Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Phân lập nấm Chaetomium spp. và khảo sát khả năng đối kháng đối nấm rhizoctonia Bicornis gây bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà

nâm có hiệu suât đôi kháng cao nhât và thử nghiệm trong điêu kiện nhà lưới.Từ kết quả định danh sinh học phân tử đã cho thay 2 dòng có hiệu suất đối khangmạnh nhất là CT03-LD và CT12-BD

TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NONG HOC

KHOA LUAN TOT NGHIEP

PHAN LAP NAM Chaetomium spp VA KHAO

SAT KHA NANG DOI KHANG DOI NAM

Rhizoctonia bicornis GAY BENH LO

PHAN LAP NAM Chaetomium spp VA KHAO

SAT KHA NANG DOI KHANG DOI NAM

Rhizoctonia bicornis GAY BENH LO

CO RE TREN CAY HO CA

Tac gia

DANH TRUONG TRUNG DINH

Khóa luận được dé trình dé dap ứng yêu cầucấp bằng kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật

Hướng dẫn khoa học

TS VÕ THỊ NGỌC HÀThS PHAM KIM HUYEN

Thành phố Hồ Chi MinhTháng 11 năm 2023

LOI CAM ON

Dé hoàn thành khóa luận này, trước hết tôi xin bày to lòng biết on sâu sắc trước

sự quan tâm, tận tình hướng dẫn của TS Võ Thị Ngọc Hà và ThS Phạm Kim Huyền.

Tôi xin cảm ơn ThS Nguyễn Trần Ngọc Trinh đã tận tình giúp đỡ hỗ trợ trong

việc phân lập và tìm hiéu về nam Chaetomium spp.

Tôi xin cảm ơn bạn Lê Hoàng Thương, Trần Minh Quang là cộng sự, ngườiluôn đồng hành giúp đỡ tôi xuyên suốt thời gian thực hiện khóa luận này

Tôi xin cảm ơn tập thể Lab 105 đã hỗ trợ trong suốt thời gian tôi thực hiện đềtài để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Quý Thầy Cô giáo Khoa Nông họcTrường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho tôi tham gia học tập

và tận tình hướng dẫn tôi học tập trong suốt thời gian từ năm 2018 đến nay

Xin chân thành cảm ơn Ba Mẹ, người thân, tất cả bạn bè đã luôn động viên, tạođiều kiện giúp đỡ tôi học tập và hoàn thành ngành học

TP Hồ Chí Minh, thang11 năm 2023

Sinh viên thực hiện

Danh Trương Trung Đính

1

nâm có hiệu suât đôi kháng cao nhât và thử nghiệm trong điêu kiện nhà lưới.

Từ kết quả định danh sinh học phân tử đã cho thay 2 dòng có hiệu suất đối khangmạnh nhất là CT03-LD và CT12-BD thuộc dong nắm Chaetomium cupreum

Từ 30 mẫu đất thu thập tại Bình Dương, Đà lạt, Củ Chi bằng phương pháp bẫygiấy lọc đã phân lập được 12 dòng nam Chaetomium spp Trong đó dòng CT03 và

CT12 có hiệu suất đối kháng cao nhất (87,4%) và (89,7%); tám dong (CT04, CT05,

CT6, CT7, CT§, CT9, CT10, CT11) có hiệu suất đối kháng từ cao đến rat cao dao động

từ (68,1% - 86,1%) hai đòng (CT01, CT02) có hiệu suất đối kháng dao động từ 57,3% —57,2%.

Trong điều kiện nhà lưới, khi có chủng nam Chaetomium spp vào đất thé hiện khảnăng phòng bệnh ở các nghiệm thức CT03-LD (65,56%), CT12-BD (64,44%), CT03-

LD + CT12-BD (71,11%) và nghiệm thức chế phẩm BS0I + Rhizoctonia bicornis(72,22%) khác biệt với nghiệm thức chủng nam Rhizoctonia bicornis và không xử lý

nam Chaetomium spp.

1H

MỤC LỤC

Trang

TT g geaeegraresennnidiinddtiranadttitio00002008800G80381983098/01018008188000g9130009030N00g886/ngi0d i

OL 5 00 g1 iiLog) 5 suasgapiazsgiusd0:8IA8:5183840018618000015400008713g42042001000501148620429113848023:96471013004ã03400265015/2435 iiiMỤC LỤC -©22-2S222215222112221127112221E27112T11221211.12 re ivDANH SÁCH CÁC CHU VIET TẮTT -©222-222+++22++t2EE++rrErxrrrrkrrrrrkrrrrrrrer viTINH BE BÁC HH cueeceeeeneeereresoeeirrienoisiitroeciE24030000000000002.000083/050G0E010.0G6 vii

ET, SUED EG WI sesamiae cite viii

©(909:773105— ÔỎ 1Đặt vấn đề - + s St 2 12112112111211211212112111111211111121111112112111121121201211111 21212211 re |IVĂHG TG cia ce eee Serre ene ee seca 6 05 wt oe Mee aie cece eee eae ees 2

CO TiistxonononipTEnriVGrg02 An 10rtigg6ctoassgiceroingoririrtorcpilerrisflerEobvforfost)ktimeoydBrfre 2Giới hạn đề tài - S2 2 3221E212122121121121112112111211111121121112121111212121 2121 re 2Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆU 5-2 5< 2s ©S££ee£xe+ee+xeeeeerseee 31.1 Giới thiệu tông quan về cây họ cà -2-222222222222222EeEErzrrersrrrrersrrsrerrerr 3Lada 'Cầyi CA CHUA bon dinttiigtig LGiAi4S4GBESIGEGSEEIDBBSSNESSIBGDSE.SNESSSSBSIRESSRGSIRGHESSS23/3H03HEGI3ES3S4.E30788 31.1.2 Tổng quan về bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà - 22 2+22+22z+zs+zzzzzszzsscxszsc .8

1.2 Tác nhân gây bệnh lở cô rễ hại cây trồng - - 2-55-5222 2ScSzcrrrrvrrrxrrrree 4

1.2.1 Rhizoctonia bicornis gây bệnh lở cỗ rễ 2-©222525+2cccsccveservesrrrcee 41.2.1.1 Đặc điểm của nấm 2 2 +2+S2+S2E+SE+EE2E2212212521211212122121111121111211 2122 Xe 41.2.1.2 Điều kiện phát triển và gây hại 22-52 22222222E22222212312212212221221 22x 5Eee | 51.2.1.4 Sự lan truyền và xâm nhiễm 22-22 2222E+2EESEEEEE2EE2EEE 22A 22L EEErrrree 61.3 Dac diém ctia nam Chaetomiim Spp n7 .5 61.3.1 Giới thiệu chung về nắm Chaetomium spp -. -. 5 52-52-©52©5255225222sz55+z55z>: 61.3.2 Đặc điểm hình thái của nắm Caefoimiui spp . -2:-5:-5525552555c25sc>ccssccs2 71.3.3 Đặc điểm phân bố của nắm Chaetomium spp -. -5-©22©52-552552255z55+25522 81.4 Những nghiên cứu về chế phẩm sinh học -. 2-2222 2222Sz22E22E++2zz2E+zzzzzz2 12

IV

Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 152.L Nội GUNS 1ghẲiÊH GIẦU cecnssscesisssxiassss6101116565650161161683556E5586655583S550/9551910145058G04SS89S85E 152.2 Thời gian va địa điểm nghiên cứu 2-22 2 22222E+2E2EE2EE2EE£EEzExerxrzrrerxres 152.5 Vat [OUR SNICH Ôn 66 H6 286 B3 56 86 S066 sioweansneuse snosbeun senate snaenene S8S048614 038586 3098 15 2.4 Phuong phap nghién cUU 8n 16

5 Piece eit Tg 80 Thoa neaaggntö ggitG0A030G35E000340120339UG00500.808030010003030g3gu18 25Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN - 5< ©s<+se+eseezseevserrserss 263.1 Kết qua phân lập nắm Chaetommim SjD - :-25-©25:©222252222+222+222+222S222S22Evczzvcre 26CN: 200109 ) n Ả 263.2.3 Đặc điểm hình thái của nấm Chaetominm spp -5-©22©52255225222555z25522 273.2 Khả năng đối kháng với nam R bicornis của các dòng Chaetomium spp trong điềukién phong thi nghi@m 013 .

