Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Xây dựng quy trình PCR cho việc phát hiện và định danh các loài vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh trên cây hoa hồng và rau cải

Các kết qua thu được trongnghiên cứu này hứa hẹn sự phát triển của các phương pháp phát hiện nhanh nhằm pháthiện bệnh do vi khuẩn này gây ra, đặc biệt là phát hiện tại hiện trường.. Trên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR CHO VIỆC PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH CÁC LOÀI VI KHUAN Erwinia sp GÂY BỆNH

TREN CAY HOA HONG VA RAU CAI

Ngành học Sinh viên thực hiện

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR CHO VIỆC PHÁT HIỆN VÀ

ĐỊNH DANH CÁC LOÀI VI KHUAN Erwinia sp GÂY BỆNH

TREN CAY HOA HONG VA RAU CAI

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiện

PGS TS NGUYÊN BẢO QUỐC NGUYEN THỊ TUYET CHI

TP Thu Đức, 03/2023

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường, quý thầy, cô KhoaKhoa học sinh học, trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã truyền đạtnhững kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Bảo Quốc,

người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức hữu ích, luôn quan tâm,động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh Nguyễn Mai Nghiệp, chị HuỳnhNguyễn Quỳnh Như, các anh chị và các bạn Phòng thí nghiệm Bệnh học và chan đoánphân tử đã tận tình hỗ trợ, chia sẽ kinh nghiệm, kiến thức và giúp đỡ em rất nhiều trong

suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp

Em cũng xin cảm ơn cố vấn học tập lớp DHI§SHA, cô PGS TS Tran Thị LệMinh, cùng các bạn lớp DH18SHA và những người bạn thân thiết Khóa 18 đã bên cạnh

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi xin cam đoan kết quả được trình bay trong khóa luận này là do tôi thực hiệntại Phòng thí nghiệm Bệnh học và chân đoán phân tử, Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh

học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phó Hồ Chí Minh

Họ và tên: Nguyễn Thị Tuyết Chi

TÓM TẮT

Erwinia caratovora là vi khuẩn có dang hình que gây bệnh thối nhiin trên nhiềuloại rau và cây cảnh Vi khuân gây bệnh này chủ yếu lây qua hạt giống, mầm bệnh tiềm

ân trong củ và cây trồng cho đến khi điều kiện môi trường thuận lợi cho sự phát triển

của bệnh Hiện nay, việc phát hiện các loài vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trênthực vật chủ yếu được tiến hành bằng cách sử dụng phương pháp chọn lọc, phương phápmiễn dịch và dựa trên PCR Mục đích của nghiên cứu này là xác định trình tự cụ thể dựatrên phân tích toàn bộ bộ gen để xây dựng thành công quy trình PCR nhằm phát hiệnErwinia carafovora và phân biệt mầm bệnh này với các loài vi khuẩn khác Primerchuyên biệt cho loài được thiết kế và đánh giá dựa trên nền tảng khuếch đại in-silicoPCR, sau đó được thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn phân lập được thu thập từ cácmẫu hoa hồng và rau cải tại Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh Kết quả cho thấy 13trong số 39 dòng vi khuẩn phân lập được cho sản phẩm khuếch đại dự kiến với kíchthước 222 bp tương tự so với kích thước của sản phẩm PCR được khuếch đại từ đốichứng Trình tự 16S rRNA của một chủng dương tinh chứng minh rang đó là vi khuẩnErwinia caratovora thông qua phân tích cây phát sinh loài Các kết qua thu được trongnghiên cứu này hứa hẹn sự phát triển của các phương pháp phát hiện nhanh nhằm pháthiện bệnh do vi khuẩn này gây ra, đặc biệt là phát hiện tại hiện trường

Từ khóa: Soft Rot Disease, Erwinia carotovora, detection, PCR, sequence.

ill

Erwinia caratovora is a rod shaped bacterium causing soft rot disease in a variety

of vegetables and ornamental plants This bacterial pathogen is preeminent seed-borne,

casing latent infection in tubers and plants until environmental conditions favor disease

development Currently, the detection of economically important soft rot erwinias (SREs) on plant materials have been mainly conducted by using selective media, immunological and PCR based methods The aim of this study is to identify specific sequence based on genome wide analysis for developing PCR based assays to detect Erwinia caratovora and differentiate this pathogen with other bacterial species PCR primers are designed and evaluated by using in-silico PCR amplification platform, then

followed by testing 1n bacterial isolates collected from rose and cabbage samples in Thu

Duc city, Ho Chi Minh City The results indicated that 13 of 39 bacterial isolates showed expected amplicon with the size of 222 bp compared to similar size of PCR product that was amplified from the control The 16S rRNA sequence of one positive isolate indicated that it is Erwinia caratovora through the analysis of phylogenetic tree The

results obtained in this study promise the development of rapid detection approaches for

detecting this bacterial pathogen, particularly in-field detection.

Keywords: Soft Rot Disease, Erwinia carotovora, detection, PCR, sequence.

IV

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT oi ccccccccccsssessesssessesseessessesesesseesnsesessessieseeseneesess viiiDANH SÁCH CAC BANG o.0 osocsscssesssesssssesseesuessessessetsessnesietssssetsessessesitesiessesanesees ixe0 :87.(e;0e (len: x

iN MIEHH ee 1

II — Đặtvấn (<n |

1:2: Mùe (ene D1 Cit GHỮHissystsptzsci6216SCESGGRSEEDGSEGEMGSDGVHSRREMSEGMGRBISNIGNIEGgIGSEG/2ISSGIERMSESEEEGEGP 1

13, NOI GUNS THỮG DICH +sseeseseseeigessbistiSSc905ES0030186200086)939302803040800812730130109L000219800985 S015 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU - 2-22 52 2+2E+2E+£E+£EezxezsezxerxerserssrseeeỔ

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Erwittia Sp -:-©22+55522cxsccsssrxesrrvsrrrsrrrrsrreeÖ

