Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Phân lập và nghiên cứu một số vi sinh vật trong đất đối kháng nấm Phytophthora infestans gây bệnh sương mai trên khoai tây (Solanum tuberosum L.)

TÓM TẮTĐề tài nghiên cứu “Phân lập và nghiên cứu một số vi sinh vật đối kháng vớinam Phytophthora infestans gây bệnh sương mai trên cây khoai tay Solanum tuberosum L.”.. Đề tài được tiến

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

3 3k sk 3k 3k 2k 2

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SO VI SINH VAT

TRONG DAT DOI KHÁNG NAM Phytophthora infestans GAY BENH SUONG MAI TREN

KHOAI TAY (Solanum tuberosum L.)

SINH VIÊN THUC HIEN : TRAN TIEN DAT

NGANH : BAO VE THUC VAT

KHOA : 2018 - 2022

Thành phó Hồ Chí Minh, tháng 11/2022

PHAN LAP VÀ NGHIÊN CUU MOT SO VI SINH VAT

TRONG DAT DOI KHANG NAM Phytophthora infestans GAY BENH SUONG MAI TREN

KHOAI TAY (Solanum tuberosum L.)

Tac gia

TRAN TIEN DAT

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầucấp bằng kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật

HỘI DONG HƯỚNG DAN

TS VÕ THỊ NGỌC HÀ

KS PHAM KIM HUYEN

Thanh phố Hồ Chi Minh

Tháng 11/2022

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin cảm ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ đã luôn tin tưởng, ủng hộ và tạomọi điều kiện tốt nhất đề tôi hoàn thành bậc đại học

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố

Hồ Chí Minh, quý thầy cô khoa Nông học đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóaluận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cam ơn chân thành đến TS Võ Thị Ngọc Hà và KS Phạm KimHuyền đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn và nhiềukinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình thực hiện khoá luận

Tôi xin cảm ơn đến các anh chị, bạn bè và các bạn sinh viên nghiên cứu ở

phòng thí nghiệm Bệnh cây thuộc Bộ môn Bảo vệ Thực vật - Khoa Nông học trường

Đại Học Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thé lớp DH18BV đã đồng hành với tôi

trong 4 năm học tập và nghiên cứu ở trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ ChíMinh.

Trân trọng cảm ơn!

Thành phố Hô Chí Minh, tháng 11 năm 2022

Sinh viên

Trần Tiến Đạt

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Phân lập và nghiên cứu một số vi sinh vật đối kháng vớinam Phytophthora infestans gây bệnh sương mai trên cây khoai tay (Solanum

tuberosum L.)”.

Đề tài được tiến hành thực hiện từ thang 05 năm 2022 đến tháng 10 năm 2022

tại phòng thí nghiệm bệnh cây trường đại học Nông Lâm TP.HCM, mục tiêu nghiên

cứu của đề tài: Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi sinh vật có ích đối với

chủng nam gây bệnh sương mai khoai tây trong điều kiện phòng thí nghiệm

Thí nghiệm khả năng đối kháng của các dòng vi sinh vật trong đất đối với namPhytophthora infestans trong điều kiện phòng thí nghiệm được đánh giá bằng phươngpháp cấy kép (Ferreira và ctv, 1991) và được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên vớimỗi dòng vi sinh vật đối kháng va một nghiệm thức đối chứng, 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp

lại trên một dia petri.

Đề tài đã thu được kết quả như sau:

Phân lập được 12 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng từ mức trung bình

Trong đó các chủng KTLD - 0104 (69,65%), KTLD - 0305 (68,85%), KTLĐ - 0102

(63,55%) có mức đối kháng cao Các chủng KTLĐ - 0206 ( 59,08%), KTLĐ - 0304

(58,40%), KTLD - 0306 ( 55,25%), KTLD - 0103 (54,55%), KTLD - 0501 (53,38%), KTLD - 0505 (53,03%), KTLĐ - 0603 (52,18%), KTLD - 0502 (52,18%), KTLD -

MỤC LỤC

Trang

AN A tee os sea ca rear Sea SR ts eee 1

LO GẮN ÔTTsosixiss6156161606156116385653853505438135EEX3SESEES434ES35255E1S5E.KSELIASEXIABEIASESEESSSEESREKSESI/SSEESE3ESE 1

Từng TK EssunatidtureudsirofiREDGHISGIEGISIG00003901910008/%008059490/G0E001040/01000) eee iii

ee a ae vi

Danh sách các Dan :‹-ccscscssccrsicsssisoxskcsesridEbinigiaStE401018501049556 S55151G116118355431496514503646829E VI

Daifili,sáGH:b 8G HÀ TH ca ccovsssennerwie swans anmmennrn stlvmineusvanrvausiienuanniveanttentauaveantectiosasarantanineweass vill9989:0110 Ẻa 5 1

Đặt vấn G6 oo ececcceccceecceceseccessessescsuesscecsecsvcsesucsveecsucssseesucsecessucsvsevssessesseveesevsevsvcevsevesseeeeveees 1

Yêu CAU eee eccceecsesssssessessesseesssssssssssesssusssssasesstissitsstsissitistissississiessesiesiessesiesiesiesieeeeseeseeees 2

LC HN a ee ce eee 2

Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆU 22 222222222EE22E22EE2EE2EE2Exzzzrrrres 3

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây -2- 2-52 S+SE+SE+EE+EESEEEEEEEEE2E22E2E 212222 ze 31.1.1 Nguồn gỐc -2-©2¿22222222222212212211221211221221121122112112112112112121121 21121 cxe 3

1¿l¿2'V'] trí phần T GÍc:seec:csgsiiziiS010G00800E5S109EGBIGESGGERSSIOGHEENISGIEGHGRGHIGRLRHBEERNSISGB03183088.: 41.1.3 Đặc điểm của cây khoai tây ho -25-2222222222 2222222212221 crrrrrrree 41.2 Bnih gương mat trên khoai (Ay csscuscseniiessg666ig6E0064gp659S1gax0g30420008d0:ESgG men cee tie 6

V1 Paint bộ về tlc isa cerca arvensessesroemvarsapemerosnsorsenenauresnenavonansmenniaenmmaroarnensmnisnemse 6

19.527 TT10U⁄GHĂTHẨBESsasnioieaekeabseliebeasanuondgBitucjnargorg-SiupdnrlugtalerogSoxi2pSraudgDrödeuiitãmoitifuzdileudikasgiejuzgdit #1.2.3 Tổng quan về nam Phytophthora infestans c.ccccsceccessvessesssessesseesessesssessesseeeses 81.2.4 Các điều kiện ảnh hưởng đến kha năng phát triển của nắm bệnh 111.25 Bich pliap PH One) GALE neesenneningibbtoiDinhitiLSS4E0i014EGS40SBVSGD92HESESHSSBSESEESESGSR.EI21S:35304800940E 111.3 Một số kết quả nghiên cứu trong va ngoài nước liên quan đến dé tải 11

1.3.1 Những nghiên cứu HƯỚc NGOAL « c ccessacecsersessssscssnsseonsousnnecneansonnssansaseonnsnasaasnes 11 1.3.2 Nhing nghién ctru 6 UOC ta 011 14Chương 2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 16

2.1 N6i dung nghién CUU 0 16

2.2 Thời gian va địa điểm nghiên cứu - 2-22 22©+++rxeErxctrxrrrxrrrrrrrrrrrrree 16

2:3 Vật liệu: KHÍ 118 HÍỂ TT iassssesessbnioondtoiitsaRetsyslitgostsidfdtstarôtdiqgouldgliilsribslbngqtaScsBsbasisulst 16

2.4 Phuong phap thi nghiém 00 17

2.4.1 Kiểm tra đặc điểm hình thai của nam Phytophthora infestans - 172.4.2 Kiểm tra khả năng gây bệnh của mẫu nam đc cung cấp trên củ khoai tây G2.4.3 Thu thập, phân lập va định danh mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất 182.4.3.1 Thu thập mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất -2 2225z22z+2z+z2+zz2 182.4.3.2 Phan lập mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất -2- 222 ©2++25++c5+z 18

