Chương 2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1 Thu thập, phân lập và định danh mẫu nam Phytophthora inƒestans
2.4.1.4 Kiểm tra tính gây bệnh của mẫu nắm được cung cấp trên cà chua
Phương pháp lây bệnh nam nhân tao theo Burgess va ctv (2008). Trồng cây và lây bệnh trực tiếp lên mô cây ký chủ bằng cách cắt miếng thạch chứa tản sợi nắm và đặt lên các bộ phận khác nhau của cây như lá hoặc trái. Mẫu lá được thu từ cây cà chua sạch bệnh, đặt vào hộp nhựa kín, bên dưới lót một lớp giấy giữ 4m dé mẫu vào tủ định ôn ở
20°C . Theo dõi và so sánh triệu chứng trên cây được chủng sau 5 ngày với các triệu
chứng điển hình trên lá với các vết bệnh hình dạng không đều, màu nâu và xanh nhạt vết bệnh không có giới hạn rõ rệt (Stevenson, 1993). Bệnh thường xuất hiện ở mép lá, cuống lá sau đó lan rộng vào phiến lá tạo thành những đám mô bị thối
nâu, khi âm ướt mặt đưới lá chỗ có vết bệnh xuất hiện lớp nam trang xốp như sương muối (Drenth, Janssen và Govers ,1995).
21
2.4.2. Thu thập, phân lập và định danh mẫu vi khuẩn có ích trong đất 2.4.2.1 Thu thập mẫu vi khuẩn có ích trong dat
Mau dat được thu thập trên những ruộng có triệu chứng bệnh do nam
Phytophthora infestans.
Tổng số mẫu thu là 6 mẫu ở 2 huyện Duong Duong, Đức trọng và TP Đà Lat.
Trên mỗi ruộng thu thập ở nhiều vị trí khác nhau. Mỗi mẫu đất lấy khoảng 200 g, lấy trong khoảng 50cm cách gốc và chiều sâu từ 0 - 10cm.
Mẫu đất nên được giữ trong túi nilon và sử dụng búp chì để viết tên nhãn cho từng mẫu. Qui ước đặt tên mẫu: được mã hóa theo tên ruộng cây trồng và địa điểm thu thập. Vi dụ: mẫu đất thu thập tại ruộng cà chua ở Lâm Đồng (CC - LD).
Hình 2.4 Mẫu đất thu tại xã Thạnh Mỹ, huyện Đơn Dương, Tỉnh Lâm Đồng 2.4.2.2 Phân lập mẫu vi khuẩn có ích trong đất
Cho mau đất, rễ nhỏ (10g) lay ở xung quanh vùng rễ cây bị bệnh được loại bỏ rác, nghiền nhỏ trong cối chày sứ vô trùng, bồ xung 90 ml nước cat vô trùng và chuyển sang bình nón, lắc trên máy lắc 200 vòng/phút trong vòng 20 phút. Lay 1 ml dung dịch chuyền sang ống nghiệm có 9 ml nước muối sính lí vô trùng, và tiếp tục pha loãng tới 10° 3, 10- 4, 10- Š. Từ các ống nghiệm có độ pha loãng khác nhau (10° 3, 10° 4, 10° Ÿ), cấy trải 100 ul trên môi trường KBA. Sau 1 - 2 ngày quan sát sự phát triển của các khuẩn lạc (Nguyễn Thị Kim Cúc và ctv, 2014).
22
2.4.2.3 Định danh vi khuẩn đối kháng trong đất
Tiến hành phương pháp định danh vi khuân theo Bergey, 1957) Xác định gram bằng dung dịch KOH 3%
Nguyên tắc: dựa vào khả năng tạo nhay (kéo sợi) giữ sinh khối của vi khuẩn với dung dịch KOH 3%. Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng, vách tế bào của vi khuẩn gram âm sẽ bi phân hủy làm giải phóng DNA va tạo dịch nhay. vi khuan gram dương
không có kéo sợi.
Cách thực hiện: dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường
KBA trải lên giọt dung dịch KOH 3% trên lam kính sạch. Ghi nhận khả năng kéo sợi
của vi khuẩn.