DM PHAN GđisssseeooaonetoioiaEDHHAOE-EELTINRNGEEEEEENGSHEEEESECRGEEQINCBEAEHENR.SNNNHEG.RENMQRGHARSỹNBSEABtuSS 3

2.1.2 Phân bố và đặc điỀm 2-52 SE221221221221221221212111212121212121 21 xe 42.1.2.1 Phân bố - 2-52 522212E152122122122122122127171211111111111111111111 11111 re 4

2.1.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 2-52 5S2+S2+E+EE£EEEEEEEEEEEEEErExrxrrxrer 4

2.1.3 Khả năng phát triển và gây hại trên cây trồng -+-©cc+cccesrreree 52.1.3.1 Điều kiện phat sinh và phát triỀn - 22 2¿©22222+222++22++2EEzErxztrrrrrrrrrree 5

BAAD, Cor đường winnie kececnseekdoiiniibdtiaddAiS026212331543813354396460.431363533888048:4.0 627.7955 TAC EHUHỔesssersnnseteessiontirimtdirnhsibeoostregnanliiugiartotBmrlgindsgriiLxiditiretngôkidrgrtinSubafnuiduetugrsii 6

2.2) Nghiên cứu trên thé giới và Việt Nam về Erwinia gây bệnh trên cây trồng 72.2.1 Trên thế giới -2-222222222212212212212212112112211 221121 .11.e xe 7

22:2: “TONG HƯỚC¿ssizoainniiootiEDSD0000000006018100000001304016000600139600660905003623Đ3999655905341799983852583 8

2.3 Giới thiệu về kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) - 8

2.3.1 Dim nghiia eee escecsesesssesssesssesosesssssnsssesssesssessnsssesssessesssesssessseseseesseeenee 8

AS TlamyulotfftỂNBeseseeeenmueaeasetottgttostrfiorttiidottogoisgtogdodgitosstiegti 82.3.3 Các thành phan phản ứng PCR cccccccscecseecssesssesssesssesssecsseessesessisecseeeseesseeeess 92.3.4 Thiết kế Primer -¿-©2-222222222122121122122112112211211211211211 212cc 10

335 Wo nhượcđiểm rũa phân ứng PỮveeeseseseenodoueoniekodeezkesridoirbotilfksgse 112.3.6 Ứng dụng của phương pháp PCR cscceccsesssessseesseesseesseesseesseessesseesseesseessees 11

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP -z222225ccccrrrrerxe 12

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu : cc+2c c2 ee 123.2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu -2- 2 2+2++2E22E+2E+2E22E22E2EzEzkzkezree i2

SN (03a no 123.2.2 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu -2- 2-52 52+2+22E+2E+2E22E22EZEzEzxzxezree 12

3.2.3 Môi trường và hóa chất -2-©22-©2++221222222EE22212231222122112212212 xe 123.3 Phuong phap nghién CWU 0 133.3.1 Thiết kế primer occ ce ccecccccsecseeseeesesseessessesseeseessesseesesenssessessseesnseseesneseeees 133.3.2 Thu mau va phân lập vi khuẩn Erwinia Sp -2 22©2222222222zz22z+zzsc+2 14

3.3.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 2 2 2222++2E2E+2EEz£E+2E+zzxzzzxzrxz 153.3.2.3 Kiểm tra các phản ứng sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn Erwinia sp 153.3.3 Ly trích DNA vi khuẩn và kiểm tra chất lượng DNA tổng số 163.3.3.1 Quy trình ly trích DNA vi khuẩn 22 52+S2+E+EE+EE2E+2E£EE2E22E22222222-22ze, 163.3.3.2 Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn trình tự 16S rRNA dé kiểm tra chất

hireng DNA: TỔ HE SO) ses cs crs enna nese eee eu EERE 0850 802 173.3.4 Xây dựng quy trình PCR phát hiện chi vi khuẩn E#wi#ia - . - 183.3.4.1 Thực hiện phản ứng PCR phát hiện chi Erwinia - 55-5 <-<<<<+s 18

3.3.4.2 Kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer EuniF và EuniR 2s2s2¿ 19

3.3.5 Khảo sát và xây dựng quy trình phản ứng PCR phát hiện loài E carotovora 19

3.3.5.1 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp -2- 2-52 2222122122122122122122121212121 212 xe 193.3.5.2 Khảo sát nồng độ primer 2+ 2 522222+EE22EE2EE£EE2EE223221271221221 22.22 crev 203.3.5.3 Kiểm tra độ đặc hiệu và độ nhạy của cặp primer EcaF - EcaR 20

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN - +22 22 +2+2E+2E££E2£E2EczEcrEzrerree 23

4.1 Két qua thiét ké primer Ố 234.1.1 Thiết kế primer bằng Primer3 2-22 72+2222EE+EE2EESEESEEESEEerxrzrrerree 234.1.2 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer trên in silico PCR 234.2 Kết quả phân lập vi khuẩn E7wiwia sp 2-©22- 22 ©222222222E+22xzzxzczxez 264.3 Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA - 284.4 Kết quả xây dựng phản ứng PCR phát hiện chi #wiyia -5- 29

vl

4.4.1 Kết quả phản ứng PCR với cặp primer EuniF - EuniR trên 39 mẫu vi khuẩn

442 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer EumiF và EunIR 30

4.5 Kết quả khảo sát và xây dựng quy trình PCR phát hiện loài E carotovora 31

4.5.1 _ Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp -. - 2: s+2S+2E2EE2EE2121212121 21 xe 314.5.2 Kết quả khảo sát nồng độ primer 2 22222+2z2zzzxeztzrxszszrserxc- 324.5.3 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện loài Z

177xoTs/2:22 PS .Ô.Ô.Ô 32

4.6 Kết quả phản ứng PCR phát hiện loài # carotovora trên các dòng vi khuẩn

THẬN HP vrerecorecoun serene meee acer HGRHISGGUGGIERIEGIEGBRBSGINSNSDI304QEBEGGIGGHHÒG4 EOE OO

