2.1 Nội dung nghiên cứu
Phân lập và định danh các vi sinh vật đối kháng với tác nhân gây bệnh sương
mai trên khoai tây.
Đánh giá tính đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập đối với tác nhân gây bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 05 năm 2022 đến tháng 11 năm 2022.
Thí nghiệm được tiễn hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa
Nông học, Đại học Nông Lâm TP. HCM.
2.3 Vật liệu thí nghiệm
Mau nam phytophthora infestan được cung cấp từ Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam - viện Bảo vệ Thực vật và mẫu đất vùng bị bệnh sương mai trên khoai tây tại tỉnh Lâm Đồng.
Các trang thiết bị gồm: cân điện tử, bếp điện, kính hiển vi, đèn cồn, máy ảnh, dụng cụ cấy, đĩa petri, que cấy, nồi hấp khử trùng, máy lắc, tủ cấy, tủ sấy, lò vi sóng.
Môi trường PSM: thành phan 1 lít cà rốt 20g, khoai tây 20g, agar 15g, pimaricin
10Hg/ml, rifampicin 20ug/ml, hymexazol 0,341/mI.
Môi trường WA: 20 g Agar và 1000 ml nước cat.
Môi trường PGA (PDA) -Potato Glucose Agar: Rửa sạch 200g khoai tây (không
gọt vỏ). Cắt khoai tây thành từng miếng nhỏ và luộc trong khoảng 1 giờ, sau đó lọc khoai tây và nước luộc bằng rây (hoặc vải mản) rồi vức bỏ phần bả đi. Hòa tan 20g
đường dextrose (glucose) và 20g Agar vào 1000 ml nước với nước lọc khoai tây.
Môi trường LB -Luria Broth: thành phan 1 lit peptone 10g, cao nam men 5g,
NaCl 10g, agar 20g, nước | lít, pH 7,0.
Môi trường KBA (King’B Agar): Thanh phan: Peptone 20g, Glycerol 10g, K2HPO4 khan 1,5g, MgSO4.7H2O 1,5g, Agar 15g, nước cất 1000 ml. Tron chung tat cả các thành phần ngoại trừ MgSO4. Điều chỉnh pH đến 7,2. Từ từ thêm MgSO4 va lắp đều. Hap khử trùng 121°C trong 25 phút.
Môi trường đặc hiệu: môi trường TZC-agar (TZCA): thành phan 1 lít Peptone 10g, Casein hydrolysate 1g, Glucose5g, TZC: 0,05 agar 20g, nước 1 lít. Hap khử trùng
121°C trong 20 phút.
Cén 70%, cồn 90%, KOH 3%, dung dich Crystal Violet, dung dịch lugol, dung
dich Safranin (Nam Khoa, Viét Nam), dung dich luc Malachite 5% ( Shanghai
Zhanyun, Trung Quốc), H2O2 (được phẩm OPC, Việt Nam). NaOH 40% Dextrose,
Malt extract, Peptone, Glycerol, K2HPO4 khan, MgSO4.7H20, MgSO4 1,2%,
tetramethyl - p - phenylenediamine dihydrochloride 1% ( GHTECH, Trung Quốc), bột
agar ( Long Hải, Việt Nam), Hymexazol 200 l/l, Benlat 0,01 g/l, Rifampicin 0,02 g/l.
2.4 Phuong phap thi nghiém
2.4.1 Kiểm tra đặc điểm hình thái của nắm Phytophthora infestans
Việc định danh tác nhân gây bệnh sương mai được thực hiện theo Erwin và
Ribeiro (1996) với phương pháp cô điển dựa trên đặc trưng về hình thái, cấu trúc các cơ quan bảo tử và túi sinh bào tử, đặc điểm sợi nắm trên môi trường nuôi cấy phù hợp.
Sợi nắm Phytophthora infestans có cấu tạo đơn bao, hình vòi hút, hình trụ hoặc hình cầu trong quá trình ký sinh trong tế bào. Cành bảo tử không màu, phân nhiều nhánh so le với nhau, trên mỗi nhánh có nhiều vết lồi lõm, đây là đặc điểm riêng biệt của cành bào tử nam Phytophthora infestans so với loài nam khác.
Bao tử phân sinh hình trứng hoặc hình quả chanh có núm nhỏ ở phía đỉnh bào tử. Kích thước trung bình của bảo tử phân sinh là 22 - 32 x 16 - 24 im.
