LUAN AN VIEM GAN C

ch tiet

Lời cảm ơn

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Phòng Sau

Đại học, các thầy cô, cán bộ Bộ môn Vi sinh Y học trường Đại học Y Hà Nội đã truyền đạt cho tôi kiến thức, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu trong suốt quá trình học tập

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Tường Vân - Phó trưởng khoa Vi sinh bệnh viện Bạch Mai, người thầy trực tiếp tận tâm hướng dẫn, truyền đạt cho tôi ý tưởng, kiến thức, kinh nghiệm và luôn động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Quang - Trưởng khoa

Vi sinh, TS Đoàn Mai Phương – Phó trưởng khoa Vi sinh bệnh viện Bạch Mai đã hết lòng động viên tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất để tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS TS Lê Thị Oanh, người thầy đã nghiêm túc góp ý kiến phê bình về phương pháp nghiên cứu khoa học trong quá trình tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ những lời cảm ơn chân thành nhất tới BS Nguyễn Thị Hạnh, ThS

Lê Trung Dũng, cử nhân Bùi Minh Vượng, ThS Lê Thị Ngân cùng các bạn đồng nghiệp

tổ virus miễn dịch, các anh chị trong Khoa Vi sinh bệnh viện Bạch Mai đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc, Khoa Thận nhân tạo bệnh viện Bạch Mai, BSCKII Nguyễn Cao Luận – Trưởng Khoa Thận nhân tạo đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ những tình cảm ấm áp và chân thành nhất tới gia đình, bạn bè gần xa đã động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 11 năm 2008

Trương Thái Phương

đặt vấn đề 1

Chương 1: TỔNG QUAN Tμi liệu 3

1.1 Một số vấn đề cơ bản về tình hình nhiễm HCV 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện virus viêm gan C (HCV) 3

1.1.2 Tình hình nhiễm HCV theo phân bố địa lý 4

1.2 Virus viêm gan C (HCV) 6

1.2.1 Đặc điểm cấu trúc của HCV 6

1.2.2 Sự xâm nhập và nhân lên của HCV 9

1.2.3 Phân loại HCV 9

1.2.4 Đáp ứng miễn dịch đối với HCV 11

1.3 Dịch tễ học nhiễm HCV 12

1.3.1 Nguồn bệnh: 12

1.3.2 Đường lây 13

1.3.3 Vai trò dịch tễ học của genotype 14

1.4 Nhiễm HCV ở bệnh nhân chạy TNT (lọc máu) 16

1.5 Đặc điểm lâm sàng nhiễm virus viêm gan C 19

1.5.1 Viêm gan cấp 19

1.5.2 Nhiễm virus viêm gan C với viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan tiên phát 19

1.6 Chẩn đoán nhiễm HCV 20

1.6.1 Thử nghiệm phát hiện kháng thể anti-HCV: Kỹ thuật ELISA 21

1.6.2 Thử nghiệm khẳng định: 22

1.6.3 Chẩn đoán sinh học phân tử 23

1.7 Điều trị và dự phòng nhiễm virus viêm gan C 27

1.7.1 Điều trị 27

1.7.2 Dự phòng viêm gan virus C 27

Chương 2: đối tượng, vật liệu vμ phương pháp nghiên cứu 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu: 28

2.1.2 Đơn vị thực hiện và các đơn vị phối hợp tham gia nghiên cứu 28

2.2 Vật liệu nghiên cứu 28

2.2.1 Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu: 28

2.2.2 Sinh phẩm và hoá chất 28

2.2.3 Dụng cụ và máy để làm xét nghiệm 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu: 30

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 31

2.3.2 Phương pháp thu thập số liệu 32

2.3.3 Các bước tiến hành: 32

2.3.4 Các xét nghiệm: 32

2.3.5 Các kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu 33

2.4 Thu thập và xử lý số liệu 42

2.5 Các yêu cầu về đạo đức nghiên cứu: 42

Chương 3: kết quả nghiên cứu 44

3.1 Một số đặc điểm ở bệnh nhân chạy TNT chu kỳ tại bệnh viện Bạch Mai 44

3.1.1 Giới và tuổi 44

3.1.2 Thời gian chạy TNT chu kỳ 46

3.1.3 Chỉ số nồng độ men gan (AST, ALT) ở bệnh nhân chạy TNT chu kỳ 47

3.2 Tỷ lệ nhiễm HCV ở bệnh nhân chạy TNT chu kỳ 48

3.2.1 Tỷ lệ anti – HCV (+) ở bệnh nhân chạy TNT chu kỳ 48

3.2.2 Phân bố bệnh nhân anti – HCV(+) theo giới 48

3.2.3 Phân bố bệnh nhân anti-HCV(+) theo nhóm tuổi 49

3.2.4 Phân bố tỷ lệ anti – HCV(+) theo thời gian chạy TNT 49

3.2.5 Nguy cơ nhiễm HCV ở bệnh nhân chạy TNT theo thời gian lọc máu 51

3.2.6 Tỷ lệ nhiễm HCV theo tình trạng truyền máu 52

3.2.7 Chỉ số sinh hoá ở bệnh nhân chạy TNT chu kỳ nhiễm HCV 53

3.2.8 Tỷ lệ HCV-RNA(+) ở bệnh nhân có anti-HCV(+) 53

3.3 Mô tả kiểu gen (genotype)HCV ở bệnh nhân chạy TNT có HCV-RNA(+) 54

3.3.1 Phân bố kiểu gen (genotype) HCV ở bệnh nhân chạy TNT có

HCV-RNA(+) 54

3.3.2 Phân bố kiểu gen (genotype) HCV theo nhóm tuổi 55

3.3.3 Phân bố kiểu gen (genotype) HCV theo giới 56

3.3.4 Phân bố kiểu gen (genotype) HCV theo tiền sử truyền máu 56

3.3.5 Phân bố kiểu gen (genotype) HCV theo thời gian chạy TNT 57

3.3.6 Phân bố kiểu gen (genotype) HCV với định lượng HCV trong máu 58

3.4 Chỉ số xét nghiệm men gan (AST, ALT) với kết quả xét nghiệm định lượng HCV ở bệnh nhân chạy TNT có HCV-RNA(+) 60

Chương 4: Bμn luận 61

4.1 Một số đặc điểm của bệnh nhân chạy TNT chu kỳ tại bệnh viện Bạch Mai 61

4.1.1 Tuổi, giới và thời gian lọc máu 61

4.1.2 Chỉ số nồng độ men gan (AST, ALT) ở bệnh nhân chạy TNT 62

4.2 Nhiễm HCV ở bệnh nhân chạy TNT chu kỳ tại bệnh viện Bạch Mai 62

4.2.1 Tỷ lệ nhiễm HCV ở bệnh nhân lọc máu chu kỳ 62

4.2.2 Nhiễm HCV với thời gian chạy TNT chu kỳ 65

4.2.3 Nhiễm HCV với tình trạng truyền máu 66

4.2.4 Tỷ lệ HCV-RNA ở bệnh nhân chạy TNT có anti – HCV(+) 68

4.3 Kiểu gen (genotype) HCV ở bệnh nhân chạy TNT chu kỳ 68

4.3.1 Phân bố kiểu gen (genotype) HCV 68

4.3.2 Kiểu gen HCV với một số yếu tố nguy cơ ở bệnh nhân lọc máu chu kỳ 70

4.3.3 Kiểu gen HCV và nồng độ HCV-RNA trong máu 71

4.4 Sự liên quan giữa nồng độ men gan ALT, AST và định lượng virus máu 72

Kết luận 75

Kiến nghị 77

Tμi liệu tham khảo

Phụ lục

các Chữ viết tắt

ALT alanin aminotransferase

AST aspartat aminotransferase

Anti-HCV Antibody against Hepatitis C virus

CMV Cymatomegalovirus

cs ……… Cộng sự

DNA ……… Deoxyribonucleotide acide

EBV Epstein – Barr virus

HCV Hepatitis C virus (virus viêm gan C)

HCV-RNA………… Hepatitis C virus Ribonucleic Acid

IFN-α Interferon alpha

OD ……… Optical density

(mật độ quang học) PCR ……… Polymerase chain reaction

(phản ứng chuỗi polymerase) RT-PCR Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction

(phản ứng chuỗi men sao chép ng−ợc) RNA……… Ribonucleotide acide

TT virus Trong các loại virus gây viêm gan trên thì virus viêm gan B và C là hai loại thường gặp hơn cả và gây ra những hậu quả nặng nề dễ dẫn đến viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan Đây là hai loại virus gây viêm gan thường gặp nhiều ở các nước châu Phi, Nam Mỹ và châu á [13] Trong những năm gần đây virus viêm gan C (HCV) gây bệnh viêm gan C, lây truyền theo

đường máu được đặc biệt chú ý Tầm quan trọng của viêm gan C không chỉ ở tỷ

lệ nhiễm tương đối cao trên thế giới, mà còn chủ yếu do bệnh thường phát triển

10 - 20 năm Đa số các trường hợp nhiễm HCV không có triệu chứng lâm sàng, nên nhiễm HCV có thể dẫn tới xơ gan hoặc ung thư gan mà không có dấu hiệu báo trước

Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ người nhiễm virus viêm gan

B và C cao trên thế giới Các công trình nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C trong nhóm người cho máu chuyên nghiệp ở Hà Nội dao động từ 0,57- 5,5% [4,15], ở thành phố Hồ Chí Minh từ 14 - 24% [8,9] Theo nghiên cứu của Trịnh Thị Ngọc virus viêm gan C chiếm 10,2% trong viêm gan cấp, 26,3% trong viêm gan mạn và 4,3% trong xơ gan Bệnh nhân chạy thận nhân tạo và truyền máu nhiều lần là đối tượng nguy cơ bị nhiễm rất cao Ngay từ buổi đầu lọc máu, người ta đã chứng minh rõ ràng kỹ thuật này

là một nguy cơ lây nhiễm cao với virus viêm gan C (HCV) Tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C trong nhóm bệnh nhân chạy thận nhân tạo chu kỳ tăng theo thời gian chạy thận nhân tạo, theo nghiên cứu của Nguyễn Đăng Mạnh [11] tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C ở bệnh nhân chạy thận nhân tạo sau 6 tháng là 22,77% và sau 12 tháng là 42,57% Ngày nay nhờ các tiến bộ về điều trị, cũng như các kỹ thuật sàng lọc máu (sự ra đời của thuốc tăng hồng cầu Erythropoetin, kiểm soát các sản phẩm máu…) đã cho phép hạn chế sự lây nhiễm HCV Để xác định rõ hơn nhiễm virus viêm gan C trong nhóm này

chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm nhiễm virus viêm gan C (HCV) ở bệnh nhân chạy thận nhân tạo tại bệnh viện Bạch Mai” với mục tiêu sau:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C và tìm hiểu sự liên quan giữa thời gian chạy TNT với tỷ lệ nhiễm HCV ở bệnh nhân chạy TNT chu

kỳ tại bệnh viện Bạch Mai

2 Mô tả kiểu gen (genotype) của virus viêm gan C ở bệnh nhân chạy TNT có HCV-RNA(+)

3 Phân tích sự liên quan giữa kết quả xét nghiệm chức năng gan với kết quả xét nghiệm định lượng virus viêm gan C trên đối tượng này

Chương 1 TỔNG QUAN Tμi liệu

1.1 Một số vấn đề cơ bản về tình hình nhiễm HCV

1.1.1 Lịch sử phát hiện virus viêm gan C (HCV)

Các virus viêm gan A và B đã được phát hiện từ lâu trên lâm sàng nhưng đến những năm 1964 – 1967 mới xác định được bản chất Năm 1975 Prince và cộng sự phát hiện thấy ngoài viêm gan A và B có những trường hợp viêm gan nhiễm trùng không phải A, B và viêm gan “không A không B” sau truyền máu được biết đến vào những năm 70 Nhưng phải đến gần 20 năm sau người ta mới tìm ra căn nguyên gây ra căn bệnh này Năm 1989 nhóm nghiên cứu của M.Houghton, Q.L.Choo và G.Kou ở hãng Chiron (California - Mỹ) kết hợp với phòng thí nghiệm viêm gan của D.W.Bradley ở CDC (Center for Diseases Control-Trung tâm kiểm soát bệnh tật) ở Mỹ đã dùng E.Coli nhân dòng bộ gen của một virus được chứng minh là tác nhân hay gặp nhất của viêm gan “không A-không B” sau truyền máu hoặc mắc phải trong cộng đồng

và phát hiện ra một loại RNA virus gọi là virus viêm gan C [21,28,50] Đồng thời cũng trong thời gian nghiên cứu này M.Houghton cũng lai tạo được dòng vô tính của virus từ E.coli chủng C100-3 làm tiền đề cho sản xuất kít chẩn

đoán kháng thể HCV [53] Tuy nhiên phải đến năm 1995 cấu trúc của virus viêm gan C mới được quan sát và mô tả đầy đủ dưới kính hiển vi điện tử [16] HCV đã được xác nhận là tác nhân quan trọng liên quan đến viêm gan “không A-không B” sau truyền máu nguyên nhân chính trong truyền nhiễm viêm gan không A không B Tuy không sao chép qua trung gian DNA và không hoà nhập với bộ gen của tế bào ký chủ, HCV vẫn gây nhiễm virus mạn từ 80 - 85% các trường hợp nhiễm HCV, sau đó phát triển đến xơ gan và ung thư tế bào gan trong khoảng 20% bệnh nhân [75]

1.1.2 Tình hình nhiễm HCV theo phân bố địa lý

1.1.2.1 Trên thế giới

Theo Tổ chức Y tế thế giới, hiện nay có khoảng 210 triệu người(3% dân số) trên thế giới nhiễm HCV và mỗi năm có thêm 3 đến 4 triệu người mới nhiễm Tỷ lệ nhiễm HCV trên thế giới khác nhau, tuỳ theo từng quốc gia và phụ thuộc nhiều yếu tố như điều kiện kinh tế, xã hội, y tế, chủng tộc…

- Viêm gan C là một vấn đề lớn trong sức khoẻ cộng đồng, có ba khu vực được phân chia dựa vào anti-HCV

+ Vùng có tỷ lệ nhiễm thấp dưới 0,5% như các nước Đan Mạch, úc, Thuỵ Sỹ, Canada

+ Vùng nhiễm vừa với tỷ lệ từ 0,5 – 1%

+ Vùng có tỷ lệ nhiễm cao trên 1% như ở Pháp là 1,2%, trong đó 80%

có dấu hiệu HCV đang nhân lên (HCV-RNA dương tính) và người mang HCV mạn tính là 0,1%[25] ở Mỹ tỷ lệ nhiễm HCV là 1,8%, những người có nhiều bạn tình cao gấp 23 lần người chưa hoặc chỉ có một bạn tình (9% so với 0,4%)

và cao hơn nữa ở người nghiện chích ma tuý (13% so với 1%)[58]

Các nước vùng Đông nam Âu châu, Nhật Bản và nhiều nước đang phát triển khác trong đó có châu á có tỷ lệ nhiễm cao nhất có thể tới 5%

Hình1.1 Tình hình nhiễm HCV ở những người cho máu trên thế giới

(ảnh của CDC truy cập tại địa chỉ virology-online.com/viruses/Hcv.jpg)

1.1.2.2 Tại Việt Nam

- ở nước ta cho đến nay việc nghiên cứu dịch tễ học nhiễm HCV còn rất hạn chế Tỷ lệ nhiễm HCV cao thường tập trung ở đối tượng có nguy cơ cao như người mắc bệnh ưa chảy máu, người nghiện chích ma tuý, bệnh nhân lọc máu Theo Nguyễn Thu Vân, Hoàng Thuỷ Nguyên, Phạm Song, Đào Đình

Đức tỷ lệ nhiễm HCV ở trong cộng đồng dân cư nước ta là 0,4 – 1,35%

- Tỷ lệ có anti-HCV(+) tại Hà Nội khoảng 4% ở các nhân viên y tế và phụ nữ mang thai Tỷ lệ nhiễm HCV cao hơn nhiều ở người mắc bệnh ưa chảy máu 6%, đặc biệt rất cao ở những người nghiện chích ma tuý 31%, ở những người cho máu tỷ lệ đó thấp hơn 0,8% [3,4]

Nghiên cứu của Trần Thanh Dương trên các nhóm đối tượng tại Hà Nội năm 2004, tỷ lệ anti-HCV(+) ở nhóm người bình thường là 1,34%, nhóm nghiện chích ma tuý là 70,17%, nhóm gái mại dâm là 20,59%, bệnh nhân chạy TNT và truyền máu nhiều lần là 63,59%, bệnh nhân viêm gan virus 12,38%, cán bộ y tế 3,57% [1]

- Tại thành phố Hồ Chí Minh: Nhiễm HCV trong quần thể bình thường

là 3,2 – 4,2%, tỷ lệ này trội ở những bệnh nhân ưa chảy máu là 29%, đặc biệt

ở những người nghiện chích là 87 – 96,9%, tỷ lệ người cho máu là 20,6% [3,8,18]

Theo Trương Thị Xuân Liên tỷ lệ anti-HCV(+) ở một số đối tượng tại thành phố Hồ Chí Minh như sau [9]:

Bảng 1.1 Tỷ lệ anti-HCV(+) ở một số đối tượng tại thành phố Hồ Chí Minh

Nhóm đối tượng Tỷ lệ % Nhóm đối tượng Tỷ lệ %

Nhóm người bình thường 2,53 Nhóm nghi viêm gan 19,3

Bệnh nhân da liễu 6,9 Ung thư gan 23,2

Bệnh nhân HIV dương tính 73,6 Người cho máu 14

Nhóm chích ma tuý 96,2 Nhân viên y tế 3,28

1.2 Virus viêm gan C (HCV)

1.2.1 Đặc điểm cấu trúc của HCV

1.2.1.1 Hình dạng và cấu trúc của HCV

Hình 1.2 ảnh của HCV

dưới kính hiển vi huỳnh quang

Sự bắt mμu miễn dịch huỳnh quang của NS5A

trong các tế bμo HuH-7 người chứa hệ gen của

HCV( ảnh của K.Barth vμ M.Frese truy cập theo

địa chỉ www.co.monaoe.uni.us/ /hepatitis-c.gif)