2.4.3.3 Định danh vi khuân đối kháng trong đất 2 2 22222+2z+22z22xzzzzzzxee 19

2.4.4 Khảo sát khả năng đối kháng của các dong vi khuẩn phân lập đối với nam

SMC KHOA PAY) guoipiticEigiosyaglztpegrsetglisopS0ingigcbtgftsgStGEBBRCEIVSGNgiHgiiiotigp?trggtdjsgilfebgp28fm 0X 253.1.1 Kiểm tra đặc điểm hình thái của mẫu nắm duoc cung cấp gSitWVgiiuiiininiondriaa 25

3.1.2 Kiểm chứng tác nhân gây bệnh sương mai c.scscscsseessesseesseeseesseeseenseeseeeennees 353.2 Thu thập, phân lập và nghiên cứu một số vi sinh vật đối kháng Phytophthora

infestan gây bệnh sương mai trên khoal tay - 5 ce eeeeeeeseescesceeeseeeeeees 27

3.2.1 Phân lập vi sinh vật trong đất - 2-2 2222222E2EE22E2222221211221221 212 e2 273.2.3 Định danh khuẩn bang đặc điểm hình thai và sinh hoá -5 - 353.2.3.2 Kết quả định danh vi khuân bằng một số phản ứng sinh hóa 40KET LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ, - 222222221223 221271211271 2227121211221 21c xe 44

ee 44

DON Vee ch na acc acc can eee 44

TÀI LIEU THAM KHẢO - 2-2 ©22©222S22E22EE2EE22EE22E22212232221221221221 22.22 45

100090 9 ,ÔỎ 49

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

KBA Môi trường King” B Agar

111 Lần lặp lại

NT Nghiệm thức

PGA Môi trường Potato Glucose Agar

MPL Mẫu phân lập

NSC Ngày sau cấy

HXDK Hiệu xuất đối khang

DKTN Duong kinh tan nam

DANH SÁCH CÁC BANG

Bảng 2.1 Quy ước đặt tên vi sinh vật phân lập trong đất -¿ -z©-5-+2 19Bảng 3.1 Vi sinh vật được thu thập từ mẫu đất các ruộng tại: Đơn Dương, Đức TrọngCRC eo rere 27

Bảng 3.2 Khảo sát kha năng đối kháng của 37 dòng vi khuan phân lập trong đất 28

Bảng 3.3 Kết quả quan sát đặc điểm của 12 dòng vi khuẩn đối kháng phân lập được

trên MOT trưởng KH knbzeecbnnnsibesbriec4gst3EEteESiLlpti82sgtsg3i:si1CgisgtssigsisSti3guias1a4Bes/55.04584 580 35

Bảng 3.4 Kết quả định danh vi khuẩn phân lập được trong đất theo đặc điểm hình thái

42

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1 Các bộ phận trên cây khoai tây cece ccc 222221222222 2112 tre 4

Hình 1.2 Phân bố bệnh sương mai trên thé giới 2-2222 ©2222+22z22+22+z2zzz2zzzx 6Hình 1.3 Bệnh sương mai gây hại trên một số bộ phận của cây khoai tây 7

Hinh 1:4 TÚI bào TỪ cceeseeenienssibiebintisyCGIBESESEGEEIEGEELREHESSEEIGEHEEETXSSEESEDEIGEIERHUSEEEGIIERESUEEESHEESRM 9

Hình 2.1 Mẫu đất thu tại xã Ninh Gia, huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Déng 18Hình 2.2 Bố trí vi khuẩn đối kháng với nam trên đĩa petri -22 +: 23Hình 3.1 Tang nam Phytophthora infestans trên đĩa PDA, sợi nam và bào tử nắm xem

rt Metra Aocrnoisitieosbi5iEEG0VGE209400008200018059001GEE9802S5S00:3SETOIE-UBRGESIIGDRGBIGGEGE-ldGSi444010529008/88800 25Hình 3.2 Lay bệnh trên củ ngày đầu và 6 ngày sau va hình soi nam được lay từ củchủng bệnh quan sát trên vật kính 40X - - - - cece 2221221 22112 921 11 1 n1 dư 26

Hình 3.3 Kha năng đối kháng của các dòng vi khuẩn với nam Phytophthora infestans

tai thoi diém 4 ngay Sau 0c 34

Hình 3.4 Kết qua thử bang dung dich KOH :c:ccccccsssessesssesesessessesssessesseessesstesseees 38Hình 3.5 Kết quả nhuộm granm cccccseccsescsessseseseessecesessseecseesseessesssecsiesseesseeseeeseeseees 38Hình 3.6 Kết quả nhuộm nội bảo tử - 2: 2 2+2222E2EE+EE+EE£EE22E22E22E222222222222222e2 39Hình 3.7 A vi khuẩn ky khí, B đối chứng nước cắt - -2 2©2+©2+c5cze- 39Hình 3.8 Kết quả phản ứng với Catalase - 2 22©22+22++2E++EEEtEEEerxrerxrerrrr 40Hình:3.9 Kết: quả phân ứng với Oxidases ccscscssssscnssvaenensnssersiswessneasvassbercusentencascehonsases 40Hình 3.10 Kết quả phan ứng thủy phân tỉnh bột - -2-©222222+22c+++ceezz+ 41

GIỚI THIỆU

Đặt van dé

Khoai tay (Solanum tuberosum L.) là loại cây trồng lay củ rộng rãi nhất thé giới

và là cây lương thực đứng thứ tư trên thế giới về sản lượng tươi (xếp sau lúa mì, gạo,bắp) Khoai tây được coi là “nguồn lương thực thực phẩm của tương lai” đã đượctrồng hơn 100 nước trên thế giới và là thành phần quan trọng trong hệ thống lươngthực thế giới (FAO, 2008) Ở Việt Nam các nghiên cứu về khoai tây tập trung chủ yếu

vảo việc lai giống, khảo nghiệm, tạo củ nhỏ và một số bệnh cây chủ yếu là bệnh virus

Sương mai là một bệnh nghiêm trọng và làm giảm năng xuất khoai tây tram trọng (Vũ

Thị Hoa Phượng, 2015) và có kha năng phá hủy toan bộ các cánh đồng ký chủ của nó,dẫn đến thiệt hại năng suất lên đến 100% (Nowicki et al 2012 ) Biện pháp phòng trừchủ yếu hiện nay đối với bệnh sương mai trên cây khoai tây là sử dụng thuốc có nguồn

gốc hoá học gây anh hưởng xấu đến sức khỏe con người, mat cân bang sinh thái, 6

nghiễm môi trường cũng như tăng khả năng kháng thuốc của nắm bệnh và đó là vấn đề

được ca thế giới quan tâm, với mong muốn sử dụng biện pháp thay thé an toàn va

mang lại hiệu quả nhưng không ảnh hưởng đến sức khỏe con người và bảo vệ môitrường Hiện nay một số biện pháp sinh học đã được sử dụng như nam đối kháng

Trichoderma hay các loại lợi khuẩn, xạ khuẩn hỗ trợ phòng trừ sâu bệnh, phân bón

hữu cơ sinh học đang là giải pháp ưu thế được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và ứngdụng rộng rãi trên toàn thé giới Nhiều vi sinh vật có đặc tính đối kháng với nam gâybệnh đã được phát hiện va sử dụng bao gồm Rhizobium (vi khuẩn cô định nitơ sốngcộng sinh), Azospirillum (vi khuẩn có định nito sống tự do), Bacillus (vi khuẩn phângiải photphat khó tan và sản sinh các chất phòng trừ bệnh cây), Pseudomonas (vikhuẩn sản sinh các chất phòng bệnh cây) (Fravel, 2005)

Trên cơ sở trên đề tài : Phân lập và nghiên cứu một số vi sinh vật trong đất đốikháng với nam Phytophthora infestans gây bệnh sương mai trên cây khoai tây

(Solanum tuberosum L.).

Mục tiêu

Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của những dòng vi khuẩn có ích trong

đất đối với nam Phytophthora infestans gây bệnh sương mai trên khoai tây

Yêu cầu

Kiểm tra lại mẫu nam Phytophthora infestans gây bệnh sương mai được Viện

Khoa học Nông nghiệp Việt Nam - viện Bảo vệ Thực vật cung cấp.

Phân lập được các vi sinh vật đối kháng với nam gay bénh.

