2.1 Nội dung nghiên cứu
Phân lập nắm Chaetomium spp. từ dat trồng và định danh dựa vào phương pháp
sinh học phân tử.
Đánh giá khả năng đôi kháng của nam Rhizoctonia bicornis trong điêu kiện phòng thí nghiệm.
Đánh giá khả năng đối kháng của nắm Chaetomium spp. đối với nam Rhizoctonia bicornis trong điều kiện nhà lưới.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 02 năm 2023 đến tháng 12 năm 2023, tại khoa nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
2.3 Vật liệu nghiên cứu
Môi trường dùng trong nghiên cứu:
Môi trường WA (water agar): 20 g agar, nước 1000 ml.
Môi trường PDA (Potato-Dextrose-Agar): 200 g khoai tay, 20 g dextrose, 20 g agar, nước 1000 ml.
Trang thiết bị: Cân điện tử, bếp điện, lò viba, buồng đếm hồng cầu. Thiết bi:may PCR, máy ly tâm, hệ thong chụp gel UVP, tủ ủ nhiệt (hoặc tu định ôn), tủ lạnh -20°C, máy điện di, máy vortex. Hóa chất: My Taq Polymerase (Bioline — Anh), cồn 96°, cồn 70°, Primer xuôi, Primer ngược, Agarose (Bioline), TAE, Bộ kit ly trích DNA
của công ty TNHH Giải pháp Y sinh ABT.
15
Dụng cụ: Đĩa petri, bông gòn thấm nước, kẹp gấp, túi nhựa thu mẫu, giấy, viết,
chày nghiền mẫu, eppendorf 1,5 ml, eppendorf 2,0 ml, đầu tuýp, Micropippet, ống nghiệm, ống đong, đèn cồn, bình thủy tinh, lame, kéo, găng tay, giống cà chua fl đại địa, chậu nhựa Có, chế phẩm BS01.
Đối tượng nghiên cứu:
Nam Rhizoctonia bicornis chủng ODT02, được cung cấp bởi phòng thí nghiệm tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành pho Hồ Chi Minh.
Hình 2.1 Tản nắm Rhizoctonia bicornis 3NSC
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phân lập và định danh nắm Chaetomium spp. dựa vào đặc điểm hình thai 2.4.1.1 Phương pháp thu mẫu
Các mẫu đất được thu thập ở độ sâu tầng đất từ 15 — 20 cm với lượng đất 500/g dat/mau được đựng trong hộp nhựa có nắp, dán nhãn ghi thông tin mẫu. Các mau đất được thu thập tại các vườn trồng ớt và cà chua ở huyện Phú Giáo, tỉnh Bình Dương;
Xuân Thọ - Đà Lạt - Lâm Đồng ;Tân Thông Hội - Củ Chi - TP. HCM
2.4.1.2 Phương pháp phân lập
Nam được phân lập từ đất bằng kĩ thuật đặt bay dùng giấy lọc. Các mẫu đất được phơi khô và nghiền nhỏ, sau đó đất nghiền được cho vào dia petri đường kính 8 cm với lượng khoảng 2/3 đĩa. Các mảnh giấy loc vô trùng, kích thước 1 x 1 em được đặt trên bề mặt đất trong dia petri. Các đĩa đất được ủ trong tủ định ôn ở điều kiện
16
28°C và hàng ngày kiểm tra sự hình thành quả thê trên bẫy giấy. Khi quả thê xuất hiện thì chuyển lên môi trường WA có bổ sung kháng sinh ampicillin (100 mg/l) và streptomycin (100 mg/l), tiếp tục cấy truyền lên môi trường PDA dé làm thuần nguồn.
Nam thuộc chi Chaetomium spp. được phan loại dua vào đặc điểm hình thái
theo khóa phân loại của Soytong và Quinio (1989).
+ Theo hình dạng, màu sắc tản nấm: tất cả các mẫu phân lập (MPL) được nuôi cấy trên môi trường PDA trong điều kiện 12 giờ sáng — 12 giờ tối, sau 7 ngày nuôi cấy
ghi nhận các đặc điêm về tan nam.