Hình1.3 Hình ảnh HCV dưới kính hiển vi điện tử

- HCV thuộc họ Flaviviridae, giống Hepacivirus, hình cầu có đường

kính khoảng 45 - 65nm và có lớp bao ngoài lipoprotein với các mỏm nhô nhỏ (6nm) bao quanh một nucleocapsid 30-50nm có cấu trúc đối xứng 20 mặt như

các thành viên khác trong họ Flaviviridae [34]

+ Acid nucleic: HCV có cấu trúc RNA mạch đơn, dương, xoắn có khoảng 9.600 nucleotide Hệ gen của HCV mã hoá cho quá trình tổng hợp một polyprotein tiền chất có khoảng 3010-3033aminoacid(aa), sau đó các polyprotein này sẽ được cắt thành các protein cấu trúc và không cấu trúc [35]

+ Lớp capside: Bao xung quanh acid nucleic được cấu tạo bởi protein

+ Lớp bao ngoài: Cấu tạo bởi glycoprotein và lipid nên dễ bị bất hoạt bởi ether và chloroform

1.2.1.2 Cấu trúc phân tử HCV

- RNA virus bao gồm một khung đọc mở duy nhất (ORF) bao trùm cấu trúc gen của HCV mã hoá cho một chuỗi polypeptide lớn khoảng 3010 - 3033 aminoacid(aa) [38,50] gắn kết vào đầu 5’ và 3’ của các vùng không dịch mã (UTR-Untranslated region)

Genome của virus chia làm 3 vùng chính có hai đầu 5’ và 3’

Hình 1.5 Cấu trúc bộ gen của HCV

- Khởi đầu khung đọc mở ở vùng 5’ không phiên mã (HCV5’-UTR) gồm 341 nucleotide, là vùng bảo tồn nhất trong cấu trúc gen của HCV, có đến 90% cấu trúc hoàn toàn tương tự nhau ở các genotype HCV khác nhau Vùng này thường được sử dụng trong chẩn đoán sinh học phân tử

- Tiếp theo là các vùng mã hoá cho các protein cấu trúc và protein không cấu trúc:

+ Vùng cấu trúc (Structural region)gồm các gen mã hoá cho các protein capside (C- core) và lớp bao ngoài (E1 và E2 - envelope) tham gia cấu tạo tính kháng nguyên của các bộ phận virus nằm ở phía tận N gồm các gen C, E1, E2, P7:

* Vùng C HCV: mã hoá cho các protein cấu trúc (P19) tạo nên các nucleocapsid là thành phần capside bao xung quanh acid nucleic của virus, là vùng tương đối ổn định

* Vùng E1 HCV mã hoá cho các glycoprotein lớp bao ngoài (envelope) gp33, gp72 các glycoprotein này có cấu trúc giống với 2 hoặc 3 glycoprotein một số virus gây bệnh tiêu chảy ở bò

* Vùng E2/NS1 HCV mã hoá cho các glycoprotein lớp bao ngoài (envelope), là thành phần glycosyl hoá không phải là cấu trúc protein HCV có vùng đột biến RNA rất cao khu trú ở hai gen E1 và E2/NS1 gọi là hai vùng siêu biến (Hypervariable region-HVR là HVR1, HVR2), ở vùng E1 là HVR1

ở vị trí aa 390 – 410 và HVR2 ở vị trí aa 474 – 480 Những vùng này hay biến

đổi qua mỗi lần virus nhân lên, đôi khi tạo ra sự khác biệt giữa các gen của HCV trong cùng một bệnh nhân, có thể tạo ra những trạng thái nhiễm virus kéo dài ở 80% bệnh nhân, giúp cho HCV trốn tránh được đáp ứng miễn dịch của ký chủ làm cho tình trạng nhiễm HCV thường diễn biến sang mãn tính [44,50]

* Vùng P7 được coi là một vùng được tách ra từ vùng E2, chức năng chưa rõ, sự hiểu biết về vùng P7 còn rất ít

+ Vùng không cấu trúc (None Structural region) nằm ở phía 3’ của vùng cấu trúc có các gen mã hoá cho các protein không cấu trúc mang tính chất enzym, quyết định sự nhân lên của virus gồm các gen: NS2, NS3, NS4, NS5:

* Vùng NS2, NS3, NS4, NS5 là những vùng mã hoá cho các protein không cấu trúc đóng vai trò quan trọng trong sự nhân lên của virus, gồm các enzyme Protease, Helicase, RNA polymerase phụ thuộc RNA và các peptid tham gia vào quá trình sao chép virus và cắt đoạn polyprotein [35] C100-3 là kháng nguyên được các gen không cấu trúc NS4, NS5 mã hoá

- Cuối cùng vùng 3’ không phiên mã (HCV 3’-UTR) có khoảng 27 – 66 nucleotide, có chức năng báo hiệu dừng quá trình phiên mã

1.2.2 Sự xâm nhập và nhân lên của HCV

Thực ra đến nay cơ chế nhân lên của HCV chưa được hiểu rõ, tuy nhiên người ta cho rằng HCV cũng tuân theo cơ chế nhân lên của các virus có cấu trúc RNA(+) khác, nghĩa là sau khi xâm nhập vào tế bào gan nhờ cơ chế ẩm bào và cởi bỏ phần nucleocapsid bên ngoài, genom của HCV hoạt động như một khuôn mẫu để sao chép ra phân tử RNA sợi âm, tiếp đó chuỗi RNA này

sẽ làm khuôn mẫu để tổng hợp nên genom RNA(+) của HCV mới Cả hai giai

đoạn này đều được thực hiện dưới tác dụng của men RNA polymerase của HCV Quá trình chịu sự kiểm soát của đầu 5’ không mã hoá vì vùng này có vị trí gắn kết với ribosome (IRES – internal ribosome entry site) để giải mã

Hình 1.6 Quá trình nhân lên của HCV

(1) HCV trong huyết thanh (2) Virus gắn vào các receptor trên bề mặt tế bào và xâm nhập vào tế bào

(3) Phá vỡ vỏ bọc giải phóng RNA vào bào tương tế bào (4) Quá trình dịch mã của ribosom, tổng hợp protein từ nguyên liệu tế bào và các protease của virus

(5) Sao mã RNA (7) Virus trưởng thành (6) Hoàn chỉnh lắp ráp (8) Giải phóng virus khỏi tế bào vật chủ

1.2.3 Phân loại HCV

- Trong nhiều nghiên cứu người ta thấy rằng cấu trúc hệ gen của HCV

là sự đa dạng về gen, bộ gen HCV khá lỏng lẻo vì RNA polymerase phụ thuộc RNA không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp RNA do thiếu enzyme exonuclease một enzyme cần thiết cho quá trình tự sửa chữa trong quá trình tổng hợp RNA của virus, ngoài ra cấu trúc gen HCV có vùng siêu biến E1(HVR1) và vùng siêu biến E2(HVR2) Cuối cùng với áp lực chọn lọc miễn dịch, HCV dần biến đổi một phần cấu trúc gen để né tránh các đáp ứng miễn dịch của vật chủ [44] Do đó bộ gen HCV không thuần nhất dù mới nhiễm HCV một lần [36] Dựa trên tính đa dạng của hệ gen, các chủng HCV được phân thành các type hay genotype, các type của HCV được phân thành nhiều phân type(subtype) và biến loài (phụ loài-quasispecies)

- Dựa vào mức độ tương đồng hay khác biệt về trình tự nucleotide, người ta sắp xếp HCV thành các genotype (kiểu gen) hay các subtype (phân type) Việc xếp loại các kiểu gen dựa trên sự so sánh các vùng khác nhau trên

bộ gen [61] Nếu sự khác biệt trong trình tự nucleotide dưới 20% người ta xếp chúng trong cùng một genotype và trong những genotype khác nhau nếu sự khác biệt lớn hơn 20% Hay nói một cách khác người ta xếp các HCV vào các genotype khác nhau (66 – 69% tương đồng), trong các genotype lại phân thành các subtype khác nhau (77 – 80% tương đồng), ngoài ra còn có sự khác biệt bên trong các phân type gọi là “biến loài” (quasispecies) là những biến chủng có mức độ tương đồng rất cao (91 – 99%) Các tác giả khác nhau đã phát triển và đưa ra hệ thống phân loại riêng của mình, tuy nhiên tại Hội nghị Quốc tế lần thứ 2 về HCV và các mối liên quan của virus, đã thống nhất đưa

ra một hệ thống phân loại genotype và subtype HCV dựa trên sự tương đồng

về trật tự nucleotide ở những nhóm gen chính (5’UTR, C, E1, NS5), có ít nhất

6 genotype (1,2,3,4,5,6) và hơn 50 phân type (subtype) đã được xác định [65]

ở các nước Đông Nam á (có Việt Nam và Thái Lan) đã xác định được những genotype mới (7,8,9,10,11), nhưng các phân tích chi tiết hơn hiện nay người ta cho rằng genotype 7,8,9,11 cũng thuộc genotype 6, genotype 10 thuộc genotype 3 [69] Mỗi kiểu gen có liên quan đến đặc điểm dịch tễ, độc lực, khả năng gây bệnh và đáp ứng điều trị với IFN với những hiệu quả khác nhau Kiểm tra type gen HCV có ý nghĩa dịch tễ và lâm sàng quan trọng: type 1 và 2

có liên quan với tiến triển bệnh, với ung thư gan Tuy nhiên type gen có thể chỉ là một yếu tố quyết định sự tiến triển của bệnh mà còn phải kể đến các yếu

tố khác như số lượng HCV, biến loài (quasispecies) hoặc đáp ứng miễn dịch của cơ thể chủ

