cứu của đề tài: phân lập, định danh được tác nhân gây bệnh sương mai trên cây cà chuavà một số dòng vi sinh vật có ích sau đó đánh giá khả năng đối kháng của các dòng visinh vật đối với
NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Kết quả xác định một số nắm gây bệnh dựa vào đặc điểm hình thái học
3.1.1 Kết quả phân lập mẫu bệnh sương mai gây hại trên cà chua
Các mẫu bệnh từ vườn cà chua ở Lâm Đồng cho thấy sự xuất hiện thường xuyên của bệnh Sương mai, đặc biệt trong mùa mưa Mẫu bệnh ghi nhận trên lá với các vết bệnh màu nâu không có hình dạng cố định Đốm bệnh xuất hiện ở mặt dưới lá có lớp bào tử trắng đặc trưng, gây lan rộng và dẫn đến tình trạng lá khô héo và chết.
Tổng cộng, 18 mẫu bệnh đã được thu thập và nuôi cấy trên môi trường chuyên biệt PSM Sau đó, các mẫu này được cấy chuyền sang môi trường PCA để tiếp tục nghiên cứu.
Kết quả phân lập được 5 dòng nam la: LD4, LDS, LD8, LD9, LD12
3.1.2 Định danh nắm gây bệnh dựa vào đặc điểm hình thái
Hình 3.1 Hình thái sợi nắm và bao tử nắm xem ở vật kính 40X của các mẫu nam
Phytophthora infestans phân lập được trên mẫu bệnh ở Lâm Đồng.
A Túi bào tử tạo ống mầm B Túi bào tử dạng trái chanh
3.1.3 Kết quả kiểm chứng tác nhân gây bệnh sương mai theo quy tắc Koch
Phương pháp lây bệnh nam nhân theo Burgess và cộng sự (2008) bao gồm việc lây bệnh trực tiếp lên mô cây ký chủ bằng cách thu dịch bao tử từ tản nam nuôi cấy sau 7 ngày và đặt lên lá cây Mẫu lá được lấy từ cây cà chua sạch bệnh, sau đó được đặt vào hộp nhựa kín với gốc lá quấn bông để giữ độ tươi Dưới đáy hộp, một lớp bông được lót để giữ ẩm, và mẫu được bảo quản trong tủ định ôn ở 20°C Sau 5 ngày, triệu chứng trên lá được chủng sẽ được theo dõi và so sánh với lá bệnh ban đầu.
C, D Bào tử quan sát trên lá sau khi chủng bệnh
Sau 5 ngày chủng bệnh nhân tạo mẫu nắm phân lập được và mẫu nắm được cung cấp trên mẫu lá đã xuất hiện triệu chứng bệnh giống với triệu chứng trên mẫu bệnh khi thu về là các vết bệnh hình dạng không đều, màu nâu và xanh nhạt vết bệnh không có giới hạn rõ rệt (Stevenson, 1993) Khi 4m ướt mặt dưới lá chỗ có vết bệnh xuất hiện lớp nam trang xốp như sương muối (Drenth, Janssen và Govers ,1995).
Khi quan sát hinh thái bao tu trên lá cà chua ghi nhận có dang bào tử đặc trưng của nam Phytophthora infestans.
Kết quả nghiên cứu một số vi sinh vật đối kháng trong đất
Vi sinh vật có lợi được thu thập từ hai nguồn chính: nguồn vi sinh vật trong đất do phòng thí nghiệm của bộ môn bảo vệ thực vật, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM cung cấp và một số vi sinh vật được phân lập từ đất.
Bang 3.1 Kết quả quan sát đặc điểm của 13 dong vi khuẩn đối kháng phân lập được trên môi trường KBA.
