Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Xây dựng quy trình vi nhân giống cây chuối già Cavendish dòng thân xanh (Musa acuminata)

Ở thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA đến sự hình thành chổi chuốiCavendish thân xanh in vitro cho thấy khi sử dụng môi trường MS có bồ sung nồng độ BA 5 mg

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO _

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH VI NHÂN GIÓNG

CAY CHUOI GIA CAVENDISH DONG THÂN XANH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUI TRÌNH VI NHÂN GIÓNG CAY CHUOI GIA CAVENDISH DONG THÂN XANH

(Musa acuminata)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS Đỗ Đăng Giáp Nguyễn Ngọc Diệu

TP Thú Đức, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm,thầy cô Khoa Khoa học sinh học và cố van học tập lớp DH19SHA đã giảng dạy, cungcấp kiến thức tạo điều kiện cho tôi có cơ hội học tap, nghiên cứu và tích lũy kiến thức,

kỹ năng dé hoàn thành khóa luận

Gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Đăng Giáp cho tôi cơ hội được thực tập và

nghiên cứu đề tài tại Viện sinh học Nhiệt đới Thầy luôn hướng dẫn tận tình, tạo điềukiện tốt nhất đề tôi hoàn thành khóa luận

Gửi lời cảm ơn đến tất cả anh chị phòng Công nghệ tế bào thực vật Viện sinh họcNhiệt đới đã giúp đỡ trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Cảm on tat cả bạn bè và gia đình luôn đồng hành va ủng hộ dé tôi nỗ lực hoànthành khóa luận.

XÁC NHẬN VÀ LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên: Nguyễn Ngọc Diệu, MSSV: 19126027, Lớp: DH19SHA chuyên ngành Công

nghệ sinh học, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tôi xin cam đoan: Đây làkhóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trongnghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoản toàn chịu trách nhiệmtrước Hội đồng về những cam kết này

Tp Hồ Chi Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2023

Người viet cam đoan

Nguyễn Ngọc Diệu

il

TÓM TẮT

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích hoàn thiện quy trình vi nhângiống cây chuối Cavendish thân xanh (Musa sp.), một giống chuối có kha năng khángnam bệnh ở Việt Nam, áp dụng quy mô sản xuất công nghiệp Ở thí nghiệm khảo sát

sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA đến sự hình thành chổi chuốiCavendish thân xanh in vitro cho thấy khi sử dụng môi trường MS có bồ sung nồng độ

BA 5 mg/L hiệu quả nhân chồi cao nhất 6,78 chồi/mẫu sau 4 tuần nuôi cấy Với thínghiệm khảo sát ảnh hưởng của adenine sulfate đến sự hình thành và phát triển củachỗồi chuối Cavendish thân xanh in vitro, môi trường thích hợp cho việc tao cytokininnội sinh là môi trường MS bé sung BA với nồng độ 5 mg/L và 100 mg/L adeninesulfate khả năng hình thành cụm chổi cao nhất sau 4 tuần nuôi cay 4,73 chéi/mau.Khảo sát điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng va quang di dưỡng đến quá trình hìnhthành cây con hoàn chỉnh chuối Cavendish thân xanh sau 20 ngày nuôi cấy, cho thaytrong điều kiện thoáng khí và bổ sung chất dinh dưỡng cho kết quả 3,85 rễ/mẫu, chiều

dài rễ 5,75 cm, trọng lượng tuoi 0,88 gram và hàm lượng chlorophyll 9,89 g/g làm

tăng khả năng quang hợp giúp bộ rễ khỏe và cây sinh trưởng, phát triển nhanh

Từ khóa: chuôi Cavendish than xanh, Musa acuminata.

1H

5 mg/L and 100 mg/L adenine sulfate had the highest ability to form shoot clusters after 4 weeks of culture 4,73 shoots/sample In investigated photoautotrophic and

photoheterotrophic culture conditions to the formation of complete green-stemmed

Cavendish banana seedlings after 20 days of culture, showing that under breathable and nutrient supplementation conditions 3,85 roots/sample, root length 5,75 cm, fresh weigh 0,88 g and chlorophyll 9,89 ug/g content increases photosynthesis ability to help healthy roots and fast growth, development of plants.

Keywords: green-stemmed Cavendish banana, Musa acuminata.

1V

MỤC LỤC

LOI CAM 090 - iXÁC NHIẬN VA LỚI CAN DOAN caceesoioeenuohgsekksidphbeuialgkiticgtgsesocbeieossg0g3cegge3e ii

¡0v (20M = Ô ÔÔỎÔỒỎ iii

i iv

MỤC LUC ose cesscssesssssessesseessesssesssssnssssssnsssessesssssssssnssinssnssinssessusesessussseesnssiessnssseeseesneesess vTRANH: SH CAG CHẾ VIET Tall nxemocussnmammaneunemmamumenmsmeuiasmacen viiiDANH SÁCH CAC BẢNG - 2 ©222222212212212211211211211211121111211211 11211 e6 ix

in lø la MET HO | ÔbengsessitoiginntgBLEDEDENGEBEDSHEGEIEOHSIGLSS.HESRGRGUHHUNGEEEEGDRODGDESGESTEHGIHGSSESSEHEIS.SIGISS0ES 32.1.2 Nguồn gốc và phân bỐ 2 2© 2+2+EE92E12EE921127127112112711211211221121111211 222 32.1.3 Các nghiên cứu chuối Musa sp kháng bệnh - 2 2 22222E+2z222z+zx+zzzzzxzex 52.2 Tổng quan về chuối Cavendish thân xanh 2 222 222z+2E2EE+2E22Ez2£Ezzzzzzzex 62.2.1 Đặc điểm hình thái 2-2 222 +S£SE+EE2EE2EE2125712212152122121111111111111111111 2111 xe 62.2.2 Giá trị dinh dưỡng 2: 2+ 222E+2E22E122E2212212112212211211271211211221121111 212 e6 6 Dis DBs OTN E UIT ie aes reac tcsaccsetie vate craton Sati ot So OnE Tate 72.3 Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy mô chuối trong và ngoài nước 8

2.301 ¢ NHöài HƯỚC secccosnesveyerose nese msvrremnnannamenuummnermrarr arr 8

2.3.2 TYONY NUGC 2.0 eccce eee ce ố ố 9

2.4 Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật -¿-2-52+22zz22z2 102.4.1 Khái niệm về kỹ thuật nuôi cay mô tế bào thực vật 2 2+s+czzzczserxee 102.4.2 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 2+ 2+s+2++Ez+E+zxzzzzxzrxcrx 11

P ÔN on nh 11

2.4.2.2 Ưu điểm kỹ thuật nuôi cấy m6 o.oo cccccccececesesssseesseeessesesseesseeesieesseesseesetess 112.4.2.3 Nhược điểm kỹ thuật nuôi cấy mô - 22 2¿©22+2EE+SEE+2EE22EE22E2222.zzzzee 122.4.2.4 Y nghĩa kỹ thuật nuôi cấy mô tế bao thực vật 2 2 2+2z22z22z22z2s+2 122.5 Các giai đoạn chính trong quá trình nuôi cấy mô 2- 2 2 2222z+2E+2zz222z+2 132.5.1 Giai đoạn chuẩn bị mẫu ¿- + 2S SE+E2E E1 12E1111215112111111111 11211 e 132.5.2 Giai đoạn tái sinh mẫu cấy -¿- 2: 22©222222E122E22E12212112212212211221 22.222 cxe 13

25:3: CHai:đoan:nhìniTÌD8TissssssessseossesscseatsedvsslBLB0ARURES2-g8S810338.1900.089800 GS1300400:958800300805 988 14 2.54, Gial dat a6 Gay HO ati! CHAD cosssssesesnnsisisse80016118090680005HEBE883630SEEG510NGHSSSID4Hg30g3588 14