2.4.2 Kiểm tra khả năng gây bệnh của mẫu nam đc cung cấp trên củ khoai tây Việc kiểm chứng tác nhân gây bệnh được tiến hành theo phương pháp lây bệnh nam nhân tao (Burgess và ctv, 2008). Trồng cây và lây bệnh trực tiếp lên mô cây ký
chủ bằng cách cắt miếng thạch chứa tản sợi nắm và đặt lên các bộ phận khác nhau của
cây như lá hoặc trái. Mẫu lá được thu từ cây khoai tây sạch bệnh, đặt vào hộp nhựa
kín, bên dưới lót một lớp giấy giữ 4m dé mẫu vào tủ định ôn ở 20°C. Theo đối và so sánh triệu chứng trên cây được chủng sau 3 ngày và cây bệnh ban đầu.
2.4.3 Thu thập, phân lập và định danh mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất 2.4.3.1 Thu thập mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất
Hình 2.1 Mẫu đất thu tại xã Ninh Gia, huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng
Mẫu đất được thu thập trên những ruộng có triệu chứng bệnh sương mai hoặc
sạch bệnh.
Thu thập từ 3 ruộng tại nhiều vị trí khác nhau, thu đất ngay tại khu vực có cây bị bệnh, bán kính 20 cm xung quanh cây bệnh. Sau đó, trộn lẫn vào nhau và lay mẫu đại điện. Mỗi mẫu đất lay khoảng 200 g, cách gốc 50 cm và chiều sâu từ 0 - 10 cm.
Tổng số mẫu thu là 6 mẫu ở 2 huyện Đương Dương, Đức trọng và Thành Phố Đà Lạt. Trên mỗi ruộng thu thập ở nhiều vị trí khác nhau.
2.4.3.2 Phân lập mẫu vi khuẩn đối kháng trong đất
Cho mẫu đất (10 g) lay ở xung quanh vùng rễ cây bị bệnh được loại bỏ rác, nghiền nhỏ trong cối chảy sứ vô trùng, b6 xung 90 ml nước cất vô trùng và chuyên sang bình nón, lắc trên máy lắc 200 vòng/phút trong vòng 20 phút. Lay 1 ml dung dịch chyén sang ống nghiệm có 9 ml nước muối sinh lí vô trùng và tiếp tục pha loãng tới
103, 10, 10°. Từ các ống nghiệm có độ pha loãng khác nhau (103, 102, 105), cấy trải 100 wl trên môi trường KBA. Sau 1 - 2 ngày quan sát sự phát triển của các khuẩn lạc (Nguyễn Thị Kim Cúc va ctv, 2014).
Quy ước đặt tên khuẩn được mã hóa theo: tên ruộng cây trồng, địa điểm thu
mẫu, ví dụ: ruộng khoai tây, Lâm Đồng: KTLĐ.
Bang 2.1 Quy ước đặt tên vi sinh vật phan lập trong đất
Địa điểm thu mẫu Vườn Tên khuẩn
Liên Nghia 1 KTLD 01**
Duc Trong, Lam Dong Lién Nghia 2 KTLD 02**
Ninh Gia KTLD 05**
Thanh phé Da Lat Trung tam rau hoa va
khoai tây KTLD 06**
Thạnh Mỹ KTLĐ 03**
Đơn Dương Đạ Ròn KTLĐ 04**
2.4.3.3 Định danh vi khuẩn đối kháng trong đất
Tiến hành phương pháp định danh vi khuẩn theo Bergey (Jonh và Ctv, 1994) Xác định gram bằng dung dịch KOH 3%
Nguyên tắc: dựa vào khả năng tạo nhay (kéo soi) giữ sinh khối của vi khuẩn với dung dịch KOH 3%. Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng, vách tế bào của vi khuẩn gram âm sẽ bị phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhay, vi khuẩn gram
dương không có kéo sợi.
Cách thực hiện: dùng que cay thu sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường KBA trải lên giọt dung dich KOH 3% trên lam kính sạch (sinh khối càng nhiều càng quan sát rõ). Ghi nhận khả năng kéo sợi của vi khuẩn.
Nhuộm gram
Tạo vết bôi vi khuẩn (0,5 em x 0,5 em) lên lam kính sạch, để khô trong không khí, sau đó cố định mẫu bằng cách hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn.
Nhỏ crystal violet phủ đều trên bề mặt vết nhuộm trong vòng 1 phút.