3.3 Dinh danh dòng Chaetomium spp CT03 và CT12 s75 S-ccccsecsereerrrrs 33

3.3.1 Cặp mỗi ITS4-ITSS oo cccccccceccssessesssessesssessecssessessesssessesssssessesssesssessesseeseesees333.4 Khả nang phòng nam Rhizoctonia bicornis của các dòng Chaetomium spp điềukiện nhà WO ssessssesessesspressszerexsesemer semanas eaomameapnenmnm EMER TEER 35KET LUẬN VÀ DE NGHỊ, cssssssssossssssosssscsnsccscsaccssssaccasccaccascsaccascsuscascssceasensesacenes 40KẾT luận -2- 52s S2 1 3E212112121121121112111111112111 1211111222111 212121 re 40LCE a CC co CC 40TẮTLIẾU THAM KHẢ nguuaeesooerenderorngrtdturitoienosttara6tSipdsttegipng(spiosgsgl 41

HT rosesvcrssncnvessasspeussnssessessunconensnsvsasenanucsnenssvunusueceessanvensvessonsscenscansacvsosessusaneverseess 48

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

Viết tắt Viết đầy đủ

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TrangHình 1.1 Một số chất kháng sinh của nắm Chaefomium spp có hoạt tính ức chế namgay bệnh (Keawchai và:cs, 2009) cseeecksieekEELDEE lau 006u.20012.01-1850.006u58024/0,g8ucE 10

Hình 2.1 Tan nắm Rhizoctonia bicornis 3NSC 5-52 525S22E2EcEEcEErErrrreee 16

Hình 2.2 Bồ trí thí nghiệm đối kháng Chaetomium spp với nam Rhizoctonia bicornis

Hình 3.1 Bay nam ở thời điểm 21 ngày sau khi đặt giấy vô trùng - 27Hình 3.2 Hình thái tan nam Chaetomium spp sau phân lập trên môi trường PDA ởthời điểm 14 ngày sau cấy ở nhóm 1: a - bMPL CT01-CT02 -2 2525522 30Hình 3.3 Hình thái tản nam Chaetomium spp sau phân lập trên môi trường PDA ởthời điểm 14 ngày sau cấy ở nhóm 2 tira - j: MPL CT03 - CT12 - 30Hình 3.4 Sự phát triển của các chủng nam Chaetomium spp va Rhizoctonia bicornis ởthời điểm 5 NSC A: Đối chứng Rhizoctonia bicornis, từ b - m: MPL CT01-CT12 32Hình 3.5 Kết quả điện di DNA bang cặp mồi ITS4-ITS5 đối với các mẫu nam phânlấp G0161 2) can nrinnsnberioitgte4489136300001081039°2093B1EĐISSNGBIIGCERISERENTSSSISS2AZ39R.t383SEsingst 33Hình 3.6 Cây phát sinh loài dựa trên mỗi ITS4-ITS5 của các mẫu nắm với một số mẫutrên ngân hàng Gen Các giá trị bootstrap sau 1000 lần lặp lại là thể hiện dưới dangphan tram PP a3 35Hình 3.7 Cây cà chua sau khi tách khỏi chậu dé lay chỉ tiêu sinh trưởng chiều cao cây,chiều dài rễ; (a) NT R bicornis, (b) không xử lý, (c) NT CT03, (đ) CT12, (e) CT03

VI

DANH SÁCH CAC BANG

TrangBảng 2.1 Các mẫu ly trích DNA của các dòng phân lập được khuếch đại bằng cách sử

Bang 2.2 Phan ứng PCR được thực hiện trong thé tích phan ứng cuối cùng là 25 ulchứa các thành phần hiện 2-2 2 S2 S%+SE+SE£EE£EE+EEEEEEEE2EE2E22E21221221221221221222.xe2 20Bảng 2.3 Quá trình khuếch đại được thực hiện trong bộ tuần hoàn nhiệt có thể lập trình

(Blue-Ray Biotech TuborCycler) sử dụng chương trình nhiệt - - 20

Bảng 3.1 Tỷ lệ số mẫu có nắm Chaetomium SPỤ - -. -5-52-522©52252552222222z22zc5522 26Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của 2 nhóm nắm Chaetomium spp . -:-5: 28Bảng 3.3 Hiệu suất đối kháng của các dòng nam Chaetomium spp đối với Rhizoctoniabicornis trên môi trường PDA sau 5 ngày nuôi cấy - -2 5-5cc5ccsccc-cc -.-3]Bảng 3.4 Kết quả tra cứu độ tương đồng trên Genbank bằng trình tự Nucleotit của cácmẫu nấm ChaectoMiUm SPP 52-52- 52 522S22EE‡EEEEEEEE2EE2E322322322121212121212121 2 xe, 34

Bảng 3.5 Tỉ lệ % bệnh ở thí nghiệm phòng bệnh - 5 552>+<++c+>+£zecxe+s 35

Bảng 3.6 Chỉ số bệnh lỡ cô rễ của nắm Chaetomium SpỤ - -5-22-75-55252-5522 36Bang 3.7 Hiệu lực phòng bệnh lỡ cô rễ của nam Chaefomium SP - 37Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nắm Chaetomium spp đến sinh trưởng của cà chua 18

0 sunesssssossoevsstg8xS18S06601130060E90055 83100383 89505830559910010011 000 040008358E.00013/VGSĐGIGG.0/840/83/000G00000.8 38

Vill

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Cây họ cà (Solanaceae) xuất hiện hầu hết các lục địa, bao gồm nhiều loài quantrọng trên thế giới như khoai tây, cà chua, cà tím, ớt (Olmstead và cs, 2008) Cây họ càkhông chỉ được biết đến là rau hay cây lương thực, làm cảnh, chúng còn chứa nhiềuloại alkaloid rất có ý nghĩa về mặt khoa học (Shah và cs, 2013)

Theo Samuels (2015), có khoảng 28 triệu ha cây họ cà được gieo trồng (chủ yếu

là khoai tây, cà chua, cà tím và ớt chuông), sản xuất ra khoảng 540 triệu tấn mang lạimột nguồn lợi lớn cho nền kinh tế Tại Việt Nam, các cây họ cà được trồng ở tỉnh LâmĐồng với hơn 13.000 ha (Thống kê của Chi cục TT&BVTV tỉnh Lâm Đồng 2018)

Trong trồng trọt, việc canh tác liên tục sẽ dẫn đến có nhiều loại nam gâybệnh hại cây trồng tồn lưu trong đất, ảnh hưởng đến năng suất và gây thiệt hại lớntrong sản xuất nông nghiệp Trong các loại nam gây bệnh, đáng chú ý là nhữngchủng nắm R solani gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất của nhiều loại câyngũ cốc (lúa, ngô, khoai tây), các loại rau họ cà, các loại cây ăn quả và cây côngnghiệp ngắn ngày, dài ngày (lạc, đậu, bông, cao su) Rhizoctonia solani gây ra cáctriệu chứng thối rễ, lở cổ rễ, thối thân, bệnh đốm lá trên cây đậu tương (Baysal và cs,2008; Nelson và cs,1989; Petersen Buddemeyer, 2004) Đặc biệt, R solani ton taiđược trong dat, trong các mô của cây đã chết trong thời gian dai (Nelson,Summerll,1989; Petersen, Buddemeyer, 2004).

Từ đó biện pháp phòng trừ sinh học trong sản xuất nông nghiệp đã được quantâm nghiên cứu nhằm góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường, nâng cao độ phì nhiêucủa đất và làm tăng năng suất cây trồng và giá trị của nông sản Hiện nay, sử dụng visinh vật đối kháng có nguồn góc từ đất đang là một biện pháp đầy tiềm năng Trong sốcác loài nam đối kháng có tiềm năng lớn ứng dụng trong phòng chống bệnh cây là nắmthuộc chi Chaetomium spp Đây là loài nam túi hoại sinh lớn nhất với trên 300 loài đãđược mô tả (Von Arx vả cs., 1986).