2.5.5 Giai đoạn dwa cay fa VƯỜN WOM siceccseseceevseenacransenecrenareeaenennes 152.6 Nuôi cấy đỉnh sinh trung oo ccc ccceeceeececceecseceeseesseesseceeesueeseesessessesssseeessesseeesee 15

7 Chitdiễn hồn tri TrHỒNG ouseeneninutesoebdkoeoiodtorsdgkidiOeGisi6010101600301851004041830632 0084 15cai Lọc CÀI LÍ] cers since crete eon sos ere st aa eee oe ea tna wae I treme 15

D2 Cy OMNI sor ante aes eee een eee nee Rene eee EOE 16 2.7.3 Gibberellin 0n 17

2.724 Adenine sulfate va L-tyrOsine bia cesson rene mnsranenusen manne 18 2.8 Hién twong hOa mau 8 182.9 Nuôi cấy quang tự dưỡng va quang di duG1ng oo ees ecceecc ccs eccseeceeecseeseeeseesseeneees 19

291 Al HIGHT GUAT E TỪ di 02 sncanosnsacesocassannacnntsne voosasnevanns nenetesnasealdensanenneseesnoetes 192.9.2 Các yêu tố ảnh hưởng đến quang tự đưỡng -. 2 22©222222+2z+2zzzz+zxzrsz 192.9.3 Phương pháp nuôi cấy quang tự đưỡng 2-2 ©2222222E222E22E222122122222x2e2 202.9.4 Nuôi cấy quang dj dưỡng -22- 22 ©222S222E22EE2EE2EE2212231221221221122121 22 czev 20Chương 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 21

VI

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 22 22+222222222E222E222E2221222122212222222 e2 213.2 Vat LU 6n 0037 6 21

fe 21

3.2.2 Thiét bi y1 21

3.2.3 Điều kiện nuôi cấy -¿- 2 2+22222122E1221221222122112112112112112211211211211 2112 e6 21

3.3 Phuong phap nghién 000) 1 22

3.3.1 Nội dụng 1: Khao sát ảnh hưởng của benzyladenine lên kha nang nhân nhanhchồi của chuối già Cavendish thân xanh in VifO -5-52-52252S22E22E2£E2E2E£EzEtzzced 233.3.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của adenine sulfate lên khả năng nhân nhanhchỗồi của cây chuối già Cavendish thân xanh in vifro -22©22-52255222s2zcscsscss 233.3.3 Nội dung 3: Khảo sát điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng và quang dị dưỡngtrong giai đoạn hình thành cây con hoàn chỉnh của chuối gia Cavendish thân xanh 243,4, Ehương ps.) es 35Chương 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2-©222222222222E222E22222223222122222222-e2 274.1 Khảo sát ảnh hưởng của benzyladenine lên khả năng nhân nhanh chồi của chuối

Ði N@ 22/22/7000 0000000, 221 274.2 Khao sát ảnh hưởng của adenine sulfate lên khả năng nhân nhanh chồi của câychuối già Cavendish thân xanh in vifro 2-©22©2222222222EE22E22222232222221222222 xe 294.3 Khao sát điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng và quang di dưỡng trong giai đoạnhình thành cây con hoàn chỉnh của chuối già Cavendish thân xanh 32Chương 5 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, 2-2 s¿22222E22E22EE2E222x22E2Exerxre 365.1 Kết luận - ¿22 22222211211211211211211211211211212112112112112112121212121212112121 xe 365.2 Kiến nghị, - 2-22 222211211211211211211211211211211211111111211111111112111121 212 re 36TÀI LIEU THAM KHẢO 2-©22©2222E222E22EE22EE22EE22212221222122212112212221222ee 37PEL IG: ni nyyn asia di tpSgfhS'H05B7SIBSCSHSDRGRSONIGURSDSESI.GIObSSHEDRBDDIEEXGSINIGENEHEERPSYINGHỜNSIHB

vil

DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT

BA _ : 6-benzyladenine

BAP: 6-benzylaminopurine

IAA : Indole-3-acetic acid

IBA _ : Indole-3-butyric acid

MS_ : Môi trường Murashige va Skoog

NAA : z-napthaleneacetic acid

FAO : Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc

2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

2iP :2-Isopentyl adenin

vill

DANH SÁCH CÁC BANG

Bang 2.1 Bang giá trị dinh dưỡng quả chuối Cavendisjh -52-552©22-5525522552<: 7Bang 3.1 Bảng bồ trí nghiệm thức ảnh hưởng của BA 2 22©22225255z22zz>22 23Bang 3.2 Bảng bồ trí nghiệm thức ảnh hưởng của adenine sulfate - 24Bảng 3.3 Bảng bồ trí nghiệm thức so sánh điều kiện nuôi cấy - 25Bang 4.1 Ảnh hưởng của BA đến quá trình tạo chéi sau 3 tuần - 2-52: 27Bang 4.2 Ảnh hưởng của BA đến quá trình tạo chéi sau 4 tuần 2-52 28Bang 4.3 Ảnh hưởng của adenine sulfate đến quá trình hình thành chỗi sau 3 tuần 30Bang 4.4 Ảnh hưởng của adenine sulfate đến quá trình hình thành chồi sau 4 tuan 31Bảng 4.5 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình hình thành cây con hoànchỉnh sau 3 tuần nuôi cấy 2 2¿222+2E+2E122E22E12212211221221122122112112712212221 2e 33Bảng 4.6 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến số lượng khí không trên lá sau 3 tuầniBang 4.7 Hình ảnh cây con chuối Cavendish hoàn chỉnh sau 20 ngày nuôi cấy 34Bang 4.8 Hình ảnh tế bảo khí khổng dưới kính hiển vi 2-2525522555c2e2 35

1X

Hình 2.1.

Hình 2.2.

Hình 4.1.

Hình 4.2.

Hình 4.3.

Hình 4.4.

Hình 4.5.

Hình 4.6.

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Các bộ phận của cây chuối trưởng thành - 2 2 2222222E+2E2Ex+zzzzzzzzxz 3 Chuối Cavendish thân xanh - 2 2-52 S2+2SeSEESEEEEEEEEEErxerreerxrrrerrrrree 6 Hình ảnh chéi chuối Cavendish thân xanh sau 3 tuần nuôi cấy Zi

Hình anh chéi chuối Cavendish thân xanh sau 4 tuần nuôi cấy 29

Hình ảnh chéi chuối Cavendish sau 3 tuần nuôi cấy với các 32

Hình anh chéi chuối Cavendish sau 4 tuần nuôi cấy với các 32

Hình ảnh cây con chuối Cavendish hoàn chỉnh sau 20 ngày nuôi cấy 34 Hình anh tế bào khí không đưới kính hiển vi - 2-2 2222222222252 35

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Chuối là loài cây ăn quả được trồng phổ biến trên toàn thế giới Theo thống kêcủa Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO), chuối là nguồnlương thực chính cho phần lớn dân sé thế giới Xuất khâu chuối trên thé giới đạt sảnlượng cao nhất 20,2 triệu tấn trong năm 2019

Chuối Cavendish (tên gọi khác là chuối Philippine) ở Việt Nam thường gọi làgiống chuối già Nam Mỹ, là một giống chuối có giá trị thương mại cao Chính vì thếtrong những năm gần đây, loài chuối này đã được trồng nhiều vùng tại Việt Nam nhằmxuất khâu sang các thị trường nước ngoài như Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc Theo chia sẻcủa nông dân xã Phú Lâm, Tân Phú, Đồng Nai cho biết năng suất thu được mỗi hakhoảng 40 — 50 tấn trái Mỗi buồng chuối thu hoạch nặng 25 — 40 kg, bán với giáhiện nay trên 6,000 đồng/kg, cao điểm 15,000 đồng/kg, mỗi buồng thu trên 300 nghìn

đồng/buông Trung bình người nông dân sẽ thu lợi nhuận hàng chục triệu đồng một ha.

