2.3.5.1 Xét nghiệm phát hiện Anti – HCV bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán
Monolisađanti – HCV Plus (Bio-Rad).
a. Nguyên lý:
Bộ sinh phẩm chẩn đoán Anti-HCV Monolisađ anti-HCV plus của hãng Bio-Rad dựa trên nguyên lý của thử nghiệm miễn dịch gắn men gián tiếp cho phép phát hiện kháng thể anti-HCV trong huyết thanh hoặc huyết t−ơng bệnh nhân, theo ph−ơng pháp “bánh kẹp” với việc sử dụng 3 protein tái tổ hợp của virus viêm gan C (protein cấu trúc và protein không cấu trúc NS3, NS4) có khả năng gắn với kháng thể anti-HCV trong mẫu huyết thanh tạo phức hợp kháng nguyên – kháng thể trên bề mặt giếng. Sau khi rửa giếng các protein không gắn của mẫu sẽ bị loại trừ. Thêm cộng hợp dê kháng IgG ng−ời gắn peroxidase vào các giếng. Cộng hợp này gắn đặc hiệu với phần IgG ng−ời có trong phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Sau khi loại bỏ phần cộng hợp không gắn, thêm dung dịch cơ chất TMB vào các giếng. Màu xanh sẽ xuất hiện trong các giếng có chứa anti-HCV d−ơng tính.
b. Các b−ớc tiến hành:
- Để bộ sinh phẩm ra ngoài ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút tr−ớc khi tiến hành.
- Chuẩn bị đủ số giếng cần sử dụng
- Chuẩn bị dung dịch rửa (R2) pha loãng 1:10 trong n−ớc cất 2 lần, khuấy đều. - Nhỏ mẫu vào giếng theo thứ tự sau:
+ 80μl dung dịch pha loãng mẫu (R6) vào mỗi giếng + 20μl chứng âm (R3) vào giếng A1, B1
+ 20μl chứng d−ơng (R4) vào giếng C1, D1, E1. + 20μl mẫu huyết thanh vào các giếng tiếp theo. - Đậy kín phiến bằng film và ủ 370C trong 60 phút.
- Bỏ băng film, rửa 4 lần bằng dung dịch rửa, thời gian ngâm dung dịch rửa trong các giếng trong mỗi lần rửa khoảng 30 giây. Hút lại toàn bộ phiến cho khô. Đập nhẹ phiến trên giấy thấm.
- Nhỏ 100μl dung dịch cộng hợp vào mỗi giếng, đậy kín phiến bằng film và ủ 370C trong 30 phút.
- Bỏ băng film, rửa 6 lần bằng dung dịch rửa, thời gian ngâm dung dịch rửa trong các giếng trong mỗi lần rửa khoảng 30 giây. Hút lại toàn bộ phiến cho khô. Đập nhẹ phiến trên giấy thấm.
- Pha dung dịch cơ chất TMB theo tỷ lệ 1 đơn vị TMB: 10 đơn vị dung dịch đệm cơ chất.
- Thêm vào mỗi giếng 100μl dung dịch cơ chất TMB.
- Không đậy film và để phiến nhựa ở 180C-220C trong 30 phút trong bóng tối. - Hết thời gian trên thêm 100μl H2SO4 1Nvào mỗi giếng của phiến nhựa để ngừng phản ứng.
- Đọc kết quả ở b−ớc sóng 450-620 nm trong vòng 30 phút sau khi dừng phản ứng.
KN KT
Enzyme KKT
KN gắn bản KT anti-HCV KKT: Cộng hợp dê Cơ chất TMB
C22-3, C33-c, kháng IgG ng−òi Tetramethyl benzidine
NS3, NS4 gắn peroxidase
Chú thích : KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể KKT : Kháng kháng thể
Hình 2.1 Sơ đồ nguyên lý bộ sinh phẩm Monolisađanti – HCV plus (Bio-Rad)
Cơ chất
c. Phân tích kết quả:
- Đọc kết quả trên máy đọc ELISA nh− sau:
- Thử nghiệm có giá trị khi thoả mãn 2 điều kiện sau: + OD chứng âm nhỏ hơn 0,150.