Trước tình hình đó đề tài “Phân lập nam Chaetomium spp và khảo sát khảnăng đối kháng nam Rhizoctonia bicornis gây bệnh lở cỗ rễ trên cây họ cà” đượcthực hiện.

Mục tiêu

Chọn lọc được dòng nam Chaetomium spp từ dat có khả năng kiêm soát nam

Rhizoctonia bicornis gây lở cô rê trên cây họ cà nhắm hướng tới phát triên chê phamsinh học kiểm soát nắm bệnh

Yêu cầu

Thu thập, phân lập nắm được Chaetomium spp từ đất

Xác định được kha năng đối kháng của nắm Chaetomium spp đối với nam

Rhizoctonia bicornis trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới

Định danh bằng kĩ thuật sinh học phân tử 2 dòng nam Chaetomium spp có hiệu

suât đôi kháng với nam R bicornis cao nhat.

Giới hạn đề tài

Đề tài được thực hiện từ tháng 02 năm 2023 đến tháng 12 năm 2023 tại

khoa Nông học Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu tống quan về cây họ cà

Cây họ ca có tên khoa học là Solanaceae, là một loại thực vật có hoa Tên khoa học của họ này có nguôn gôc từ tiêng Latinh Solanum, nghĩa là “cây cà dược”.

Ở Việt Nam, họ cà gồm các cây thân thảo hoặc cây nhỏ, phân bố rộng khắp cảnước Một số loài được trồng dùng làm thực phâm (cà tím, cà pháo, cà chua, khoaitây), gia vị (ớt), cây công nghiệp (thuốc lá) hoặc cây dược liệu

về sản lượng Cà chua có tầm quan trọng chỉ sau khoai tây ở nhiều quốc gia và đứng thứ

nhât về rau được bảo quản, chê biên và cả mục đích sử dụng tươi.

1.1.2 Tổng quan về bệnh lở cỗ rễ trên cây họ cà

Bệnh lở cô rễ hay còn gọi là bệnh thối gốc, một trong những loại bệnh nguyhiểm, gây thiệt hại nhiều nhất, nhanh nhất cho những người sản xuất cây họ cà nóichung Bệnh lở cô rễ do nhóm nắm bệnh có nguồn gốc trong đất gây ra, điển hình nhưnam Rhizoctonia bicornis Tuy nhiên, tùy điều kiện thời tiết, chế độ canh tác có thé do

nhiêu loại nam khác như Pythium sp., Fusarium sp Cac bào tử nam này thường sông

tiềm ấn trong dat và tàn du cây trồng khá lâu, nhất là ở những vườn ươm cây giống,những vườn sản xuất đã từng bị bệnh lở cổ rễ không được xử lý đất trước khi trồng lại.

Bệnh chủ yêu gây hai ở phần cô rễ, phần gốc sát mặt đất Khi mới xuất hiện,nếu quan sát kỹ có thể thấy những vết bệnh có màu khác với vỏ cây, phần vỏ này bịrộp lên, sau đó lan dần bao quanh toàn bộ phần cổ rễ hoặc gốc cây Dần dan phan vỏnày khô teo lại, khi gặp trời mưa hoặc độ ầm cao sẽ bị thối nhũng, bong ra, trơ lại phầnlõi gỗ của cây có màu thâm đen, cây sẽ héo dan và chết Vết bệnh có thé lan rộngquanh gốc thân và lan xuống rễ, sốc thân bị lở loét Đối với cây con, bệnh gây hạitrước hoặc sau khi mọc khỏi mặt đất, trước khi nảy mam bệnh gây chết đỉnh sinhtrưởng Sau khi nảy mầm, bệnh gây ra các vết bệnh màu nâu đậm, nâu đỏ hoặc hơi đen

ở gốc cây sát mặt dat, phần non bị thắt lại, trở nên mềm, cây con bị đồ gục

Bệnh lây lan trong môi trường nước và xâm nhập qua các vết thương cơ giớihoặc các lỗ khí không của lá, phát sinh, phát triển mạnh trong điều kiện độ 4m cao,nhiệt độ cao hoặc mưa, nẵng, rét, nóng thất thường Bệnh phá hoại xuất hiện thời kỳ

sinh trưởng của cây nhưng chủ yếu là vào thời kỳ cây con gây thiệt hại lớn cho nguồnnông sản nước ta (Võ thị Thu Oanh, 2007).

1.2 Tác nhân gây bệnh lớ cỗ rễ hại cây trồng

1.2.1 Rhizoctonia bicornis gầy bệnh lở cỗ rễ

1.2.1.1 Đặc điểm của nam

Chi Rhizoctonia có rất nhiều loài, Rhizoctonia bicornis thuộc lớp nam bat toàn(Deuteromyces) Ở giai đoạn sinh sản hữu tính loài này có tên gọi là Thanatephoruscucumeris thuộc lớp nắm đảm (Basidiomycetes), nam phat trién nhanh, phan nhanh taiđiểm gần vách ngăn giữa hai tế bao và vuông góc với sợi nam chính (Mezies, 1970).Sinh sản hữu tính tạo đảm đơn bào, không màu, hình bau dục, có từ 2 — 4 bào tử đảm,hình trứng hoặc hình bầu dục đẹp Ở nước ta chưa thấy dạng sinh sản hữu tính (VũTriệu Mân và Lê Lương Tè, 1998)

Ở giai đoạn vô tính, nam phat triển ở dạng sợi, tạo hạch Theo Papav1zas và cs(1975), sợi nam Rhizoctonia khi mới hình thành không màu, khi gia có mau nâu đậm,

đường kính 7 — 12 ym với những vách ngăn không liên tục (Ou, 1985) Soi nam

thường phân nhánh xiên tạo góc 45° — 90° tại vi tri phân nhánh có vách ngăn và hơi

thắt lại Theo Van Bruggen và cs (1986) đã xác định: vách của sợi nắm có màu trắngđến nâu, chiều rộng của sợi nam là từ 4 — 5 wm va phân nhánh ở góc phải Rhizoctoniabicornis có 3 loại sợi nam: sợi nam bò (runner hyphae), sợi nam phân nhánh (lobatehyphae) và các tế bao dạng chuỗi (moniloid cells) (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005)

1.2.1.2 Điều kiện phát triển và gây hại

Nhiệt độ cho sự xâm nhiễm của nam có thé xảy ra là 23°C — 25°C, nhưng tốihảo nhất là 30°C — 32°C, am độ phải từ 96 — 97% Ở 32°C nắm xâm nhiễm vào trongvòng 18 giờ (Võ Thanh Hoàng, 1993) Ở nhiệt độ thấp dưới 10°C va cao hon 38°C sợinam ngừng phát triển Hach nắm có thé chịu ngập trong 96 giờ mà không giảm sứcsông nếu như giữ khô từ 24 — 168 giờ sau khi ngập (Vũ Triệu Man và Lê Lương Tè,1998) Ảnh hưởng của các điều kiện thời tiết khí hậu, kỹ thuật chăm sóc, địa thế đấtđai, chế độ luân canh cây trồng đến sự phát sinh và gây hại bệnh cũng rất khác nhau

Trong phòng thí nghiệm, nam R bicornis có thé mọc tốt trên nhiều loại môi

trường khác nhau như PGA, PDA, PGB, không đòi hỏi môi trường chuyên biệt Trên

môi trường PGA nam sinh trưởng rất nhanh, sau 7 ngày nuôi cấy, đường kính tan namlên đến 8,12 cm Nam có thé phát triển được trong phạm vi pH rộng từ 4 - 8, pháttriển thuận lợi nhất ở pH 6 — 7 (Võ Thi Dung và cs, 2017)

1.2.1.3 Sự tồn lưu

Nam tôn lưu và lây lan ở hai dạng: Soi nam và hạch nam Ở điều kiện khô, hạch

nam có thê sông được 2 năm, ở điêu kiện ngập 7 cm trong nước nam có thê sông từ 1 —

4 tháng, điều kiện 4m hạch nắm có thé sống 7 tháng (Võ Thanh Hoàng, 1993)

Rhizoctonia bicornis là những loài hoại sinh mạnh Chúng có thé sống sót quathời gian dài trong trường hợp không có cây ký chủ bằng nguồn dinh dưỡng từ cácchất hữu cơ đang phân hủy Hach nắm có cấu trúc phức tạp được tạo ra do các sợi namcuộn lại, chúng có khả năng duy trì sức sống trong điều kiện môi trường không thuậnlợi như: khô hạn, thiếu thành phần dinh dưỡng hay hóa chất độc hại (Ghaffar, 1993)

Theo nguyên cứu ở Philiplines hạch nắm có khả năng sống vài tháng hay hạch nam cóthể sống 9 tháng trong phân bò, trâu (Ou, 1985).