Rửa nhanh với nước.
Nhuộm lugol trong | phút.
Rửa nhanh với nước.
Dé nghiêng trên tiêu bản, nhỏ từ từ alcohol lên vết nhuộm, khi giọt alcohol rời
khỏi lam không còn màu tím thì ngừng lại.
Rửa nhanh với nước.
Nhuộm Safranin trong 1 phút.
Rửa nhanh với nước, sau đó thấm khô.
Nhỏ giọt dầu rồi soi kính 100X.
Nếu vi khuẩn bắt màu tím xanh: Gram (+). Vi khuẩn bắt màu hồng đỏ: Gram (-—).
Nhuộm bào tử
Nguyên tắc: không phải mọi vi khuân đều có nội bào tử. Nội bao tử được tạo ra nhằm giúp vi khuẩn chống chịu tốt hơn trước những tác động bat lợi của môi trường bên ngoài. Nội bào tử khó bắt màu hơn tế bào sinh dưỡng. Dé bào tử có thé bắt màu xanh của hỗn hop malachite ta cần hoạt hóa nó bằng nhiệt độ cao, sau khi bắt màu rồi thì lại rất khó bị tây màu, trong khi đó tế bào sinh dưỡng bị tây màu nhanh chóng. Bảo tử khó bị bắt màu hơn tế bào sinh dưỡng. Nhưng khi đã bắt màu rồi thì màu sẽ bám rất chặt và khó bị trôi đi. Khi dùng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh như thuốc lục malachite với tiêu ban có đun nóng, thuốc nhuộm xâm nhập vào nội bào tử và làm chúng nhuộm màu xanh. Khi rửa vết bôi bang nước các tế bào sinh dưỡng sẽ bị mat mau còn bào tử vẫn giữ lại màu xanh. Khi nhuộm bổ sung bằng đỏ safranin sẽ làm tế bao sinh dưỡng bắt màu đỏ hồng.
Cách thực hiện: sử dụng phương pháp Schaefera và Fulton cải tiến theo các bước. Dùng que cấy thu mẫu vi khuân từ môi trường LB dàn đều lên giọt nước trên lam kính sạch, có định tiêu bản vi khuẩn bằng ngọn lửa đèn cồn. Đặt tiêu bản lên trên
giá đỡ, giá đỡ đặt trên cốc thủy tinh có chứa một ít nước đang đun nóng (85°C-90°C) trên bếp. Đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi. Nhỏ 2 -3 giọt dung dịch lục Malachite 5% lên vết bôi và tiến hành hơ trên nước nóng từ 5 - 10 phút. Nếu thấy thuốc nhuộm trên giấy bị khô thì phải bổ sung. Rửa vết bôi bằng nước cất trong 30 giây. Sau đó đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi, nhỏ 2 - 3 giọt safranin trong 1 phút. Rửa lam kính với nước cất và dé khô. Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi với thấu kính 100X.
Đánh giá kết quả: mau vi khuẩn có màu xanh, vi khuẩn có cau tạo bào tử. Mẫu
vi khuân có màu đỏ hong, vi khuân không có câu tạo bào tử.
Phản ứng oxidase
Nguyên tắc: các loại enzyme hiếu khí tuyệt đối có enzyme oxidase. Thành viên quan trọng nhất của hệ thống này là cytochrome oxidase trong chuỗi chuyền điện tử của hô hấp hiếu khí với O> là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay ky khí tùy ý. Enzyme này phản ứng với tetramethyl - p - phenylenediamine dihydrochloride được tâm trong đĩa giấy làm đĩa giấy chuyển sang
mau xanh tim.
Cách thực hiện: tam giấy lọc với thuốc thử tetramethyl - p - phenylenediamine dihydrochloride 1%. Sau đó cấy vi khuẩn lên miếng giấy lọc đã tâm thuốc. Quan sát kết quả trong 10 giây đầu tiên.
Đánh giá kết quả: nếu vi khuẩn có màu xanh tím thì phản ứng dương tinh, ngược lại vi khuẩn không đổi màu thì phản ứng âm tính.
Khao sát hoạt tinh catalase
Nguyên tac: phần lớn các vi sinh vật hiếu khí va ki khí tùy ý chứa chuỗi điện tích có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tốn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy. Các vi sinh vật này có khả năng biến đổi năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tích cuối cùng trong chuỗi điện từ tạo HaOa. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O
và giải phóng O¿, gây hiện tượng sui bọt khí.
