Có 4 phương pháp xác định chlorophyll + Phương pháp trắc quang.
+ Phương pháp huỳnh quang.
+ Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng ( HPLC). + Phương pháp điện hóa.
Phương pháp huỳnh quang có độ nhạy cao hơn phương pháp trắc quang, do đó, đối với các mẫu có hàm lượng chlorophyll nhỏ, phương pháp huỳnh quang sẽ ưu tiên được sử dụng.
HPLC là thiết bị phức tạp hơn nhưng vẫn dựa trên nguyên tắc của phương pháp huỳnh quang và trắc quang.
Phương pháp điện hóa xác định chlorophyll a bằng cực phổ tuần hoàn trực tiếp thông qua điện cực màng carbon (SPCE) thu được mũi đơn thuận nghịch oxy hóa tại cực dương ở EV = +400 mV, điện cực so sánh là Ag/AgCl. Theo kết quả
nghiên cứu cho thấy là chlorophyll a hấp thụ trên bề mặt màng SPCE. Hiện tượng hút bám này cho phép phát triển phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll a dựa trên sự trao đổi trung gian bằng cực phổ tích góp hòa tan (AdSV). Phương thức cuối cùng để tối ưu phương pháp là khảo sát pH của dung dịch đệm tích góp, thời gian tích góp và lượng acetone của đệm tích góp. Sử dụng phương pháp tối ưu này để xác định hàm lượng chlorophyll a trong dung dịch đệm phosphate với nồng độ khoảng 0,014-2,24µM.
1.4.2.1. Phương pháp huỳnh quang
a. Phương pháp đo trực tiếp: phương pháp này cho phép xác định chlorophyll trong
phiêu sinh vật mà không cần chiết hay xử lí hóa học.
Phương pháp đo huỳnh quang trực tiếp này có thể thực hiện theo 2 cách: - Đo trên dòng chảy liên tục áp dụng cho giám sát môi trường.
- Đo trên mẫu nước riêng lẻ tại hiện trường hoặc phòng thí nghiệm.
Thiết bị cho phương pháp đo trực tiếp này là máy đo huỳnh quang hiện trường 10-AU hay máy huỳnh quang cho phòng thí nghiệm DT-700.
b. Phương pháp ngâm chiết (gián tiếp):
Các phép đo huỳnh quang trong dung môi ngâm chiết từ các tế bào bị phá vỡ thường được dùng để xác định lượng tuyệt đối của chlorophyll hiện diện và lượng sản phẩm phân hủy chính pheophytin (chlorophyll bị mất ion Mg).
Hầu hết các thí nghiệm thông thường, chất liệu được quan tâm là chlorophyll a và pheophitin a.
Lưu ý trong quá trình chiết tách chlorophyll:
Vấn đề quan trọng trong xác định chlorophyll bằng phương pháp ngâm chiết luôn là việc tách định lượng chlorophyll ra khỏi tế bào. Có 3 hệ dung môi dùng trong toàn bộ các thí nghiệm là: acetone 90%, methanol và DMSO (Dimethyl sulfoxide). Điều cần lưu ý là dù dùng bất kì phương pháp nào thì chlorophyll đều không ổn định với chất acid và ánh sáng. Lượng vết acid sẽ làm cho chlorophyll chuyển thành pheophitin tương ứng. Vì vậy, dụng cụ phải được trung hòa đảm bảo không có acid. Ánh sáng mặt trời hay ánh sáng huỳnh quang sẽ làm chlorophyll
phân hủy rất nhanh. Do đó cần tiến hành thí nghiệm ở ánh sáng dịu và dụng cụ chứa cản sáng. Nên nghiền mẫu trước khi chiết. Đã có nghiên cứu cho thấy rằng nghiền mẫu trước khi chiết sẽ làm tăng lượng chlorophyll tách được từ 5 – 60%. Một số thử nghiệm sử dụng dung môi DMSO thì không cần nghiền.
1.4.2.2. Phương pháp trắc quang
Nguyên tắc: ba dạng chlorophyll a, b, c có thể ngâm chiết bằng acetone. Mỗi loại có một phổ hấp thu ánh sáng đặc trưng với peak hấp thu riêng. Phần ngâm chiết acetone được phân tích trên máy so màu ở ba peak này. Chiều cao peak biểu thị nồng độ chlorophyll.
Phép xác định chlorophyll a bằng phương pháp trắc quang bao gồm các quá trình: lọc, phá vỡ tế bào và ngâm chiết chlorophyll a sau đó đo độ hấp thụ.
1.4.2.3. Ưu nhược điểm trong việc xác định chlorophyll a bằng phương pháp trắc
quang và huỳnh quang:
Độ nhạy: phương pháp huỳnh quang có độ nhạy lớn hơn 1000 lần. Xử lí mẫu
cho phương pháp huỳnh quang dùng kĩ thuật ngâm chiết tương tự như phương pháp trắc quang nhưng có độ nhạy cao hơn và lượng mẫu sử dụng ít hơn.
Tốc độ: phương pháp trắc quang phải đo mẫu ở một vài bước sóng, trong khi
phương pháp huỳnh quang chỉ cần đo ở một bước sóng.
Chọn bước sóng đo: với máy huỳnh quang kết quả đo không phụ thuộc vào
việc chọn bước sóng.
Cuvet: phương pháp huỳnh quang không phụ thuộc quá nhiều vào vị trí cũng như sự tương thích của cuvet.