Đánh giá khả năng đối khang của các vi sinh vật trong điều kiện phòng thí

Chương 1

TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

1.1.1 Nguồn gốc

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là cây thân thảo, có củ thuộc họ cà có

nguồn gốc ở vùng cao nguyên thuộc dãy núi Andes (Nam mỹ) ở độ cao 2000 - 5000m.Các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều di tích lịch sử chứng minh cây khoai tây cónguồn gốc từ khoảng 500 năm trước công nguyên Người Tây Ban Nha lần đầu phát

hiện ra cây khoai tây khi họ đặt chân lên thung lũng Magdalena Lúc đó, người ta gọi

khoai tây là truffles vì hoa có mau sắc sặc sở (Salaman, 1949) Đến thời ki người TâyBan Nha chinh phục Châu Mỹ trong thế ky XVI, hang trăm giống khoai tây đã đượcbiết đến và được trồng chủ yếu dọc miền núi, bây giờ là Bolivia, Chile, Colombia,Ecuador và Peru (Horton, 1987) Ngày nay người da đỏ ở vùng Titicaca vẫn còn trồngnhững giống khoai tây khởi thủy (Ducreux, 1989) Năm 1890 khoai tây được du nhậpvào nước ta là do một người Pháp là giám đốc vườn Bách Thảo Hà Nội đem vào trồngthử và nó nhanh chóng được trồng ở nhiều địa phương Do người Pháp là người đem

cây về nước ta và phô biến cách trồng nên nhân dân ta gọi cây này là "khoai tây" (Vũ

Hướng Văn, 2007) Hiện nay, khoai tây được trồng tập trung chủ yếu ở đồng bằng

sông Hồng, Sapa, Đà Lạt những vùng có khí hậu mát mẻ, ôn hòa (Đỗ Kim Chung,

2003) Từ đó đến bây giờ cây khoai tây đã dần phổ biến và có một vai trò quan trọng

hơn trong đời sông con người.

Tổ chức Nông Lương Thế Giới ( FAO) khuyến cáo : trong tương lai sản xuất

lương thực sẽ cần phải tăng 75% mới có thể cung cấp lương thực cho 9 tỷ người vào

năm 2050 Theo số liệu do Liên Hợp Quốc công bố trên bai báo (Tình trạng An ninhLương thực và Dinh dưỡng trên thế giới) xuất bản ngày 13/07/2020 năm 2019 trên thế

giới có 690 triệu người thiếu ăn Vấn đề an ninh lương thực là vấn đề thế giới đang đốimặt Hơn nữa biến đổi khí hậu đang diễn biến ngày càng phức tạp, nắng nóng kéo đài,hạn hán, xâm nhập mặn, dịch bệnh đặc biệt ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển năngxuất, chất lượng của cây trồng.

1.1.2 Vị trí phan loại

Vi trí phân loại của khoai tây trong hệ thong hoc thuc vat (USDA, NRCS, 2010):

Giới: Plantae (plants)

Lớp: Magnoliopsida (dicotyledons)

Bộ: Solanales Ho: Solanaceae Chi: Solanum Loai: Solanum tuberosum L.

1.1.3 Đặc điểm của cây khoai tây

Nhuy Nhị

Than chính

Thân nga (Tia củ)

Mat củ

M—=” Củ

(Atlas des plantes de France, 1891) Hình 1.1 Các bộ phận trên cây khoai tây

Thân: Khoai tây có thân chính mọc từ hạt hoặc từ củ Chiều cao thân khoai tây

từ 45 cm đến 90 cm tùy thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác và độ phì của đất Thân va

lá khoai tây có nhiều lông Thân cây khoai tây là một hệ thống gồm thân, tia củ và củ.Tia củ phát triển từ thân ngầm Trong điều kiện thuận lợi sẽ phát triển củ Trong điềukiện không thuận lợi sẽ trồi lên mặt đất, phát triển thành thân

Lá: Lá khoai tây là lá kép lông chim, không đối xứng Các lá chét có đặc điểm làluân phiên xen kẽ một lá to đến một lá nhỏ

Hoa: Khoai tây có hoa cân đối Màu sắc hoa là đặc điểm phân biệt các giống:

Cánh hoa có màu: trắng, tím — đỏ, tím — xanh, xanh thẫm Hoa khoai tây mọc thành

chùm, là hoa lưỡng tính Khoai tây là cây tự thu phan nhưng cũng có trường hợp giao

phấn Sự thụ phấn chéo của khoai tây được thực hiện nhờ côn trùng Sau thời kỳ ra

hoa, một vài loài kết quả Quả chưa chín có màu xanh, quả chín có màu đỏ anh đàogiống như màu cà chua Quả khoai tây thuộc loại quả mọng, có 2 ô, hạt rất nhỏ

Rễ: Rễ khoai tây trồng từ củ giống chỉ phát triển rễ chùm, có rễ cọc khi trồng

bằng hạt, từ rễ cọc phát triển nhiều rễ phụ khác Ở các thân ngầm dưới mặt đất (còn

gọi là tia củ) cũng có khả năng ra rễ, nhưng rễ ngắn và ít phân nhánh Bộ rễ phân bốchủ yếu trên đất canh tác 20 - 40 cm, nhưng cũng có rễ ăn sâu tới 1,5 - 2,0 m (Ta Thu

Cúc, 2007).

Củ: Mầm ngủ trên thân khoai tây được tạo thành ở các nách lá và củ Mầm ngủ

ở mỗi củ thường là một , phần lớn là 3 mầm Các mắt ngủ trên củ khoai tây phân bố

theo hình xoắn ốc Chúng được phân bố không đều trên bề mặt củ Thường tập trung

chủ yếu ở phần trên của củ, nơi có các tế bào tương đối trẻ

Cây khoai tây được chia làm 4 thời kỳ:

Thời kỳ ngủ

Thời kỳ nảy mầm

Thời kỳ hình thành thân củ

Thời kỳ phát triển củ

1.2 Bệnh sương mai trên khoai tây

trên hầu hết các châu lục Tại châu Á bệnh xuất hiện tại 26 nước, trong đó có nhữngnước lân cận va láng giéng nước ta như Trung Quốc, Lao, Thái Lan, Philippin, Han

Quốc, Nhật Ban, Ấn độ va bao gồm cả Việt Nam Ở nước ta phân bó của bệnh cũngkhá rộng, theo các nghiên cứu cho thấy bệnh phổ biến ở các vùng Hà Nội, Lào Cai,Bắc Giang, Bắc Ninh, Hải Phòng, Lâm Đồng (Vũ Hoan, 1973; Nguyễn Văn Viên,

1998).

Bệnh sương mai khoai tây do Phytophthora infestans gay ra, là một trong những

bệnh được nghiên cứu nhiều nhất, có lịch sử nghiên cứu lâu dài nhất, tuy vậy đây vẫn

là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất trong lịch sử nhân loại Bệnh sương maikhoai tây lần đầu tiên ghi nhận tại Mexico, đây cũng được coi là trung tâm đa dạngsinh học của nắm sương mai Triệu chứng bệnh được mô tả chi tiết năm 1845 trên câykhoai tây Sự phát tán của bệnh được chia làm hai giai đoạn giữa thế kỉ 19 và giai đoạn

thế ki 20 cho đến nay Giai đoạn giữa thế kỉ 19, lúc này khoai tây bắt đầu xuất hiện và

được phô biến rộng rãi trên các nước Bắc Mỹ và châu Âu Cùng với sự phổ biến củakhoai tây, nắm sương mai cũng phat tán ra các vùng trồng, đầu tiên là Mỹ theo nguồnbệnh trên khoai tây đại, sau đó lan sang châu Âu theo đường củ giống Giai đoạn thứ 2vào thế kỉ 20, lúc này do toàn cầu hóa về thương mại cũng như vận chuyên hàng hóa,bệnh sương mai theo củ khoai tây phát tán ra hầu như tất cả các vùng trồng cây khoaitây và cà chua Bệnh hại nặng có thể mất mùa và dẫn tới nạn đói như ở Ireland năm

1845 - 1846 và ở Đức năm 1919 Bệnh sương mai có thé coi là một trong những căn

bệnh có sức tàn phá lớn nhất trong lich sử con người(Trần Yến Chi, 2009)