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHI o.oi.ococcocccscssesssssssessesssseseesessessessseseesnsaeeseeeses 36

5.1 — OC (Cs nT)

i | een 36TAI LIEU THAM KHAO wooo ccccccsccesccssessessessessessessessessessessessessessessessessessesstssessesseeseeeed 7

PHU LUC

Vil

DNA: Deoxyribo Nucleic Acid

dNTP: Deoxyribo Nucleotide Triphosphate

rRNA: Ribosomal Ribo Nucleic Acid

E carotovora: Erwinia carotovora

Blast: Basic Local Alignment Search Tool

NCBI: Nationnal Center for Biotechnology Information

EuniF: primer xuôi của chi Erwinia

EuniR: primer ngược của chi Erwinia

EcaF: Primer xuôi của loài Erwinia carotovora

EcaR: Primer ngược cua loài Erwinia carotovora

TBE: Tris - Borate - EDTA

UV: Ultra violet

ctv: Cộng tác viên

ĐC: Đối chứng

vill

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Bang 3.1 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA 17

Bang 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch dai vùng trình tự 16S rRNA 17

Bảng 3.3 Thành phan phản ứng PCR phát hiện chi vi khuẩn Ezwiwia - 18

Bang 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR phát hiện chi vi khuẩn Erwinia 18

Bảng 3.5 Thanh phần phan ứng PCR khảo sát nhiệt độ bắt cặp phát hiện E carotovora 2202372010126 6 ố ổố cố Cố ốc CỐ ố CỔÔ 20 Bảng 3.7 Thành phan phản ứng PCR phát hiện loài E earofovora - - Pall Bang 3.8 Chu trình nhiệt phản ứng PCR phát hiện loài F carofovora pA Bằng 4.1 Trình tự primer đã tht lễ accenascn crsarnenrvmnesnrravernvrsicenarsaronnenmnamensnavaenninine 23 Bảng 4.2 Kết quả phân lập Erwinia Sp 525252 2222E2E2E22E2E2E2122222222Ece Si Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của các dong vi khuẩn phân lập 28

1X

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn Erwinia nhuộm Gram - 2 25522s22zsezszccze 3 Hình 2.2 Bệnh thối nhũn rau cải do vi khuẩn Eÿwiyia 5-52-5255+cs2cz<zcsee 6 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thực hiện nghiên cứu 2- 22 2222zz2z22+z2xzzzzzzzzex 13

Hình 3.2 Giao diện Primer3 - - - 2225222222111 1 313221111135 2111111188211 1 118811 re 14

Hình 3.3 Giao diện InsilicO - c2 222 2222532211221 1 51112112 1118111221121 1E xce 14 Hình 3.4 Mẫu lá có triệu chứng của bệnh thối nhũn -2- 2 222222222222 14

Hình 4.1 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu cặp primer EuniF - EuniR trên Insilico 24

Hình 4.2 Kết quả Blast sản phẩm khuếch dai của cặp primer EuniF -EuniR 24

Hình 4.3 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu cap primer EcaF - EcaR trên Insilico 25

Hình 4.4 Kết qua Blast san phẩm khuếch đại của cặp primer EcaF - EcaR 25

Hình 4.5 Hình thái khuẩn lạc nghi ngờ Erwinia Sp -2©22©52552552552252222 26 Hình 4.6 Hình thái vi khuẩn sau khi nhuộm Gram (100X) 2 2252252252 26 Hình 4.7 Vi khuẩn sui bọt có phản ứng catalase 222 ©22+22222+zz+zzzzzzzzzez 27 Hình 4.8 Khuẩn lạc trên môi trường King B dưới tia UV : 22-55+55+ 27 Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR 16S rRNA 2-©22©2252222z225zz2 29 Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện chi Ezwiwia - 30

Hình 4.11 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu primer phát hiện chi Erwiwia 31

Hình 4.12 Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của primer EcaF và EcaR 31

Hình 4.13 Kết quả khảo sát nồng độ primer EcaF và EcaR 2-52 32 Hinh 4.14 Két qua kiểm tra độ đặc hiệu của primer EcaF và EcaR - 33

Hình 4.15 Kết quả kiểm tra độ nhạy phản ứng PCR phát hiện loài E carotovora 33

Hình 4.16 Kết quả phản ứng PCR phát hiện loài E carotovora trên các dòng vi khuẩn 00.50101177 — 34

Hình 4.17 Kết quả so sánh trình tự của mẫu C2 trên ngân hang gen NCBI 35

Hình 4.18 Kết quả phân tích cây phát sinh loài dựa trên trình tự vùng 16S rRNA 35

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, dịch bệnh gây hại trên cây trồng do tác nhân vi khuẩn là một trong nhữngnguyên nhân gây thất thu năng suất và thiệt hại về kinh tế Bệnh thối nhũn do vi khuẩnErwinia sp gây ra là van đề nan giải trong ngành trồng trot ở nước ta hiện nay cũng nhưtrên toàn thé giới Vi khuẩn Erwinia sp gây hại trên nhiều đối tượng cây trồng quantrọng như các loại cây họ cải, cây hoa, cây cảnh và một số loài khác Trong đó, rau cải

là một loại thực phẩm phổ biến có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao Cây rau chứa nhiều

vitamin và nhiều chất khoáng quan trọng đối với sức khỏe con người Bên cạnh nhu cầu

về thực phẩm của con người thì nhu cầu thưởng thức và tận hưởng cuộc sông lại càng

được nâng cao Con người chú trọng hơn đến vẻ đẹp, tính nghệ thuật của cuộc sống, đó

chính là nghệ thuật thưởng thức hoa Cây hoa hồng là một trong những loại cây hoađược yêu thích nhất hiện nay và cũng mang lại giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, đối vớitình hình biến đổi khí hậu như hiện nay, các cây trồng dé bị nhiễm các loại bệnh hại

khác nhau Trong đó bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora được xem là bệnh

làm giảm đáng kê năng suất, chất lượng cây trồng Bệnh có thé gây hại trong giai đoạn