- Phân type (kiểu phụ – subtype): Khi cùng kiểu gen nhưng có sự khác biệt <20% trình tự thì được xếp vào kiểu phụ, tuy nhiên ngay cả trong cùng một kiểu phụ của cùng một kiểu gen trình tự nucleotide cũng có thể khác nhau

<10% Hiện nay có trên 50 subtype được xác định tên gọi theo vần a, b, c [29], các subtype mới tiếp tục được khám phá

- Biến loài (tựa loài – quasispecies): Sự khác biệt bên trong các phân type hình thành các biến loài, bao gồm các bộ gen liên quan chặt chẽ nhưng không thuần nhất, trên một bệnh nhân xảy ra theo nhịp độ nhân lên của virus, theo giai

đoạn lâm sàng dưới áp lực chọn lọc của hệ thống miễn dịch của cơ thể

HCV có khả năng né tránh đáp ứng miễn dịch của vật chủ dẫn đến tỷ lệ nhiễm HCV mạn tính cao, đồng thời việc nghiên cứu sản xuất vaccin phòng và

điều trị viêm gan C gặp rất nhiều khó khăn

1.2.4 Đáp ứng miễn dịch đối với HCV

- Nhiễm HCV thường gây nhiễm trùng kéo dài dù đã có đáp ứng miễn dịch cả miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể chống lại virus

1.2.4.1 Miễn dịch dịch thể

- HCV có thể thoát khỏi đáp ứng miễn dịch dịch thể nếu HCV không bị trung hoà hoàn toàn bởi kháng thể đặc hiệu sau khi mới bị nhiễm HCV có tỷ

lệ đột biến cao, đặc biệt là vùng E2/NS1 đã làm giảm tác dụng của kháng thể

đặc hiệu với HCV Mặt khác kháng thể đặc hiệu với HCV thường xuất hiện muộn khoảng từ 7–31 tuần sau khi bị nhiễm HCV, thời gian xuất hiện kháng thể khác nhau ở những bệnh nhân khác nhau [66]

Hình 1.7 Diễn biến huyết thanh của người nhiễm virus viêm gan C[14]

1.2.4.2 Miễn dịch tế bào

- Miễn dịch tế bào đóng vai trò quan trọng trong nhiễm HCV vì nó có khả năng loại trừ virus khi virus xâm nhập vào bên trong tế bào Trong miễn dịch tế bào có vai trò quan trọng của tế bào T hỗ trợ CD4 và tế bào T gây độc CD8 Tế bào T gây độc CD8 đáp ứng miễn dịch bảo vệ tương đối tốt với nhiễm HCV cấp tính Nhưng trong phần lớn các trường hợp nhiễm HCV mạn tính, hoạt động của các tế bào T gây độc CD8 giảm do các tế bào T hỗ trợ CD4 cần thiết cho hoạt động tế bào gây độc CD8 không có hoặc chỉ tồn tại trong giai đoạn cấp [66]

1.3 Dịch tễ học nhiễm HCV

- Hiểu biết đường lây truyền của HCV là kiến thức cần thiết của dịch tễ học Nhiễm HCV mắc phải theo nhiều con đường khác nhau Bệnh chủ yếu do truyền máu nhiễm virus, thường gặp ở các bệnh nhân ưa chảy máu nhận các yếu

tố đông máu không tiệt trùng, tiêm chích ma tuý, các bệnh nhân bị chấn thương, tai biến sản khoa hoặc các loại phẫu thuật khác Nhiễm HCV trong bệnh viện còn

được nhận thấy thông qua các can thiệp trong điều trị cấp cứu, trong thăm dò chẩn đoán, lọc máu, ghép tạng, thận nhân tạo, các dây luồn tĩnh mạch, các ống dẫn lưu… Tuy vậy khoảng 50% nguồn nhiễm HCV còn chưa được hiểu rõ

1.3.1 Nguồn bệnh:

Là những bệnh nhân bị viêm gan C cấp hoặc mạn tính Máu là nguồn lây truyền HCV, do HCV-RNA được phát hiện trong máu của người nhiễm HCV cấp hay mạn tính [26,30] Khả năng truyền HCV ở các đối tượng rất khác nhau: người suy giảm miễn dịch, nhiễm HIV, nghiện chích ma tuý có khả năng truyền HCV lớn, người mẹ nhiễm phối hợp HIV và HCV có khả năng truyền HCV cho trẻ sơ sinh cao [13,26,30]

1.3.2 Đường lây

Hình1.8 Các con đường lây nhiễm HCV

(ảnh của West Shore Endoscopy Center truy cập tại

địa chỉ www.endowsec.com/pated/gifs/elv0013.gif)

1.3.2.1 Lây nhiễm theo đường máu: là nguy cơ chính lây nhiễm HCV

- HCV chủ yếu lây theo đường máu, nhất là sau truyền máu hoặc các phương tiện tiếp xúc với máu như: kim, bơm tiêm, thẩm phân máu …đặc biệt những bệnh nhân nhận máu nhiều lần và bệnh nhân chạy TNT có tỷ lệ nhiễm HCV cao, các bệnh nhân chạy TNT kéo dài tỷ lệ lưu hành HCV khoảng 20% [15,31,68] Tỷ lệ này ở người nghiện chích có thể tới 71,73% so với 1,96% ở người khoẻ mạnh [25] Đây là phương thức lây truyền HCV hữu hiệu nhất, nguồn lây bệnh chủ yếu ở các nước phát triển và đang phát triển Tỷ lệ anti-HCV(+) trong những người bị phơi nhiễm này nói chung là vượt quá 60%

Sâu lỗ tai, sâu mũi, xăm mình dùng dụng cụ không khử trùng tốt cũng có khả năng lây truyền HCV [30], nguy cơ lây truyền HCV sau khi phơi nhiễm do kim tiêm với bệnh nhân có anti-HCV(+) khoảng 5-10% Do ghép phủ tạng đã nhiễm HCV, những người ghép phủ tạng có nguy cơ nhiễm HCV cao do HCV

đã tồn tại ở nội tạng người cho hoặc trong quá trình ghép phải truyền máu Ngoài ra còn có nguy cơ lây truyền HCV trong tiếp xúc gia đình với người có anti-HCV(+), tuy nhiên tầm quan trọng của nguy cơ này chưa được xác định

1.3.2.2 Lây truyền từ mẹ sang con

- Khả năng truyền từ mẹ sang con hiếm: tỷ lệ là 3 – 5% trong số những người mẹ có kháng thể anti-HCV dương tính, Theo OhtoH [63] những người

mẹ có nồng độ HCV-RNA>106bản sao/ml tỷ lệ truyền HCV cho con cao hơn những người mẹ có nồng độ HCV-RNA thấp <106bản sao/ml Trên phụ nữ có

thai đồng nhiễm HCV và HIV thì khả năng lây truyền từ mẹ sang con sẽ cao hơn, hiện tượng này cho ta thấy rằng có thể lượng HCV-RNA cao ở bệnh nhân

bị nhiễm HIV [13]

1.3.2.3 Lây truyền qua đường tình dục

- Tỷ lệ HCV lây truyền qua đường tình dục ít khoảng 5% thấp hơn HBV (10-15%) và HIV(30%) [43], có thể tăng ở người có quan hệ đồng tính luyến

ái hay người có nhiều bạn tình Nguy cơ thấp có thể do sự hiện diện của HCV

ở tinh dịch rất thấp [58]

1.3.3 Vai trò dịch tễ học của genotype

- Xác định genotype (kiểu gen) đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu dịch tễ học nhiễm HCV Theo phân loại hiện nay người ta đã biết có ít nhất 6 genotype và hơn 50 subtype đã được xác định Sự phân bố HCV của các genotype HCV khác nhau rõ rệt trong những vùng địa dư khác nhau Genotype 1,2 và 3 cùng với subtype của nó có mặt trên khắp các vùng của thế giới, genotype 4 xuất hiện ở Châu Phi và HyLạp, genotype 5 chủ yếu ở Nam Phi, genotype 6 chủ yếu ở các nước Châu á[71]

- Nghiên cứu trình tự nucleotide HCV vùng NS5B được khuyếch đại từ những người cho máu nhiễm HCV và bệnh nhân nhiều nước khác nhau để xác

định genotype và subtype phân bố khác nhau ở các vùng trên thế giới [5,31,57]

+ Subtype 1a gặp ở Mỹ, các nước phát triển ở Tây Âu

+ Subtype 1b hay gặp ở Mỹ, Nhật, Châu Âu

+ Genotype 2 ở các nước phát triển nhưng tỷ lệ thấp

+ Genotype 3 tỷ lệ nhiễm đang tăng lên ở người nghiện chích

+ Genotype 4 hay gặp ở Trung cận đông, Bắc Phi

+ Genotype 5 hay gặp ở Nam Phi

+ Genotype 6 hay gặp ở Châu á trong đó có Việt Nam, subtype 6a giới hạn ở Nam á (Hồng Kông, Việt Nam, Mianma)