Tuy nhiên, những năm gần đây nam bệnh tan công trên chuối làm suy giảm năngsuất và chất lượng Phổ biến là bệnh đốm lá hay còn gọi là bệnh cháy lá do namPseudocercospora, bệnh phát triển mạnh những thang có thời tiết nóng âm, điều kiệnthời tiết nhiều mưa gió, nhiều sương mù, âm ướt Bệnh tấn công trực tiếp trên lá khiến

lá vàng, khô và rụng, làm giảm chức năng quang hợp Chính vì thế khiến cây sinhtrưởng, phát triển kém, trường hợp nặng cây có thé chết, nấm bệnh lây lan tan côngsang cây con và những cây xung quanh gây thiệt hại rất lớn cho người dân Đặc biệt,bệnh héo rũ Panama do nam Fusarium oxysporum sp cubense (Foc) khiến việc sảnxuất chuối trên toàn cầu đang bị đe dọa Vào giữa thế kỷ XX, nam bệnh này đã tancông dẫn đến việc xóa số ngành công nghiệp chuối ở Trung Mỹ và Caribbean Đếnnay, Foc đã phân chia thành 3 chủng trong đó Foc TR4 được xem là chủng chiếm ưuthế, khả năng sống sót và phân tán cao, lưu tồn trong đất, sống hoại sinh trong củchuối và các bộ phận khác, lây lan chuối con và đất có mang mầm bệnh Chủng nàytan công chủ yếu vào nhóm chuối Cavendish Sự xuất hiện của dịch TR4 tại các trangtrại Cavendish ở Trung Quốc (2004), Philippines (2008) và gần đây là Mozambique(2013) đã làm gia tăng mối lo ngại nghiêm trọng về tiềm năng hủy diệt của chúng ở

1

vùng nhiệt đới Tại Việt Nam, báo cáo khoa học do Trung tâm Tài nguyên Thực vật tại

Hà Nội và Vườn Bach thao Meise của Bỉ công bó tháng 2/2022 đã cảnh báo: Việt Nam

sẽ mat tới 71% diện tích đất trồng chuối trong vòng 25 năm tới do tác hại của loại namFusarium Steven Janssens, một trong những tác giả của báo cáo, nói rằng: “Chuối làmột trong những cây lương thực quan trọng nhất trên toàn thế giới Nếu loại nắmFusarium tiếp tục lây lan, tác động đối với nhân loại có thé khá lớn”

Vì vậy, việc nghiên cứu dé tạo ra giống mới với khả năng khang nam bệnh TR4đồng thời phải đủ chất lượng và số lượng là vấn đề cần thiết Kỹ thuật nhân giốngbằng nuôi cấy mô là một phương pháp nhân giống hiện đại đáp ứng nhu cầu tạo ra câysạch bệnh, khả năng kháng bệnh cao, rút ngắn thời gian sản xuất, tạo ra số lượng câylớn đồng đều có phẩm chất ưu tú, năng suất cao Ngoài ra, chuối nuôi cấy mô giúpnhân giống nhanh, điều khiển thời gian ra hoa và kết trái

Vì những lý do trên, đề tài: “Xây dựng quy trình vi nhân giống chuối giảCavendish dong thân xanh (Musa acuminatay’ đã được thực hiện góp phan tạo ragiống cây có khả năng kháng nam bệnh đảm bảo năng suất, chất lượng phục vụ chonhu cầu thực tiễn

1.2 Mục tiêu đề tài

Hoàn thiện được quy trình vi nhân giống cây chuối già Cavendish dé áp dụng vàosản xuất theo quy mô công nghiệp

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của benzyladenine lên khả năng nhân nhanhchéi của chuối già Cavendish thân xanh in vitro

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng cua adenine sulfate lên khả năng nhân nhanhchỗồi của chuối già Cavendish thân xanh in vitro

Nội dung 3: Khảo sát điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng và quang dị dưỡngtrong giai đoạn hình thành cây con hoàn chỉnh của chuối già Cavendish

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Téng quan về cây chuối

2.1.1 Tên khoa học

Phân loại khoa học

Giới (regnum) : Plantae

Chi (genus) : Musa

Loai : Musa acuminata

Z4» > ye |

#{/NA\5Iz173⁄

= ⁄ Fy hate Se) $

chính sự tái t6 hợp của hai loài này trong điều kiện tự nhiên và theo thời gian đã cho rađời nhiều giống chuối Trong số đó, phân nhóm Cavendish mang kiểu gen AAA vanhiều giống chuối thương mại đã được trồng rộng rãi ở nhiều quốc gia và khu vực.

Vakili và Simmond đã phân loại các giống chuối hiện nay dựa trên số lượngnhiễm sắc thể và đặc điểm hình thái, chia thành các nhóm kiểu gen theo 15 đặc điểmthực vật học.

Nhóm AA: giống chuối cau, chuối ngự, chuối Pisang Mas (Malaysia), LadiesFinger (Haiwai) Các giống này thường có một bất lợi là quả bé, vỏ mỏng, chatlượng cao nhưng năng suất thấp và mẫn cảm với Sigatoka (bệnh đốm lá trên chuối donam Mycosphaerella fijiensis gây ra)

Nhóm AAA: nhóm này bao gồm các giống chuối tiêu Pingsa Embun (Malaysia),Chinese (Hawai) và một số giống du nhập từ Dai Loan vào Việt Nam như nhóm chuốigià Musa chuyên xuất khẩu Thông qua thanh lọc dong, thử nghiệm so sánh giống, thửnghiệm khu vực và thử nghiệm sản xuất, các tính trạng và đặc điểm nông học, khảnăng kháng nam bệnh Fusarium Hầu hết các giống nhóm nay đều có năng suất cao,chất lượng tốt, có khả năng kháng bệnh Panama nên được trồng phổ biến ở nhiều quốcgia Đồng thoi, dé tiêu thụ và xuất khẩu

Nhóm AAB: gồm các giống chuối như chuối tây (Thái Lan), chuối bơm Những giống này có chứa nhiều tinh bột Đặc điểm là cây cao, sinh trưởng khỏe,không kén đất và đất trồng có thể ít tưới Trái thích hợp cho việc làm chuối sấy Ngoài

ra, thân non, hoa chuối ít vị chát có thé dùng ăn sông như chuối tây

Nhóm ABB: các giống chuối sứ được nhiều người Việt Nam ưa chuộng

Nhóm BB: đại diện nhóm này là chuối hột Cây sinh trưởng khỏe, chịu bóng,chịu hạn khá, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt, quả có nhiều hạt, nhiều tỉnh bột Phầnlớn dùng làm rau ăn sống và làm thuốc (Nguyễn Thị Việt Nga, 1996)

Một số giống chuối phô biến tại Việt Nam:

Chuối cau: là loại chuối được trồng nhiều ở miền Nam, miền Trung Chuối có

Chuối bơm là loại chuối được trồng nhiều ở Đông Nam Bộ Loại chuối này pháttriển nhanh, cứ khoảng 4 tháng là cho ra một buồng Quả chuối bom được sử dụng dé

ăn sông, làm chuối sấy Đặc biệt, loại chuối này có giá thành khá rẻ

Chuối tiêu có hai loại là chuối tiêu cao và chuối tiêu lùn Trái có hình đáng congnhư lưỡi liềm

Chuối hột: phần ruột có màu trắng có nhiều hột Được dùng chủ yếu để ngâm

rượu và ăn kèm với các loại rau khác.