Trên lá: vết bệnh ban đầu là những điểm nhỏ màu xanh thẫm sau đó lan rộng ra

có màu nâu tham, ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe không rõ ràng Bệnh thường

xuất hiện đầu tiên ở mép chóp lá, sau đó lan rộng vào phiến lá (Stevenson, 1993) Phầngiữa vết bệnh hóa nâu đen do các đám mô bị chết, xung quanh vết bệnh thường có

đám cành bào tử va bào tử phân sinh màu trăng Khi thời tiệt âm ướt hoặc buôi sáng

sớm có sương, các đám bào tử phân sinh này dày và xôp tạo ra một lớp trăng như

Sương muối ở mặt dưới lá bệnh (Drenth và ctv, 1996)

Trên cuống lá, cành và thân: triệu chứng bệnh cũng tương tự như những triệu

chứng trên lá Những tốn thương trên thân và cuống lá điển hình là những vết đốm lớn

màu tối hoặc những vết đốm màu nâu, dẫn đến dé gãy và cây bị chết (Stevenson,1993) Khi điều kiện âm độ xuống thấp, vết bệnh chết tóp lại, khi độ âm cao, trên vếtbệnh có lớp cành bao tử và bao từ phân sinh trắng như sương muối bao phủ Bệnh làm

cho thân cành bi thôi, mém, có mùi moc.

Trên củ khoai tây: bắt đầu từ những vết đốm bóng nhờn, màu tối trên bề mặt củ.Những vết đốm này có thé tăng kích thước bao phủ toàn bộ củ Dưới điều kiện môi

trường thuận lợi cho sự hình thành bao tử, hệ sợi trắng có thé nhìn thấy được trên củ

(Stevenson, 1993) Tiếp theo sự xâm nhiễm trên củ khoai tây sương mai là bệnh thối

nhũn dẫn đến hỏng toàn bộ củ (Watterson, 1986) Triệu chứng bệnh sương mai có thể

nhằm lẫn với một số bệnh thối củ do vi khuẩn vì có chung các đặc điểm như có vếtmàu nâu lõm xuống Tuy vậy khi cắt ngang củ sẽ thấy các mô bệnh có màu nâu xám

lan rộng vào phía trong, đôi khi còn ăn sâu vao trong lõi củ Các củ bị bệnh và các lát

củ này khi đặt ở nhiệt độ dưới 20°C và âm độ bão hòa có thể quan sát thấy một lớpnam trang và cành bào tử phân sinh cũng như bao tử phân sinh trên bề mặt của củ (VũTriệu Man và Lê Lương Té, 2001)

Bệnh lan truyền trong cây có thé từ lá tới thân rồi quả, củ Nhưng cũng có thé

lan truyền từ củ, hạt nhiễm bệnh lên thân, lá Khi bệnh xuất hiện nếu gap điều kiện

thời tiết phù hợp như nhiệt độ dưới 20°C, âm độ cao trên 80% cây sẽ nhanh chóng tànlui có thể gây thành dich làm giảm năng suất nghiêm trọng

1.2.3 Tổng quan về nam Phytophthora infestans

Phytophthora infestans là một loài Oomycete Sinh san vô tính thông qua túi

bao tử có hình elip đến hình quả chanh với một cuống nhỏ Túi bao tử có kích thước

29 - 36 x 19 - 22 um Bào tử nảy mam hoặc trực tiếp tạo thành ống mam (ở nhiệt độ

15 - 24°C), hoặc gián tiếp qua động bào tử (ở nhiệt độ dưới 18°C)

Cây phân loại theo (cabi, 2022)

Domain: Eukaryota Kingdom: Chromista

Phylum: Oomycota

Class: Oomycetes Order: Peronosporales Family: Peronosporaceae

Genus: Phytophthora

Species: Phytophthora infestans

Nam có cấu tao dạng sợi đơn bào Sinh san theo hai phương thức vô tinh và hữu

tính.

(Nguồn: Fry, William E and Niklaus J Griinwald, 2010)

Hình 1.4 Túi bào tửPhương thức sinh sản vô tinh: nam tạo ra cành bao tử phân sinh và bao tử phân

sinh lộ ra trên bề mặt vét bệnh, đặc biệt là mặt dưới lá bệnh Bệnh Sương mai qua đôngkhi nam tôn tại trên tàn dư thực vật, trên những ký chủ tự nhiên Dưới điều kiện môi

trường thuận lợi cho sự sinh bảo tử, hệ sợi sản sinh ra các cành bào tử nhánh kéo dài

200 pm trên bề mặt lá (Carlile, 1994) Canh bào tử không mau, chia nhiều nhánh cấp 1

so le với nhau, trên mỗi đỉnh nhánh có nhiều chỗ phình lồi lõm, đây là đặc điểm riêngbiệt của cảnh bào tử nam Phytophthora infestans so với các Phytophthora khác Tại

đầu cành bảo tử, bào tử hình quả chanh, có núm được tạo ra Các bao tử này có kích

thước khoảng 29 x 19 um đến 36 x 22 pm (Erwin và Ribeiro, 1996) Bao tử phát tán

thông qua gió và giọt nước bắn Mỗi bọc bao tử có thé chứa 3 - 8 bao tử động, được

giải phóng khi phá vỡ thành bao tử (Agrios, 1997) Mỗi bào tử động có 2 lông roi

thuận lợi cho sự vận động trong môi trường có nước (Lê Lương Té, 2007) Bào tử có 2kiểu nảy mam trực tiếp và gián tiếp Nếu nhiệt độ môi trường trong khoảng 20 - 24°Cbảo tử phân sinh sẽ trực tiếp hình thành ống mam sau đó tạo thành sợi nam xâm nhậpvào tế bảo mô cây ký chủ Nếu nhiệt độ môi trường từ 12 - 18°C trong điều kiện ẩm

cao hoặc có giọt nước, bào tử phân sinh sẽ giải phóng các du động bảo tử (zoospore)

có 2 roi Các du động bào tử này có khả năng chuyền động nhờ có giọt nước sẽ tìm tớicác lỗ khí không nảy mam tạo ra các sợi nam và xâm nhập vào cây kí chủ Dù là

phương thức nảy mam trực tiếp hay gián tiếp nhưng khi xâm nhập sợi nam đều dùngphương pháp cơ học là hình thành các vòi hút hình trụ hoặc hình cầu để xâm nhập vào

mô lá Nắm sương mai có chu kì phát triển hoàn toàn với giai đoạn sinh sản vô tính vàhữu tính Sinh sản vô tính bằng bao tử phân sinh (Croiser, 1934), dưới hai hình thứcnảy mam trực tiếp và gián tiếp nảy mam thông qua bao tử động (hình thành trong điềukiện lạnh, có giọt nước) Nắm sương mai có 2 chủng nam Al, A2 và một dang hữu

tính.

Sinh sản hữu tính: phần lớn xảy ra ở các vùng lạnh âm, phải có đủ cả 2 chủngnam Al, A2 hoặc có dạng hữu tính lúc này sẽ sinh ra bào tử trứng Bào tử trứng đượchình thành khi có sự kết hợp giữa Al và A2 ở cạnh nhau, cơ quan sinh sản trên sợinam là bao trứng (Oogonium), và bao đực (Antheridium) Sau khi phối giao nhân củabao đực đồn sang bao trứng thụ tinh hình thành bào tử trứng lưỡng bội (Oospore) với

kích thước khoảng 31 x 50 um (Erwin và Ribeico, 1996) Khi ở vùng khí hậu không

thuận lợi cho sự hình thành bao tử trứng hoặc chỉ có 1 trong 2 chủng nam thì namsương mai chỉ sinh sản theo kiểu vô tinh Bệnh lan truyền từ cây nay sang cây khác dogió lan truyền bào tử phân sinh, có thé do nước rửa trôi bào tử Bào tử vô tính có khanăng tồn tại trong đất âm từ vài ngày tới vài tuần tuy vậy trong đất khô khả năng nàykhá hạn chế Trong điều kiện tồn tại trên bề mặt nước có đất, bào tử cũng có thể tồn tạitới vài tuần nhưng trong điều kiện không có đất bảo tử chỉ tồn tại được vài ngày (TrầnYến Chi, 2009)