1.2.1.4 Sự lan truyền và xâm nhiễm

Nắm được lan truyền nhờ gió, nước hoặc thông qua các hoạt động nông nghiệpnhư làm đất và vận chuyên hạt giống (Kareem và cs, 2018) Nắm có khả năng lantruyền theo 2 chiều: đứng hoặc ngang Lan truyền theo chiều đứng chủ yếu là sợi nắm,vết bệnh phát triển dần lên lá, chồi và các bộ phận khác Bệnh lan truyền theo chiềungang từ nơi này sang nơi khác bằng hạch nắm và sợi nắm, sự lan truyền chủ yếu nhờdòng nước, hạch nam bị nước cuốn đi gặp kí chủ thích hợp sẽ bám vào hay do nướcmưa (Tô Thị Thùy Hương, 1993).

Sự xâm nhiễm của Rhizoctonia bắt đầu khi sợi nam hay tản nam từ một hạchnam nảy mam bat dau phát trién hướng về ký chủ phù hợp như là sự thu hút của cáchóa chất được tiết ra ở rễ, amino acids, đường, acids hữu cơ và phenol của cây trông

Khi hạch nam bám vào be lá sẽ nảy mam ra sợi nam rat nhỏ, sợi nam có thê

xâm nhập trực tiêp qua biêu bì hay khí không Muôn xâm nhập qua khí không sợi nâm phải phát triên len vào mặt lá và xâm nhiễm vào.

1.3 Đặc điểm của nắm Chaetomium spp

1.3.1 Giới thiệu chung về nắm Chaetomium spp

Chi Chaetomium spp thuộc

Bộ Sordariales có 120 chi và 700 loài khác nhau Riêng Chaetomium spp có khoảng 300 loài khác nhau Chaetomium spp có đặc trưng riêng là có các lông bao,

còn gọi là “sợi tóc”; cellulose là vật chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát sinh bao

tử Nắm Chaetomium spp được tìm thấy trên nhiều loại bề mặt vật chất khác nhau ởđiều kiện ấm áp và khô như: phân, rơm, giấy, hạt, mảnh vụn thực vật, lông chim.Nhưng môi trường sống chủ yếu vẫn là ở trong đất Theo Soytong và Quimio (1989),

Chaetomium spp có thé được phân lập bằng phương pháp bay nam bằng mảnh giấy

lọc đặt trên bề mặt đất âm trong đĩa petri

1.3.2 Đặc điểm hình thái của nắm Chaetomium spp

Khuan ty: phát triển nhanh trên môi trường thạch khoai tây, kích thước 6 — 9

cm sau 9 — 10 ngày nuôi cấy Khuẩn ty ban đầu có màu trắng như bông, sau chuyênsang màu xám nhạt, rồi dần chuyên sang màu nâu đen do sự hình thành các quả thểascoma Các quả thé này có dạng hình cầu hoặc hình quả lê, kích thước lớn, hình thành

rải rác khắp bề mặt khuẩn lạc, tạo thành đám màu nâu đen khi gia (Soytong, 1991).

Soi nam: Soi nam có vách ngăn, có màu xám hoặc nâu nhạt, moc từ môi trường

và từ sợi khí sinh (Soytong, 1991).

Cơ quan sinh sản: Quả thể hình quả lê phình ra ở giữa, có màu tối (đen hoặcnâu đen), có mở lỗ; có nhiều lông bao mọc xung quanh bên ngoài, kích thước 100 —

500 x 100 — 400 um, với các kiểu dang và độ dày mỏng khác nhau tuỳ loài; có loạithang hay uốn nếp kiểu gon sóng, loại ngoan ngoèo kiểu ruột già, loại chi ngoằn ngoèotrên đỉnh sợi, loại xoăn lọn, loại đơn giản, loại phân nhánh (Soytong, 1991).

Quả thé lúc còn non có hình cavat đến hình gậy chứa đựng từ 4 — 8 bào tử màunâu Khi quả thé chín các nang nam giống như cột trụ hoặc hình chùy nhú lên từ đầucủa qua thé, chứa các nang bao tử thắng hoặc không thang hàng Kích thước của nangnam là 68 — 84 x 5 — 7 wm Các nang bao tử có màu, thành tế bào nhẫn, có nhiều hìnhdạng khác nhau (chủ yếu là hình quả chanh) với 1 lỗ mầm, kích thước 10 — 12 x 2.8 —

4 um Bao tử bọc sinh ra từ túi bào tử hình trụ hoặc sợi nam, kích thước bao tử 7 — 8 x

5 — 6 pm (Rai và cs, 1964).

1.3.3 Đặc điểm phân bố của nam Chaetomium spp.

Nắm Chaetomium spp là một trong những nhóm nam lớn nhất trong hệ vi sinhvật dat phân bồ rộng rãi trong tự nhiên, và sự phân bố cũng tuân theo quy luật như cácloài vi sinh vật khác Số lượng của nam Chaetomium spp chủ yêu nằm trong các tầngđất dưới Đặc biệt ở tầng đất sâu 25 — 30 cm thì số lượng Chaetomium spp cô nhiềunhất (Soytong và Quimio, 1989)

1.3.4 Yếu tố dinh dưỡng, sinh trưởng và phát triển của nam Chaetomium spp

Kha năng hấp thụ nguồn khác nhau của các chủng nam Chaetomium spp đượcứng dụng trong việc sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ nam bệnh hai cây trồng(Soytong, 1990) Các chủng nắm này hấp thụ tốt một số loại đường như Saccharose,

glucose, fructose, cellubioseza, D- lactose, D-maltose, tinh bột, rỉ đường, axit malic,

L- arabinoea dé tổng hợp năng lượng, hấp thụ kém đối với rượu, N-amylic, citric acid(Lê Thi Anh Hồng va cs, 2005) Chaetomium spp sử dung rat tốt với các loại đường

fructose, saccharose, galactose, ribose, cellobiose (Bainier, 1910).Ciing có những

nghiên cứu cho thấy rang, trong môi trường không cần đường thì Chaetomium spp.van phát triển tốt Các loài Chaefomium spp hap thụ ca hợp chat vô cơ và hữu cơ có

chứa nitơ, nhưng ưa môi trường có chứa L-triptophan va L-glutamic Prolin nhanh

chóng bị phân giải bởi Chaefomium globosum và sử dụng các sản pham của quá trìnhphân giải đó (Rai và cs, 1964).