Chuối tiêu hồng có màu sắc đẹp mắt và mùi vị thơm ngon, hiện nay đang đượcxuất khẩu rộng rãi tại Việt Nam

Chuối Laba là đặc sản của Đà Lạt (Lâm Đồng) Chuối này có mùi thơm, độ đẻo

2.1.3 Các nghiên cứu chuối Musa sp kháng bệnh

Năm 2009, Huang và ctv nghiên cứu gen kinase ( SERK ) giống như thụ thể phátsinh phôi soma của chuối, được chỉ định là MaSERKI phân lập từ Musa acuminata.Axit salicylic ngoại sinh (SA) hoặc tiêm chủng với FOC TR4 không có sự thay đổi sau

xử lý MaSERKI không chỉ có thé đóng vai trò là dau hiệu phân tử cho quá trình taophôi soma của chuối mà còn đóng vai trò trong phản ứng kháng bệnh ở chuối

Theo Wei Shaolong và ctv (2015), giống chuối lai tạo mới Guijiao 9 Canvendish

là đột biến của Musa AAA Cavendish Năm 2019, Sun và ctv đã tiến hành phân tíchRNA - Seq Guijiao 9 trên 16 mẫu sinh học được thu thập sau khi cấy Foc - TR4 6ngày Tái lập trình phiên mã dé đáp ứng với Foc - TR4 đã được phát hiện va phản ứngmạnh các gen cụ thê liên quan đến sự tương tác giữa mầm bệnh và tín hiệu bảo vệ thựcvật bao gồm MAPK, canxi, axit salicylic, con đường axit jasmonic và ethylene đãđược phân tích Các gen liên quan đến quá trình tổng hợp các chất chuyên hóa liênquan đến phòng thủ như protein NB - LRR, protein liên kết với calmodulin và gen sinhtổng hợp đã được điều chỉnh tăng đáng ké trong Guijiao 9 kháng Foe - TR4

Năm 2021, Trần Đức Trung và ctv xác định và mô tả họ gen kháng NBS - LRR ởchuối Musa acuminata nhầm chóng lại mầm bệnh cải thiện giống chuối

5

2.2 Tổng quan về chuối Cavendish thân xanh

2.2.1 Đặc điểm hình thái

Chuối gia Cavendish thân xanh là một giống chuối được đánh giá có kha năngkháng nắm bệnh thông qua chọn lọc tự nhiên Cây có tốc độ sinh trưởng nhanh Câykhông kén đất có thé trồng ở nhiều nơi khác nhau từ vùng đồng bằng ké cả đôi núi.Cây phát triển tốt nhất nơi có đất tơi xốp, nhiều mun, đặc biệt là đất phù sa và nơikhông bị ngập ung, dé tưới tiêu nước Cây có chiều cao tầm 3 — 4 m thấp hơn cácgiống Cavendish khác 5 — 6 m

Sau khi trồng 7 — 8 tháng chuối bắt đầu trổ buồng va 11 — 12 tháng bắt đầu thuhoạch Mỗi buồng có trên 10 nải và năng suất trung bình mỗi cây từ 30 — 40 kg/buồng

có thể lên đến 50 kg sau khi thu hoạch Vỏ quả nhan mịn, thịt quả ngọt có mùi thơm

đặc trưng Kích thước trái 15 — 22 cm và đường kính trên 3 em.

Hình 2.2 Chuối Cavendish thân xanh

2.2.2 Giá trị dinh dưỡng

Các thành phần dinh dưỡng trong một quả chuối trung bình 118 gram được théhiện qua bang 2.1:

Bang 2.1 Bang giá trị định dưỡng của chuối Cavendish

Thành phần dinh dưỡng Giá trị dinh dưỡng

Năng lượng 105 cal

2.2.3.1 Lam thức ăn dinh dưỡng

Chuối chứa nhiều dinh dưỡng cần thiết như protein, tinh bột, chất béo, vitamin Đặc biệt là pectin giúp cho sự tiêu hoá, hấp thụ tốt và chống nhiễm trùng đường ruột.Chuối cung cấp nhiều năng lượng (trên dưới 100 Calo trong 100 g thịt chuối chín) vìchứa nhiều bột đường Ngoài lượng carbohydrate phong phú, chuối còn giàupotassium, một chất khoáng cần thiết cho hoạt động nhịp nhàng của tim Nó còn chứanhiều vitamin C, B6 Bởi vì trong chuối có chứa 3 loại carotenoid khác nhau:provatamin A carotenoid, beta-carotenoid, alpha-carotenoid, nó có khả năng giúp cothé sản sinh ra vitamin A, một loại vitamin thường thiếu hụt trong bữa ăn của ngườidân vùng nhiệt đới Ngoài ra, vitamin E trong chuối còn giúp chống oxy hóa, rất có lợicho mắt Thêm vào đó, lutein là chất giúp giảm nguy cơ thoái hóa điểm vàng

Mặc dù chuối không chứa nhiều calcium, nhưng chúng lại có kha năng thúc dayhấp thụ calcium nhờ chất fructo-oligosaccharides Fructo-oligosaccharides lên mentrong đường ruột sẽ giúp cơ thé hap thụ tối đa lượng calcium từ thức ăn Lượng protein

và chất béo phù hợp giữ cho lượng đường trong máu luôn 6n định Hàm lượng chất xơcao duy trì sức khỏe hệ tiêu hóa.

100 calo, vượt xa các loại quả ngọt khác về năng lượng (100 g cam 43 calo, đu đủ chín

36 calo, nhãn 49 calo, vú sữa 43 calo ) Hàm lượng glucid cao trong chuối chín baogồm glucose (20%), fructose (1,5%) và saccharose (65%) Những loại đường tự nhiêncủa quả chín dễ tiêu hóa giúp cơ thể hấp thụ nhanh và cung cấp nhiều năng lượng.Chuối dé tiêu hóa và giá trị dinh dưỡng nhiều hơn cả khoai tây Chuối chứa hai hợpchất sinh ly quan trọng: serotinin và nore-pinephrin, cùng với dopamin va mộtcatecholamin chưa xác định Nhờ những hoạt chất này, chuối có những ứng dụng quantrọng trong y học Các hợp chat indol và tryptophan có trong bau của hoa chuối Theo

y học cô truyền, vị ngọt và tính lạnh của chuối có tác dụng tư âm, nhuận tràng, nhuận phé, thanh nhiệt và giải độc Nó có thê sử dụng dé điều trị tao bón, sốt nóng, mụn nhot,

tăng huyết áp, an thai, giảm đột quy, giảm stress,

Trong y học cô truyền, vỏ chuối còn được sử dụng như một loại dược thao déđiều trị các bệnh như bỏng, ho, loét, tiêu chảy và nhiều bệnh khác Chăng hạn, vỏchuối giúp làm lành vết thương do bỏng Hơn nữa, vỏ có thể sử dụng như một biệnpháp thay thé dé điều trị mụn cóc trên da bằng cách đắp mặt trong của vỏ

2.3 Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy mô chuối trong và ngoài nước

2.3.1 Ngoài nước

Năm 1883, Wilhelm Roux giải thích rằng các tế bao thực vật sau khi được nuôicấy in vitro có thé tái sinh thành một cây con hoàn chỉnh Kha năng này của tế baothực vật được gọi là tính toàn năng.

Năm 1902, Haberlandt thử nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm lần đầu tiên

nhưng không thành công Năm 1934, Kogl đã xác định được vai trò của hormone thực

vật đầu tiên IAA, thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự sinh trưởng và phânchia tê bào.