- Theo nghiên cứu của Nguyễn Thu Vân và các nhà khoa học Quốc tế, ở Việt Nam tỷ lệ lưu hành genotype 1a, 1b khoảng 50 – 60%, gần 30% người nhiễm HCV thuộc genotype 6, chỉ có một tỷ lệ nhỏ người nhiễm HCV thuộc genotype 2, 3 [60] Nghiên cứu của Trần Thanh Dương và cs năm 2004 trên 14 bệnh nhân viêm gan tại

Hà Nội có các kiểu gen với tỷ lệ như sau [1]: 1a:4/14(28,57%), 1b:4/14(28,57%), 6a:6/14(42,86%) Hồ Tấn Đạt và cs tại Trung tâm y khoa MEDIC trong thời gian 1 năm phân tích 327 trường hợp viêm gan C mạn ở Việt Nam đã xác định được ba kiểu gen chính là: 1, 6 và 2 trong đó kiểu gen HCV1 chiếm 58,4% (1:5,8%; 1a:6,4%; 1a/1b:0,3%; 1b:45,9%), HCV6 (6a:23,9%) và HCV2 là 13,1% (2:1,5%; 2a/2c:11,6%)

Trung phi Nam Mỹ

Hình 1.9 Phân bố các kiểu gen HCV trên thế giới

- Sự khác biệt về genotype có ý nghĩa quan trọng về mặt lâm sàng và

ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị bệnh ở Pháp nhiễm HCV type2 có tần suất chuyển sang dạng xơ gan cao hơn và điều trị bằng IFN-α kém kết quả hơn [27] Ngày nay người ta đã biết đến có sự biến đổi di truyền giữa các chủng virus và ngay cả trong cơ thể người bệnh Sự biến đổi di truyền này giúp virus

tránh được tác dụng của hệ thống miễn dịch và bệnh dễ tiến triển thành mạn tính (>80%) Sau khỏi bệnh cơ thể không có miễn dịch bảo vệ và vẫn có nguy cơ bị tái nhiễm [65]

1.4 Nhiễm HCV ở bệnh nhân chạy TNT (lọc máu)

- Bệnh nhân suy thận mạn chạy TNT là một quần thể có nguy cơ cao nhiễm HCV do phải điều trị bảo tồn dài ngày, truyền máu, can thiệp kỹ thuật như phẫu thuật tạo lỗ thông động-tĩnh mạch thiết lập tuần hoàn ngoài cơ thể khi lọc máu, dùng chung máy, quả lọc, dây máu, môi trường lây nhiễm, do vậy có nguy cơ lây nhiễm HCV Tỷ lệ nhiễm HCV trong nhóm này cũng khác nhau do điều kiện kỹ thuật đề phòng lây nhiễm khác nhau, tỷ lệ anti-HCV(+) thay đổi từ 0 – 75,5% ở các trung tâm khác nhau theo nghiên cứu ở Bồ Đào Nha Theo B.Dussol; P.Bethezene; P.Brunet và cs năm 1995, tỷ lệ nhiễm HCV

ở các bệnh nhân chạy TNT chu kỳ tại Pháp tăng theo thời gian lọc máu 10% mỗi năm [42]

9% ở bệnh nhân lọc máu chu kỳ dưới 3 năm

Hình 1.10:Tỷ lệ nhiễm HCV ở bệnh nhân chạy TNT theo thời gian lọc máu

(Dussol.B; Bethezene.P; Brunet.P và cs 1995)[42]

ở Việt Nam theo nghiên cứu của Nguyễn Đăng Mạnh (2002) tỷ lệ nhiễm HCV ở bệnh nhân chạy TNT sau 6 tháng là 22,77%, sau 1 năm là 42,57% [11]

Cũng theo B.Dussol và cs 1995 nếu bệnh nhân chạy TNT không có truyền máu lần nào tỷ lệ anti-HCV(+) là 7% Nếu truyền 1-3lần tỷ lệ tăng lên

là 15% Nếu truyền từ 4-8 lần tỷ lệ tăng tới 28% Còn nếu truyền >9lần thì tỷ

lệ anti-HCV(+) là 40%[42] Ngày nay nhờ có kỹ thuật sàng lọc sản phẩm máu

mà nguy cơ nhiễm HCV do truyền máu giảm đi đáng kể Tuy nhiên các nhà khoa học Nhật Bản và Italia đã báo cáo có 5 – 25,7% các trường hợp bệnh nhân lọc máu chu kỳ không truyền máu bao giờ cũng bị nhiễm HCV [37,45], như vậy có sự lây chéo giữa các bệnh nhân với nhau trong lọc máu chu kỳ Tỷ

lệ nhiễm HCV tăng dần theo số lần lọc máu, không phụ thuộc vào truyền máu Lọc máu ở nhà nhiễm HCV thấp hơn so với lọc máu ở bệnh viện: 8% so với 25% [42]; 0% so với 18,5% [51] Qua các nghiên cứu thấy rằng lây nhiễm HCV ở những người chạy TNT thường phụ thuộc theo tính chất của các yếu tố nguy cơ như sử dụng dụng cụ không sát khuẩn giữa các bệnh nhân, dùng chung bơm kim tiêm hoặc dụng cụ truyền dịch, kỹ thuật vô khuẩn kém, sử dụng máy chạy TNT không được sát khuẩn kỹ và khoảng cách giữa các ghế chạy thận không thích hợp (quá gần) [76] Sự lây chéo HCV giữa các bệnh nhân với nhau trong cùng đơn vị lọc máu diễn ra ở khâu nào, ở quả lọc dùng lại, ở hệ thống dây máu, kim chọc hay do nhân viên y tế, do các biện pháp can thiệp dụng cụ y tế khác vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu

Có rất nhiều yếu tố thuận lợi cho việc nhiễm chéo xảy ra giữa các bệnh nhân bao gồm:

+ Các dụng cụ không được tiệt khuẩn khi sử dụng từ bệnh nhân này sang bệnh nhân khác

+ Dùng chung một xe đẩy để chuẩn bị và phân phát thuốc cho bệnh nhân Dùng chung ống thuốc đã được để ở chỗ bệnh nhân khác trên mặt máy chạy thận

+ Dùng chung xe đẩy từ máy này sang máy khác, trong đó chứa cả dụng cụ sạch và những dụng cụ đã bị dính máu (khay nhiễm khuẩn, hộp kim

bỏ, dụng cụ đã chứa máu)

+ Bộ kim mồi nhiễm bẩn không được thay hoặc rửa sạch và tiệt khuẩn trước khi dùng cho bệnh nhân khác

+ Mặt máy không được làm sạch theo đúng lịch và tiệt khuẩn khi dùng cho bệnh nhân khác Các vết máu không được lau sạch đúng cách

Do vậy có thể tóm tắt cách lây nhiễm HCV trong các Trung tâm lọc máu theo sơ đồ sau:[30]

Nhân viên y tế Nhân viên y tế

Hình 1.11 : Con đường lây nhiễm HCV ở đơn vị lọc máu[30]

1.5 Đặc điểm lâm sàng nhiễm virus viêm gan C

- Bệnh cảnh lâm sàng của viêm gan C rất đa dạng từ thể nhẹ không có triệu chứng – cấp tính – tối cấp – mạn tính đến xơ gan và ung thư gan

- Có thời kỳ ủ bệnh từ 30 – 120 ngày, trung bình là 50 ngày

1.5.1 Viêm gan cấp

- Sau khi nhiễm HCV, phần lớn 75% không có biểu hiện lâm sàng [23],

40 – 60% có nồng độ ALT bình thường mặc dù có HCV-RNA cao, nhưng tổn thương gan là 80%, vàng da gặp khoảng 10% Viêm gan cấp với ALT tăng gấp 2,5 lần mức bình thường, 25% có vàng da, rối loạn tiêu hoá thường không rõ

- ở bệnh nhân viêm gan cấp HCV-RNA xuất hiện sớm trước khi có biểu hiện lâm sàng 1-2 tuần và nồng độ lên đạt đỉnh 106-108bản sao/ml sau vài tuần Các kháng thể anti-HCV xuất hiện muộn sau khi có tăng aminotransferase và biểu hiện lâm sàng Trong các trường hợp nhiễm HCV chỉ có 30 - 50% được phát hiện trong những tháng đầu, 80% được phát hiện sau 15 tuần Kết quả này cho thấy nhiều trường hợp nhiễm HCV không được phát hiện [32,31]

Triệu

Bình thường

Thời gian sau phơi nhiễm

Hình 1.12 Diễn biến huyết thanh học nhiễm HCV cấp tính hồi phục

1.5.2 Nhiễm virus viêm gan C với viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan tiên phát

- Viêm gan mạn được xác định bằng các phản ứng viêm xảy ra tại gan kéo dài, với ALT cao trên 6 tháng Nhiễm HCV đặc biệt nguy hại do tần suất chuyển sang dạng mạn tính rất cao 80 – 85% Theo một nghiên cứu ở Nhật

81,1% viêm gan cấp sẽ phát triển thành viêm gan mạn [55] Nhiễm HCV kéo dài hàng chục năm, men gan tăng giảm không phụ thuộc vào triệu chứng lâm sàng, nồng độ HCV-RNA duy trì ổn định trong huyết thanh [31,48]