1.2.4 Các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng phát triển của nắm bệnh

Các nghiên cứu ban đầu đã chứng minh rằng mầm bệnh nay không hoạt động tốt

ở nhiệt độ cao hơn (vi dụ > 25°C) ( Jones và ctv, 1912 ) và sự nảy mam gian tiếp

chiếm ưu thế ở nhiệt độ dưới 20C (Crosier, 1934; Melhus, 1915) Bệnh phát sinh và

gây hại mạnh trong điều kiện thời tiết mưa nhiều âm độ cao, mưa nắng xen kẽ, trời âm

u có sương mù, ở các vùng đất trũng thấp, ít thoát nước, bón phân không cân đối, bón

quá nhiều đạm

1.2.5 Biện pháp phòng trừ

Áp dụng biện pháp quản lí dịch hại tổng hợp IPM

Biện pháp canh tác: dùng cây giống sạch bệnh, trồng luân canh cây họ ca và cây

trồng khác, đặc biệt là lúa nước Vệ sinh đồng ruộng, thu gom và tiêu hủy tàn dư cây

bệnh Bón vôi, phân hữu cơ trước khi gieo trồng Bón phân cân đối, tăng lượng bón

phân kali và lân Luống đánh cao, rãnh rộng đề dễ thoát nước Vườn ươm phải là nơiđất cao ráo, sạch sẽ Không nên trồng cà chua gần ruộng khoai tây và không luân canh

kế cận với khoai tây Thường xuyên kiểm tra phát hiện bệnh kịp thời ngoài đồngruộng, khi thấy phát sinh các 6 bệnh đầu tiên cần phải phân loại ruộng để có kế hoạchphun thuốc ngăn chặn ngay

Biện pháp sinh học: sử dụng chế phẩm Trichoderma ủ với phân chuồng hoaimục 7 - 10 ngày dé bón lót

Biện pháp hóa học: dùng các loại thuốc được phép sử dụng, theo nồng độkhuyến cáo và theo nguyên tắc 4 đúng (đúng thuốc, đúng thời điểm, đúng nồng độ và

liều lượng, đúng cách) có thể sử dụng một số loại thuốc như: Daconil 75WP, Metaxyl500WG, Makozeb - RBC 80WP (Bùi Thị Khanh, 2021).

1.3 Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài

1.3.1 Những nghiên cứu ở nước ngoài

Nghiên cứu của Bhimanagoud Kumba và ctv (2019) về hoạt động kiểm soátsinh học của bốn chủng B.subtilis phân lập viz., B.subtilis KU936341 (T - 6), B

subtilis MTCC - 2422 (T - 3), B.subtilis KU936344(T - 4), B.subtilis KU936345(T - 5)

chống lại bệnh mốc sương trên khoai tay do nam Phytophthora infestans gây ra đã

được khảo sát Những vi sinh vật phân lập nay tao ra độc tố nắm mốc chống lại sinh

vật gây bệnh Thuốc diét nắm (Mancozeb) M 45 (CURZATE®) đã được sử dụng nhưmột biện pháp phòng trừ tích cực Giống khoai tây ( Solanum tuberosum ), Kufri Jyoti

đã được sử dụng Các phương pháp xử lý được sử dụng như làm ướt đẫm đất cũng như

phun qua lá Kết qua cho thấy, nghiệm thức vi khuẩn làm giảm đáng ké tỷ lệ bệnh mốcsương so với đối chứng Xử lý vi khuẩn làm tăng các thông số sinh dưỡng của cây như

chiều cao cây, độ nảy mam, số lá, khối lượng tươi và khối lượng khô của cây Ngoài

ra, các nghiệm thức cũng cho thấy sự khác biệt rõ ràng giữa năng suất củ thương phâm

và phi thương phẩm / ha Trong thí nghiệm này, hai quan sát cho thấy sự giảm mức độ

nghiêm trọng của bệnh Ở lô đối chứng tăng 32,73% và thuốc trừ nấm hóa học là

14.3% , trong khi ở nghiệm thức vi khuẩn tăng lần lượt là 12,75%, 14,09%, 4,7% và4,13% đối với T3, T4, TS và T6 Làm ướt dat dé nuôi cấy vi khuan đã cho năng suấtcao ở củ khoai tây thương phẩm, ngay cả khi so sánh với thuốc diệt nam hóahọc Tổng năng suất của lô đối chứng là 166,04 tạ / ha nhưng năng suất phi thươngphẩm là 101,07 tạ / ha Với thuốc trừ bệnh hóa học, tông năng suất là 188,8 tạ / ha và

củ phi thương phẩm là 69,66 tạ Các nghiệm thức vi khuẩn T4, T5, T6, cho năng suấtkhoai tây phi thương phẩm kém hơn 48,29, 22,60 và 24,67 tạ / ha trong tổng năng suất

177,02, 212,89 và 190,737 tạ / ha ở các nghiệm thức tương ứng Vì vậy, nghiên cứu

nay phát hiện ra rằng các phương pháp điều trị B subtilis có hiệu quả trong điều kiệnđồng ruộng để kiểm soát bệnh mốc sương ở khoai tây

Theo nghiên cứu của Lukas Hunziker và ctv (2015) Các chủng vi khuẩnCyanogenic Pseudomonas là hoạt động tích cực nhất, dẫn đến sự ức chế hoàn toàn sựphát triển, những noncyanogenic cũng tạo ra chất bay hơi antioomycete Phân tích cácchất bay hơi phát ra cho thấy 1 - undecene là một hợp chất làm giảm đáng kể sự phát

triển của sợi nấm, sự hình thành túi bào tử, sự nảy mầm và sự giải phóng bao tử động

vật phụ thuộc vao liều lượng

Theo Xiufen Yang va ctv (2011) Xenocoumacin 1 (Xen]) là một chat khangkhuẩn từ vi khuẩn cộng sinh tuyến trùng côn trùng, Xenorhabdus nematophila var.pekingensis Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá hoạt tính kháng nam củaXen], cùng với hoạt tính tiềm năng của nó đối với Phytophthora infestans, in vitro và

in vivo Kết quả cho thay Xenl có hoạt tính kháng nấm mạnh đối với năm loài

Phytophthora, với giá trị EC50 nằm trong khoảng từ 0,25 đến 4,17 wg / mL Xenlkhông chỉ ức chế sự phát triển của sợi nam của P infestans, đạt tới mức ức chế 100%

ở 1,5 ug / mL Xenl1, mà còn ức chế sản xuất bào tử Xcn1 cũng cho thấy hoạt động in

vivo mạnh mẽ chống lại P infestans, với 92,63% và 80,27% ở cây tách rời và câytrồng trong chậu, so với đối chứng Do đó, Xenl có hoạt tính kháng sinh chống lại P

infestans cả in vitro va 1n vivo.

Anju Ran va ctv (2020) đã thi nghiệm va có kết qua là Ba dong vi khuan phânlập được thử nghiệm chống lai P infestans bằng phương pháp nuôi cấy kép Trong sốcác phân lập vi khuan nay, Bacillus cho thấy vùng ức chế tối đa là 6,0 mm trong khiPseudomonas phân lập 1 và 2 cho thấy vùng ức chế lên đến 5,7 mm Hiệu quả củadich lọc nuôi cấy ba chủng vi khuẩn (Bacillus sp., Pseudomonas phan lập 1 và 2) chothấy sự ức chế> 75% và ở nồng độ dịch lọc 10%, chúng cho thấy sự ức chế hoàn toàn

(100%)

Kết quả nghiên cứu của Simon Caulier và ctv (2018) Bộ sưu tập gồm 2.826chủng vi khuan được phân lập từ tổng số 157 mẫu thu thập được Dựa trên các hoạtđộng đối kháng in vitro của chúng đối với ít nhất một trong năm mam bệnh được thử

nghiệm (A solani, F solani, R solani, P carotovorum, P infestans) với GIP > 50%,

52 Bacillus spp và 8 Pseudomonas spp các chủng đã được chon dé xác định thêm đặctính Đối với tập hợp con gồm 60 chủng này, 12 Bacillus spp các chủng đã đượcchứng minh là có hoạt tính chống lại F solani (GIP > 50%), trong khi không cóPseudomonas spp cho thấy một hoạt động mạnh mẽ chống lại loại nắm này Điềuđáng lưu ý là do sự phát triển hình trụ được hiển thị bởi chín trong số các chủngBacillus hoạt động, hoạt động của chúng chống lại F solani cũng có thé là do sự cạnh

tranh dé xâm chiếm bề mặt Liên quan đến tính đối kháng với bệnh mốc sương (P

infestans), 18 Bacillus spp và 7 Pseudomonas spp các chủng có hoạt tinh ức chếmạnh (GIP > 70%) Ngoài ra, 25 Bacillus spp các chủng cho thấy hoạt động ức chế tốt

đối với A solani (GIP > 50%) và bốn đối với P carotovorum, trong khi không có

chủng Pseudomonas nào có hoạt tính chống lại hai vi khuẩn nay Các thử nghiệmchống lại R solani cũng cho thấy các chủng vi khuan B amyloliquefaciens, B pumilus

và P putida hiệu quả Kết hợp với nhau, một hoạt động đối khang in vitro mạnh mẽ

(GIP > 70%) chống lại ít nhất một trong các mầm bệnh được thử nghiệm đã được quansát đối với 26 Bacillus spp và 5 Pseudomonas spp các chủng.