Năm 2014, Tran.T.H và ctv với nghiên cứu ảnh hưởng cua auxin va cytokinin

đối với quá trình phát sinh phôi soma từ nuôi cấy huyền phù tế bào của giống chuốiCau Mẫn Nồng độ 0,17 mg/L indole-3-acetic acid (IAA); 2,5 mg/L 6-benzyladenine(BA) và 1 mg/L zeatin mô phân sinh tăng sinh cao và được chuyên vào môi trườnglỏng dé tạo huyền phù tế bao

Vào năm 2017, các nhà nghiên cứu của Đại học Công nghệ Queensland đã pháttriển và trồng giống chuối Cavendish cải tiến có khả năng kháng lại loài nam nhiệt đớiTR4 (còn gọi là bệnh héo rũ Panama trên cây chuối)

Hasan và ctv, 2020 đã nghiên cứu xây dựng quy trình chuẩn cho tái sinh in vitromột số giống chuối chọn lọc (Musa sp.) từ An Độ như Grand Naine (G9), Monthan vàchuối Đỏ Sự phát sinh chi tốt nhất với 5 và 3 mg/L BAP đối với giống G9

Năm 2021, Arifa Khan va ctv nghiên cứu ảnh hưởng của 6-benzylaminopurine

và indole-3-acetic acid đối với sự tăng trưởng va phát triển rễ của mẫu chuối thínghiệm trong vi nhân giống đã báo cáo rằng giống lai Pisang cho trọng lượng tươi tối

đa (15,45 g) với số lượng rễ nhiều hon ở mức 5 mg/L BAP va 1 mg/L IAA

2.3.2 Trong nước

Năm 1997, trên cơ sở nghiên cứu của Phạm Thị Kim Thu và Đặng Thị Vân vềhoan thiện quy trình sản xuất cây giống chuối nuôi cấy mô, tác giả kết luận môi trườngnuôi cay là MS (1962) có bé sung 1 ppm Thiamin HCI đã làm tăng khả năng tái sinhchổi chuối, nền giá thé ra cây cho tỷ lệ sống cao nhất là 1/3 dat, 1/3 phân hữu co, 1/3cát đen và thời vụ ra cây thích hợp từ tháng 4 đến tháng 10 Ứng dụng kết quả này đãsản xuất được hàng triệu cây giống cung cấp cho các tỉnh phía Bắc (Nam Định, TháiBình ).

Năm 1998, Trần Thế Tục và ctv đã đưa ra tỷ lệ phân bón tính cho 1 gốc chuốitrong I chu kỳ là 100 — 200 gram đạm, 20 — 40 gram lân và 250 — 300 gram kali.

Năm 1999, theo Vũ Công Hậu thì lượng phân bón NPK thích hợp tính cho 1 gốcchuối vụ là 50 — 60 gram đạm, 30 — 40 gram lân và 70 — 80 gram kali

Nam 2009, Theo Vũ Ngoc Phượng vả ctv, một số giống cây trồng đã đượcnghiên cứu nuôi cay mô như: chuối tiêu (Cavendish sp.), giông Laba, giống già lùn(Dwarf Cavendish) và nhiều giống khác Kết quả cho thay môi trường MS (Murashine

& Skoog, 1962) bổ sung BAP 5 mg/L, IAA 0,5 mg/L, adenine hemisulfate 100 mg/L,nước dừa 20%, pH 5,8, sacarose 30 gr/L, agar 8 gr/L có số chồi cao nhất trong thí

9

nghiệm nhân chồi và sinh trưởng, phát triển trong điều kiện ánh sáng tự nhiên tốt hơnánh sáng đèn trong phòng thí nghiệm, cường độ ánh sáng tự nhiên thay đổi liên tụctrong ngày từ 500 — 7000 lux, cây chuối sẽ dé thích nghi hơn so với ánh sáng đèn.

Theo Nguyễn Văn Nghiêm và ctv (2010), tập đoàn giống chuối quốc gia hiện lưugiữ 120 mẫu giống, trong đó 74 mẫu giống trong nước và 46 mẫu giống nhập nội

Năm 2012, theo Đỗ Đăng Giáp và ctv với thí nghiệm quy trình nhân giống chuốiLaba đã chỉ ra rằng sau 4 tuần nuôi cấy, ở các nồng độ BA cảm ứng tạo chồi đượckhảo sát, môi trường MS bồ sung 5 mg/L BA cho hiệu quả tạo chéi cao nhất Cường

độ ánh sáng hiệu quả nhất cho giai đoạn nhân nhanh chỏi là 18,70 + 1,00 umol.m 2s]cho kết quả hình thành chồi cao nhất Sự kết hợp của BA nồng độ 5 mg/L với adeninsulfate 100 mg/L giúp làm tăng hiệu qua nhân chồi

Năm 2013, theo Tran Thanh Huong và Bùi Trang Việt khi chuối Cau man đượcnuôi cấy trong môi trường 2,4-D 1 mg/L và acid ascorbic 15 mg/L thì huyền phù tếbào chuối Cau mãn sẽ được tạo từ mô sẹo có nguồn gốc hoa đực non

Năm 2018, Tán Thị Nữ đã nghiên cứu quy trình sản xuất và trồng cây chuối đỏDacca nuôi cấy mô Cây chuối đỏ Dacca in vitro giai đoạn vườn ươm sinh trưởng tốtnhất khi được trồng trên đất phù sa Giá thé cát phù sa trộn trấu tỉ lệ 1:1, che sáng 50%

và tưới nước 1 lần/ngày, tiêu chuẩn giống xuất vườn (chiều cao trung bình 10,02 em,

trung bình 6,23 lá và chu vi thân gia trung bình 3,57 cm).

Năm 2023, theo Phạm Thị Lý và ctv với nghiên cứu đánh giá thử nghiệm và ứng

dụng bổ sung hỗn hợp amino acid cho môi trường nhân chéi chuối Tiêu hồng in vitrođưa ra kết luận sự ảnh hưởng của hỗn hợp adenine sunfate và L-tyrosin nồng độ 1 g/L

cho thay sự hình thành chồi đạt mức cao nhất 5 — 6 chéi /mẫu

2.4 Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.1 Khái niệm về kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô là kỹ thuật nuôi các mô hay cơ quan thực vật tách rời trong môitrường dinh dưỡng thích hợp bao gồm các khoáng chất, chất điều hòa sinh trưởng vàcác chất dinh dưỡng cần thiết Mô hay cơ quan thực vật được tách rời, xử lý vô trùngtrước khi được cấy vào môi trường dinh dưỡng sau đó đặt trong điều kiện có sự kiểmsoát chặt chẽ về ánh sáng, nhiệt độ và độ âm Trước hết, kỹ thuật này cho phép duy trì

sự sống thực vật và khả năng điều khiến sự sinh trưởng của mô thực vật tùy mục đích(tạo chồi, rễ, mô sẹo)

10

2.4.2 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.2.1 Tính toàn năng

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra giả thuyết rằng mỗi tế bảo của một

cơ thê sinh vật đa bào đều có khả năng phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theoquan điểm của sinh học hiện đại, mỗi tế bào riêng biệt đã phân hóa đều mang toàn bộthông tin đi truyền cần thiết cho cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tếbào đều có thé phát triển thành một cá thé hoan chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bao

Tính toàn năng mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp

nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho đến nay, các nhà khoa học đã chứng minh được khảnăng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bảo riêng rẽ

2.4.2.2 Ưu điểm kỹ thuật nuôi cấy mô

Việc sản xuất số lượng lớn cây giống và đồng nhất về mặt di truyền: trong hauhết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ mộtcây ban dau sau khi được nuôi cấy có thé tạo ra hàng triệu cây Đồng thời, tạo ra quầnthé có tính đồng nhất cao, dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp

Kiểm soát được các yêu tô gây bệnh cây trồng, nâng cao chất lượng và năng suấtcây trồng: cây được nuôi cấy đã được chọn lọc từ những cây khỏe, không chứa mầmbệnh như nam, vi khuẩn, virus nên tao ra cây con hoàn toàn sạch bệnh Vì thế, câygiống từ phương pháp nuôi cấy mô có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt, nâng caonăng suất cây trồng hơn 15 — 30 % so với phương pháp truyền thống

Tiết kiệm diện tích nhân giống: Hệ thống sản xuất chỉ cần một diện tích phòngthí nghiệm, mật độ cây sản xuất trên cùng một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều lần sovới sản xuất cây giống trên đồng ruộng hay trong nhà kính theo phương pháp truyềnthống Chính vì thế, phù hợp với mục đích thương mại Là công cụ để bảo tồn, pháttriển nguồn gen và nghiên cứu những đặc tính sinh lý thực vật

Chủ động trong việc lập kế hoạch sản xuất: Quy trình sản xuất có thể tiến hànhbat kỳ thời gian nào, không cần phụ thuộc vào mùa vụ hay các yếu tố môi trường bênngoai.

Lợi thé về mặt cạnh tranh: Cây con dam bảo về tiêu chuẩn giống va được san

xuất trong điều kiện vô trùng xác nhận là sạch bệnh Do vậy, đảm bảo an toàn, đáp

ứng các quy định về chất lượng cây giống

II

Tạo ra số lượng cây lớn trong thời gian ngắn nên giá thành cây giống thấp tạo sựcạnh tranh về giá cả và đáp ứng nhu cầu thị trường.

Lợi thế về di chuyển: cây con có kích thước nhỏ và được nuôi cấy trong bìnhthủy tinh hoặc túi nilong nên vận chuyền xa dé dang và thuận lợi

2.4.2.3 Nhược điểm kỹ thuật nuôi cấy mô

Bên cạnh những ưu điểm, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cũng cónhững hạn chế:

Chi phí đầu tư ban đầu cao: cần phải chuẩn bị đầy đủ các trang thiết bị hiện đại

(tủ cay vô trùng, nồi hấp ), hệ thống đèn cung cấp ánh sáng và các điều kiện nhiệt độ,

độ âm thích hợp dé mẫu cấy phát triển

Doi hỏi trình độ chuyên môn cao vì khi thao tác rất dé làm mẫu bị nhiễm Hạnchế tôi đa việc làm tổn thương mẫu vì làm mẫu hóa nâu và có thé hoại tử dan đến chết

Ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường: giai đoạn khử trùng mẫudùng thủy ngân tác động nghiêm trọng đến sức khỏe con người và môi trường Vì thế,ngày nay các nhà khoa học đã khuyến cáo thay thủy ngân bằng javen, chat kháng sinh,

nước khử ion hoặc nước từ trường.

2.4.2.4 Ý nghĩa kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Sự ra đời của kỹ thuật nhân giống in vitro đã mang lại ý nghĩa vô cùng to lớn Nó

đã chứng minh được tính toàn năng của tế bảo thực vật Kỹ thuật nhân giống in vitrogóp phan giải quyết các vấn dé lý luận và thực tiễn, đặc biệt trong lĩnh vực nghiên cứuquá trình phát sinh hình thái ở nhiều thực vật từ mức độ tế bào đến cấu trúc mô

Nhân giống in vitro được xem là một trong những giải pháp công nghệ mới có ý

nghĩa khoa học trong công nghệ sinh học Trong các môi trường nhân tạo, từ các mô

12

hay tế bào thực vật sẽ phân chia, biệt hoá và phát triển thành cây hoàn chỉnh Đây làmột kỹ thuật sinh học hiện đại và là một phương pháp nhân giống hữu hiệu nhất trongcác phương pháp nhân giống vô tính.

Công nghệ nhân giống cây cấy mô đã có những bước tiến vượt bậc trong việcnhân giống thành công rất nhiều loại cây trồng khó trồng, quý hiếm trở nên dé dang từhoa mau, cây nông nghiệp, cây công nghiệp, dược liệu, cho sản lượng lớn và chấtlượng cao Chính vì thế, ngày nay nhu cầu về cây giống in vitro ngày càng tăng Trongnhững năm gần đây, hàng năm thế giới sản xuất số lượng lớn cây giống nuôi cấy mô.Tại Việt Nam, chỉ riêng địa bàn tỉnh Lâm Đồng năm 2022 sản lượng cây giống nuôicấy mô đạt 74 triệu cây, trong đó xuất khâu khoảng 50 triệu cây giống với giá trị xuấtkhẩu đạt 12,7 triệu USD

2.5 Các giai đoạn chính trong quá trình nuôi cấy mô

2.5.1 Giai đoạn chuẩn bị mẫu

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các mẫu thực vật vô trùng như mảnh lá, đốtthân, đỉnh chồi, đỉnh rễ trong ống hoặc bình thí nghiệm Các cơ quan khác nhau củacây được lựa chọn làm mẫu cấy dựa trên: khả năng tái sinh của cơ quan, mục đích của

hệ thống nuôi cấy (tạo phôi sinh dưỡng, nhân đa chổi hoặc tạo callus, ) Độ tuổi mẫucàng nhỏ thì khả năng tái sinh càng cao.

Các yêu cầu cơ bản đối với cây mẹ: cây giống tốt, có các đặc tính sinh học phùhợp với yêu cầu nhân giống, có các tính trạng kiểu gen hoặc kiểu hình trội có ưu thế sovới những cây khác trong quan thé, hoan toàn sạch bệnh và khỏe mạnh Ngoài ra, khilựa chọn mô nuôi cấy can chú ý tuôi sinh lý của cây mô, những mô này phải ở thời kỳsinh trưởng mạnh của cây trong mùa sinh trưởng tăng khả năng tái sinh chồi(Anolesnon, 1980).

Tạo mẫu vô trùng cho các giai đoạn nuôi cấy in vitro nhằm loại bỏ hoàn toàn các

vi sinh vật tồn tại trên mẫu và môi trường xung quanh mẫu Các phương pháp khửtrùng phô biến bao gồm ngâm mẫu trong hóa chất (thường là ethanol 70%; các hợpchất có gốc -OCI; HaO›; HgCh, Javen, nước khử ion ) với nồng độ và thời gian thíchhop, sau đó rửa mẫu bằng nước cat vô trùng nhiều lần trước khi cấy lên môi trường đãkhử trùng.

2.5.2 Giai đoạn tái sinh mẫu cấy

13

Mục đích: giúp mẫu phục héi sau quá trình khử trùng bằng hóa chat, tái sinhchéi, hành hoặc giả hành từ mẫu đã khử trùng và tạo ra lượng mẫu đủ lớn cho giaiđoạn nhân nhanh, đa chồi hoặc sinh khối.