Thời gian sau phơi nhiễm

Hình 1.13 Diễn biến huyết thanh nhiễm HCV cấp dẫn đến mạn tính

- Khoảng 20 – 30% viêm gan mạn tiến triển sau một thời gian có thể phát triển thành xơ gan, 30% những người viêm gan mạn có nguy cơ đưa đến ung thư gan tiên phát sau 10 – 20 năm [20,22,24]

- Nhiễm HCV và ung thư gan: trên thế giới 52,3% số bệnh nhân ung thư gan có liên quan với nhiễm HBV, 25% với HCV ở Việt Nam khoảng 81% có liên quan với HBV và khoảng 13,7 – 15,8% liên quan với HCV[7], kiểm tra kháng thể kháng HCV nhiều khi chưa đủ ở châu Âu khi ứng dụng PCR vào xét nghiệm chẩn đoán người ta thấy HCV-RNA dương tính ở 7% trong huyết thanh, 0,26% trong nhu mô gan ở những bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có anti-HCV âm tính

1.6 Chẩn đoán nhiễm HCV

- Chẩn đoán nhiễm HCV nên chú trọng ở những bệnh nhân có các yếu tố nguy cơ cao, các bệnh nhân có triệu chứng viêm gan sau truyền máu và các sản phẩm của máu, bệnh nhân chạy TNT, bệnh nhân có tiền sử tiêm chích ma tuý, quan hệ tình dục với người nghi mắc bệnh hoặc phơi nhiễm bơm kim tiêm

với người có anti-HCV(+), sau khi đã loại trừ các loại viêm gan khác như A,

B, D, CMV, EBV

- Chẩn đoán viêm gan C, sớm nhất là kỹ thuật huyết thanh học Việc nghiên cứu các kỹ thuật huyết thanh học được thực hiện từ năm 1989 ngay sau khi HCV được phát hiện và được triển khai ở một số nước từ năm 1990 Chẩn

đoán huyết thanh học là phương pháp dùng các kháng nguyên mẫu để phát hiện các kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh Kháng thể anti-HCV xuất hiện muộn trong nhiễm virus viêm gan C, đây là loại kháng thể không bảo vệ Trong những tháng đầu chỉ có 30 – 50% các trường hợp phát hiện anti-HCV Sau 6 tháng có 80% các trường hợp phát hiện anti-HCV và tồn tại nhiều tháng Tìm thấy kháng thể anti-HCV không cho phép đánh giá tiến triển của bệnh Kháng thể anti-HCV có thể tìm thấy trong giai đoạn đang tiến triển hoặc nhiễm trùng đã khỏi không còn mang virus Các kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh phát triển rất nhanh từ những kỹ thuật thế hệ 1 tới thế hệ 2 và 3 Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học kỹ thuật PCR phát hiện HCV-RNA đã góp phần chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị viêm gan C có hiệu quả

- Hiện nay các phòng thí nghiệm thường sử dụng 2 thử nghiệm để phát hiện kháng thể anti-HCV

+ Thử nghiệm phát hiện kháng thể virus viêm gan C (anti-HCV): kỹ thuật ELISA - thử nghiệm miễn dịch gắn men (Enzyme linked immunosorbent assay)

+ Thử nghiệm khẳng định: thử nghiệm miễn dịch vạch (Recombinant immunoblot assay – RIBA)

1.6.1 Thử nghiệm phát hiện kháng thể anti-HCV: Kỹ thuật ELISA

- Kỹ thuật ELISA dựa trên sự kết hợp đặc hiệu kháng nguyên và kháng thể Các kháng nguyên đặc hiệu của HCV được gắn bản trên giếng nhựa, kháng thể anti-HCV (nếu có) trong mẫu huyết thanh sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên tạo thành phức hợp miễn dịch “kháng nguyên – kháng thể” [19] Phức hợp này được phát hiện nhờ enzyme gắn với kháng thể kháng IgG người tác động lên cơ chất đặc hiệu

+ Kỹ thuật ELISA thế hệ 1: Anti-HCV EIA-1 phát hiện kháng thể đặc hiệu với C100-3 tương ứng với vùng NS4 của bộ gen của HCV Phương pháp này không phát hiện được các kháng thể đặc hiệu với các vùng cấu trúc của virus, kháng thể anti-C100 xuất hiện muộn và chỉ có 40% các trường hợp viêm gan C cấp [32], do đó có thể có nhiều trường hợp nhiễm virus không

được phát hiện

+ Kỹ thuật ELISA thế hệ 2: Anti-HCV EIA-2 phát hiện kháng thể đặc hiệu với những kháng nguyên capside, vùng NS3 Độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn thế hệ 1 Cửa sổ huyết thanh học giảm còn 8 – 18 tuần

+ Kỹ thuật ELISA thế hệ 3: Anti-HCV EIA-3 gồm kháng nguyên vùng NS3 cộng với kháng nguyên vùng NS5 Cửa sổ huyết thanh học giảm 17 ngày

so với thế hệ 2 (khoảng 4 - 6 tuần) [40]

Những thử nghiệm huyết thanh dương tính chỉ nói lên đã nhiễm HCV, không phân biệt được người đang mắc viêm gan với người đã mắc cũ, kháng thể chống lại protein lõi của HCV thường còn dương tính sau khi đã sạch HCV-RNA trong huyết thanh

1.6.2 Thử nghiệm khẳng định:

- Thử nghiệm miễn dịch vạch (RIBA) hay kỹ thuật miễn dịch thấm (RIBA – recombinant immunoblot assay), phát hiện các kháng thể đặc hiệu

đối với các kháng nguyên khác nhau của virus thuộc các vùng NS3, NS4, NS5

và gần đây cả kháng nguyên envelope Các kháng nguyên được giàn trải trên những băng tách bạch trên một màng Nitrocellulose Mẫu bệnh phẩm được coi

là dương tính khi có 2 băng phản ứng, không xác định khi có 1 băng phản ứng, âm tính khi cả 2 băng đều không phản ứng

Mục đích: là để đánh giá những kết quả của những thử nghiệm phát hiện (ELISA) Khi thử nghiệm ELISA dương tính mà thử nghiệm khẳng định âm tính thì coi như kết quả thử nghiệm ELISA là dương tính giả

Sử dụng thử nghiệm RIBA có thể phát hiện hầu hết các trường hợp dương tính giả nhưng đòi hỏi các chất tham gia phản ứng có chất lượng

cao, người thực hiện kỹ thuật quan sát và nhận định các vạch một cách thận trọng, chính xác

Nhược điểm của thử nghiệm RIBA là thường cho kết quả nghi ngờ ở một số mẫu khó xác định Đối với những bệnh nhân mắc bệnh viêm gan thì PCR có giá trị hơn trong việc khẳng định có hay không tình trạng nhiễm HCV mạn tính

1.6.3 Chẩn đoán sinh học phân tử

- Phát hiện HCV-RNA: có 2 kỹ thuật chính

+ PCR: xác định RNA của HCV, độ nhạy và độ khuyếch đại rất lớn Real time PCR định lượng HCV-RNA độ nhạy và độ đặc hiệu cao

+ Phương pháp DNA nhánh hoá (bDNA) định lượng HCV-RNA độ nhạy kém PCR

- Năm 1985, Tiến sỹ Kary Mulli đã phát minh ra phương pháp khuyếch

đại gen (PCR – Polymerase Chain Reaction) và nhanh chóng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh y học do có độ nhạy và khả năng khuyếch đại rất lớn Kỹ thuật PCR cho phép phát hiện bằng cách khuyếch đại chọn lọc một đoạn acide nucleic (RNA hoặc DNA) rất nhỏ mà bằng các kỹ thuật thông thường khác không phát hiện được [6,46]

Nguyên lý của phản ứng PCR: PCR là phương pháp invitro để tổng hợp

một đoạn DNA cần thiết dưới sự xúc tác của polymerase DNA bằng việc kéo dài các đoạn mồi (primer) oligonucleotide bổ trợ với phần đầu 3’ của đoạn DNA cần được tổng hợp trên nguyên tắc kết hợp bổ sung đôi base: Guanosine

và Cytosine, Adenine và Thymine

Vấn đề cơ bản của kỹ thuật PCR là việc chọn đoạn mồi Virus viêm gan

C có nhiều biến chủng di truyền do đó đoạn mồi được chọn cần thiết bổ trợ cho đoạn nucleotide ổn định và chung nhất cho tất cả các genotype Vùng 5’-UTR không phiên mã (5’ untranslated region) gồm khoảng 324 – 341

nucleotide trong bộ gen của virus là đoạn ổn định nhất giữa các chủng loại khác nhau được chọn làm đoạn gen đích để sao chép khuyếch đại

- Kỹ thuật PCR có ưu điểm là độ nhạy cao chỉ cần một lượng mẫu huyết thanh hoặc tế bào gan rất nhỏ, kỹ thuật thực hiện nhanh