đồng ruộng và cũng như trong quá trình bảo quản, vận chuyền và bày bán Bệnh thối

nhũn gây thiệt hại ước tính mỗi năm khoảng 15 - 30% giá tri cây trồng (FAOSTAT data,2012) Vi khuân gây bệnh phát triển mạnh va lây lan nhanh chóng trong mùa mưa Bệnhthối nhữn do vi khuan Erwinia carotovora có khả năng lây lan rất cao, khó phát hiện

triệu chứng trong giai đoạn sớm, vì vậy cần có một phương pháp cụ thé dé có thé xác

định nhanh, chính xác, phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm dé có thé giảm thiệt hại về năngsuất, chất lượng và kinh tế cho người trồng trọt Hiện nay, phương pháp PCR là mộttrong những phương pháp tối ưu với độ chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao có thégiải đáp vấn đề nan giải cho các nhà vườn

Chính vì lý do này nên đề tài “Xây dựng quy trình PCR cho việc phát hiện và địnhdanh các loài vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh trên cây hoa hồng và rau cải” được thực

hiện.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài thực hiện nhằm phân lập vi khuẩn Erwinia sp và xây dựng thành công quytrình PCR phát hiện vi khuân Erwinia carotovora gây bệnh cây hoa hồng và rau cải

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Thu mẫu và phân lập vi khuẩn Erwinia sp từ các mẫu cây hoa hồng,rau cải tại khu vực Thủ Đức, Quận 9 (TPHCM).

Nội dung 2: Thiết kế 2 cặp primer chuyên biệt cho chi vi khuân Erwinia và loài

vi khuan Erwinia carotovora bằng phần mềm tin sinh học ứng dụng

Nội dung 3: Xây dựng quy trình PCR phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora và

sử dụng quy trình PCR dé phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora cho các mau vi khuân

đã phân lập.

CHƯƠNG 2 TÔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Erwinia sp

Chi (Genus): Erwinia

Erwinia sp được chia thành 2 nhóm: nhóm vi khuẩn gây thối nhữũn hay

“carotovora”, và nhóm vi khuẩn gây bệnh héo hoặc tàn rụi hay “amylovora” Nam 1998,

chi Erwinia này đã được đổi tên thành chi Pectobacterium (Hauben và ctv, 1998)

Pectobacterium được chia thành các nhóm dưới loài gồm: Pectobacterium

atroseptica (trước đây là Erwinia carotovora subsp atroseptica); Pectobacterium carotovora subsp carotovorum (Erwinia carotovora subsp carotovora) (Gardan va ctv,

2003); Pectobacterium carotovora subsp brasilinse (Erwinia carotovora subsp.

brasilinse); Pectobacterium wasabiae (Erwinia carotovora subsp wasabiae) (Pitman

va ctv, 2008) va Pectobacterium carotovora subsp odiferiferum (Erwinia carotovora subsp odorifera) (Seo va ctv, 2001); Pectobacterium betavasculorum (Nabhan va ctv,

2012).

2.1.2 Phân bố và đặc điểm

2.1.2.1 Phân bố

Erwinia sp phân bố rộng khắp thế giới cả vùng nhiệt đới và ôn đới, đặc biệt là ở

các nước nhiệt đới, cả cây trồng ngoài trời và trong nhà kính Trong đó, loài Erwinia

carotovora có phô kí chủ rộng hơn những loài khác, là tác nhân chủ yếu gây bệnh thối

nhiin trước và sau thu hoạch làm giảm đáng kể năng suất cây trồng

Erwinia sp là loài đa thực, ký sinh và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhaunhư: Solanum tuberosum, Allium (hành củ, củ tỏi, toi tây), Ananas comosus (dita),Anemone, Apium graveolens (can tay), Araceae, Asparagus officinalis (mang tay),

Brassica oleracea (cải bắp, súp lơ), Capsicum annuum (hồ tiêu), Carica papaya (du đủ),

Cichorium intybus (rau diép xoăn), Chrysanthemum maximum hybrids, Chrysanthemumvestitum, Colocasia esculenta (khoai sọ), Consolida ambigua (cây phi yên), Cucumis

melo (dua), Cucumis sativus (dua chuột), Cyclamen, Cynara scolymus (cây atis6),

Dahlia pinnata, Daucus carota (cà rốt), Dianthus (cam chướng), Elettaria cardamomum(bach đậu khẩu), Z uphorbia pulcherrima (cây trạng nguyên), Glycine max (đậu nành),

Helianthus annuus (hoa hướng dương), Ipomoea batatas (khoai lang), Lactuca sativa

(rau diép), Lycopersicon esculentum (ca chua), Medicago sativa (cé linh lang), Musa

(chuối), Nicotiana tabacum (thuốc la), Oryza sativa (lua), Paspalum, Pennisetum

purpureum (co voi), Phalaenopsis, Philodendron, Pyrus communis (dau), Raphanus sativus (cu cai), Saccharum officinarum (mia), Sedum spectabile, Solanaceae, Solanummelongena (ca tim), Solanum tuberosum (khoai tay), Sorghum bicolor (lúa mién),Urochloa mutica (kê), Zea mays (ngô) (Dickey va ctv, 1984).

2.1.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa

Erwinia sp là vi khuan ky khí tùy nghi, Gram âm, dạng hình que, hai đầu hơi

tròn, đơn lẻ hoặc từng cặp, có khả năng di động do có 2 - 8 lông roi bao quanh tế bao và

có kích thước trung bình từ 0,6 - 0,7 um đến 2 - 2,5 um (Fiori và Schiaffino, 2003)

Erwinia sp có phan ứng catalase đương tính, phát triển trong điều kiện ky khí,lên men glucose, biến đổi nitrate, thủy phân và sản sinh acid từ các loại đường

L-arabinose, D-galactose, D-glucose, glucerol, D-manose, D-ribose va sucrose Tuy nhiên, Erwinia sp có phan ứng âm với oxidase, không san sinh urease hoặc acid từ

adonitol Hau hết các dòng thủy phân L-rhamnose và D-manitol nhưng không thủy phân

dextrin (Avrova va ctv, 2002).