Nguồn nitơ (đạm): Theo Soytong (1988), các loài Chaetomium spp hap thụ cảhợp chat vô cơ và hữu cơ có chứa nito, nhưng ưa môi trường có chứa L- triptophane va

L-glutamic Prolin nhanh chóng bị phân giải bởi Chaetomium globosum và sử dụng

các sản phẩm của quá trình phân giải đó Các loài C cupreum, C globosum, C.lucknowense thích hợp sử dụng đạm nitrat natri, nitrat amon sử dụng kém hơn.TheoSoytong thì có những loài hấp thụ tốt muối amon đó là C mollicellum, C funicolum.Trên môi trường có chứa casein ức chế sinh trưởng của nhiều loài Chaetomium spp

Độ âm: Độ am tương đối là ảnh hưởng đến sự nảy mam của bào tử và phát triển

các cơ quan dinh dưỡng của nấm Chaetomium spp Bào tử nam Chaetomium spp cóthé nảy mam trong một phổ độ ẩm tương đối rộng 30 - 100%, nhưng phù hợp nhất là

70 - 100% Bao tử nam Chaetomium spp có thé nảy mầm cả khi ở các vùng đất khôhạn vì tiết ra ergosterol (Sekita va cs, 1981)

Nhiệt độ: Nam Chaetomium spp phát triển trong một phô nhiệt độ rộng từ 3 52°C Mỗi loài Chaetomium spp lại có khoảng nhiệt độ thích nghi riêng như: C.globosum, C cupreum là 4 - 42°C, C lucknowense là 3 - 50°C (Chives, 1915) Nguồngốc xuất xứ có ảnh hưởng lớn đến khoảng nhiệt độ sinh trưởng thích hợp của namChaetomium spp Nêu cùng C globosum, nhưng khi phân lập ở Trung Quốc trongvùng khí hậu ôn đới thì nhiệt độ thích hợp là 12 — 15°C và phát triển tối ưu cả ở Nga,

-nhưng cũng loài đó khi phân lập ở Thái Lan thì nhiệt độ thích hợp là 25 - 30°C Khi

nhiệt độ lên cao quá thì nam Chaetomium spp chậm sinh trưởng, bề mặt map mô,không bằng phẳng (Sekita và cs, 1981) Tuy nhiên nhiệt độ không ảnh hưởng rõ rệtđến hoạt tính đối kháng của nam Chaetomium spp (Bordeau va Andrew, 1987)

Ánh sáng: Ánh sáng ảnh hưởng đến hoạt động và quá trình sinh trưởng của nắmChaefomium spp Trong điều kiện tối, quá trình sinh bào tử chậm hơn trong điều kiệnchiếu sáng, nhưng số lượng bào tử điều kiện chiếu sáng liên tục sẽ ít hơn so với điềukiện tối Trong điều kiện sáng xen tối thì lượng bào tử và lượng nam sinh khối thuđược là cao nhất Trong điều kiện chiếu sáng liên tục sẽ ức chế sự tạo thành sinh khối,

sự hình thành bao tử và sự tăng trưởng phát triển của sợi nam.Anh sáng không có anhhưởng rõ rệt đến một số chủng nam Chaetomium spp (Heye va Andrew, 1983)

pH: Là một yếu tố quan trọng liên quan đến sự sinh tồn của nam Chaetomiumspp Mặc dù các loài Chaetomium spp khác nhau có thé phát triển ở các mức pH khácnhau, những loài cụ thé có độ pH tối ưu khác nhau, C.globosum và C.cupreum (pH 5-

6), nhưng C /ucknowense thích hợp pH 3 - 8 (Soytong, 1991).

1.3.5 Hoạt tính cơ bản của nam Chaetomium spp.

Một trong những hoạt tính co ban và quan trọng của loài Chaetomium spp là

khả năng sinh enzyme ngoại bào mạnh như cellulase Cellulase là enzyme phô biến ởnhiều loài Chaetomium spp Đây là enzyme khá quan trọng trong quá trình sống củaloài nấm này Nam Chaetomium spp không chỉ giúp phân giải các xác thực vật tạonguồn dinh dưỡng cho sinh trưởng và phát triển của nắm mà còn tạo cơ chế dé xâmnhập và phá hủy một số loại nắm gây bệnh khác bằng cách ức chế sự tổng hợp thành tếbao nấm như ức chế hình thành thành tế bào 3 - D - glucan của nam Đây là một trongnhững cơ chế cơ bản để ký sinh trên nam bệnh của Chaetomium spp Ngoài ra,Chaetomium spp còn kích thích sinh trưởng của cây bằng cách tiết ergosterol làm tăng

độ mùn trong đất, từ đó kích thích cây sinh trưởng làm tăng sức đề kháng cho cây.Nam Chaetomium spp có khả năng sản sinh ra bào tử trong vùng đất của rễ cây trồng,

có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng mạnh hơn so với nắm bệnh, nhất là trong điều kiệnđất có nhiều mùn hơn (Di Pietro và cs, 1991)

Chaetomium spp còn có kha năng tổng hợp được các chất hoạt hóa sinh họcnhóm Mycotoxin (Chaetoglobosin Q, R, T, U) và nhóm Epipolythiodioxopiperazine(Chaetoglobosin A, B, C) Đây là nhóm chất có hoạt tính kháng nắm, có khả năng tiêudiệt các tế bào nắm bệnh bằng cách phá hủy màng tế bào, làm cho nguyên sinh chất bịpha vỡ ra ngoài và mat đi độc tính của nắm bệnh, kết quả là làm giảm hiệu quả của tác

nhân gây bệnh cũng như mức độ nhiễm bệnh (Di Pietro và cs, 1991)

Hình 1.1 Một số chất kháng sinh của nam Chaetomium sppcó hoạt tính ức

chê nam gây bệnh (Keawchai va cs, 2009)

10

Chaetomium spp có khả năng tiết ra 4 loại kháng sinh quý hiếm Các chất này

có khả năng ức chế, phá vỡ tế bao, xâm nhiễm, tiêu diệt các loài nắm hại một cách khá

dễ dang(Pornsuriya và cs, 2008)

Chaetomium spp sản sinh ra chất Chaetoglobusin C có khả năng ức chế sinhtrưởng của một số nam gây bệnh cây như Colletotrichum gloeosporioides,

Coldematium, Fusarium oxysporum, Phytophthora palmivora, P.parasitica,

P.cactorum, Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani va Sclerotium rolfsli (Soytong va ces, 2001).

Chat Chaetoviridins A và B có kha năng ức chế sinh trưởng một số nắm nhưPyricularia oryzae, Pythium ultimum (Park và cs, 2005).

Chat Rotiorinois: do nam C cupreum tạo ra có kha năng ức chê sinh trưởng của

nhiều tác nhân gây bệnh gồm cả nam va vi khuẩn (Kanokmedhakul và cs, 2006)

Thực tế khi xử lý chế phẩm sinh học được sản xuất từ các chủng namChaetomium, cây sinh trưởng phát triển mạnh và cho năng suất, chất lượng cao hơn, cảtrong điều kiện nhà kính và ngoài đồng ruộng, Chaetomium spp được biết có khả năngsản sinh một lượng cơ chất ergosterol khá lớn Chính ergosterol là một nhóm hợp chấtchuyền hóa có nguồn gốc từ nam có khả năng cải tạo đất làm cho đất thêm màu mỡ,tăng độ phì nhiêu của đất, cải thiện cấu trúc đất, kích thích sự phát triển của cây (Eash

và cs, 1994) Hàm lượng ergosterol là một chỉ thị sinh học quan trọng về chất lượngđất (Dick và cs, 1994)

Một cơ chế nữa cũng phải kế đến là hợp chất chaetoglobosin C do Chaetomiumglobosum sản sinh ra có khả năng kích thích cây hình thành tính khang (IR, InducedResistance) của cây Các thí nghiệm đã cho thấy CJaefomiưm spp cảm ứng hình thànhcác lớp oxy hoạt hóa (ROS, reactive oxygen species) — là các phân tử dẫn truyền tínhiệu để cảm ứng tại thành tính kháng tập nhiễm trên cây ca rốt, khoai tây, khoai lang,thuốc lá (Soytong và cs, 2001)

1.3.6 Đặc điểm phân loại của nắm Chaetomium spp

Phân loại theo phương pháp truyền thống

11

Nam Chaetomium spp được chia thành nhiều loại khác nhau dựa trên các đặcđiểm hình dang quả thé, lông bề mặt và lông bên của quả thé, chi tiết qua bào tử.Trong thực tế Chaetomium spp rat đa dạng về hình dáng qua thé, đa dạng của lôngbao Hầu hết các tác giả đều dựa trên sự phân nhánh và cách cuộn xoắn của lông baobên ngoài quả thê làm tiêu chí chính cho phân loại, trong khi Von Arx và cs (1984),dựa trên đặc điêm của nang bào tử, quả bào tử và bê mặt thành của nang bào tử.