Đối với viêm gan virus C kỹ thuật PCR áp dụng chẩn đoán sớm, xác định HCV-RNA là chỉ điểm sớm nhất nhiễm HCV bằng kỹ thuật PCR sau 2 tuần phơi nhiễm PCR phát hiện các trường hợp nhiễm virus khi kháng thể anti-HCV chưa hình thành ở những người huyết thanh âm tính, khi đó PCR dương tính khẳng định nhiễm trùng thực sự do HCV, ngược lại trong trường hợp PCR

âm tính cho thấy có những người chỉ có kháng thể đặc hiệu với HCV nhưng không mang virus, không lây nhiễm Ngoài ra người ta còn sử dụng kỹ thuật PCR trong nghiên cứu lây truyền virus mẹ sang con, theo dõi tác dụng điều trị

và nghiên cứu các đặc tính di truyền sinh học của các biến chủng virus, xác

định kiểu gen của HCV

1.6.3.1 Định tính HCV-RNA bằng kỹ thuật PCR

Để phát hiện HCV bằng kỹ thuật PCR thì cần một giai đoạn chuyển RNA thành cDNA (Complementary Deoxyribonucleic Acid-DNA bổ sung) nhờ các enzyme phiên mã ngược (Reverse Transcriptase – RT) Sau đó dùng một đoạn DNA đặc hiệu làm mồi để xác định DNA đích và khuyếch đại đoạn DNA đích lên nhiều lần Kỹ thuật PCR phát hiện RNA của HCV là một bằng chứng về sự có mặt của HCV

ưu điểm của phương pháp RT-PCR có độ nhạy cao, trong điều kiện tối

ưu chỉ cần có 100 bản sao/1ml huyết thanh có thể phát hiện được bằng phương pháp này Kỹ thuật PCR tương đối phức tạp, đắt tiền, chỉ thực hiện được trong phòng thí nghiệm tiêu chuẩn [46,49,54]

1.6.3.2 Định lượng HCV-RNA

1.6.3.2.1 Định lượng HCV-RNA bằng kỹ thuật Real time PCR

- Năm 1991 Holland và cs đã phát hiện chức năng 5’-3’ exonuclease của

Taq polymerase, Oee (1993), Bassler (1995), Livak (1995) đã phát hiện các

loại mẫu dò có khả năng thực hiện phản ứng chuyển năng lượng huỳnh quang FRET (Fluorescent energy transfer) và cùng với sự phát triển thiết bị máy móc của các công ty như Perkin Elmer, Idaho Technologies đã hình thành phương pháp định lượng virus Real time PCR Với phương pháp PCR thông thường chỉ có tính chất định tính, để cần biết số lượng các hạt virus (copy numbers) trong 1ml máu bệnh nhân dùng kỹ thuật Real time PCR

Nguyên lý của Real time PCR: Cần có hoá chất có khả năng phát huỳnh quang như SYBR Green I, Ethidium bromide, các mẫu dò (probe) có gắn chất phát huỳnh quang như fluorescein, Tamra ở 2 đầu mút Trong phản ứng, nếu

có sự nhân lên của DNA đích thì chất này sẽ liên kết với DNA đích đó và bắt

đầu phát tín hiệu huỳnh quang Các tín hiệu huỳnh quang phát ra sẽ được các

đầu dò của máy luân nhiệt real time thu nhận và xử lý Khi cường độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt qua đường tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng thì mẫu được xem là (+) và người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ ngưỡng – Ct) để so sánh với một đường cong (Standard curve)

được xây dựng từ chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ mà suy ra số lượng DNA mẫu đưa vào phản ứng

ưu điểm của Real time PCR: Độ nhạy và độ đặc hiệu cao, kết quả được phân tích ngay trong lúc phản ứng đang chạy nên không bị nhiễm sản phẩm từ ngoài vào, kết quả thu được nhanh hơn nhưng lại được kiểm soát tốt hơn Không cần các bước sau PCR như điện di hay lai phân tử Đây là phương pháp

đắt tiền, đòi hỏi người có trình độ chuyên môn thực hiện và phân tích kết quả

Kỹ thuật Real time PCR để định lượng HCV được áp dụng từ những năm 1996

Kỹ thuật này còn cho phép đáp ứng các nhu cầu khác trong chẩn đoán bệnh viêm gan virus như xác định genotype, phân tích các đột biến kháng thuốc

1.6.3.2.2 Định lượng HCV-RNA bằng kỹ thuật bDNA(Branched Deoxyribonucleic Acid technology)

- Dựa trên khả năng lai ghép của các oligonucleotide gắn trên giếng với HCV-RNA và một đoạn DNA Cộng hợp Alkaline phosphatase gắn đoạn mồi kết hợp đặc hiệu với bDNA Sau đó thêm cơ chất vào giếng, cơ chất phản ứng với Alkaline phosphatase phát hiện phức hợp lai ghép Kỹ thuật có độ chính xác cao nhưng độ nhạy thấp khoảng 200.000 bản sao/1ml huyết thanh [33]

1.6.3.3 Xác định genotype của virus viêm gan C

- Các genotype và subtype được xác định trên thế giới được chia thành 6 genotype chính từ HCV1 đến HCV6 và mỗi genotype lại được chia thành nhiều subtype khác nhau như 1a, 1b … Các genotype đã được xác định dựa trên việc phân tích trình tự nucleotide của một phần hệ gen 5’-UTR, vùng C, vùng E1 và vùng NS5B [46,38,70]

- Xác định genotype HCV gồm nhiều phương pháp đã được phát triển: + Giải trình tự (sequencing)

+ RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): xác định tính đa dạng độ dài các đoạn cắt giới hạn, ít áp dụng cho chẩn đoán chủ yếu sử dụng trong nghiên cứu

+ Lai phân tử: lai ghép sản phẩm RT PCR với mồi đặc hiệu type

+ Real time PCR (PCR nhân bội đoạn gen đặc hiệu type): real time RT PCR sử dụng TaqMan probe đặc hiệu type

+ Huyết thanh học (sử dụng kỹ thuật đặc hiệu type), phương pháp này độ nhạy không cao

Phần lớn các kỹ thuật trên đều chọn trình tự nucleotide khuôn là vùng 5’ không mã hoá (5’UTR), kết hợp với một số vùng khác như vùng “lõi” (core) mã hoá protein lõi hay vùng NS5B mã hoá polymerase của HCV

1.7 Điều trị và dự phòng nhiễm virus viêm gan C

1.7.1 Điều trị

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân điều trị là bệnh nhân được chẩn đoán xác

định nhiễm HCV (anti-HCV dương tính, HCV-RNA dương tính), tình trạng

bệnh lý gan cấp hoặc mạn (men gan tăng – ALT tăng), có xơ gan hay không

Đánh giá hiệu quả điều trị: bệnh nhân phải được làm xét nghiệm Aminotransferase kiểm tra hàng tháng, có hiệu quả khi các men này trở về bình thường, âm tính hoá HCV-RNA Nên kiểm tra trước, sau 3 tháng, 12 tháng và 18 tháng sau điều trị

Các thử nghiệm huyết thanh không có giá trị theo dõi kết quả điều trị, vì vậy cần kiểm tra HCV-RNA bằng kỹ thuật PCR để phát hiện sớm quá trình mãn tính hoá

1.7.2 Dự phòng viêm gan virus C

- Không có biện pháp dự phòng đặc hiệu đối với HCV, khi phát hiện

được viêm gan C cấp, điều trị INF-α cũng là một biện pháp cần thiết dự phòng viêm gan C trở thành mạn tính

- Dự phòng không đặc hiệu như biện pháp phòng nhiễm HBV và HIV

+ Sàng lọc anti-HCV ở những người cho máu

+Hạn chế truyền máu tới mức cần thiết, tốt nhất dùng máu tự thân

+ Thực hiện tốt các biện pháp khử trùng, tiệt trùng … trong y tế

+ Chống tệ nạn ma tuý, mại dâm, giáo dục người nghiện biết cách

phòng như dùng bơm kim tiêm một lần

Chương 2

đối tượng, vật liệu vμ phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân chạy TNT chu kỳ tại khoa Thận nhân tạo bệnh viện Bạch Mai + Nghiên cứu mô tả cắt ngang: Bệnh nhân suy thận mạn được chạy TNT chu kỳ 3lần/tuần, tại thời điểm nghiên cứu tổng số đối tượng tham gia nghiên cứu là 469 bệnh nhân

+ Nghiên cứu mô tả theo dõi dọc: Bệnh nhân có thời gian chạy TNT chu kỳ được 2 năm từ 1/2006 đến 5/2008, trước khi chạy TNT có anti-HCV(-)

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu được triển khai tại Bệnh viện Bạch Mai 2.1.2 Đơn vị thực hiện và các đơn vị phối hợp tham gia nghiên cứu: Khoa

Vi sinh, Khoa Thận nhân tạo, Khoa Hoá sinh, bệnh viện Bạch Mai

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu:

- Lấy máu tĩnh mạch, máu được chia ra làm 2 ống:

ống 1 lấy 4ml máu không có chống đông vào tube nhựa vô trùng có nắp

đậy ghi các thông tin cá nhân, mã số bệnh phẩm, máu được để đông tự nhiên sau đó ly tâm 3000vòng/5phút và tách huyết thanh vào tube nhựa có nắp đậy vô trùng, bảo quản lạnh âm sâu (-700C) cho tới khi làm các xét nghiệm virus học ống 2 lấy 2ml máu không có chống đông được tách huyết thanh để làm xét nghiệm men gan AST, ALT