Phương thức thực hiện: mẫu được cấy vào môi trường cơ bản có khoáng, chấtđiều hòa sinh trưởng va các chất dinh dưỡng bổ sung Đặt bình nuôi cấy trong điềukiện ánh sáng, nhiệt độ và độ 4m phù hợp cho sự phát triển của chỗồi Giai đoạn nàycần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và phát triển tốt, tỷ lệ nhiễm bệnhthấp Giai đoạn này thường kéo đài trong 4 — 6 tuần lễ

2.5.3 Giai đoạn nhan nhanh

Hệ số nhân giống cao là một trong những ưu điểm lớn nhất của phương phápnhân giống in vitro so với các phương pháp nhân giống truyền thống Vì vậy, giai đoạnnhân nhanh được coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống

Ở giai đoạn này, mô nuôi cấy được kích thích dé tái sinh nhiều chồi nhằm cungcấp cho giai đoạn tiếp theo Điều này được thực hiên bằng cách cắt nhỏ các bộ phậnmới sinh ở giai đoạn 2 và cấy chúng vào môi trường mới Dé đạt hiệu quả tối đa cầnxác định được môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy phù hợp Các chất điềuhoà sinh trưởng như auxin, cytokinin, gibberellin và các chất phụ gia như nước dita,khoai tây đóng vai quan trọng Tuỳ vào đối tượng nuôi cấy mà người ta có thể nhânnhanh theo hướng kích thích sự phát triển của chồi nách hoặc kích thích sự hình thànhcụm chdi từ mô phân sinh đỉnh

Ngoài ra, cũng cần đảm bảo các yếu tố vật lý như độ ẩm, nhiệt độ và ánh sángphù hợp Trong giai đoạn này cần tăng cường chiếu sáng (16 giờ/ngày, cường độ ánhsáng tối thiểu 1000 lux, ánh sáng tím) là yếu tố quan trọng kích thích mô phân hoá

mạnh Bao đảm nhiệt độ 20 — 30°C.

Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra hệ số cao nhất nhưng không ảnh hưởng đếnsức sông và tính chất di truyền của cây

2.5.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Day là giai đoạn các chồi đã đạt kích thước nhất định và được chuyền từ môitrường ở giai đoạn 3 sang môi trường nuôi cay tạo rễ dé phát triển thanh cây hoànchỉnh Những chdi riêng lẻ này sẽ hình thành rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh sau

2 — 3 tuần Ở giai đoạn này môi trường cần giảm lượng cytokinin và tăng lượng auxin

dé rễ phát triển (Pierik, 1987) Hầu hết các loài cây trồng yêu cầu chất o-NAA, IBA,

14

IAA thường được sử dụng với nồng độ 1 — 5 mg/L dé tạo rễ Do hoạt động của lá và

rễ mới còn yếu, cây chưa chuyên sang giai đoạn tự dưỡng nên cây con rất nhạy cảmvới am độ và mam bệnh

Yêu cầu giai đoạn này tỉ lệ tạo rễ cao, cây khỏe đồng đều và có bộ rễ khỏe mạnh.2.5.5 Giai đoạn đưa cây ra vườn ươm

Mục đích: đây là giai đoạn giúp cây con thích nghi dan với điều kiện sinh trưởng

tự nhiên ngoài Ống nghiệm trước khi đem trồng bên ngoài Khi cây con đủ tiêu chuẩn

về chiều cao, số lá, bộ rễ khỏe thì có thé trồng Tuy nhiên, trong giai đoạn 2 — 3 tuầnđầu cần duy trì độ âm trên 50%, tránh ánh sáng quá mạnh có thể gây cháy lá, tránhnhiễm khuẩn và nam gây hiện tượng thối nhũn thân Nhà kính hoặc nhà lưới kiểmsoát: nhiệt độ, độ âm và ánh sáng Ngoài ra, điều kiện môi trường trong giai đoạn nàyrat quan trong dé bộ rễ phát triển, cây con cứng cáp Đây được xem là một công đoạnquan trọng quyết định khả năng ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô thực vậttrong thực tiễn sản xuất

2.6 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên, làmột phương pháp thuận lợi đề đạt được mục tiêu nuôi cấy mô tế bào thực Mẫu sau khiđược khử trùng được nuôi cấy trong môi trường phù hợp Các chéi đơn hoặc cụm chồiphát triển từ một đỉnh sinh trưởng sau thời gian nuôi cay Sau đó, các chồi tiếp tục phattriển tạo thành thân, lá, rễ và trở thành một cây hoản chỉnh Đây là một chu trình ngắnnhất và thuận tiện hơn các phương thức nhân giống thông thường khác

Trên thực tế, người ta thường nuôi cấy đỉnh chồi non với kích thước khoảng vài

mm Đó có thể là đỉnh chéi nách hoặc đỉnh chồi ngọn Mỗi đỉnh sinh trưởng nuôi cấytrong điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chỗồi và mỗi chéi sẽ phát triển thànhcây hoàn chỉnh Xét về nguồn gốc của cây:

- Cây phát triển từ chồi ngọn

- Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ

- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh như nuôi cấy đoạn trụ hạ điệp của cây mãngcầu (Annona squamosa) sẽ cho rất nhiều mam trên mô cấy và một số mam sau đó sẽphát triển thành chồi và sau đó sẽ thành cây in vitro hoàn chỉnh

2.7 Chất điều hòa sinh trưởng

2.7.1 Auxin

15

Chất điều hòa sinh trưởng (hay còn gọi là hormone) 1a yếu tố quan trọng quyếtđịnh kết quả nuôi cấy mô tế bào thực vật Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong điềukhiến sự phát sinh hình thái và tái sinh cây hoan chỉnh.

Auxin là một hormone thực vật có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của

tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính

hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo ra quả không hạt Auxin kích thích

sự sinh trưởng của tế bào Tuy nhiên, hiện tượng ức chế ngược sẽ xảy ra nêu kích thíchvới hàm lượng quá cao, lúc này auxin sẽ trở thành chất ức chế Auxin là những hợpchất có nhân indol, loại auxin tự nhiên đầu tiên được tìm thấy là B-indol-acetic acid(IAA) Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc day sinh trưởng của mau do hoạt hóa sựphân chia và dan nở của tế bảo, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chat,tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi (Bhojwani và Razdan, 1983) Các auxinđược sử dụng với nồng độ thấp từ 10° — 107M tùy theo từng chất, mục đích và đốitượng nghiên cứu Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, hàm lượng caokích thích hình thành mô sẹo Theo Hobbie (2007), nồng độ auxin trong té bao duocđiều khiển bởi tốc độ sinh tổng hop, trạng thái hoạt động va sự vận chuyén của auxin,trong khi khả năng dap ứng auxin của tế bào được xác định bởi hàm lượng và sự hoạtđộng của con đường truyền tín hiệu Sự hiện điện của các chất điều hòa tăng trưởngthực vật nội sinh, đặc biệt là auxin và cytokinin đóng vai trò cảm ứng sự hoạt hóa tếbao dé hình thành mô phân sinh rễ

Giai đoạn hoạt hóa tế bào cần auxin ở nồng độ cao, trong khi giai đoạn kéo dài rễcần auxin ở nồng độ thấp hơn (Bùi Trang Việt và ctv, 2009) Auxin kích thích tạo rễnhưng cản trở rễ phát triển nên việc xem xét nồng độ auxin thích hợp là một van déquan trọng Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin

tự nhiên, quan trọng nhất là IAA Nhung IAA chỉ được dùng trong một số môi trườngnuôi cây do có đặc tính không 6n định với nhiệt độ và ánh sáng Vi vay, các aminoacid kết hợp với IAA 6n định hơn được sử dung phổ biến hơn làm giảm bớt liên kếtkhi sử dụng IAA Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơntrong các môi trường nuôi cây như 2,4-D, IBA, NAA

2.7.2 Cytokinin

Nhóm cytokinin: kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tếbao, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như Khanh, 2009)

16

Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sửdụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sựhình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994) Trong các cytokinin tự nhiên cóhai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyladenine) Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và

không 6n định Các chất tong hợp tương tự như kinetin va BAP được sử dung phố biến

hơn Các chất hóa học không có base purine và thay thế bằng phenylureas, cũng được

sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật Trong cây có sự cânbằng nội hormone (Vũ Văn Vụ, 2007) Do vậy, khi sử dụng các chất điều tiết sinhtrưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý dé sử dụng nồng độ thích hợp đạt hiệu quảcao Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà cytokinin được sử dụng ở các nồng

độ khác nhau Ở nồng độ thấp 107 — 10° M có tác dụng kích thích sự phân bào, ởnồng độ 105 — 10° M kích thích sự phân hoá chồi Trong nuôi cấy mô dé kích thích

sự nhân nhanh thường sử dung cytokinin với nồng độ 105 — 10 M Nhiều tác gia đãtổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ;nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc day hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành

mô sẹo.