+ OD chứng d−ơng lớn hơn hoặc bằng 1,000 và nhỏ hơn 2,400. - Tính giá trị trung bình của chứng d−ơng: ODR4
ODR4= [OD(C1) + OD(D1) + OD(E1)]/3 - Tính giá trị ng−ỡng: CO = ODR4/5
- Mẫu huyết thanh có giá trị OD nhỏ hơn giá trị ng−ỡng (CO)(cut-off value) là mẫu âm tính với thử nghiệm.
- Mẫu huyết thanh có giá trị OD lớn hơn hoặc bằng giá trị ng−ỡng (CO) là mẫu d−ơng tính với thử nghiệm.
- Nhắc lại thử nghiệm khi:
+ Thử nghiệm không có giá trị.
+ Giá trị OD của mẫu thử bằng hoặc lớn hơn 10% giá trị ng−ỡng (CO) đ−ợc xem là d−ơng tính ban đầu với thử nghiệm. Các mẫu này cần tiến hành kiểm tra lại trên 2 giếng. Mẫu thử cho kết quả d−ơng tính với ít nhất một trong hai giếng kiểm tra lại này sẽ đ−ợc coi là mẫu d−ơng tính với anti-HCV. Mẫu thử âm tính ở cả hai giếng kiểm tra lại đ−ợc xem là mẫu âm tính.
2.3.5.2 Xét nghiệm định l−ợng HCV-RNA bằng kỹ thuật Real-time RT PCR trên máy COBAS TaqMan 48 của Roche, xác định kiểu gen (genotype) HCV bằng kỹ thuật Real time RT PCR trên máy iCyclerTM iQ5 của Bio-Rad.
* Các mẫu máu có anti-HCV(+) đ−ợc định l−ợng HCV-RNA trong huyết thanh bằng kỹ thuật Real time RT PCR trên hệ thống máy real time PCR của Roche (máy tách chiết tự động – COBAS AmpliPrep, máy real time PCR – COBAS TaqMan 48) với kít chẩn đoán COBASđ AmpliPrep/COBASđ TaqManđ HCV test.
a. Nguyên lý: Định l−ợng HCV-RNA trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm HCV dựa trên nguyên lý của kỹ thuật PCR. Kỹ thuật Real time RT PCR sử dụng probe TaqMan đặc hiệu cho HCV. Kỹ thuật này dựa trên quá trình phiên mã ng−ợc RNA của HCV thành cDNA (DNA bổ sung - Complementary Deoxyribonucleic Acid), sau đó xử dụng các cặp primer và probe đặc hiệu đ−ợc thiết kế trong vùng 5’ không mã hoá (5’UTR) của bộ gen HCV để khuyếch đại một trình tự DNA đích này. Độ nhạy của bộ sinh phẩm là 10 IU/ml huyết thanh (37copies/ml huyết thanh), độ đặc hiệu > 99,99% cho tất cả các genotype của HCV.
b. Cách tiến hành: Gồm 4 b−ớc: tách chiết RNA bằng máy tách chiết tự động COBAS AmpliPrep (Roche), phiên mã ng−ợc chuyển RNA thành cDNA, khuyếch đại DNA bằng kỹ thuật real time PCR, đọc kết quả, các quá trình này thực hiện trên máy real time PCR COBAS TaqMan 48 (Roche). Quy trình hoàn tất trong 4giờ30phút - 5giờ.
Tiến hành tách chiết RNA của virus trong mẫu huyết thanh ng−ời trên hệ thống tách mẫu tự động COBAS AmpliPrep. Sau đó chuyển sản phẩm tách chiết sang máy real time PCR (COBAS TaqMan 48), đọc kết quả sau 2giờ30phút.