Trong khuôn khổ chi Chaefomium spp., có trên 300 loài đã được nghiên cứu và

mô tả Trong đó phân loại của Soytong và Quimio (1991) có những mô tả và hình ảnh

rõ ràng nhất từ qua thé, lông bao qua thé (đặc điểm của lông, sự phân nhánh của lông),

hình dạng quả bào tử, hình dạng nang bào tử.

Ở Philippines, Quimio và Soytong (1991) đã phân lập được 19 loài hoàn chỉnhtrong tổng số 88 mẫu phân lập Ở Thái Lan Soytong đã phân lập được 15 loài hoànchỉnh trong tông số 190 mẫu phân lập

Định danh dựa vào trình tự vùng ITS.

DNA tổng số của nam được chiết bằng phương pháp CTAB theo phương pháp

Doyle (1987) Phản ứng PCR được thực hiện với primer ITS1 và ITS4 Phan ứng được

thực hiện theo chu trình nhiệt như sau: 94°C: 5 phút, 25 chu ky (94°C: 30s, 55°C: 30s,72°C: 1 phút), 72°C: 10 phút Sản pham của phan ứng PCR được kiểm tra bằng điện ditrên gel agarose 1% Kích thước của đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được sosánh với thang DNA chuẩn (1 Kb Plus DNA ladder Marker) sau đó sản phẩm PCRđược giải trình tự Mức độ tương đồng về trình tự ITS của hai chủng nghiên cứu được

so sánh với các chủng đã công bố trên Genbank bằng công cụ BLAST Sử dụng phầnmềm MEGAII dé xây dựng cây di truyền, lựa chọn phương pháp Neiborg Joining với

độ tin cậy được tính bằng thuật toán Bootstrap với 1000 lần lặp lại Dựa vào cây phânloại và giá tri bootstrap dé xác định mối quan hệ di truyền của chủng nghiên cứu

1.4 Những nghiên cứu về chế phẩm sinh học

1.4.1 Những nghiên cứu ngoài nước

Các loài Chaetomium spp được phân lập từ đất sử dụng như tác nhân kiểm soátsinh học được khai thác ở Thái Lan từ năm 1989 Theo kết quả nghiên cứu các loài

12

Chaetomium spp có khả năng phòng trừ bệnh nắm hại cây trồng, biệt là các bệnh nắmlan truyền trong đất như Pyricularia oryzae, Curvularia lunata, Rhizoctonia oryzae,Phytophthora palmivora, Phytophthra parasitica (Soytong va Quimio, 1989) Nhữngbao tử sống của loài Chaefomium spp làm giảm bệnh héo rũ cây cà chua do namFusarium oxysporum, F lycopersici trong những thí nghiệm trong nhà kính hay trênđồng ruộng và cũng ngăn chặn bệnh thối cuống lá ngô do Sclerotium rolfsii (Soytong,1991) Theo Singh và cs (2001), dùng môi trường có 1% rỉ đường, 2 - 3% nam men cóthể sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ một số loại nắm bệnh từ một số chủng

Chaetomium spp.

Ketomium là tên thương mai của thuốc trừ nắm sinh học phô rộng (Int cl 5 AO

1 N 25/12, chứng nhận sáng chế Thai Lan số 626620 năm ngày phát hành 22/1/1994:ngày kết thúc 21/01/2014) là chế pham sinh học sản xuất từ 22 chủng Chaetomiumglobosum và Chaetomium spp Ketomium đã được đăng ký bởi Bộ Nông nghiệp ThaiLan (số 458/2539, 02/9/1996) sử dụng như thuốc trừ nam sinh học kiểm soát bệnh hạicây trồng, như phân bón sinh học phân hủy chất hữu cơ, cảm ứng hệ miễn dịch thựcvật và như chất kích thích tăng trưởng Cơ chế kiểm soát bệnh cây đòi hỏi các chủng

cụ thé của C globosum và C cupreum có khả năng sản xuất chất kháng sinh; sản xuấtergosterol kích thích tăng trưởng cây trồng do khả năng cải thiện lớp mùn trong đất,tăng độ phì của đất; ví dụ như C globosum sản xuất Chaettolobosin C, ngăn chặn sựphát triển của tác nhân gây bệnh như Phytophthora parasitica, P palmivora, P.cactorum, Pyricularia oryzae, Fusarium oxysporum, Colletotrichum gloeosporioide,

C dematium, Sclerotium rolfsii va Rhizoctonia solani (Suh va cs, 1993) TheoSoytong, ché pham Ketomium trừ nam sinh học có hoạt tính diệt nắm, lượng bào tử

Is

trước khi có những thiệt hại về kinh tế có thể giúp ngăn ngừa các thiệt hại do nắm

bệnh (Soytong, 1992).

1.4.2 Những nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, nam đối kháng Chaefomium spp lần đầu tiên được nghiên cứu ởViện Di truyền nông nghiệp vào năm 1999 Chế phâm Ketomium cũng đã được thửnghiệm và đăng ký thành công tại Việt Nam trên một số bệnh cây trồng: bệnh đạo ôntrên lúa do Pyricularia oryzae gây ra, bệnh thối rễ cây cà chua do nam Fusariumoxysprum gây ra, bệnh thối rễ và vàng lá cây hoa cúc do nam Rhizoctonia solani gây

ra Các nghiên cứu đã phân lập và định danh được 4 loài Chaetomium spp., nghiên cứu

được khả năng đối kháng của hai loài Chaetomium globosum và Chaetomium cupreumtrong phòng thí nghiệm, đã chứng tỏ rằng nam Chaefomium spp có khả năng đốikháng cao với với các loài nam bệnh như: Curvularia lunata, Fusarium olucopersici,Sclerotium rolfsii, Pyricularia oryzae, P palmyvora, P parasitica, Colletotrichum gloeosporioides.

Nam 2002 — 2003 Viện Di truyền nông nghiệp đã san xuất thử thành công chếphẩm trừ nam sinh học từ các chủng Chaetomium spp được tìm thấy ở Việt Nam, vớitên gọi Chaetomium spp VDT và đã tiễn hành thử hiệu lực chế pham trừ nam sinh họcnày lên một số loài cây trồng như:Cam, canh, thông, hoa hồng, hoa cúc va ca chua.Ngoài ra ở viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm Nghiệp Miền núi phía Bắc, NguyễnVăn Thiệp và cs (2003), đã có những nghiên cứu bước đầu về khả năng ức chế củanam Chaetomium spp với một số loại nam gây bệnh chính trên chè, cà phê, cao su.Tuy nhiên, những nghiên cứu này vẫn hạn chế về số loài nắm đối kháng Chaetomiumspp., va các nghiên cứu chi mới là những nghiên cứu bước đâu.

14

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Phân lập nắm Chaetomium spp từ dat trồng và định danh dựa vào phương phápsinh học phân tử.

Đánh giá khả năng đôi kháng của nam Rhizoctonia bicornis trong điêu kiện

phòng thí nghiệm.

Đánh giá khả năng đối kháng của nắm Chaetomium spp đối với nam

Rhizoctonia bicornis trong điều kiện nhà lưới

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 02 năm 2023 đến tháng 12 năm 2023, tại khoanông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

2.3 Vật liệu nghiên cứu

Môi trường dùng trong nghiên cứu:

Môi trường WA (water agar): 20 g agar, nước 1000 ml.

Môi trường PDA (Potato-Dextrose-Agar): 200 g khoai tay, 20 g dextrose, 20 g agar, nước 1000 ml.

Trang thiết bị: Cân điện tử, bếp điện, lò viba, buồng đếm hồng cầu Thiếtbi:may PCR, máy ly tâm, hệ thong chụp gel UVP, tủ ủ nhiệt (hoặc tu định ôn), tủ lạnh-20°C, máy điện di, máy vortex Hóa chất: My Taq Polymerase (Bioline — Anh), cồn96°, cồn 70°, Primer xuôi, Primer ngược, Agarose (Bioline), TAE, Bộ kit ly trích DNA

của công ty TNHH Giải pháp Y sinh ABT.