STT Ténmau Địa điểm thu mẫu
1 ĐK-LĐI Huyện Đức Trọng,
2 ĐK- Lb2 Huyén Đức Trọng,
3 DK- LĐ3 Huyện Đức Trọng,
4 DK- LD4 Huyén Đức Trọng,
30 Đặc điểm hình thái Hình ảnh
Khuan lạc có hình đạng tròn phăng, mau trang sữa
Khuan lạc có hình dạng tròn lỗi, màu trắng đục, không nhay
Khuan lạc có hình đạng tròn nhỏ, màu trăng, bê mặt phang, khô
Khuẩn lạc có hình dạng bat định, màu trắng, bề mặt nhăn nheo, khô
Xa Lién Nghia, Huyện Đức Trọng, Lâm Đông
Xã Liên Nghĩa, Huyện Đức Trọng, Lâm Đông
Xã Thạnh Mỹ, huyện Đơn Dương, Lâm Đông
Xã Thạnh Mỹ, huyện Don Dương, Lâm Đông
Xã Thạnh Mỹ, huyện Đơn Dương, Lâm Đông
Xã Thạnh Mỹ, huyện Đơn Dương, Lâm Đông
Khuẩn lạc có hình dạng bat định, màu hơi vàng, bê mặt lôi, tâm bóng, nhay
Khuan lạc có hình dạng tròn, màu trắng trong, bề mặt phẳng hơi nhay
Khuan lạc có hình dang tròn nhỏ, màu trắng đục, bề mặt lỗi, khô
Khuan lạc có hình dạng tròn lôi, màu trăng sữa
Khuẩn lạc có hình dạng tròn lồi, màu trắng sữa, bề mặt bóng, nhay
Khuẩn lạc có hình đạng tròn lỗi, màu trắng đục
Xã Thanh My, dạng tròn lỗi, mau
11 ĐK-LĐII huyệnĐơn Dương, S978 TU ỉ2
R x trăng, mép khuân lạc Lâm Đông khô : x ông mau, nhây
12 Xã Hiệp Thạnh, Khuẩn lạc có hình ĐK-LĐI2 huyện Đức Trọng, dạng tròn nhỏ, màu tỉnh Lâm Đông trăng, nhây
Khuan lạc có hình dạng tròn nhỏ, màu trăng đục, bê mặt lôi
13 ĐK-LĐI3 Lạt, Lâm Đồng
3.2.1 Kết quả định danh vi khuẩn phân lập trong đất theo đặc điểm hình thái
Xác định Gram bằng KOH 3%
Kết quả thử nghiệm với dung dịch KOH 3% cho thấy 10/13 dòng vi khuẩn phân lập được có khả năng tạo sợi khi nhỏ KOH 3% vào, với hiện tượng nhót dính Khi nhúng đầu tăm vô trùng vào dịch khuẩn và lắc lên, dịch vi khuẩn hình thành sợi Các dòng vi khuẩn có khả năng kéo sợi bao gồm: ĐK-LD1, DK-LĐÐ2, DK-LD3, DK-LDS, DK-LD7, DK-LD8, DK-LD9, và DK.
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các dòng vi khuẩn LĐI1 và DK - LD12 thuộc loại gram âm, trong khi đó, ba dòng DK - LD4, DK - LD6 và DK - D13 được xác định là gram dương.
Sau khi thử nghiệm với KOH 3%, chúng ta tiến hành nhuộm Gram để xác nhận kết quả phản ứng KOH 3% Nhuộm Gram là một trong những bước cơ bản và quan trọng nhất trong việc định danh vi khuẩn Vi khuẩn Gram dương sẽ giữ màu xanh tím từ hỗn hợp crystal violet, trong khi vi khuẩn Gram âm sẽ không giữ được màu này sau khi rửa bằng cồn và sẽ chuyển sang màu hồng đỏ của safranin.
Kết quả nhuộm gram cho thấy trong số 13 dòng vi khuẩn phân lập, có 10 dòng gram âm không giữ màu của hỗn hợp crystal violet, trong khi 1 dòng còn lại bắt màu sau khi rửa cồn Cụ thể, các dòng gram âm bao gồm: DK - LĐI, DK - LD2, DK - LD3, DK - LDS, DK - LD7, DK - LD8, DK - LD9, DK - LD10, DK - LD11, DK - LD12, và 3 dòng gram dương là DK - LD4, DK - LD6.
Hình 3.4 kết quả nhuộm gram: A gram âm, B gram dương
Kết quả từ quá trình nhuộm nội bào tử cho thấy dòng vi khuẩn ĐK - LD4 có khả năng giữ màu của hỗn hợp malachite Điều này cho phép xác định rằng trong số 13 dòng vi khuẩn phân lập được, có một dòng có cấu tạo nội bào tử.