Vi khuẩn Erwinia phát triển ở phạm vi nhiệt độ khá rộng, nhiệt độ thích hợp nhất

là khoảng 27°C - 32°C, nhiệt độ tới han là 50°C Pham vi pH cũng khá rộng, dao động

từ 5,3 - 9,2 trong đó pH thích hợp nhất là 7,2 Vi khuẩn có thể bị chết trong điều kiện

khô và dưới ánh nang (Vũ Triệu Man, 2007)

Dé phân lập vi khuân Erwinia sp có thé dùng nhiều loại môi trường khác nhaunhư: CVP, PDA (PGA), TZA, YDC Tuy nhiên, môi trường phân lập tốt nhất được lựachọn dé phân lập vi khuẩn gây thối nhũn là CVP (Crystal Violet Pectate) Trên môitrường này, sau 48 giờ ủ ở 27°C, khuan lạc trong mờ, có màu sắc óng ánh, dang lõm(Hyman và ctv, 2002) Trên môi trường TZC khuẩn lạc của vi khuẩn Erwinia sp có màu

đỏ ở giữa, ria ngoài màu trang Đây cũng là một đặc trưng dé nhận biết loài Erwinia (LêLương Té va Vũ Triệu Man, 1977)

Ngoài ra, có thé sử dụng môi trường agar dinh dưỡng hoặc KB dé phân lập vikhuẩn Erwinia sp Khuan lạc của Erwinia sp trên môi trường KB sẽ không phát huỳnhquang trong khi hầu hết các loài của Pseudomonas đều phát huỳnh quang

2.1.3 Khả năng phát triển và gây hại trên cây trồng

2.1.3.1 Điều kiện phát sinh và phát triển

Sự khởi đầu của mầm bệnh phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trường và vi khuângây bệnh thực sự được coi là tác nhân cơ hội Vi khuân Erwinia có khả năng sống trong

mô thực vật mà không gây ra triệu chứng nhưng giai đoạn không triệu chứng kết thúckhi độ 4m cao va nồng độ oxy thấp tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩndẫn đến cây trồng bị nhiễm bệnh

Bệnh do vi khuẩn Erwinia sp thường xảy ra trong những ngày mưa dam, dat

thoát nước kém, lên liếp thấp, có nhiều tàn dư chưa hoai mục hoặc tưới nhiều nước, bón

phân không cân đối Vi khuẩn tồn tại trong quá trình bảo quản, trong đất, xác bã thựcvật, trong nước tưới và có thé tồn tại trên nhộng của một số côn trùng Sau khi xâm nhậpchúng bat đầu phát triển trong gian bào, xâm nhiễm vào trong nhu mô (Lê Lương Té và

Vũ Triệu Man, 1999) Vi khuẩn Erwinia sp phat triển thuận lợi trong phạm vi nhiệt độkhá rộng, nhiệt độ thích hợp nhất là 27 - 32°C, nhiệt độ tới hạn chết là 50°C; phạm vi

pH cũng khá rộng từ 5,3 - 9,2, thích hợp nhất là pH 7,2 (Lê Lương Té và Vũ Triệu Man,

1977).

2.1.3.2 Con đường xâm nhiễm

Erwinia sp xâm nhập qua vết thương như: do cơ giới (vết thương do cắt tỉa, thu

hoạch, tưới phun áp lực cao), gió mưa, côn trùng, gia súc, con người Erwinia là loài vikhuân đa thực, chúng phá hoại trên 50 loại cây trồng khác nhau Bệnh lây nhiễm từ cây

bệnh sang cây mạnh hay có thé lan truyền qua mam, củ, thân hành, thân rễ, lá thân, rễ

(Lê Lương Té và Vũ Triệu Man, 1999)

2.1.3.3 Triệu chứng

Erwinia sp là nguyên nhân gây bệnh thối nhữn trên rau cải, hành tây, khoai tây,

hoa hồng, hoa cúc, thược dược; gây héo rũ trên hoa hồng, hoa cúc, ngô, Dieffenbachia

pulcherrimai, chuối; gây bệnh còi cọc (drawing), héo chậm (slow wilting) và can cỗi

(stunting) trên hoa câm chướng (Burkholder và ctv, 1953)

Vi khuẩn tấn công trên các bộ phận khác nhau của cây, có thể có những triệu

chứng bệnh khác nhau Lá bi bệnh do vi khuẩn Erwinia sp thường có triệu chứng bị

thương tốn, héo rũ, thối nhũn, bị vàng dan và rụng; thân cây bệnh bị biến đổi màu, héo

rũ, phát triển đị dạng hoặc chết, phần rễ bị bệnh thường có triệu chứng thối rữa Quá

trình nhiễm bệnh từ một bộ phận thân, lá cho đến khi lan ra cả cây diễn ra rất nhanh

Trên khoai tây, vi khuân gây thôi nhũn thân củ làm thân củ không mọc tiếp được.Sau đó, vi khuan gây hại đến thân cây, triệu chứng này xuất hiện phụ thuộc vào điềukiện môi trường: dưới điều kiện nóng, khô cây có xu hướng bị khô, héo nhưng khi môitrường nóng, am thân bị thối đen từ thân củ lên phía trên (Perombelon và Kelman, 1987)

Thối nhũn trên đồng ruộng có thé do một trong những loài vi khuẩn Erwinia sp

gây ra như: Erwinia carotovora va Erwinia chrysanthemi là chủ yêu.