15

Dụng cụ: Đĩa petri, bông gòn thấm nước, kẹp gấp, túi nhựa thu mẫu, giấy, viết,

chày nghiền mẫu, eppendorf 1,5 ml, eppendorf 2,0 ml, đầu tuýp, Micropippet, ốngnghiệm, ống đong, đèn cồn, bình thủy tinh, lame, kéo, găng tay, giống cà chua fl đạiđịa, chậu nhựa Có, chế phẩm BS01

Đối tượng nghiên cứu:

Nam Rhizoctonia bicornis chủng ODT02, được cung cấp bởi phòng thí nghiệmtại Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành pho

Hồ Chi Minh

Hình 2.1 Tản nắm Rhizoctonia bicornis 3NSC2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phân lập và định danh nắm Chaetomium spp dựa vào đặc điểm hình thai

2.4.1.1 Phương pháp thu mẫu

Các mẫu đất được thu thập ở độ sâu tầng đất từ 15 — 20 cm với lượng đất 500/gdat/mau được đựng trong hộp nhựa có nắp, dán nhãn ghi thông tin mẫu Các mau đấtđược thu thập tại các vườn trồng ớt và cà chua ở huyện Phú Giáo, tỉnh Bình Dương;Xuân Thọ - Đà Lạt - Lâm Đồng ;Tân Thông Hội - Củ Chi - TP HCM

28°C và hàng ngày kiểm tra sự hình thành quả thê trên bẫy giấy Khi quả thê xuất hiệnthì chuyển lên môi trường WA có bổ sung kháng sinh ampicillin (100 mg/l) vàstreptomycin (100 mg/l), tiếp tục cấy truyền lên môi trường PDA dé làm thuần nguồn.

Nam thuộc chi Chaetomium spp được phan loại dua vào đặc điểm hình tháitheo khóa phân loại của Soytong và Quinio (1989).

+ Theo hình dạng, màu sắc tản nấm: tất cả các mẫu phân lập (MPL) được nuôicấy trên môi trường PDA trong điều kiện 12 giờ sáng — 12 giờ tối, sau 7 ngày nuôi cấyghi nhận các đặc điêm về tan nam.

+ Theo hình dang, màu sắc quả thé: tat cả các mẫu phân lập (MPL) được nuôi

cấy trên môi trường PDA trong điều kiện 12 giờ sáng — 12 giờ tối, sau 14 ngày nuôi

cây ghi nhận các đặc điêm về quả thê.

+ Theo hình dạng, màu sắc bào tử: tất cả các mẫu phân lập (MPL) được nuôi

cay trên môi trường PDA trong điều kiện 12 gid sáng — 12 giờ tối, sau 14 ngày nuôicây phi nhận các đặc điêm về bào tu.

2.4.1.3 Định danh đặc điểm hình thái các chang nam Chaetomium spp

Quan sat và ghi nhận đặc điêm hình thái cua nâm mọc trên các đĩa peri (màu

sắc, hình dáng sợi nam, tan nam) Quan sát bào tử và giác bám băng kính hiên vi sau

đó ghi nhận màu sắc, hình dạng của chúng (Sutton va cs, 1995)

Từ kêt qua quan sát ghi nhận được chia các mau nam thành các nhóm có hìnhthái tương đồng

2.4.2 Đánh giá khả năng đối kháng R bicornis của các dòng Chaetomium spp.trong điều kiện phòng thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố gồm 13nghiệm thức, tương ứng với 12 dòng Chaetomium spp phân lập được và 1 đối chứngvới 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 03 đĩa petri Nghiệm thức đối chứng là nam R.bicornis Các thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng được tiến hành theo phương

pháp của Soytong (1988).

17

Phương pháp thực hiện:

Chuan bị nguồn nam Chaetomium spp và nam Rhizoctonia bicornis được nuôicay trên môi trường PDA 7 ngày và tiến hành thí nghiệm theo phương pháp cấy kép

Tiến hành cấy đối xứng 2 loại nắm Chaetomium spp và nam gây bệnh trên bề

mặt môi trường trong đĩa petri § cm Dùng khoan thạch hình trụ có đường kính 4 mm,

vô trùng, khoan lấy một phan thạch 6 ria tan nam Chaetomium spp và đặt vào đĩa petri(đường kính 8 cm) chứa môi trường PDA, khoảng cách đặt khoanh thạch và mép dia là

1 cm Sau 3 ngày nuôi cấy tiến hành cấy khoanh tản sợi nắm bệnh đối xứng vào trongdia petri U đĩa ở nhiệt độ từ 28 — 30°C

Chỉ tiêu theo dõi: Do bán kính tan nam gây bệnh về phía vị trí cấy nam đốikháng ở thời điểm 7 NSC

Hiệu qua ức chế PIRG (Percent Inhibition of Radical Growth)

PIRG= (R1- R2)/R1 x 100.

Trong do:

RI là bán kính tan nắm gây bệnh cay đối chứng;

R2 là bán kính tản nắm gây bệnh khi cấy với nắm đối kháng

Hoạt tính đối kháng quy ước như sau: Hoạt tính rất cao (PIRG > 75%); Hoạttính đối kháng cao (PIRG: 61 - 75%); Hoạt tính đối kháng trung bình (PIRG: 50 -60%); Hoạt tính đối kháng kém (PIRG < 50%); Không có khả năng đối kháng

Chaetomium R bicornis

Hình 2.2 Bồ tri thí nghiệm đối kháng Chaetomium spp với nam Rhizoctonia bicornis

18

2.4.2.1 Định danh sinh học phân tử các chủng nắm Chaetomium spp.

Bước 2: Cho thêm 200 uL CL buffer, vortex đều ủ ở 72°C trong 10 phút

Bước 3: Thêm 200 uL ethanol (96 - 100 %), trộn đều và chuyên hỗn hợp sangcột silica đặt sẵn trong tube 2 mL Ly tâm với tốc độ 13000 rpm trong 1 phút Giữ laicột và loại bỏ chất lõng bên dưới

Bước 4: Đặt lại cột va tube 2 mL cũ Thêm 500 ul WB1 buffer và ly tâm với tốc

độ 13000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lõng bên dưới

Bước 5: Dat lại cột và tube 2 mL cũ Thêm 500 uL WB2 buffer và ly tâm với

tốc độ 13000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phan chất lõng bên dưới

Bước 6: Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ Làm khô cột bằng cách ly tâm ở 13000rpm trong | phút.

Bước 7: Chuyên cột sang tube 1,5 mL mới Thêm 50 ul EB buffer va ủ 1 phút ởnhiệt độ phòng Ly tâm với tốc độ 13000 rpm trong 1 phút

Bước 8: Cho thêm 50 ul EB buffer và ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm với tốc

độ 13000 rpm trong 1 phút, thu phần dịch DNA bên dưới

19

2.4.2.1.2 Phản ứng PCR và giải trình ty DNA

Bảng 2.1 Danh sách thông tin các primer sử dụng trong phản ứng PCR

Tài liệu thamGen Môi (Primer) Trinh tự môi

khảo ITS ITS5 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 White vacs,

ITS4 5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ' 1990

Bang 2.2 Thanh phan phan tng PCR

Thanh phan Nong độ Thé tich (ul)

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR bởi cặp đoạn môi ITS4/ITS5

Chu kỳ Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian

1 Tién bién tinh 95 5 phut

Bién tinh 95 30 giây

20

Các sản phẩm PCR được theo dõi bằng cách nhuộm với 6X Gelred DNALoading trên gel điện di agarose 1,5% trong đệm 1 x TAE (10 mM Tris; 1 mM EDTA;

pH 8,0) ở 90 V trong 35 phút ở nhiệt độ phòng và hiền thị dưới tia UV Kích thước củacác vùng DNA khuếch đại được ước tính bằng cách so sánh với thang DNA Ladder100/bp.

2.4.2.1.3 Phần tích phát sinh loài

Kết quả giải trình tự gen được đọc và chỉnh sửa bằng cách sử dụng BioEditSequence Alignment Editor (Hall, 1999) Phân tích tính tương đồng của các trình tựnày với trình tự giống loài có trong cơ sở dit liệu GenBank Các sắp xếp của trình tựgen được phân tích dé thiết kế các mối quan hệ lịch sử tiến hóa dựa trên phương phápthe maximum parsimony (MP) va neighbor-joining (NJ) trong phan mềm MEGA

(Tamura va cs, 2011) Dựng cây phát sinh loài.