Khả năng phát triển trong điều kiện ky khí
Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi cấy sâu vi khuẩn vào môi trường PGA và ủ ở 28°C trong 3 - 4 ngày, có 3 trên 13 dòng vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy Trong số 13 dòng vi khuẩn, 3 dòng được xác định là vi khuẩn kỵ khí, bao gồm dòng DK - LD8 và DK.
Hinh 3.6 Vi khuan phat trién trong diéu kién ki khi:
A Vi khuan ki khi, B Vi khuan hiéu khi 3.2.2 Kết quả định danh vi khuẩn bằng một số phan ứng sinh hóa
Kết qua thử catalase cho thấy, có 13/13 dòng vi khuẩn phản ứng với H2O> tạo nên hiện tượng sủi bọt.
A.Vi khuẩn phản ứng sti bọt, B Vi khuân không có phản ứng sti bọt
Kết quả thí nghiệm cho thấy sau 1 phút quết khuân lên đĩa giấy oxydase, có 9/13 dòng vi khuẩn xuất hiện màu xanh, chứng tỏ rằng 9 dòng vi khuẩn này chứa enzyme oxydase.
- LĐI, DK - LĐÐ2, DK - LD3, DK - LD4, DK - LDS, DK - LD7, DK - LD9, DK LD10, DK LD12.
Hình 3.8 Kết qua phan ứng với Oxidase:
A Vi khuẩn chuyên sang màu xanh, B Vi khuẩn không đổi màu
Khả năng thủy phân tỉnh bột
Sau 3 ngày nuôi cấy điểm vi khuẩn lên môi trường thạch pepton có chứa 0,2% tinh bột Nhỏ dung dịch lugol lên trên vi khuẩn, quan sát thấy có 2 dòng vi khuân DK - LD4 và DK - LD6 không xuất hiện màu xung quanh vi khuân chứng tỏ 2 có dòng vi khuẩn ĐK - LD4 và DK - LD6 có khả năng thủy phân tinh bột.
Hình 3.9 Kết qua phản ứng thủy phân tinh bột
A Vi khuẩn thủy phân tinh bột, B Vi khuẩn không thủy phân tinh bột
Bang 3.2 Kết quả định danh vi khuẩn bang đặc điểm hình thái và phản ứng sinh hóa
Nhướm Thit Ki | Thủy Phát
Dòng vi KOH Nhuộm - Khí Thử Thu Phan quang khuẩn 3% gram a = Oxidase (Catalase Tĩnh trên
DK- LĐ9 + : : : + + : : ĐK- LĐ1I0 + : : - 4 4 - 5 DK- LDI1 + : : + : + : : ĐK- LĐI2 + : : - + h - h
Ghi chú: (+): phản ứng dương tính, (- ): phản ứng âm tinh
Dựa trên kết quả định danh vi khuẩn thông qua các đặc điểm hình thái và phản ứng sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập, chúng tôi đã tiến hành xác định sơ bộ các chi vi khuẩn phổ biến theo tiêu chuẩn của N.W Schaad (2001).
Dong DK - LD1, DK - LD2, DK - LD3, DK - LĐ5, DK - LD7, DK - LD9, DK - LD10, DK - LD12 là Pseudomonas spp, dong DK - LD4 là Bacillus spp, dong DK -
LD6, DK - LĐI13 thuộc nhóm xạ khuẩn (Actinobacteria), trong khi dòng DK - LD8 và DK - LD11 thuộc họ Enterobacteriaceae So với nghiên cứu của Trần Tiến Đạt, đa dạng vi sinh vật được phân lập và định danh có sự phong phú hơn, với 4 dòng Pseudomonas spp và 6 dòng Bacillus spp được tuyển chọn.
3.2.4 Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi sinh vật đối với nam
Bang 3.3 Bang khao sat kha nang đối kháng của 19 dòng vi sinh vật có lợi trong đất đôi với nam Phytophthora infestans ở điêu kiện phòng thí nghiệm.