- Khởi động hệ thống, truy cập vào ch−ơng trình AMPLILINK, tiến hành kiểm tra, bảo d−ỡng vệ sinh hệ thống máy COBAS AmpliPrep và COBAS TaqMan 48.
- Nạp thuốc thử vào khay chứa thuốc rồi đ−a vào máy tách chiết tự động sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh để thuốc đạt độ cân bằng trong máy khoảng 30phút tại các vị trí t−ơng ứng: CS1( Bead Reagent Cassette – Hạt từ tính trong dung dịch Isopropanol) khay 1 rãnh A; CS2 (Lysis Reagent Cassette – Guanidine Thiocyanate), CS3 (Multi Reagent Cassette – Proteinase, đệm Tris với 0.2% Methylparaben), CS4 (Test specific Cassette – thuốc thử đặc hiệu xét nghiệm: RNA phiên mã bao bọc bởi vỏ protein thực khuẩn thể MS2-phage, cấu trúc DNA, Manganese acetate, Z05 DNA Polymerase) khay 2 rãnh B-E.
- Cho khay chứa SPU (Sample Processing Unit) (rack), S-tip, K-tip vào máy tại các vị trí t−ơng ứng.
- Kết nhập K-carrier vào khay K-carrier (rack), đọc mã vạch của khay K-carrier rồi tới mã vạch của K-carrier liên tiếp nhau trong 5giây bằng cách sử dụng đầu đọc mã vạch cầm tay. Nạp K-carrier/ K-carrier rack vào máy tại vị trí đặt carrier t−ơng ứng.
- Cài S-tube (ống mẫu) gắn barcode clips và control(chứng) clip vào khay chứa mẫu (sample rack). Trộn lắc mẫu bệnh phẩm, hút 1ml huyết thanh bệnh nhân và chứng vào S-tube theo thứ tự, đặt K-tube vào các lỗ t−ơng ứng trên khay chứa mẫu. Đ−a khay chứa mẫu vào vị trí t−ơng ứng trong máy. Khởi tạo order cho mẫu và chứng. Kiểm tra trạng thái hệ thống, chạy xét nghiệm.
Sau khi máy đã hoàn thành tách RNA thì chuyển sản phẩm sang máy real time PCR COBAS TaqMan 48: lấy K-carrier đã làm xong ra khỏi máy COBAS AmpliPrep rồi chuyển tiếp vào máy COBAS TaqMan 48. Đọc kết quả sau 2h30phút.
Công thức tính: kết quả định l−ợng HCV-RNA của máy COBAS TaqMan 48 đ−ợc tính theo đơn vị quốc tế IU/ml, quy đổi ra số copies/ml (theo công thức tính toán của máy đã đ−ợc thiết lập) là:
Số bản sao (copies) HCV-RNA/ml = Số IU/ml x 2,5
* Xác định genotype HCV ở các mẫu có HCV-RNA(+) bằng kỹ thuật Real time RT PCR sử dụng TaqMan probe với đoạn mồi đặc hiệu type ở vùng gen “lõi” (core) của HCV đ−ợc thực hiện trên máy iCyclerTM iQ5 (Bio-Rad) và sử dụng kít chẩn đoán HCV GENOTYPE (VA. A02 – 005A) (Việt á - Việt Nam).