+ Theo hình dang, màu sắc quả thé: tat cả các mẫu phân lập (MPL) được nuôi cấy trên môi trường PDA trong điều kiện 12 giờ sáng — 12 giờ tối, sau 14 ngày nuôi
cây ghi nhận các đặc điêm về quả thê.
+ Theo hình dạng, màu sắc bào tử: tất cả các mẫu phân lập (MPL) được nuôi cay trên môi trường PDA trong điều kiện 12 gid sáng — 12 giờ tối, sau 14 ngày nuôi
cây phi nhận các đặc điêm về bào tu.
2.4.1.3 Định danh đặc điểm hình thái các chang nam Chaetomium spp.
Quan sat và ghi nhận đặc điêm hình thái cua nâm mọc trên các đĩa peri (màu sắc, hình dáng sợi nam, tan nam). Quan sát bào tử và giác bám băng kính hiên vi sau
đó ghi nhận màu sắc, hình dạng của chúng (Sutton va cs, 1995).
Từ kêt qua quan sát ghi nhận được chia các mau nam thành các nhóm có hình
thái tương đồng.
2.4.2 Đánh giá khả năng đối kháng R. bicornis của các dòng Chaetomium spp.
trong điều kiện phòng thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố gồm 13 nghiệm thức, tương ứng với 12 dòng Chaetomium spp. phân lập được và 1 đối chứng với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 03 đĩa petri. Nghiệm thức đối chứng là nam R.
bicornis. Các thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng được tiến hành theo phương
pháp của Soytong (1988).
17
Phương pháp thực hiện:
Chuan bị nguồn nam Chaetomium spp. và nam Rhizoctonia bicornis được nuôi cay trên môi trường PDA 7 ngày và tiến hành thí nghiệm theo phương pháp cấy kép.
Tiến hành cấy đối xứng 2 loại nắm Chaetomium spp. và nam gây bệnh trên bề
mặt môi trường trong đĩa petri § cm. Dùng khoan thạch hình trụ có đường kính 4 mm,
vô trùng, khoan lấy một phan thạch 6 ria tan nam Chaetomium spp. và đặt vào đĩa petri
(đường kính 8 cm) chứa môi trường PDA, khoảng cách đặt khoanh thạch và mép dia là
1 cm. Sau 3 ngày nuôi cấy tiến hành cấy khoanh tản sợi nắm bệnh đối xứng vào trong dia petri. U đĩa ở nhiệt độ từ 28 — 30°C.
Chỉ tiêu theo dõi: Do bán kính tan nam gây bệnh về phía vị trí cấy nam đối kháng ở thời điểm 7 NSC.
Hiệu qua ức chế PIRG (Percent Inhibition of Radical Growth).
PIRG= (R1- R2)/R1 x 100.
Trong do:
RI là bán kính tan nắm gây bệnh cay đối chứng;
R2 là bán kính tản nắm gây bệnh khi cấy với nắm đối kháng.
Hoạt tính đối kháng quy ước như sau: Hoạt tính rất cao (PIRG > 75%); Hoạt tính đối kháng cao (PIRG: 61 - 75%); Hoạt tính đối kháng trung bình (PIRG: 50 - 60%); Hoạt tính đối kháng kém (PIRG < 50%); Không có khả năng đối kháng.
Chaetomium R. bicornis
Hình 2.2 Bồ tri thí nghiệm đối kháng Chaetomium spp. với nam Rhizoctonia bicornis
18
2.4.2.1 Định danh sinh học phân tử các chủng nắm Chaetomium spp.
2.4.2.1.1 Ly trích DNA
Ly trích DNA bang kit ly trích DNA của công ty TNHH Giải pháp Y sinh ABT theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:
Bước 1: Dùng lame đã hấp khử trùng cạo khoảng 2 cm? sợi nam cho vào tube 1,5 mL cùng với 200 uL TL buffer và 20 uL proteinase K. Nghiền mẫu bằng chày cho đến khi nát mẫu, vortex đều và ủ ở 72°C cho đến khi mẫu ly giải hoàn toàn (vortex
thường xuyên trong quá trình ủ).
