thường, chất liệu được quan tâm là chlorophyll

a và pheophitin a

 Lưu ý trong quá trình chiết tách chlorophyll:

Vấn đề quan trọng trong xác định chlorophyll bằng phương pháp ngâm chiết luôn là việc tách định lượng chlorophyll ra khỏi tế bào Có 3 hệ dung môi dùng trong toàn bộ các thí nghiệm là: acetone 90%, methanol và DMSO (Dimethyl sulfoxide) Điều cần lưu ý là dù dùng bất kì phương pháp nào thì chlorophyll đều không ổn định với chất acid và ánh sáng Lượng vết acid sẽ làm cho chlorophyll chuyển thành pheophitin tương ứng Vì vậy, dụng cụ phải được trung hòa đảm bảo không có acid Ánh sáng mặt trời hay ánh sáng huỳnh quang sẽ làm chlorophyll

phân hủy rất nhanh Do đó cần tiến hành thí nghiệm ở ánh sáng dịu và dụng cụ chứa cản sáng Nên nghiền mẫu trước khi chiết Đã có nghiên cứu cho thấy rằng nghiền mẫu trước khi chiết sẽ làm tăng lượng chlorophyll tách được từ 5 – 60% Một số thử nghiệm sử dụng dung môi DMSO thì không cần nghiền

1.4.2.2 Phương pháp trắc quang

Nguyên tắc: ba dạng chlorophyll a, b, c có thể ngâm chiết bằng acetone Mỗi loại có một phổ hấp thu ánh sáng đặc trưng với peak hấp thu riêng Phần ngâm chiết acetone được phân tích trên máy so màu ở ba peak này Chiều cao peak biểu thị nồng độ chlorophyll

Phép xác định chlorophyll a bằng phương pháp trắc quang bao gồm các quá trình: lọc, phá vỡ tế bào và ngâm chiết chlorophyll a sau đó đo độ hấp thụ

1.4.2.3 Ưu nhược điểm trong việc xác định chlorophyll a bằng phương pháp trắc quang và huỳnh quang:

Độ nhạy: phương pháp huỳnh quang có độ nhạy lớn hơn 1000 lần Xử lí mẫu

cho phương pháp huỳnh quang dùng kĩ thuật ngâm chiết tương tự như phương pháp trắc quang nhưng có độ nhạy cao hơn và lượng mẫu sử dụng ít hơn

Tốc độ: phương pháp trắc quang phải đo mẫu ở một vài bước sóng, trong khi

phương pháp huỳnh quang chỉ cần đo ở một bước sóng

Chọn bước sóng đo: với máy huỳnh quang kết quả đo không phụ thuộc vào

việc chọn bước sóng

Cuvet: phương pháp huỳnh quang không phụ thuộc quá nhiều vào vị trí cũng

như sự tương thích của cuvet

1.5 Mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken

- Cho phép xác định điều kiện tối ưu đa yếu tố của đối tượng nghiên cứu một cách khá chính xác bằng các công cụ toán học thay cho cách giải gần đúng, tìm tối

ưu cục bộ như ở các thí nghiệm theo phương pháp cổ điển

Sử dụng thiết kế Behnken-Box trong thống kê để bố trí thí nghiệm tối ưu hóa Thiết kế Behnken-Box là thiết kế thử nghiệm cho phương pháp bề mặt phản ứng, được nghĩ ra bởi George EP Box và Donald Behnken vào năm 1960, nhằm đạt được các mục tiêu sau đây:

 Mỗi yếu tố, hoặc biến độc lập, được đặt tại một trong ba giá trị cách đều nhau (Ít nhất ba cấp độ là cần thiết cho mục tiêu tiếp theo)

 Thiết kế nên vừa đủ để phù hợp với một mô hình bậc hai, đó là có chứa các giới hạn bình phương và các sản phẩm của hai yếu tố

 Tỷ lệ của số lượng các điểm thử nghiệm với số lượng các hệ số trong mô hình bậc hai nên hợp lý (trên thực tế, các thiết kế thường giữ nó trong khoảng từ 1,5 đến 2,6)

 Phương sai ước tính nên nhiều hoặc ít, chỉ phụ thuộc vào khoảng cách từ trung tâm ( điều này đạt được sự chính xác cho các thiết kế với 4 và 7 yếu tố), không nên thay đổi quá nhiều bên trong khối lập phương nhỏ nhất chứa các điểm thử nghiệm

 Thiết kế với 7 yếu tố được tìm thấy đầu tiên trong khi tìm kiếm một thiết kế tài sản mong muốn liên quan đến phương sai ước lượng, và sau đó các thiết kế tương tự đã được tìm ra cho số các yếu tố khác

 Mỗi thiết kế có thể được xem như là một sự kết hợp của một thiết kế giai thừa bậc hai (đầy đủ hoặc phân đoạn) với một thiết kế khối không đầy đủ Trong mỗi khối, một số lượng nhất định các yếu tố được đặt thông qua tất cả các kết hợp cho thiết kế giai thừa, trong khi các yếu tố khác được giữ ở các giá trị trung tâm

 Thiết kế cho 8 yếu tố không có trong giấy tờ gốc Thiết kế cho số lượng các yếu

tố khác cũng đã được phát minh ra (ít nhất lên đến 21) Một thiết kế cho 16 yếu

tố tồn tại chỉ có 256 điểm giai thừa Hầu hết những thiết kế này có thể được chia thành các nhóm (các khối), mỗi mô hình sẽ có một giới hạn hằng số khác nhau,

nói một cách khác là các hằng số khối sẽ không tương quan với các hệ số khác

[11]

1.5.2 Các bước tiến hành

Bước 1: Chọn thông số nghiên cứu:

Yếu tố đầu vào Yếu tố đầu ra

(Biến tiên đoán) (Hàm mục tiêu)

(Yếu tố ảnh hưởng) (Biến đáp ứng)

- Phải chọn hàm mục tiêu

- Chọn biến tiên đoán

Phân tích từ các biến tiên đoán để chọn ra các yếu tố ảnh hưởng chính, loại

bỏ những yếu tố không cần thiết nhằm đảm bảo tính khả thi và tính hiệu quả của thực nghiệm Những biến tiên đoán này phải điều khiển, kiểm tra, khống chế, kiểm soát được nó

Bước 2: Xác định miền thí nghiệm

Miền thí nghiệm là khu vực trong đó các nhân tố biến thiên hay nói cách khác đó là miền mà chúng ta tiến hành thí nghiệm

Để xác định miền thí nghiệm có 3 cơ sở:

+ Dựa vào lý thuyết

+ Tham khảo các công trình nghiên cứu đã công bố

Bước 5: Kiểm định hệ số và phương trình

Bước 6: Tối ưu hóa