2.7.3 Gibberellin

Trong đời sống thực vật gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quátrình sinh lý như sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăngsinh trưởng chiều dài của thực vật Nhưng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật tácdụng của gibberellic acid chưa thật rõ ràng Nhiều tác giả có sử dụng và coi đó làthành phần không thể thiếu của một loại môi trường chuyên dụng nào đó Trong sốhơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 là chất được sử dụng nhiều hơn cả trongthực tiễn GA3 kích thích kéo đài chéi và nảy mầm của phôi vô tính Trong nhiềutrường hợp của gibberellin kích thích sự ra hoa rõ rệt Ảnh hưởng đặc trưng sự ra hoacủa gibberellin là kích thích sự sinh trưởng kéo dai va nhanh chóng của cụm hoa.Gibberellin kích thích cây ngày dài ra hoa trong điều kiện ngày ngắn (Lang, 1956).Gibberellin ảnh hưởng đến sự phân hóa giới tính của hoa, ức chế sự phát triển hoa cái

và kích thích sự phát triển hoa đực Gibberellin có tác dụng giống auxin là làm tăngkích thước của quả và tạo quả không hạt Hiệu quả này càng rõ rệt khi phối hợp tácdụng với auxin So với auxin va cytokinin, gibberellin hiém khi được dùng

17

2.7.4 Adenine sulfate và L-tyrosine

Adenine sulfate là tiền chất của cytokinin, thường được sử dung trong nuôi cay

in vitro các giỗng chuối Musa sp Adenine sulfate được sử dụng trong nuôi cay in vitro

như một chat bổ sung kích thích tăng trưởng tế bào, tỷ lệ phát sinh chồi Anh hưởngcủa adenine sulfate lên khả năng tạo chồi có thé do tính chat của cytokinin Khi có mặtadenine sulfate trong môi trường, các chéi đơn sử dung adenine sulfate làm tiền chat

dé tổng hợp ra cytokinin nội sinh Cytokinin nội sinh tác động lên khả năng hình thànhchéi của mẫu Gubbuk va Pekmezci (2004) cho rằng, nồng độ cytokinin ngoại sinhchính là yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh chồi trong nhân giống in vitro Tương tự,Shrivastava và Banerjee (2008) báo cáo rằng ảnh hưởng của adenine sulfate lên khảnăng hình thành chồi có thể do hiệu quả kết hợp với các cytokinin khác

L-tyrosine được xem là nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trườngnuôi cây tế bào thực vật, được sử dụng để kích thích hình thái trong nuôi cay té baonhưng chỉ nên được sử dung trong môi trường thạch Mặc dù tế bao có khả năng tonghợp tat cả các amino acid cần thiết nhưng sự bé sung các amino acid vào môi trườngnuôi cấy là dé kích thích sự tăng trưởng của tế bào

2.8 Hiện tượng hóa nau

Trong vi nhân giống, thường xuất hiện hiện tượng hóa nâu mẫu cấy hay hóa nâumôi trường, hậu quả là làm tổn thương mô thực vật và ngăn chặn quá trình hấp thụdinh đưỡng của cây Mẫu cấy sẽ trở thành màu nâu sam hoặc màu đen, nghiêm trọng

bị hoại tử và mẫu cấy sẽ chết Các nhà khoa học cho rằng sự sản sinh phenol trongsuốt quá trình nuôi cấy gây oxy hóa làm cho mẫu cấy và môi trường bị hóa nâu(BhoJwam và ctv, 2013) Tình trạng hóa nâu xảy ra tại vi trí mặt cắt ngay khi mẫuđược cắt va phenol được sản xuat liên tục trong suốt quá trình nuôi cấy Những phenolnày trở nên độc hại với mẫu cấy liên kết ngược bằng liên kết hydro với protein thôngqua quá trình oxy hóa tạo thành các quinon có hoạt tính cao Sau đó, các quinon nàyđược polymer hóa và oxy hóa protein dé hình thành các hợp chất melanic còn được gọi

là polyphenol có thể gây độc cho thực vật Các enzyme oxy hóa phenol có thể bị ảnhhưởng bởi nhiệt độ, ánh sáng kích thích làm tăng hoạt động của các enzyme dẫn đến tỷ

lệ hóa nâu tăng.

18

Một số yêu tố ảnh hưởng đến mức độ hóa nâu bao gồm kiểu gen, mẫu nuôi cấy,

độ tuổi của mô cấy (mô non hiện tượng hóa nâu sẽ ít hơn mô già) và môi trường nuôicấy (sự hóa nâu xuất hiện nhiều khi mẫu nuôi cấy trong môi trường lỏng)

Một số phương pháp đơn giản để bảo vệ các mẫu cấy khỏi sự hóa nâu là cấychuyên thường xuyên ở giai đoạn nuôi cấy ban đầu và hạn chế sự oxy hóa phenol bằngphương pháp nuôi cấy trong tối hoặc ở cường độ ánh sáng thấp (3 — 4 mol.m2.sÐ);giảm nồng độ muối trong môi trường Các khoáng kim loại trong môi trường nuôi cấynhư Mn?", Cu?" là các chất đồng dạng với các enzyme peroxidase và phenolase nên cóthé giảm hoặc loại bỏ sự kích thích của các enzyme oxy hóa phenol và ngăn ngừa hiệntượng hóa nâu mẫu cấy Ngoài ra, việc bồ sung các chất bô trợ như acid ascorbic,cystein-HCI hoặc acid citric (chất chống oxy hóa), poly-vinylpyrolidone (một loạipolyamide hấp thu phenol qua vòng hydrogen) và than hoạt tính ngăn cản sự hóa nâumẫu cấy Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấpthu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác

Các nhà khoa học còn đưa ra vài kỹ thuật khi thao tác trên mẫu cấy giúp hạn chế

sự hóa nâu như sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non, hạn chế gây vết thương trênmẫu khi khử trùng, ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric acid vải giờ trướckhi cấy

2.9 Nuôi cấy quang tự dưỡng và quang dị dưỡng

2.9.1 Khái niệm quang tự dưỡng

Vi nhân giống quang tự dưỡng là phương pháp nuối cấy mô dựa vào khả năngquang tự dưỡng của mô thực vật Trong phương pháp này cây sẽ hấp thu CO¿ trongkhông khí làm nguồn carbon cung cấp cho các quá trình chuyên hóa của cây, thôngqua quá trình quang hợp giống như một cây sống bình thường ngoài tự nhiên màkhông cần dùng đường và vitamin bổ sung vào môi trường nuôi cấy Điều này cũnglàm giảm được sự nhiễm khuẩn và nam ở mẫu nuôi cấy, cây sẽ tự quang hợp và hô hấptốt hơn, hệ thống rễ phát triển tốt hơn, cây sẽ hap thu muối khoáng và chất đinh dưỡng

dé dàng hơn Nâng cao tốc độ tăng trưởng và phát triển của cây in vitro Cải thiện chatlượng và giảm những bat thường về hình thái và sinh lý của cây Hạn chế tối da tỉ lệcây in vitro chết trong giai đoạn thuần hóa

2.9.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quang tự dưỡng

19