2.4.3 Đánh giá khả năng phòng bệnh lở cỗ rễ do nam Rhizoctonia bicornis gây ra

của nam Chaetomium spp trong điêu kiện nhà lưới

Từ kết quả đánh giá khả năng đối kháng của Chaetomium spp trong điều kiệnphòng thí nghiệm đối với nam Rhizoctonia bicornis, chọn 2 dòng Chaetomium spp cóhiệu suất đối kháng cao nhất dé thực hiện thí nghiệm đánh giá kha năng đối khángtrong điều kiện nhà lưới Cây trồng được chọn dé đánh giá khả năng đối kháng là cây

ca chua.

Chuẩn bị:

Thí nghiệm được tiến hành trong chậu C6 (13 x 12 x 10 cm) với giá thé là hỗnhợp đất — tro trau — xơ dừa — phân bò theo tỷ lệ 1 — 1 — 1 — 1 Hỗn hợp giá thé đượchấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút trước khi sử dụng

Tiến hành thí nghiệm:

Pha dịch bào tử: cho 5 mL nước cất đã thanh trùng vào đĩa petri có chứa nắm(đã hình thành bào tử) nuôi cấy trên môi trường PDA, dùng lam kính cao đi lớp sợinam sau đó lọc lay dịch huyền phù bào tử điều chỉnh mật số bào tử đến nồng độ 10°bào tử/mL bằng buồng đếm hồng cau

21

+ Đôi với NT có xử lí nam bệnh: mâm bệnh trực tiép vào trong dat với gia thê

tự nhiên vỏ trau và hạt kê (ti lệ 1:1) đã nhân sinh khối khoảng 2 - 3 tuần

+ Đối với NT có xử lý chế phẩm sinh học: Pha nước cất đã thanh trùng với chế

phẩm sinh học theo các nồng độ đã quy định sẵn tưới vào chậu ở thời điểm 7 ngàytrước khi gieo hạt.

+ Đối với NT có xử ly nam đối kháng và nam bệnh: Phun đều 20 mL dịchhuyền phù bào tử nam/chau mật độ 10° bào tử/mL ở thời điểm 7 ngày trước khi gieohạt, sau khi cây có 2 lá mam bat đầu đưa mầm bệnh trực tiếp vào trong đất với giá thé

tự nhiên vỏ trau và hạt kê (tỉ lệ 1:1) đã nhân sinh khối khoảng 2 - 3 tuần Sau đó trộnhỗn hợp nam bệnh trên bề mặt chậu dat theo tỉ lệ 60/g nam bệnh/chậu 500/g dat

Ching nam Chaetomium spp vào dat trừ những nghiệm thức nam bệnh,nghiệm thức H20 và nghiệm thức phun chế phâm BSO1

Phương pháp bồ trí thí nghiệm Thí nghiệm được bé trí theo kiểu hoàn toànngẫu nhiên đơn yếu tố với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 10 chậu

Các nghiệm thức như sau:

Nghiệm thức 1: Phun nắm Chaetomium spp CT03-LD vào đất ủ trong 7 ngày sau gieo hạt

chủng nam R birconis.

22

Nghiệm thức 2: Phun nắm Chaetomium spp CT12-BD vào đất ủ trong 7 ngày

sau gieo hạt chủng nam Rhizoctonia birconis

Nghiệm thức 3: Phun nam Chaetomium spp CT03-LD,CT12-BD vào đất ủtrong 7 ngày sau gieo hạt chủng nắm Rhizoctonia birconis

Nghiệm thức 4: Gieo hạt bap chủng nam Rhizoctonia birconis vào đất

Nghiệm thức 5: Phun nam Chaefomium spp CT03-LD vào đất ủ trong 7 ngày

sau khi gieo hạt.

Nghiệm thức 6: Phun nam Chaetomium spp CT12-BD vào đất ủ trong 7 ngày saukhi gieo hạt.

Nghiệm thức 7: Phun nắm Chaetomium spp CT03-LD, CT12-BD vào đất ủ

trong 7 ngày sau gieo hat

Nghiệm thức 8: Không phun nam Chaefomium spp vào đất, không chủng nambệnh vào dat

Nghiệm thức 9:Phun chế phẩm BS0I vào đất trước 7 ngày sau gieo hạt bap

chủng nam Rhizoctonia birconis vào đất

Phương pháp thực hiện:

Chậu C6 (13 x 12 x 10 cm) chứa giá thé đã được hap khử trùng

Chuẩn bị nguồn nam Rhizoctonia birconis: nam Rhizoctonia bicornis đượcnhân nuôi trên hạt bap trong 3 ngày dé nhân sinh khối, sau đó được cấy vào đất Mỗikhay cấy 20 hạt bắp đã được bao phủ hoàn toàn bởi nam Rhizoctonia bicornis được ủbệnh trong 3 ngày dé nam bệnh phát triển

Chuan bị nắm Chaetomium spp: nam Chaetomium spp được nhân nuôi trongmôi trường PDB, lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 28°C trong vòng 7 ngày (Lê Thi AnhHồng va cs, 2005) Pha loãng điều chỉnh mật số 10 cfu/ml

23

Hạt cà chua được khử trùng bề mặt bằng cách rửa với ethanol 70% trong 30giây, tiếp theo ngâm trong dung dịch Sodium hypochlorite (NaOCl) 1% trong 5 phút.Sau đó hạt giống được rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng.

Chỉ tiêu theo dõi:

Quan sát mỗi ngày, theo dõi tỉ lệ bệnh ở thời điểm nghiệm thức đối chứng xuấthiện bệnh đầu tiên, theo dõi tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh ở các thời điểm 9, 12, 15, 18ngày sau xử lý nam, tính hiệu quả giảm bệnh (HQGB) tại thời điểm 18 NSCB , trongkhi đánh giá chi số thối rễ được ghi lại theo thang điểm 1 — 4, có điều chỉnh của

Hwang va Chang (1989), như sau: 1 = 1 — 10%, 2 = I1 — 25%, 3 = 26 — 50% và 4= 51

— 100% (cây héo).

Phương pháp tính toán và xử lí:

Tỷ lệ bệnh (%) = (A/B) x 100

Trong đó: A là sỐ cây bị bệnh nhiễm lở cô rễ;

B là Tổng số cây điều tra;

Hiệu lực phòng trừ (%) = [(D — C)/D] x 100;

Trong đó: D là số cây nhiễm bệnh ở nghiệm thức đối chứng;

C là số cây nhiễm bệnh ở nghiệm thức thí nghiệm

Chỉ số thối rễ = [(1 x C¡ + 2x Ca+ 3 x Cạ+ 4x Cy)/(N x 4)] x 100;

Trong đó: N: là tổng số cây theo dõi;

Ci: Số cây bị bệnh ở cấp 1 với 1 — 10% diện tích rễ (cổ rễ) bị bệnh;Co: Số cây bị bệnh ở cấp 2 với 11 — 25% diện tích rễ (cô rễ) bị bệnh;C3: Số cây bị bệnh ở cấp 3 với 26 — 50% diện tích rễ (cổ rễ) bị bệnh;Cu: Số cây bị bệnh ở cấp 4 với 51 — 100% biến màu rễ (cây héo).+ Chiều cao cây: Do 6 chậu mỗi chậu 5 cây cà chua 5 NT, 3 LLL, đo từ mặt đấtđến đỉnh ngọn cao nhất ở thời điểm 18 NSCB

24

+ Chiều dai rễ: Do 6 chậu mỗi chậu 5 cây cà chua 5 NT, 3 LLL, đo từ gốc củacây đến đỉnh của rễ thời điểm 18 NSCB.

2.5 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Microsoft Excel dé tổng hợp số liệu, xử lý thống kê trắcnghiệm phân hạng Duncan bằng phần mềm SAS 9.4

25