2.2 Nghiên cứu trên thé giới và Việt Nam về Erwinia gây bệnh trên cây trồng2.2.1 Trên thế giới

Bệnh cây do vi khuẩn gây ra trong đó có nhiều bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn đặc

biệt trong thời kỳ sinh trưởng của cây cũng như trong thời gian bảo quản, cất trữ nông

sản phẩm Đối với những khu vực sản xuất thuộc vùng nhiệt đới, bệnh cây do vi khuẩn

đã gây ra những thiệt hại lớn trong sản xuất nông nghiệp như bệnh bạc lá lúa doXanthomonas oryzae, bệnh héo xanh cây họ cà như cà chua, khoai tây, thuốc lá doRalstonia solanacearum, bệnh thối nhữn do vi khuẩn gây hại trên rau cải củ khoai tây,

cà rốt, hành tây do Erwinia carotovora

Ở những vùng trồng trọt có khí hậu ôn đới, bán ôn đới, chủ yếu xuất hiện các loài

vi khuẩn điển hình như: Erwinia sp., Pseudomonas syringae, Xanthomonas sp.,Corynebacterium sp Agrobacterium tumefaciens, gây hai trên hau hết các loại cây

trồng: ngũ cốc, cây hoa, cây cảnh, cây ăn quả, cây thực pham,

Năm 1880, Burill (Mỹ) đã đi sâu nghiên cứu về bệnh hại cây trồng do vi khuẩngay ra trên các loại cây ăn quả (bệnh cháy xém cây lê do vi khuẩn Erwinia amylovora),tác giả đã phân lập và nuôi cay được vi khuẩn Erwinia amylovora, đồng thời đã xác định

được khả năng gây bệnh của nó.

Năm 1994, tại Thổ Nhĩ Kỳ, bệnh thối thân cây cà chua gây ra bởi Erwiniacarotovora subsp carotovora và Erwinia chrysanthemi được phát hiện lần đầu tiên

trong nhà kín ở vùng phía đông Địa Trung Hải (Eastern Mediterrean region).

Tại Canada, thiệt hại do vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora gây ra

là 12% và 20% vào năm 1996 và 1997 tại các nhà kính trồng cây tiêu (Capsicum

annuuma) tai St Davids, Ontario.

Từ năm 1999, bệnh bùng phát nghiêm trọng trong nhiều nhà kính trồng cà chua

ở vùng Địa Trung Hải và Aegean của Thổ Nhĩ Kỳ Trong vụ đông và xuân năm 2002,xuất hiện bệnh trong một số nhà kính ở Mersin và Antakya, vùng phía đông Địa TrungHải của Thổ Nhĩ Kỳ Thiệt hai của bệnh nay tác động khoảng 20 - 25% phạm vi nhakính ở Mersin và 80 - 90% nhà kính ở Antakya Sau khi quan sát các triệu chứng, phân

lập, mô tả về đặc điểm, hình thái học, sinh lí, sinh hóa, kiểm tra khả năng gây bệnh đã

xác định được nguyên nhân gây bệnh do vi khuẩn Pseudomonas viridiflava, Erwinia

carotovora subsp carotovora va Erwinia chrysanthemi (Aysan va ctv, 2005).

Bên cạnh đó, các nghiên cứu dé nhận dạng và phân biệt tat cả các loài vi khuângây thối nhữn Erwinia sp bằng phương pháp PCR va RFLP cũng được tiễn hành và cho

kết quả nhanh với độ chính xác cao (Toth và ctv, 2001; Kwon va ctv, 1997)

Năm 2006, Nguyễn Thi Thanh Hà đã thực hiện đề tài nghiên cứu về “Phat hiện

vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora trên cây Địa Lan (Cymbidium) bang

phương pháp PCR”, trường Dai học Nông Lam, Tp Hồ Chí Minh đã định danh chínhxác loài vi khuẩn gây thối nhữn trên cây Địa Lan là Erwinia carotovora subsp

carotovora.

2.3 Giới thiệu về kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

2.3.1 Dinh nghia

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh

nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng Phương pháp này được KaryMullis đưa ra năm 1985 va Saiki hoàn thiện năm 1988 Phương pháp PCR được thực

hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều

bản sao DNA Kỹ thuật PCR có thé được ứng dung trong nhiều lĩnh vực: chân đoán, xét

nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền,tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiễn hoá của sinh vật ở mức

độ phân tử.

2.3.2 Nguyên tắc phản ứng

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNAdựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bảnsao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase vả

một cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA này.

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bô sung với một mạch của

đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéodài dé hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này củaDNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượnglớn ban sao đến mức có thé thay được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có théthu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Nhưvậy, dé khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu vềtrình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ dé tao các primer bồ

sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003)

Theo Phạm Hùng Vân (2009), về mặt nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ

gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:

1 Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94°C, các liên kết hydro sẽ bị

phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn

2 Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 - 65°C, các đoạn primer sẽ batcap bô sung vào hai đầu trình tự mục tiêu

3 Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72°C, Taq polymerase sẽ sử dụngdNTP dé kéo dài đầu 3’ của primer và tạo ra mạch bố Sung

2.3.3 Các thành phần phản ứng PCR

Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần cần thiết bao gồm: DNA khuôn

mẫu hoặc cDNA chứa vùng của đoạn DNA cần khuếch dai, cặp primer là yếu tố quyết

định vị trí bắt cặp và kết thúc của vùng cần khuếch đại, enzyme Taq polymerase giúpnhân bản vùng khuếch dai, nucleotides, dung dich dém cung cap môi trường hóa hocthích hợp cho DNA-Polymerase (Rahman và ctv, 2013).

Phản ứng khuếch đại tôi ưu xảy ra trên DNA tỉnh sạch Tuy nhiên nhiều kỹ thuậtchan đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận được trực tiếp từ dịch chiết

tế bào Lượng DNA mau sử dụng cũng có xu hướng giảm (lug xuống còn 100ng) với

việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)

Enzyme Taq polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn Thermus

aquaticus sông ở các sudi nước nóng Enzyme này không bi phá vỡ ở nhiệt độ biến tính.Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác được đưa ra thị trường với nhiều chức năngchuyên biệt và hoàn thiện hơn.

Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một phản ứngPCR Nếu primer được thiết kế một cách chính xác và chuyên biệt thì phản ứng sẽ mang

lại kết quả với độ nhạy và đặc hiệu cao

Nong độ dNTP thường được sử dụng là 20 - 200 uM Bên cạnh đó, sự cân bằngtrong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phan ứng PCR Sự mất cân bằng trongthành phần các dNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase

Nong độ MgCh cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phan ứng PCR Mg?”rất cần cho quá trình liên kết các đNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng

Tm của DNA mạch kép Mg?” là Co - factor của Taq polymerase nên nếu lượng Mg?”quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéodai, hạn chế quá trình kéo dài Ngược lại nồng độ Mg?” cao sẽ giúp ôn định mạch đôiDNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn (do sự tach mạch đôi DNA) của sản pham

trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phâm PCR ít đi; đồng thời, có thé làm cho hiện tượng bat

cặp giả xảy ra ôn định hơn và cho ra những sản pham mong muốn với số lượng quá lớnnhưng mức độ chuyên biệt thấp (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Một nồng độ cao của dung dịch đệm PCR được sử dụng dé tăng cường hiệu quacho phản ứng PCR Sau đây là dung dịch đệm PCR được xem là tốt hơn đối với các đệmđang có mặt trên thị trường:

vùng khuếch đại và hạn chế tạo ra các sản phẩm không đặc hiệu Cần quan tâm đến

chiều dai của primer vì nó là yêu tố quyết định nên tính đặc hiệu của sản phâm PCR.Thông thường độ dài tối ưu của primer là khoảng 18 - 22 bp Các primer có chiều dài

nằm trong khoảng này đạt được sự cân bằng phù hợp giữa độ đặc hiệu và nhiệt độ bắt

cặp thích hợp, primer càng dài thì độ đặc hiệu càng lớn và nhiệt độ bắt cặp càng cao

(Nguyễn Hoàng Lộc và cvt, 2007)

10

Nhiệt độ nóng chảy của primer có thể sử dụng công thức liên hệ với các base

(Sugg va ctv, 1981):

Ta = 4(G4C) + 2(A+T)

Phải duy trì hàm lượng GC ở mức thích thích hop với nhiệt độ Tm vì khi Tm cànglớn thì hiện tượng gan primer nhầm càng cao

Ngoài ra, cần chú ý đến đầu 3’ của primer vì nó kiểm soát hiện tượng gắn primer

nhằm và ngăn cản hiện tượng tương đồng trong cùng một cặp primer (Kwok và ctv,1990) Cần kiểm tra hiện tượng bắt cặp cho nhau của tất cả primer, thông thường trong

chương trình cài đặt sẵn của máy tính, không cho phép cặp primer có sự tương đồng ở

đầu 3’, nhằm giảm sự hình thành các primers - dimers (Chous va ctv, 1992)

2.3.5 Ưu nhược điểm của phản ứng PCR

Ưu điểm

Chi phí đầu tư nghiên cứu thấp, dé dàng phân tích kết quả Thực hiện đơn giản

và it tốn kém Thời gian cho kết quá nhanh chóng

Nhược điểm

Cần phải có primer đặc trưng cho DNA cần khuếch đại Dé có đoạn primer này

ít nhất phải biết trước trình tu nucleotide cần khuếch đại Khả năng ngoại nhiễm lớn (dothao tác nhiều lần) Độ nhạy và độ đặc hiệu thấp hơn Real-time PCR

2.3.6 Ứng dụng của phương pháp PCR

Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử vớinhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiêm nghiệm vi sinh vật gây bệnh:thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nước, phát hiện pháp y

Trong lĩnh vực công nghệ sinh học, kỹ thuật PCR được sử dụng trong việc lậpbản đồ gen, dòng hóa gen, giải trình tự DNA và phát hiện gen, chọn lọc các gen đượcbảo tồn Trong đời sống, kỹ thuật PCR nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mụctiêu trong ống nghiệm từ một lượng DNA rat nhỏ

Trong y học và thú y, PCR được dùng để chan đoán bệnh, mầm bệnh cho người

và động vật, phát hiện các gen đột biến, xác định các gen có ảnh hưởng đến năng suất

và chất lượng thịt, sữa, chọn tạo giống vật nuôi Trong nông nghiệp và thực phẩm, PCR

dùng đề chân đoán các bệnh trên cây trồng, phát hiện các giống mang gen đột biến, chọn

tạo giống cây trồng Ngoài ra, kỹ thuật PCR còn được sử dụng để truy tìm dấu vết tội

phạm, chân đoán sớm các bệnh di truyền.

lãi

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 07 năm 2022 đến tháng 12 năm

2022.

Đề tài khóa luận được thực hiện tại RIBE 302-304, phòng thí nghiệm Bệnh học

và chân đoán phân tử, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đạihọc Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Các mau vi khuân Erwinia sp phân lập từ các mẫu lá cây hoa hồng và rau cải códau hiệu bị bệnh thối nhữn Tổng cộng có 10 mau lá hoa hồng được thu tại các vườnhoa hồng Tp Thủ Đức, Quận 9 (Tp Hồ Chí Minh) và 8 mẫu rau cải bị bệnh thối nhữn

thu tại các chợ nông sản Thủ Đức.

Mẫu đối chứng dương là vi khuan Erwinia carotovora được cung cấp bởi Khoa

Nông Nghiệp, Trường Đại học Cần Tho, Thành phố Cần Thơ

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

Máy tính, các phần mềm ứng dụng tin sinh học

Dụng cụ thí nghiệm bao gồm: đĩa petri, que cấy vòng, que cấy trang, đèn côn,ống nghiệm, giá đựng ống nghiệm, micropipette, đầu tuýp, eppepdorf

Các trang thiết bị: máy PCR (Mastercycler Nexus GSX1, Eppendorf - Đức), máy

ly tam Microfuge 16 (Beckman Coulter, Đức), may vortex (OSI Rotolab), cân điện tử

(ScoutPro, Trung Quốc), máy điện di gel (Mupid - Exu — Nhật Bản)

3.2.3 Môi trường và hóa chất

Môi trường nuôi cấy King B (peptone 20 g/l; MgSOx.7HaO 1,5 g/l; KaHPO¿ 1,5g/l; Glycerol 15 ml/I; agar 20 g/l) Môi trường King B có bổ sung thêm khang sinh

Cycloheximide 0,1%.