Cách thực hiện: nhỏ vài giọt H2O2 lên vi khuẩn phân lập. Quan sát và ghi nhận
hiện tượng sui bot.
Đánh giá kết quả: v1 khuẩn có enzyme catalase xuất hiện hiện tượng sui bot.
Khả năng thủy phan tinh bột
Nguyên tắc: dựa vào phản ứng màu giữa lugol và tinh bột. Lugol tác động lên tinh bột sẽ thấy suất hiện màu tím. Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có chứa tinh bột, vi khuẩn sản sinh ra enzyme amylase làm phân giải tinh bột trong môi trường, dẫn đến hiện tượng khi ta nhỏ lugol vào môi trường, vùng môi trường xung quanh
khuân lạc sẽ không thây màu tím xuât hiện.
Cách thực hiện: dùng que cấy vô trùng cấy điểm vi khuẩn lên môi trường thạch pepton có chứa 0,2% tinh bột. Nuôi cấy ở 37°C tối thiểu 3 - 4 ngày. Nhỏ dung dich lugol lên trên vi khuẩn, quan sát sự xuất hiện mau.
Đánh giá kết quả: không thấy xuất hiện màu xung quanh vi khuẩn, ghi kết qua phan ứng dương tinh. Có xuất hiện mau tím xung quanh vi khuẩn, ghi kết quả phản
ứng âm tính.
Khả năng phát triển của vi khuẩn trong điều kiện ky khí
Cách thực hiện: cay đâm sâu vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường PGA đã được chuẩn bị trước, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 - 4 ngày. Quan sát sự phát triển của vi khuẩn và ghi nhận kết quả.
Đánh giá kết quả: nếu vi khuẩn phát triển lan ra khỏi đường cấy, không phat triển trên bề mặt môi trường thì đó là vi khuẩn ki khí. Ngược lại, nếu vi khuẩn chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, không phát triển lan ra khỏi đường cấy thì đó là vi khuẩn hiểu khí.
2.4.4 Khảo sát khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập đối với nam
Phytophthora infestans
2.4.4.1 Phuong pháp bo tri thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với mỗi dòng vi khuẩn phân lập được là một nghiệm thức và một NT đối chứng, 5 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL là
1 dia petri.
2.4.4.2 Cách tiến hành
Thực hiện thí nghiệm theo phương pháp cấy kép (Ferreira và ctv, 1991). Sử dụng que cấy ria, cấy vi khuẩn thành 2 đường thắng song song và cách vị trí đặt thạch nam 2,5 cm vào đĩa petri có sẵn PDA. Sau đó, tiến hành cấy thạch nắm (đường kính 5 mm)
đã được nuôi trong 7 ngày vào tâm đĩa petri.
Vi khuẩn đối kháng
Hình 2.2 Bồ trí vi khuan đối kháng với nam trên dia petri Phương pháp do bán kính tản nam
Do bán kính trung bình theo công thức: r = (r1+12)/2.
Trong đó:
r: bán kính trung bình của tản nam.
rl, r2: bán kính đo từ tâm đến phần tản nắm phân bồ theo hướng vi khuẩn.
Chỉ tiêu theo dõi
Do bán kính tản nấm và tính hiệu suất đối kháng (HSDK) theo công thức của
Moayedi và ctv (2009) sau 24, 48, 72, 96 giờ.
Theo công thức: AE(%) = —* 100.
AE: hiệu suất đối kháng (%).
C: bán kính tản nắm tương ứng ở nghiệm thức đối chứng (mm).
T: bán kính tan nắm tương ứng ở nghiệm thức có chủng vi khuẩn đối kháng (mm).
Đánh giá hiệu suất đối kháng: theo thang đánh giá của Soytong (1988).
Hiệu suất đối kháng > 75% : có khả năng đối kháng rất cao.
Hiệu suất đối kháng từ 61% đến 75%: có khả năng đối kháng cao.
Hiệu suất đối kháng từ 51% đến 60%: có khả năng đối kháng trung bình.
Hiệu suất đối kháng < 50%: có khả năng đối kháng thấp.
2.5 Xử lí số liệu
Các số liệu của các nghiệm thức được phân tích ANOVA, trắc nghiệm phân hạng Ducan sử dụng phần mềm SAS 9.1.
._—_ Chương 3