Nhuộm gram
Nguyên tắc: dựa vào khả năng lưu trữ phẩm màu Crystal Violet trên thành tế bao vi khuẩn sau khi rửa bằng cồn. Vi khuẩn gram (+) có lớp vỏ tế bao day tạo peptidoglycan, nhờ đó mà màu tím của Crystal Violet được gắn chắc vào tế bào (nhờ iodine) nên không bị khử bởi cồn. Còn vi khuẩn gram (-) có lớp vỏ tế bào mỏng (do có ít peptidoglycan) nhưng lại có nồng độ lipid cao, khi rửa bằng cồn lớp chất béo này sẽ bị hòa tan kéo theo màu của thuốc nhuộm ban đầu, tế bao không màu lại bắt màu hồng
đỏ của thuôc nhuộm Safranin.
Cách thực hiện: dùng que cấy thu mẫu vi khuẩn từ môi trường KBA dàn đều lên giọt nước trên lam kính sạch, có định tiêu bản vi khuan bằng ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm mẫu bằng dung dịch tim tinh thé (Crystal Violet) trong 30 giây, rửa lại bằng nước, dé khô. Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugon dé cố định màu trong 30 giây và rửa sạch bằng nước. Tay bằng cồn 90° trong 30 giây sau đó rửa sạch. Nhuộm tiếp mẫu bang dung dich Safranin trong 30 giây, rửa lại bằng nước. Quan sát đưới kính hiển vi với thấu kính 40X
và 100X.
Đánh giá két quả: vi khuân gram âm có mau đỏ hong, vi khuân gram dương có mau tim.
23
Nhuộm bào tử
Nguyên tắc: bao tử khó bị bắt màu hơn tế bào sinh dưỡng. Nhưng khi đã bắt màu rồi thì màu sẽ bám rất chặt và khó bị trôi đi. Khi dùng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh như thuốc lục malachite với tiêu bản có đun nóng, thuốc nhuộm xâm nhập vào nội bào tử và làm chúng nhuộm màu lục. Khi rửa vết bôi bằng nước các tế bảo sinh dưỡng sẽ bị mat mau còn bào tử vẫn giữ lại màu lục. Khi nhuộm bồ sung bằng đỏ Safranin sẽ làm tế bao sinh đưỡng bat màu đỏ hồng.
Cách thực hiện: dùng que cấy thu mẫu vi khuẩn từ môi trường KBA dan đều lên giọt nước trên lam kính sạch, cô định tiêu bản vi khuẩn bằng ngọn lửa đèn cồn. Đặt tiêu bản lên trên giá đở, giáđở đặt trên cốc thủy tính có chứa một ít nước đang đun nóng (85°C - 90°C) trên bếp. Đặt miếng giấy lọc lên trên vét bôi. Nhỏ 2 - 3 giọt dung dich lục Malachite 5% lên vét bôi và tiền hành ho trên nước nóng từ 5 - 10 phút. Nếu thay thuốc nhuộm trên giấy bị khô thì phải bổ sung. Rửa vết bôi bằng nước cat trong 30 giây. Sau đó đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi, nhỏ 2 - 3 giọt Safranin trong 1 phút. Rửa lam kính với nước cat và dé khô. Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi với thay kính 100X.
Đánh giá kết quả: mẫu vi khuẩn có màu lục, vi khuẩn có cấu tạo bào tử. Mẫu vi khuẩn có màu đỏ hong, vi khuẩn không có cấu tạo bao tử.
Khả năng phát triển của vi khuẩn trong điều kiện ky khí
Cách thực hiện: cấy đâm sâu vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường PDA đã được chuẩn bị trước, ủ ở 28°C trong 3 - 4 ngày. Quan sát sự phát triển của vi khuẩn và ghi nhận kết quả.
Đánh giá kết quả: nếu vi khuẩn phát triển lan ra khỏi đường cấy, không phát triển trên bề mặt môi trường thì đó là vi khuẩn kị khí. Ngược lại, nếu vi khuẩn chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, không phát triển lan ra khỏi đường cấy thì đó là vi khuẩn hiếu khí.
Phản ứng oxidase
Nguyên tắc: các loại enzyme hiếu khí tuyệt đối có enzyme oxidase. Thành viên quan trọng nhất của hệ thống này là cytochrome oxidase trong chuỗi chuyền điện tử của hô hấp hiếu khí với O¿ là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiểu khí hay ky khí tùy ý. Enzyme này phan ứng với tetramethyl - p -
24
phenylenediamine dihydrochloride được tam trong đĩa giấy làm đĩa giấy chuyên sang
mau xanh tím.