Bước 2: Cho thêm 200 uL CL buffer, vortex đều ủ ở 72°C trong 10 phút.
Bước 3: Thêm 200 uL ethanol (96 - 100 %), trộn đều và chuyên hỗn hợp sang cột silica đặt sẵn trong tube 2 mL. Ly tâm với tốc độ 13000 rpm trong 1 phút. Giữ lai cột và loại bỏ chất lõng bên dưới.
Bước 4: Đặt lại cột va tube 2 mL cũ. Thêm 500 ul WB1 buffer và ly tâm với tốc độ 13000 rpm trong 1 phút. Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lõng bên dưới.
Bước 5: Dat lại cột và tube 2 mL cũ. Thêm 500 uL WB2 buffer và ly tâm với
tốc độ 13000 rpm trong 1 phút. Giữ lại cột và loại bỏ phan chất lõng bên dưới.
Bước 6: Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ. Làm khô cột bằng cách ly tâm ở 13000
rpm trong | phút.
Bước 7: Chuyên cột sang tube 1,5 mL mới. Thêm 50 ul EB buffer va ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm với tốc độ 13000 rpm trong 1 phút.
Bước 8: Cho thêm 50 ul EB buffer và ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm với tốc độ 13000 rpm trong 1 phút, thu phần dịch DNA bên dưới.
19
2.4.2.1.2 Phản ứng PCR và giải trình ty DNA
Bảng 2.1 Danh sách thông tin các primer sử dụng trong phản ứng PCR
Tài liệu tham
Gen Môi (Primer) Trinh tự môi
khảo ITS ITS5 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 White vacs,
ITS4 5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ' 1990
Bang 2.2. Thanh phan phan tng PCR
Thanh phan Nong độ Thé tich (ul)
DreamTaq Green 2X 1X 12,5 Primer ITS4 0,2 uM 2.
Primer ITS5 0,2 uM 2 DNA 2
Nước cat vô tring 6,5 Tổng 25
Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR bởi cặp đoạn môi ITS4/ITS5
Chu kỳ Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian
1 Tién bién tinh 95 5 phut
Bién tinh 95 30 giây
35 Bat cap 55 30 giây
Kéo đài 72 45 giây
Ị Hậu kéo dài 72 7 phút
20
Các sản phẩm PCR được theo dõi bằng cách nhuộm với 6X Gelred DNA
Loading trên gel điện di agarose 1,5% trong đệm 1 x TAE (10 mM Tris; 1 mM EDTA;
pH 8,0) ở 90 V trong 35 phút ở nhiệt độ phòng và hiền thị dưới tia UV. Kích thước của các vùng DNA khuếch đại được ước tính bằng cách so sánh với thang DNA Ladder
100/bp.
2.4.2.1.3 Phần tích phát sinh loài
Kết quả giải trình tự gen được đọc và chỉnh sửa bằng cách sử dụng BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, 1999). Phân tích tính tương đồng của các trình tự này với trình tự giống loài có trong cơ sở dit liệu GenBank. Các sắp xếp của trình tự gen được phân tích dé thiết kế các mối quan hệ lịch sử tiến hóa dựa trên phương pháp the maximum parsimony (MP) va neighbor-joining (NJ) trong phan mềm MEGA
(Tamura va cs, 2011). Dựng cây phát sinh loài.
2.4.3 Đánh giá khả năng phòng bệnh lở cỗ rễ do nam Rhizoctonia bicornis gây ra
của nam Chaetomium spp. trong điêu kiện nhà lưới
Từ kết quả đánh giá khả năng đối kháng của Chaetomium spp. trong điều kiện phòng thí nghiệm đối với nam Rhizoctonia bicornis, chọn 2 dòng Chaetomium spp. có hiệu suất đối kháng cao nhất dé thực hiện thí nghiệm đánh giá kha năng đối kháng trong điều kiện nhà lưới. Cây trồng được chọn dé đánh giá khả năng đối kháng là cây
ca chua.