1.3.2 Những nghiên cứu ở nước ta

Theo nghiên cứu các tác giả Lê Vũ Khánh Trang va ctv (2021) thì cho thấy tat

cả các thành phan trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn B velezensis đều thé hiện khảnăng đối kháng với nắm bệnh Phytophthora sp Trong đó, hiệu lực ức chế nam bệnhcủa tế bao và dịch ngoại bao là cao nhất, tương ứng lần lượt là 84,44% va 80% Ngoài

ra, trong dịch ngoại bào của vi khuẩn B velezensis thì dich enzyme ngoại bảo có hiệu

lực ức chế sự phát triển của nắm bệnh (72,59%) cao hơn 1,6 lần so với các thành phần

khuẩn có triển vọng được thực hiện trên môi trường ÿ - glucan với 5 lần lặp lại Kết

quả cho thay, chủng xạ khuẩn CM18 có khả năng tiết enzyme j - glucanase cao nhấtvới bán kính là 10,81 mm ở thời điểm 14 ngày sau khi cấy Bên cạnh đó, các chủng xakhuân thí nghiệm đều có khả năng tiết siderophore dang hydroxamates

Theo Lê Thị Hiền và ctv (2014) Đã phân lập và làm thuần được 43 chủng xạ

khuẩn, phân thành 7 nhóm màu với tỷ lệ khác nhau Hai chủng xạ khuân HN6 và NA1

có hoạt tính kháng nam mạnh nhất, sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 30 oC và pH trung tính.Ching HN6 duy trì ức chế nam F osyxporum, B dothidea, P capsici và S.hydrophylum tương ứng là 17, 7, 4, 5 ngày; có khả năng sông sót ở nhiệt độ 45°C, chịumuối đến 5% Ching NA1 ức chế sự phát triển của nam F osyxporum, B dothidea, P.capsici, S hydrophylum tương ứng là 20, 21, 7, 23 ngày; có khả năng sống sót ở nhiệt

độ 40°C, chịu muối đến 7% Dựa trên cơ sở so sánh các đặc điểm hình thái khuẩn lạc,

sinh lý và sinh hóa, chủng xạ khuân HN6 được định danh là Streptomyces roseosporus

HNó, chủng NA1 được định danh là Streptomyces albofaciens NA.

Theo nghiên cứu của Lê Thị Thanh Thuỷ, Lê Như Kiều và Hồ Tuyên (2018) Haichủng Azotobacter; 2 chủng Bacillus và 3 chủng nam Trichoderma có hoạt tính sinhhọc cao,an toàn sinh học, ức chế nắm Phytophthora sp., Fusarium sp., Colletotrichum

sp gay bệnh cây hồ tiêu đã được phân lập và tuyển chon Ching A Vinelandii AV2 đahoạt tính sinh học (cố định nitơ, sinh IAA, gibberellin, sinh siderophore, ức chế namgây bệnh), chủng B subtilis BS5 (sinh IAA, phân giải kitin, sinh siderophore, ức chế

nam gây bệnh),chủng 7 harzianum TH6 (phần giải kitin, sinh siderophore, ức chế

nam gây bệnh) Các chủng này có khả năng sử dụng dé sản xuất chế phẩm sinh họcphỏng trừ bệnh chết nhanh, chết chậm cây hồ tiêu

Theo thí nghiệm của Trần Thanh Tâm và Phạm Quang Thu, 2009 Ông đã phân

lập được 70 chủng vi khuân sông trong mô của 12 loài thực vật Luyên chọn được 11

chủng vi khuân có khả năng sản sinh ra chat kháng sinh gây ức chê sự phat triên của

nam bệnh Chung MD2 phân lập từ cành cây mẫu đơn và SP14 phân lập được từ cành

cây ngâu đỏ có hiệu lực cao nhât trong việc ức chê sự phát triên của nam bệnh Fusarium oxysporum và chủng MD2 và SP18 phân lập từ cành cây ngâu đỏ có hiệu lực cao nhat trong việc ức chê sự phát triên của nam bệnh Phytophthora Ching MD2 có hiệu lực cao nhât trong việc ức chê sự phát triên của cả 2 loại nâm bệnh.

Ộ Chương2 - ;

NOI DUNG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Phân lập và định danh các vi sinh vật đối kháng với tác nhân gây bệnh sương

mai trên khoai tây.

Đánh giá tính đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập đối với tác nhân gâybệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 05 năm 2022 đến tháng 11 năm 2022

Thí nghiệm được tiễn hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa

Nông học, Đại học Nông Lâm TP HCM.

2.3 Vật liệu thí nghiệm

Mau nam phytophthora infestan được cung cấp từ Viện Khoa học Nông nghiệpViệt Nam - viện Bảo vệ Thực vật và mẫu đất vùng bị bệnh sương mai trên khoai tâytại tỉnh Lâm Đồng

Các trang thiết bị gồm: cân điện tử, bếp điện, kính hiển vi, đèn cồn, máy ảnh,

dụng cụ cấy, đĩa petri, que cấy, nồi hấp khử trùng, máy lắc, tủ cấy, tủ sấy, lò vi sóng

Môi trường PSM: thành phan 1 lít cà rốt 20g, khoai tây 20g, agar 15g, pimaricin

10Hg/ml, rifampicin 20ug/ml, hymexazol 0,341/mI.

Môi trường WA: 20 g Agar và 1000 ml nước cat

Môi trường PGA (PDA) -Potato Glucose Agar: Rửa sạch 200g khoai tây (không

gọt vỏ) Cắt khoai tây thành từng miếng nhỏ và luộc trong khoảng 1 giờ, sau đó lọc

khoai tây và nước luộc bằng rây (hoặc vải mản) rồi vức bỏ phần bả đi Hòa tan 20g

đường dextrose (glucose) và 20g Agar vào 1000 ml nước với nước lọc khoai tây.

Môi trường LB -Luria Broth: thành phan 1 lit peptone 10g, cao nam men 5g,

NaCl 10g, agar 20g, nước | lít, pH 7,0.

Môi trường KBA (King’B Agar): Thanh phan: Peptone 20g, Glycerol 10g,

K2HPO4 khan 1,5g, MgSO4.7H2O 1,5g, Agar 15g, nước cất 1000 ml Tron chung tat

cả các thành phần ngoại trừ MgSO4 Điều chỉnh pH đến 7,2 Từ từ thêm MgSO4 va

lắp đều Hap khử trùng 121°C trong 25 phút

Môi trường đặc hiệu: môi trường TZC-agar (TZCA): thành phan 1 lít Peptone10g, Casein hydrolysate 1g, Glucose5g, TZC: 0,05 agar 20g, nước 1 lít Hap khử trùng

121°C trong 20 phút.