Cách thực hiện: tâm giấy lọc với thuốc thử tetramethyl - p - phenylenediamine dihydrochloride 1%. Sau đó cấy vi khuẩn lên miếng giấy lọc đã tam thuốc. Quan sát kết quả trong 10 giây đầu tiên.
Đánh giá kết quả: nêu vi khuẩn có màu xanh tím thì phản ứng dương tính, ngược lại vi khuân không đổi màu thì phản ứng âm tính.
Khảo sát hoạt tính catalase
Nguyên tắc: phần lớn các vi sinh vật hiến khí và ki khí tùy ý chứa chuỗi điện tích có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tốn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy. Các vi sinh vat này có khả năng biến đổi năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tích cuối cùng trong chuỗi điện từ tạo HạO;. Catalase thủy phan hydrogen peroxide (HạO;) thành HạO và giải
phóng Os, gay hiện tượng sui bọt khí.
Cách thực hiện: nhỏ vài giọt HạO; lên vi khuẩn phân lập. Quan sát và ghi nhận
hiện tượng sủi bọt.
Đánh giá kết quả: vi khuẩn có enzyme catalase xuất hiện hiện tượng sủi bọt.
Kha năng thủy phan tinh bột
Nguyên tắc: dựa vào phản ứng màu giữa lugon và tỉnh bột. Lugol tác động lên tinh bột sẽ thấy suất hiện màu tím. Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có chứa tinh bột, vi khuẩn san sinh ra enzyme amylase làm phân giải tinh bột trong môi trường, dan đến hiện tượng khi ta nhỏ lugol vào môi trường, vùng môi trường xung quanh khuẩn lạc sẽ không thấy màu tím xuất hiện.
Cách thực hiện: dùng que cấy vô trùng cấy điểm vi khuẩn lên môi trường thạch pepton có chứa 0,2% tinh bột. Nuôi cay ở 37°C tối thiểu 3 - 4 ngày. Nhỏ dung dịch lugol lên trên vi khuẩn, quan sát sự xuất hiện màu.
Đánh giá kết quả: không thấy xuất hiện màu xung quanh vi khuẩn, ghi kết quả phản ứng dương tính. Có xuất hiện màu tím xung quanh vi khuẩn , ghi kết quả phan ứng
25
âm tính.
2.4.3 Khao sát kha năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập đối với nam 2.4.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với mỗi dòng vi khuẩn phân lập được là một nghiệm thức và một NT đối chứng, 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL
là một đĩa petri.
2.4.3.2 Cách tiến hành
Thực hiện thí nghiệm theo phương pháp cấy kép (Ferreira và ctv, 1991): Sử dụng que cấy ria, cay vi khuẩn thành 2 đường thang song song và cách vị trí đặt thạch 2,5 cm vào dia petri có san môi trường PDA. Sau đó, tiễn hành cấy thạch nam (đường kính 5
mm) đã được nuôi trong 7 ngày vào tâm dia petri.
Nam gây bệnh Vi khuẩn đối kháng
Hình 2.5 Bồ trí vi khuẩn đối kháng với nắm trên dia petri Phương pháp đo bán kính tản nắm
Do bán kính trung bình theo công thức: f = (ri+12)/ 2
Trong đó:
R: bán kính trung bình của tản nam
rl, r2: bán kính do từ tâm đến phan tan nam phân bố theo hướng vi khuẩn
Chỉ tiêu theo dõi
Do bán kính tản nam và tính hiệu suất đối kháng (HSĐK) theo công thức của
Moayedi và ctv (2009) sau 48, 72, 96 giờ.
Theo công thức: AE(%) = —* 100
26
Trong đó:
AE: hiệu suất đối kháng (%)
C: bán kính tan nắm tương ứng ở nghiệm thức đối chứng (mm)
T: bán kính tản nắm tương ứng ở nghiệm thức có chủng vi khuẩn đối kháng (mm) Đánh giá hiệu suất đối kháng: theo thang đánh giá của Soytong (1988)
Hiệu suất đối kháng > 75%: có khả năng đối kháng rất cao
Hiệu suất đối kháng từ 61% đến 75%: có khả năng đối kháng cao
Hiệu suất đối kháng từ 51% đến 60%: có khả năng đối kháng trung bình Hiệu suất đối kháng < 50%: có khả năng đối kháng thấp
27