Chuẩn bị:
Thí nghiệm được tiến hành trong chậu C6 (13 x 12 x 10 cm) với giá thé là hỗn hợp đất — tro trau — xơ dừa — phân bò theo tỷ lệ 1 — 1 — 1 — 1. Hỗn hợp giá thé được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút trước khi sử dụng.
Tiến hành thí nghiệm:
Pha dịch bào tử: cho 5 mL nước cất đã thanh trùng vào đĩa petri có chứa nắm (đã hình thành bào tử) nuôi cấy trên môi trường PDA, dùng lam kính cao đi lớp sợi nam sau đó lọc lay dịch huyền phù bào tử điều chỉnh mật số bào tử đến nồng độ 10°
bào tử/mL bằng buồng đếm hồng cau.
21
Công thức tính số bào tử:
A =(400 x ax 10! x 105/b
Trong đó:
a: Số lượng bào tử đếm trong 16 ô lớn;
b: số 6 con trong 16 6 lớn = 400 6;
n: nồng độ pha loãng của dich bao tử;
10!: hang số.
Tiến hành xử lý nam:
+ Đối với NT có xử lí nấm đối kháng: Phun đều 20 mL dịch huyền phù bao tử ndm/chau mật độ 10° bào tử/mL ở thời điểm 7 ngày trước khi gieo hạt.
+ Đôi với NT có xử lí nam bệnh: mâm bệnh trực tiép vào trong dat với gia thê
tự nhiên vỏ trau và hạt kê (ti lệ 1:1) đã nhân sinh khối khoảng 2 - 3 tuần.
+ Đối với NT có xử lý chế phẩm sinh học: Pha nước cất đã thanh trùng với chế phẩm sinh học theo các nồng độ đã quy định sẵn tưới vào chậu ở thời điểm 7 ngày
trước khi gieo hạt.
+ Đối với NT có xử ly nam đối kháng và nam bệnh: Phun đều 20 mL dịch huyền phù bào tử nam/chau mật độ 10° bào tử/mL ở thời điểm 7 ngày trước khi gieo hạt, sau khi cây có 2 lá mam bat đầu đưa mầm bệnh trực tiếp vào trong đất với giá thé tự nhiên vỏ trau và hạt kê (tỉ lệ 1:1) đã nhân sinh khối khoảng 2 - 3 tuần. Sau đó trộn hỗn hợp nam bệnh trên bề mặt chậu dat theo tỉ lệ 60/g nam bệnh/chậu 500/g dat.
Ching nam Chaetomium spp. vào dat trừ những nghiệm thức nam bệnh, nghiệm thức H20 và nghiệm thức phun chế phâm BSO1.
Phương pháp bồ trí thí nghiệm. Thí nghiệm được bé trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 10 chậu.
Các nghiệm thức như sau:
Nghiệm thức 1: Phun nắm Chaetomium spp. CT03-LD vào đất ủ trong 7 ngày sau gieo hạt
chủng nam R. birconis.
22
Nghiệm thức 2: Phun nắm Chaetomium spp. CT12-BD vào đất ủ trong 7 ngày
sau gieo hạt chủng nam Rhizoctonia birconis
Nghiệm thức 3: Phun nam Chaetomium spp. CT03-LD,CT12-BD vào đất ủ trong 7 ngày sau gieo hạt chủng nắm Rhizoctonia birconis.
Nghiệm thức 4: Gieo hạt bap chủng nam Rhizoctonia birconis vào đất.
Nghiệm thức 5: Phun nam Chaefomium spp. CT03-LD vào đất ủ trong 7 ngày
sau khi gieo hạt.
Nghiệm thức 6: Phun nam Chaetomium spp. CT12-BD vào đất ủ trong 7 ngày sau
khi gieo hạt.