Cén 70%, cồn 90%, KOH 3%, dung dich Crystal Violet, dung dịch lugol, dung

dich Safranin (Nam Khoa, Viét Nam), dung dich luc Malachite 5% ( Shanghai

Zhanyun, Trung Quốc), H2O2 (được phẩm OPC, Việt Nam) NaOH 40% Dextrose,

Malt extract, Peptone, Glycerol, K2HPO4 khan, MgSO4.7H20, MgSO4 1,2%,

tetramethyl - p - phenylenediamine dihydrochloride 1% ( GHTECH, Trung Quốc), bột

agar ( Long Hải, Việt Nam), Hymexazol 200 l/l, Benlat 0,01 g/l, Rifampicin 0,02 g/l.

2.4 Phuong phap thi nghiém

2.4.1 Kiểm tra đặc điểm hình thái của nắm Phytophthora infestans

Việc định danh tác nhân gây bệnh sương mai được thực hiện theo Erwin và

Ribeiro (1996) với phương pháp cô điển dựa trên đặc trưng về hình thái, cấu trúc các

cơ quan bảo tử và túi sinh bào tử, đặc điểm sợi nắm trên môi trường nuôi cấy phù hợp

Sợi nắm Phytophthora infestans có cấu tạo đơn bao, hình vòi hút, hình trụ hoặchình cầu trong quá trình ký sinh trong tế bào Cành bảo tử không màu, phân nhiềunhánh so le với nhau, trên mỗi nhánh có nhiều vết lồi lõm, đây là đặc điểm riêng biệtcủa cành bào tử nam Phytophthora infestans so với loài nam khác

Bao tử phân sinh hình trứng hoặc hình quả chanh có núm nhỏ ở phía đỉnh bào

tử Kích thước trung bình của bảo tử phân sinh là 22 - 32 x 16 - 24 im.

2.4.2 Kiểm tra khả năng gây bệnh của mẫu nam đc cung cấp trên củ khoai tây

Việc kiểm chứng tác nhân gây bệnh được tiến hành theo phương pháp lây bệnhnam nhân tao (Burgess và ctv, 2008) Trồng cây và lây bệnh trực tiếp lên mô cây ký

chủ bằng cách cắt miếng thạch chứa tản sợi nắm và đặt lên các bộ phận khác nhau của

cây như lá hoặc trái Mẫu lá được thu từ cây khoai tây sạch bệnh, đặt vào hộp nhựa

kín, bên dưới lót một lớp giấy giữ 4m dé mẫu vào tủ định ôn ở 20°C Theo đối và so

sánh triệu chứng trên cây được chủng sau 3 ngày và cây bệnh ban đầu

2.4.3 Thu thập, phân lập và định danh mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất

2.4.3.1 Thu thập mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất

Hình 2.1 Mẫu đất thu tại xã Ninh Gia, huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng

Mẫu đất được thu thập trên những ruộng có triệu chứng bệnh sương mai hoặc

sạch bệnh.

Thu thập từ 3 ruộng tại nhiều vị trí khác nhau, thu đất ngay tại khu vực có cây

bị bệnh, bán kính 20 cm xung quanh cây bệnh Sau đó, trộn lẫn vào nhau và lay mẫuđại điện Mỗi mẫu đất lay khoảng 200 g, cách gốc 50 cm và chiều sâu từ 0 - 10 cm

Tổng số mẫu thu là 6 mẫu ở 2 huyện Đương Dương, Đức trọng và Thành Phố

Đà Lạt Trên mỗi ruộng thu thập ở nhiều vị trí khác nhau

2.4.3.2 Phân lập mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất

Cho mẫu đất (10 g) lay ở xung quanh vùng rễ cây bị bệnh được loại bỏ rác,nghiền nhỏ trong cối chảy sứ vô trùng, b6 xung 90 ml nước cất vô trùng và chuyênsang bình nón, lắc trên máy lắc 200 vòng/phút trong vòng 20 phút Lay 1 ml dung dịchchyén sang ống nghiệm có 9 ml nước muối sinh lí vô trùng và tiếp tục pha loãng tới

103, 10, 10° Từ các ống nghiệm có độ pha loãng khác nhau (103, 102, 105), cấytrải 100 wl trên môi trường KBA Sau 1 - 2 ngày quan sát sự phát triển của các khuẩn

lạc (Nguyễn Thị Kim Cúc va ctv, 2014)

Quy ước đặt tên khuẩn được mã hóa theo: tên ruộng cây trồng, địa điểm thu

mẫu, ví dụ: ruộng khoai tây, Lâm Đồng: KTLĐ

Bang 2.1 Quy ước đặt tên vi sinh vật phan lập trong đất

Địa điểm thu mẫu Vườn Tên khuẩn

2.4.3.3 Định danh vi khuẩn đối kháng trong đất

Tiến hành phương pháp định danh vi khuẩn theo Bergey (Jonh và Ctv, 1994)Xác định gram bằng dung dịch KOH 3%

Nguyên tắc: dựa vào khả năng tạo nhay (kéo soi) giữ sinh khối của vi khuẩn với

dung dịch KOH 3% Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng, vách tế bào của vi

khuẩn gram âm sẽ bị phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhay, vi khuẩn gram

dương không có kéo sợi.

Cách thực hiện: dùng que cay thu sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên môi trườngKBA trải lên giọt dung dich KOH 3% trên lam kính sạch (sinh khối càng nhiều càng

quan sát rõ) Ghi nhận khả năng kéo sợi của vi khuẩn

Nhuộm gram

Tạo vết bôi vi khuẩn (0,5 em x 0,5 em) lên lam kính sạch, để khô trong khôngkhí, sau đó cố định mẫu bằng cách hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn.

Nhỏ crystal violet phủ đều trên bề mặt vết nhuộm trong vòng 1 phút

Rửa nhanh với nước.

Nhuộm lugol trong | phút.

Rửa nhanh với nước.

Dé nghiêng trên tiêu bản, nhỏ từ từ alcohol lên vết nhuộm, khi giọt alcohol rời

khỏi lam không còn màu tím thì ngừng lại.

Rửa nhanh với nước.

Nhuộm Safranin trong 1 phút.

Rửa nhanh với nước, sau đó thấm khô

Nhỏ giọt dầu rồi soi kính 100X

Nếu vi khuẩn bắt màu tím xanh: Gram (+) Vi khuẩn bắt màu hồng đỏ: Gram (-—)

Nhuộm bào tử

Nguyên tắc: không phải mọi vi khuân đều có nội bào tử Nội bao tử được tạo ranhằm giúp vi khuẩn chống chịu tốt hơn trước những tác động bat lợi của môi trườngbên ngoài Nội bào tử khó bắt màu hơn tế bào sinh dưỡng Dé bào tử có thé bắt màu

xanh của hỗn hop malachite ta cần hoạt hóa nó bằng nhiệt độ cao, sau khi bắt màu rồi

thì lại rất khó bị tây màu, trong khi đó tế bào sinh dưỡng bị tây màu nhanh chóng Bảo

tử khó bị bắt màu hơn tế bào sinh dưỡng Nhưng khi đã bắt màu rồi thì màu sẽ bám rấtchặt và khó bị trôi đi Khi dùng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh như thuốc lụcmalachite với tiêu ban có đun nóng, thuốc nhuộm xâm nhập vào nội bào tử và làmchúng nhuộm màu xanh Khi rửa vết bôi bang nước các tế bào sinh dưỡng sẽ bị matmau còn bào tử vẫn giữ lại màu xanh Khi nhuộm bổ sung bằng đỏ safranin sẽ làm tế

bao sinh dưỡng bắt màu đỏ hồng

Cách thực hiện: sử dụng phương pháp Schaefera và Fulton cải tiến theo các

bước Dùng que cấy thu mẫu vi khuân từ môi trường LB dàn đều lên giọt nước trên

lam kính sạch, có định tiêu bản vi khuẩn bằng ngọn lửa đèn cồn Đặt tiêu bản lên trên

giá đỡ, giá đỡ đặt trên cốc thủy tinh có chứa một ít nước đang đun nóng (85°C-90°C)trên bếp Đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi Nhỏ 2 -3 giọt dung dịch lục Malachite5% lên vết bôi và tiến hành hơ trên nước nóng từ 5 - 10 phút Nếu thấy thuốc nhuộmtrên giấy bị khô thì phải bổ sung Rửa vết bôi bằng nước cất trong 30 giây Sau đó đặtmiếng giấy lọc lên trên vết bôi, nhỏ 2 - 3 giọt safranin trong 1 phút Rửa lam kính với

nước cất và dé khô Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi với thấu kính 100X

Đánh giá kết quả: mau vi khuẩn có màu xanh, vi khuẩn có cau tạo bào tử Mẫu

vi khuân có màu đỏ hong, vi khuân không có câu tạo bào tử.