a. Nguyên lý: Kỹ thuật Real time RT PCR sử dụng probe TaqMan đặc hiệu cho HCV. Kỹ thuật này dựa trên quá trình phiên mã ng−ợc RNA của HCV thành cDNA (DNA bổ sung - Complementary Deoxyribonucleic Acid), sau đó xử dụng các cặp primer và probe đặc hiệu cho từng kiểu gen HCV đ−ợc đánh dấu huỳnh quang và đ−ợc thiết kế ở vùng “lõi” (core) của bộ gen HCV
để nhân bản một trình tự DNA đích có kích th−ớc 103 cặp base. Các TaqMan probe đặc hiệu cho từng kiểu gen HCV sẽ đ−ợc đánh dấu bằng các chất huỳnh quang khác nhau (Cy5, VIC, TAMRA ...), mỗi tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu sẽ đánh dấu sự có mặt của một kiểu gen HCV trong mẫu thử. Mỗi bản sao của DNA khuôn đ−ợc nhân lên sẽ t−ơng ứng với một tín hiệu huỳnh quang và đ−ợc đầu dò của máy ghi nhận. Dựa vào đ−ờng cong chuẩn đ−ợc thiết lập từ hàm l−ợng HCV xác định, có thể tính đ−ợc hàm l−ợng HCV và xác định đ−ợc kiểu gen HCV trong mẫu thử.
b. Cách tiến hành: Gồm 4 b−ớc: tách chiết RNA, phiên mã ng−ợc chuyển RNA thành cDNA, khuyếch đại DNA bằng real time PCR, đọc kết quả. Quy trình hoàn tất trong 5-6 giờ.
- Tách triết RNA HCV trong huyết thanh ng−ời: Ph−ơng pháp tinh khiết RNA của HCV dựa trên khả năng gắn chọn lọc vào màng Silica của RNA virus. Mẫu sau khi đ−ợc xử lý bằng dung dịch đệm thích hợp sẽ đ−ợc cho vào cột li tâm Qiaamp. RNA virus sẽ đ−ợc gắn vào màng trong cột và các tạp chất sẽ đ−ợc loại bỏ hoàn toàn sau 2 lần rửa cột với 2 loại dung dịch rửa khác nhau. RNA tinh sạch sau đó sẽ đ−ợc phản hấp thu bằng một dịch đệm đặc biệt không chứa ARNase.
Pha dung dịch sử dụng theo h−ớng dẫn của bộ sinh phẩm Qiaampđ Viral RNA Mini Kit.
+ Đệm AVL(buffer AL-Lysis buffer) (có RNA): cho 1ml đệm AVL vào 1 tube chứa RNA đông khô, lắc đều. Chuyển dung dịch trên vào chai đựng đệm AVL, lắc đều. Bảo quản 2-80C. Tr−ớc khi sử dụng lắc đều và nếu đệm có tủa ủ ở 600C.
+ Đệm AW1(Buffer AW1-wash buffer 1): pha loãng AW1 bằng ethanol (95-100%) theo tỷ lệ 19:25.
+ Đệm AW2(Buffer AW2-wash buffer 2): pha loãng AW2 bằng ethnol (95-100%) theo tỷ lệ 13:30.
Cho 560μl dung dịch đệm AVL (có RNA) vào tube eppendorf 1,5ml. Cho 140μl mẫu huyết thanh vào tube trên. Tube chứng âm cho 140μl n−ớc cất PCR và tube chứng d−ơng cho 140μl mẫu huyết thanh HCV-RNA d−ơng tính, lắc đều trong 15 giây.
ủ trong nhiệt độ phòng (15-200C) trong 10 phút. Ly tâm 8000vòng/phút trong 1 phút.
Bổ sung 560μl ethanol (95-100%) vào các tube trên, lắc đều trong 15giây. Ly tâm 8000vòng/phút trong 1 phút.
Cho từ từ 630μl dung dịch trên vào cột Qiaamp. Đóng nắp và ly tâm ở 8000vòng/phút trong 1 phút. Chuyển các cột Qiaamp vào các tube thu nhận mẫu 2ml và loại bỏ các tube chứa dịch lọc.
Mở nắp cột Qiaamp, bổ sung 500μl đệm AW1. Đóng nắp và ly tâm ở 8000vòng/phút trong 1 phút. Chuyển các cột Qiaamp vào các tube thu nhận mẫu 2ml và loại bỏ tube chứa dịch lọc.