Nghiệm thức 7: Phun nắm Chaetomium spp. CT03-LD, CT12-BD vào đất ủ
trong 7 ngày sau gieo hat
Nghiệm thức 8: Không phun nam Chaefomium spp. vào đất, không chủng nam bệnh vào dat.
Nghiệm thức 9:Phun chế phẩm BS0I vào đất trước 7 ngày sau gieo hạt bap chủng nam Rhizoctonia birconis vào đất.
Phương pháp thực hiện:
Chậu C6 (13 x 12 x 10 cm) chứa giá thé đã được hap khử trùng.
Chuẩn bị nguồn nam Rhizoctonia birconis: nam Rhizoctonia bicornis được nhân nuôi trên hạt bap trong 3 ngày dé nhân sinh khối, sau đó được cấy vào đất. Mỗi khay cấy 20 hạt bắp đã được bao phủ hoàn toàn bởi nam Rhizoctonia bicornis được ủ bệnh trong 3 ngày dé nam bệnh phát triển.
Chuan bị nắm Chaetomium spp: nam Chaetomium spp. được nhân nuôi trong môi trường PDB, lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 28°C trong vòng 7 ngày (Lê Thi Anh Hồng va cs, 2005). Pha loãng điều chỉnh mật số 10 cfu/ml.
23
Hạt cà chua được khử trùng bề mặt bằng cách rửa với ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo ngâm trong dung dịch Sodium hypochlorite (NaOCl) 1% trong 5 phút.
Sau đó hạt giống được rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng.
Chỉ tiêu theo dõi:
Quan sát mỗi ngày, theo dõi tỉ lệ bệnh ở thời điểm nghiệm thức đối chứng xuất hiện bệnh đầu tiên, theo dõi tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh ở các thời điểm 9, 12, 15, 18 ngày sau xử lý nam, tính hiệu quả giảm bệnh (HQGB) tại thời điểm 18 NSCB. , trong khi đánh giá chi số thối rễ được ghi lại theo thang điểm 1 — 4, có điều chỉnh của
Hwang va Chang (1989), như sau: 1 = 1 — 10%, 2 = I1 — 25%, 3 = 26 — 50% và 4= 51
— 100% (cây héo).
Phương pháp tính toán và xử lí:
Tỷ lệ bệnh (%) = (A/B) x 100
Trong đó: A là sỐ cây bị bệnh nhiễm lở cô rễ;
B là Tổng số cây điều tra;
Hiệu lực phòng trừ (%) = [(D — C)/D] x 100;
Trong đó: D là số cây nhiễm bệnh ở nghiệm thức đối chứng;
C là số cây nhiễm bệnh ở nghiệm thức thí nghiệm.
Chỉ số thối rễ = [(1 x C¡ + 2x Ca+ 3 x Cạ+ 4x Cy)/(N x 4)] x 100;
Trong đó: N: là tổng số cây theo dõi;
Ci: Số cây bị bệnh ở cấp 1 với 1 — 10% diện tích rễ (cổ rễ) bị bệnh;
Co: Số cây bị bệnh ở cấp 2 với 11 — 25% diện tích rễ (cô rễ) bị bệnh;
C3: Số cây bị bệnh ở cấp 3 với 26 — 50% diện tích rễ (cổ rễ) bị bệnh;
Cu: Số cây bị bệnh ở cấp 4 với 51 — 100% biến màu rễ (cây héo).
+ Chiều cao cây: Do 6 chậu mỗi chậu 5 cây cà chua 5 NT, 3 LLL, đo từ mặt đất đến đỉnh ngọn cao nhất ở thời điểm 18 NSCB.
24
+ Chiều dai rễ: Do 6 chậu mỗi chậu 5 cây cà chua 5 NT, 3 LLL, đo từ gốc của cây đến đỉnh của rễ thời điểm 18 NSCB.
2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel dé tổng hợp số liệu, xử lý thống kê trắc nghiệm phân hạng Duncan bằng phần mềm SAS 9.4.
25
Chương 3