Phản ứng oxidase

Nguyên tắc: các loại enzyme hiếu khí tuyệt đối có enzyme oxidase Thành viênquan trọng nhất của hệ thống này là cytochrome oxidase trong chuỗi chuyền điện tửcủa hô hấp hiếu khí với O> là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong cácloài vi sinh vật hiếu khí hay ky khí tùy ý Enzyme này phản ứng với tetramethyl - p -phenylenediamine dihydrochloride được tâm trong đĩa giấy làm đĩa giấy chuyển sang

mau xanh tim.

Cách thực hiện: tam giấy lọc với thuốc thử tetramethyl - p - phenylenediamine

dihydrochloride 1% Sau đó cấy vi khuẩn lên miếng giấy lọc đã tâm thuốc Quan sát

kết quả trong 10 giây đầu tiên

Đánh giá kết quả: nếu vi khuẩn có màu xanh tím thì phản ứng dương tinh,ngược lại vi khuẩn không đổi màu thì phản ứng âm tính

Khao sát hoạt tinh catalase

Nguyên tac: phần lớn các vi sinh vật hiếu khí va ki khí tùy ý chứa chuỗi điện

tích có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tốn thương

bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy Các vi sinh vật này có khả năng biếnđổi năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tích cuối cùng

trong chuỗi điện từ tạo HaOa Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O

và giải phóng O¿, gây hiện tượng sui bọt khí.

Cách thực hiện: nhỏ vài giọt H2O2 lên vi khuẩn phân lập Quan sát và ghi nhận

hiện tượng sui bot.

Đánh giá kết quả: v1 khuẩn có enzyme catalase xuất hiện hiện tượng sui bot.

Khả năng thủy phan tinh bột

Nguyên tắc: dựa vào phản ứng màu giữa lugol và tinh bột Lugol tác động lêntinh bột sẽ thấy suất hiện màu tím Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có chứa

tinh bột, vi khuẩn sản sinh ra enzyme amylase làm phân giải tinh bột trong môi trường,

dẫn đến hiện tượng khi ta nhỏ lugol vào môi trường, vùng môi trường xung quanh

khuân lạc sẽ không thây màu tím xuât hiện.

Cách thực hiện: dùng que cấy vô trùng cấy điểm vi khuẩn lên môi trường thạchpepton có chứa 0,2% tinh bột Nuôi cấy ở 37°C tối thiểu 3 - 4 ngày Nhỏ dung dichlugol lên trên vi khuẩn, quan sát sự xuất hiện mau

Đánh giá kết quả: không thấy xuất hiện màu xung quanh vi khuẩn, ghi kết quaphan ứng dương tinh Có xuất hiện mau tím xung quanh vi khuẩn, ghi kết quả phản

ứng âm tính.

Khả năng phát triển của vi khuẩn trong điều kiện ky khí

Cách thực hiện: cay đâm sâu vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường PGA đãđược chuẩn bị trước, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 - 4 ngày Quan sát sự phát triển của vi

khuẩn và ghi nhận kết quả

Đánh giá kết quả: nếu vi khuẩn phát triển lan ra khỏi đường cấy, không phattriển trên bề mặt môi trường thì đó là vi khuẩn ki khí Ngược lại, nếu vi khuẩn chỉ pháttriển trên bề mặt môi trường, không phát triển lan ra khỏi đường cấy thì đó là vi khuẩnhiểu khí

2.4.4 Khảo sát khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập đối với nam

Phytophthora infestans

2.4.4.1 Phuong pháp bo tri thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với mỗi dòng vi khuẩnphân lập được là một nghiệm thức và một NT đối chứng, 5 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL là

1 dia petri.

2.4.4.2 Cách tiến hành

Thực hiện thí nghiệm theo phương pháp cấy kép (Ferreira và ctv, 1991) Sử dụngque cấy ria, cấy vi khuẩn thành 2 đường thắng song song và cách vị trí đặt thạch nam

2,5 cm vào đĩa petri có sẵn PDA Sau đó, tiến hành cấy thạch nắm (đường kính 5 mm)

đã được nuôi trong 7 ngày vào tâm đĩa petri.

r: bán kính trung bình của tản nam

rl, r2: bán kính đo từ tâm đến phần tản nắm phân bồ theo hướng vi khuẩn

Chỉ tiêu theo dõi

Do bán kính tản nấm và tính hiệu suất đối kháng (HSDK) theo công thức của

Moayedi và ctv (2009) sau 24, 48, 72, 96 giờ.

Theo công thức: AE(%) = —* 100.

AE: hiệu suất đối kháng (%)

C: bán kính tản nắm tương ứng ở nghiệm thức đối chứng (mm)

T: bán kính tan nắm tương ứng ở nghiệm thức có chủng vi khuẩn đối kháng (mm).Đánh giá hiệu suất đối kháng: theo thang đánh giá của Soytong (1988)

Hiệu suất đối kháng > 75% : có khả năng đối kháng rất cao

Hiệu suất đối kháng từ 61% đến 75%: có khả năng đối kháng cao

Hiệu suất đối kháng từ 51% đến 60%: có khả năng đối kháng trung bình

Hiệu suất đối kháng < 50%: có khả năng đối kháng thấp

2.5 Xử lí số liệu

Các số liệu của các nghiệm thức được phân tích ANOVA, trắc nghiệm phânhạng Ducan sử dụng phần mềm SAS 9.1

._—_ Chương 3

KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kiếm tra đặc điểm hình thái va kha năng gây bệnh của mẫu nấm được cung

cấp trên củ khoai tây

3.1.1 Kiểm tra đặc điểm hình thái của mẫu nắm được cung cấp

Qua quan sát trên vật kính 40X thấy được sợi nam có cấu tạo đơn bao, hình vòihút, hình trụ và hình cầu Cành bào tử không màu, phân nhiều nhánh so le với nhau,trên mỗi nhánh có nhiều vết lồi lõm, bào tử hình trứng hoặc hình quả chanh có númnhỏ ở phía đỉnh Hình thái quan sát cũng giống với Anton de Bary miêu tả

Hình 3.1 Tang nam Phytophthora infestans trên dia PDA, sợi nam và bao tử nắm xem ở

vật kính 40X

3.1.2 Kiểm chứng tác nhân gây bệnh sương mai

Việc kiểm chứng tác nhân gây bệnh được tiến hảnh theo phương pháp lây bệnhnam nhân tạo theo Burgess va ctv (2008) Lay bệnh trực tiếp lên mô ký chủ bằng cáchcắt miếng thạch chứa tản sợi nắm và đặt lên các mẫu củ được thu từ cây khoai tây sạchbệnh, đặt vào hộp nhựa kín, bên dưới lót một lớp giấy giữ 4m dé mẫu vào tủ định ôn ở

20°C Theo dõi và so sánh triệu chứng trên củ được chủng sau 5 ngày va củ bệnh ban

Hình 3.2 Lây bệnh trên củ ngày đầu và 6 ngày sau và hình sơi nắm được lấy từ củ chủng

bệnh quan sát trên vật kính 40X

Sau khi lây bệnh trên củ 6 ngày thì quan sát thấy một lớp nắm trắng và cành bảo tử

phân sinh cũng như bào tử phân sinh trên bề mặt của củ và các mô bệnh có màu nâu xám

lan rộng vào phía trong giống với miêu tả của Vũ Triệu Man và Lê Lương Té, 2001

3.2 Thu thập, phân lập và nghiên cứu một số vi sinh vật đối kháng Phytophthora

infestan gầy bệnh sương mai trên khoai tây

3.2.1 Phân lập vi sinh vật trong đất

Bảng 3.1 Vi sinh vật được thu thập từ mẫu đất các ruộng tại: Đơn Dương, Đức Trọng

Thành phố Đà Lạt, Lam Trung tâm Rau hoa và 4

Dong khoai tay

Thanh My 6

Don Duong, Lâm Đồng Da Ron 3