Bán kính tản nam (mm) Hiệu suất đối kháng (%)
4NSC 5 NSC 6 NSC 4NSC SNSC 6NSC
1! PK-LDI 116efg ll6edf£ 11,7efg 606d 656a 70,1 ab
2 ĐK-LĐ2 1l4efg 116edf ll6eft£ 612d 656a 70,3 ab ĐK-LĐ3 ll0f£ Illef 1l2efg 624d 670a 713ab
6 DK-LD6 116efg 11,6def 11,6efg 60,7d 65,5a 70,2ab
8 DK - LD8 13,1 de 13,4 de 13,4ed 55,6cd 60,4ab 65,7 ab
10 ĐK-LĐI0 11,9efg 12,0def 120defg 597d 646a 69,3 ab
Il ĐK-LĐIIL 12,9def 13,0def 133def£ 563cd 61,5ab 66,0 ab
12 ĐK-LĐI2 11,6defg 11,7 def 11,9defg 606d 653a 69,4 ab
13 ĐK-LĐI3 12,1 defg 12,.2def 12,3 defg 58,7cd 63,9a 68,4 ab
chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,01.
37 Ở thời điểm 4 NSC ( Hình 3.10), giữa các nghiệm thức khác biệt rất có ý nghĩa thong kê Các nghiệm thức có mức đối kháng cao là DHT3 (10,3 mm, 65,03%), DK -
LD7 (10,5 mm, 64,3%), DK - LĐ5 (10,6 mm, 64,0%), DK - LÐ3 (11,0 mm, 62,4%),
Nghiệm thức DK - LÐ2 (11,4 mm, 61,2%) không có sự khác biệt thống kê so với nghiệm thức DK - LĐI (11,6 mm, 60,6%) và DK - LD6 (11,6 mm, 60,7%) Tuy nhiên, các nghiệm thức DK - LD7, DK - LDS, DK - LD3, và DK - LD2 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, đặc biệt là so với nghiệm thức CCFN1.1 (HSDK 0,39%) và nghiệm thức ĐXT 5 (HSĐK 1,08%) Ở thời điểm 5 NSC, các nghiệm thức thể hiện sự khác biệt rõ rệt về mặt thống kê Nghiệm thức DHT3 (10,4 mm, 69,2%) có bán kính tản nam thấp nhất và HSDK cao nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng Các nghiệm thức được đánh giá ở mức đối kháng trung bình và yếu bao gồm DK - LD4 (22,4 mm, 33,8%), DK - LD8 (13,4 mm, 60,4%), ĐK - LD9 (14,1 mm, 58,0%), CCFN1.1 (32,4 mm, 4,9%), DHT1 (7,3 mm, 48,7%), DNH3 (32,2 mm, 48,7%), DXT6 (22,1 mm, 34,6%), và CCLD - 2.1 (22,1 mm).
Trong nghiên cứu, 34,4% mẫu có BKTN, và nghiệm thức DHT3 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức khác Tại thời điểm 6 NSC (Hình 3.11), các nghiệm thức trong thí nghiệm cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, trong đó nghiệm thức ĐHT3 đạt HSĐK cao nhất với 10,4 mm, tương ứng 73,4%, và có sự khác biệt rất có ý nghĩa so với nghiệm thức có mức đối kháng cao.
DK - LD9 (14,3 mm, 63,3%), nghiệm thức có mức đôi kháng trung bình ĐHTI (17,8 mm, 54,5%), các nghiệm thức có mức đối kháng yếu ĐNH3 (37,1 mm, 5,0%), CCFN1.1
(37,4 mm, HSĐK 4,2%), DXT6 (22,3 mm, 43,0%), CCLD2.1 (23,4 mm, 40,1%), DK -
LD4 (22,4 mm, ứng 42,5%) Nhưng nghiệm thức ĐHT3 khác biệt không có nghĩa thống kê đối với các nghiệm thức còn lại.
Kết quả đánh giá cho thấy các dòng vi sinh vật phân lập từ đất trồng cà chua có khả năng đối kháng với nấm Phytophthora infestans cao hơn so với các dòng vi sinh vật từ đất trồng khoai tây Theo nghiên cứu của Trần Tiến Đạt (2022), chỉ có 4 dòng vi sinh vật đạt khả năng đối kháng cao, trong đó KTLĐ — 0104 đạt 69,65% và KTLD — 0305 đạt 68,85%.
38 đối với nam Phytophthora Hình 3.10 Khả năng đối kháng của các dòng vi khuan infestans tại thời điểm 4 NSC: A - U theo thứ tự Bang 3.3
Hình 3.11 Khả năng đối kháng của các dòng vi khuân đối với nam Phytophthora infestans tại thời điểm 6 NSC: A - U theo thứ tự Bang 3.3
KET LUẬN VÀ DE NGHỊ