2.2.2 Sinh phẩm và hoá chất

* Sinh phẩm sử dụng cho kỹ thuật ELISA xác định kháng thể anti-HCV:

- Bộ sinh phẩm chẩn đoán MONOLISAđ Anti-HCV Plus (BioRad – Pháp)

* Sinh phẩm sử dụng cho kỹ thuật PCR:

- Bộ sinh phẩm dùng trong kỹ thuật Real time RT PCR định lượng HCV-RNA:

COBASđ AmpliPrep/ COBASđ TaqManđ HCV Test (Roche – Pháp)

- Bộ sinh phẩm tách chiết RNA virus: Qiaampđ Viral RNA Mini Kit

(Qiagen – Mỹ)

- Bộ sinh phẩm chẩn đoán genotype HCV: HCV GENOTYPE (VA.A02–005A)

(Việt á – Việt Nam)

- Hệ thống primer và probe đặc hiệu HCV: trình tự cặp mồi (primer – consensus) và TaqMan probe đ−ợc thiết kế dựa trên dữ liệu về các trình tự bộ gen HCV công bố gần đây, từ ngân hàng dữ liệu gen NCBI (National Center for Biology Information- www.ncbi.nlm.nih.gov) đ−ợc xử lý, kiểm tra và chỉnh sửa cho phù hợp với tiêu chuẩn bằng các phần mềm quy chuẩn Annhyb, Clustaex, Oligo Analyzer (IDT) Trình tự primer và probe đ−ợc thiết kế theo trình

tự tại vùng 5’ không phiên mã và vùng „lõi” (core) của HCV đặc hiệu type

* Hoá chất sử dụng trong xét nghiệm sinh hoá thăm dò chức năng gan:

- Đo nồng độ men AST, ALT huyết thanh, thuốc thử R1, R2 của hãng Diasys, đọc trên máy phân tích hoá sinh tự động HITACHI 912 (Nhật)

2.2.3 Dụng cụ và máy để làm xét nghiệm

* Dụng cụ thiết bị xử lý và bảo quản bệnh phẩm:

- Máy rửa phiến nhựa vi lượng hiệu 3490 - 2 của hãng Bio-Rad

- Máy ủ ở nhiệt độ 370C, máy trộn mẫu, máy ly tâm eppendorf, máy spin-down

- Hệ thống tách chiết tự động COBAS AmpliPrep (Roche)

- Máy real time PCR của Roche : COBAS TaqMan 48

- Máy real time PCR: iCyclerTM iQ5 (Bio-Rad)

- Máy tính, phần mềm có chức năng Auto series, Export file, Import file

- Tấm nhựa, đầu côn các loại, đầu côn có phin lọc

- S – tip, K – tip, S – tube, K – tube, SPU, K – Carrier

- Chai thuỷ tinh 100ml, 500ml, 1000ml, ống đong 500ml, 1000ml

- Tube eppendorf (RNase free) 0,2ml, 0,5ml, 1,5ml, 2ml

+ Xác định kiểu gen (genotype) HCV ở bệnh nhân HCV-RNA(+)

+ Phân tích sự thay đổi một số chỉ số xét nghiệm chức năng gan với kết quả xét nghiệm định lượng virus

+ Điều tra hồi cứu theo phiếu điều tra xác định một số yếu tố nguy cơ (truyền máu, tiêm chích, )

- Nghiên cứu mô tả theo dõi dọc: xác định nguy cơ nhiễm HCV theo thời gian chạy TNT (theo dõi xét nghiệm anti-HCV 6 tháng 1 lần trong thời gian 2 năm: tại các thời điểm T1, T2, T3, T4 tương ứng sau 6 tháng, sau 12 tháng, sau 18 tháng và sau 24 tháng chạy TNT)

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

+ Thiết kế nghiên cứu điều tra ngang:

Xác định tỷ lệ nhiễm HCV bằng xét nghiệm tìm kháng thể anti-HCV, lấy mẫu huyết thanh của tất cả bệnh nhân Khoa TNT theo tiêu chuẩn lựa chọn tại thời điểm nghiên cứu Định l−ợng HCV-RNA trên bệnh nhân anti-HCV(+) cỡ

mẫu đ−ợc tính theo công thức sau:

p: tỷ lệ (%) −ớc tính

α: mức ý nghĩa thống kê (với α=0,05 thì Z (1-α/2) =1,96)

n: cỡ mẫu nghiên cứu

z: hệ số tin cậy

n = (0,1)2

n = 35

p = 0,9 tỷ lệ HCV-RNA (xác định HCV-RNA bằng PCR, định l−ợng virus)

−ớc đoán theo tài liệu nghiên cứu ở Việt Nam của Nguyễn Đăng Mạnh và cs (2002)[11] là 89,29%, của Lok A và cs (1997) là >90% [56]

d = 0,1

n: số mẫu cần điều tra: 70 = 35 x 2

Nh− vậy tổng số mẫu chúng tôi xét nghiệm định l−ợng HCV-RNA và kiểu gen HCV là 70 mẫu

- Chọn mẫu: chọn mẫu có chủ định kết hợp với chọn mẫu có hệ số Chọn đối t−ợng nghiên cứu, lập danh sách từng đối t−ợng chọn các cá thể theo cách lấy mẫu ngẫu nhiên hệ thống với hệ số k=3

+ Thiết kế nghiên cứu mô tả theo dõi dọc (hồi cứu và tiến cứu): xác

định nguy cơ nhiễm HCV qua việc tìm hiểu mối liên quan giữa thời gian chạy TNT với tỷ lệ nhiễm HCV trên bệnh nhân chạy TNT

- Chọn những bệnh nhân suy thận mạn có chỉ định chạy TNT chu kỳ

3 lần/tuần với tiêu chuẩn: Trước khi chạy TNT được xét nghiệm HCV, sau đó lựa chọn bệnh nhân có kết quả anti-HCV(-)(T0), bệnh nhân không truyền máu hoặc có truyền máu đã được sàng lọc anti-HCV

anti Tiến hành theo dõi antianti HCV theo chiều dọc trong thời gian 2 năm ở nhóm bệnh nhân này bằng cách định kỳ xét nghiệm anti-HCV 6 tháng 1 lần (tại thời điểm T1, T2, T3, T4) bằng kỹ thuật ELISA Như vậy tổng số mẫu chúng tôi thực hiện cho nghiên cứu dọc là 71 trường hợp

độ men gan AST, ALT

- Tiến hành điều tra theo phiếu điều tra bệnh nhân về thông tin cá nhân, các yếu tố nguy cơ (xem phụ lục)

2.3.4 Các xét nghiệm:

- Các xét nghiệm về virus học

Thực hiện tại Khoa Vi sinh bệnh viện Bạch Mai

+ Virus viêm gan C: phát hiện anti-HCV, định lượng HCV-RNA, genotype HCV

Xét nghiệm được tiến hành theo phương pháp ELISA bằng bộ sinh phẩm MONOLISAđ Anti - HCV Plus của hãng Bio-Rad, định lượng HCV-RNA trên

hệ thống máy real time PCR của Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48, xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật Real time RT PCR trên máy iCyclerTMiQ5 của Bio-Rad

- Các xét nghiệm thăm dò chức năng gan: xác định nồng độ AST,

ALT trong huyết thanh Thực hiện tại Khoa Hoá sinh bệnh viện Bạch Mai

2.3.5 Các kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu

2.3.5.1 Xét nghiệm phát hiện Anti – HCV bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán Monolisa đ anti – HCV Plus (Bio-Rad)

a Nguyên lý:

Bộ sinh phẩm chẩn đoán Anti-HCV Monolisađ anti-HCV plus của hãng Bio-Rad dựa trên nguyên lý của thử nghiệm miễn dịch gắn men gián tiếp cho phép phát hiện kháng thể anti-HCV trong huyết thanh hoặc huyết tương bệnh nhân, theo phương pháp “bánh kẹp” với việc sử dụng 3 protein tái tổ hợp của virus viêm gan C (protein cấu trúc và protein không cấu trúc NS3, NS4) có khả năng gắn với kháng thể anti-HCV trong mẫu huyết thanh tạo phức hợp kháng nguyên – kháng thể trên bề mặt giếng Sau khi rửa giếng các protein không gắn của mẫu sẽ bị loại trừ Thêm cộng hợp dê kháng IgG người gắn peroxidase vào các giếng Cộng hợp này gắn đặc hiệu với phần IgG người có trong phức hợp kháng nguyên – kháng thể Sau khi loại bỏ phần cộng hợp không gắn, thêm dung dịch cơ chất TMB vào các giếng Màu xanh sẽ xuất hiện trong các giếng có chứa anti-HCV dương tính

b Các bước tiến hành:

- Để bộ sinh phẩm ra ngoài ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút trước khi tiến hành

- Chuẩn bị đủ số giếng cần sử dụng

- Chuẩn bị dung dịch rửa (R2) pha loãng 1:10 trong nước cất 2 lần, khuấy đều

- Nhỏ mẫu vào giếng theo thứ tự sau:

+ 80μl dung dịch pha loãng mẫu (R6) vào mỗi giếng

+ 20μl chứng âm (R3) vào giếng A1, B1