Mở nắp cột Qiaamp, bổ sung 500μl đệm AW2. Đóng nắp và ly tâm ở 14000vòng/phút trong 3 phút.
Chuyển các cột lọc vào tube eppendorf 1,5ml. Loại bỏ tube chứa dịch lọc. Mở nắp cột Qiaamp, bổ sung 60μl đệm AVE(Buffer AE-Elution buffer). Đậy nắp, ủ nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm ở 8000vòng/phút trong 1 phút.
RNA của virus sau quá trình tách chiết trên có thể đ−ợc giữ trong 1 năm với điều kiện nhiệt độ bảo quản là (-200C) hoặc (-700C).
- Thực hiện phản ứng RT PCR:
Thành phần của 1 phản ứng RT 20μl: dung dịch đệm (buffer)1X(50mM KCl, Tris pH8 10mM), dNTP 200μM, M-MnLV Reverse Transcriptase 0.625unit, MnCl2 1.5mM, mồi ng−ợc 10pmol, RNA bản mẫu, n−ớc cất vô trùng.
Cho 4μl RT mix vào 1 eppendorf 0,2ml, cho 15μl chứng (+), chứng (-), dịch RNA tách chiết vào eppendorf trên. Đậy nắp eppendorf thật kỹ, ly tâm nhẹ để lắng hỗn hợp xuống đáy ống, sau đó đặt vào máy luân nhiệt (thao tác đ−ợc tiến hành trong đá đang tan).
Chu kỳ nhiệt chạy RT: + 250C trong 5 phút + 420C trong 30 phút + 850C trong 5 phút Giữ ở 40
- Sau khi hoàn tất phản ứng RT thực hiện phản ứng real time PCR:
Thành phần của 1 phản ứng real time PCR 25μl: dung dịch đệm (buffer)1X(50mM KCl, Tris pH8 10mM), dNTP 200μM, Taq DNA polymerase 0.625unit, MgCl2 1.5mM, mỗi mồi 10pmol, cDNA, n−ớc cất vô trùng.
Lấy 2,5μl cDNA từ phản ứng RT ở trên vào 1 eppendorf real time PCR mix. Đậy nắp eppendorf thật kỹ, ly tâm nhẹ để lắng tất cả xuống đáy tube và đặt vào máy real time PCR.
Cài ch−ơng trình định dạng vị trí các mẫu trong block nhiệt của máy (plate set up) chọn màu FAM (6-carboxyfluorescein) và cài đặt ch−ơng trình real time HCV nh− sau:
+ 1 chu kỳ 950C trong 5 phút + 40 chu kỳ 950C trong 15 giây
E. Cleavage, Polymerisation : phõn cắt trỡnh tự probe và sự tổng hợp mạch mới được tiếp tục
D. Strand displacement: thay thế probe
đang bắt vào mạch khuụn bằng hoạt tớnh 5'-3' exonuclease của Taq polymerase.
C. Hybridization, Polymerisation : probe lai với mạch khuụn và sự tổng hợp bắt đầu.
B. Denaturation, primer and probe annealing: biến tớnh tỏch mạch, primer và probe bắt vào mạch khuụn.
A. Reverse transcription : bước phiờn mó ngược của phản ứng RT-PCR.
Hỡnh 2.2 Nguyờn tắc hoạt động của TaqMan probe
- Đọc kết quả: Sau khi kết thúc ch−ơng trình PCR, chuyển sang chế độ PCR standard cure, chọn Report, chọn chế độ hiển thị toàn phần (amp cycles) phân tích và in kết quả.
2.3.5.3 Đo nồng độ men AST và ALT trong huyết thanh
Giá trị bình th−ờng:
AST: Nam: ≤ 37 u/l/370C. Nữ : ≤ 31 u/l/370C ALT: Nam: ≤ 40 u/l/370C Nữ : ≤ 32 u/l/370C