Môi trường tang sinh LB (peptone 10 g/l; NaCl 10 g/l; yeast extract 5 g/l).

Hóa chat: STE buffer (pH = 8; Nacl 100 nM, Tris - HCl 10 nM, EDTA 1 mM),chloroform, Ethanol, Isopropanol, GelRed (TBR, Việt Nam), thang chuẩn 1 kb (BioLabs

- England), agarose, dung dich dién di TBE (Tris HCI: Borate: EDTA).

12

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Thu mâu và xử lí mâu

— — Thiết kế và kiểm tra độ đặc hiệuPhân lập và chọn lọc Erwinia primer băng công cụ tin sinh học ứng

primer đã thiệt kê thiệt kê

Điện di và đánh giá kết quả

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thực hiện nghiên cứu.

3.3.1 Thiết kế primer

Primer là các trình tự oligonucleotide ngắn có thể bám đặc hiệu vào một vùngtrình tự nhất định Primer là điểm khởi đầu để DNA polymerase có thé thực hiện tổnghợp mạch bé sung mới cũng như xác định đoạn DNA được khuếch đại Do đó, việc thiết

kế primer sẽ quyết định mức độ đặc hiệu của phản ứng

Phân tích so sánh hệ gen của Erwinia sp trên web NCBI dé chọn lọc được đoạntrình tự đặc biệt cho vi khuẩn chi Erwinia và loài Erwinia carotovora

Hai cap primer đặc hiệu của chi vi khuẩn Erwinia và loài Erwinia carotovora

được thiết kế bằng phần mềm Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) dựa trên đoạn

trình tự đặc biệt từ kết qua phân tích hệ gen của vi khuẩn

Các cặp primer sau khi thiết kế sẽ được kiểm tra bằng phần mềm in-silico PCRamplification (http://insilico.ehu.es/PCR/) dé đánh mức độ bắt cặp cũng như độ đặc hiệu

của các cặp primer đã thiết kế được có tính đặc hiệu chuyên biệt, phát hiện các gen củaloài mong muôn.

13

Ì Primer Aplus interface sautions | _EAQAWIKI

There is a newer version of Primer3 available at http://primer3.wimit.edu/

Paste source sequence below (9->3!, string of ACGTNacgtn ~ other leters weated as N Ở oumbers and blanks ignored) FASTA formar ok.

Please N-out undesirable sequence (vector, ALUs, LINEs, cic.) or use a Misarirnins Library (msgsaf library): | non '

[5 Pick left primer, Pick Rybedization probe (intemal Pick right primer, or use right primer Below

Jor use ie primer below: 5 (otlgo),or use oligo below: Sto 3! on opposite strand)

hàng A ing ety yo mượn

: Eg 30.2 requires primers to sorooed the 2 bases at positions 50 and 51 Or mark the source sequence wih {and

cee eg ATCTICCCCITCAT means ha primers must flank the eenalCCCC

Excloded 1g 40127 68.) fofDydexẹlEcton of primer In the 7 bascs starting at 401 and the 3 Dates a 6%, mark the

Repons: sounce sequence with < and >: e.g ATCT TCA forbids primers in the central CCCC.

Product Size Ranges T15 358 15 83 151-488 404-89 1đỉ.488 61-388 ỏỉ-S:2 wi 1805

Nunsr To Rctum 5 ỔMax.2 Stability %ẹ

Max Repeat Mispriming (1260 | Pair Max Repeat Mispriming 24.09

ỔMax Template Mispoming 12.00 Pair Max Template Mispriming 24.00

General Primer Picking Conditions

Primer Size Min: [is] Ope 3] Max: (37

Primer Tm Min: ($70 | Ope: $òẹ | Max: [63.6 | Max Tm Difference: (1006 | Table of shermodynamic parameters: | Sreslauer ot si 1988 (

Max: 288

So =

Primer GC% Min: [706] Ope

Hinh 3.2 Giao dién Primer3.

In silico PCR amplification

Input primers in fasta format

Primer 1Ỗ s-| be Primer 2Ỗ 5-| ức

Migroorganism

APPLY TO ALL Erwinia vị

ẹ Include plasmids (if available)

Allow mismatches, but in nucleotides in 3' end

Maximum length of bands

3000 nucleotides

a Degenerated nucleotides are allowed; A+T+G+C must be 10 or more.

Info

Hinh 3.3 Giao dién Insilico.

3.3.2 Thu mẫu và phan lập vi khuẩn Erwinia sp

3.3.2.1 Phương pháp thu mẫu

Tiến hành thu thập các mẫu lá cây hoa hồng và rau cải có triệu chứng đặc trưngcủa bệnh thối nhiin Kết quả thu thập được 10 mẫu lá hoa hồng tại các vườn trồng câyhoa hồng ở TP Thủ Đức và 8 mẫu rau cải bị bệnh thối nhiin tại các chợ nông sản Thủ

Đức.

Mau sau khi thu sẽ tiến hành rửa bằng nước cat dé loại bỏ các bụi ban và các sinhvật biểu sinh Cắt mẫu thành những đoạn nhỏ tại điểm tiếp giáp giữa mô bệnh và môkhỏe, cho vào cối sứ và nghiền nát bằng chày sứ, thêm vào cối khoảng 2 ml nước cấtkhử trùng Hút phần dịch nghiền cho vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng King

B lỏng và đem ủ ở 28ồC trong 24h Sau thời gian ủ tăng sinh mau sẽ được tiến hành cácthắ nghiệm tiếp theo dé phân lập vi khuan Erwinia sp trên môi trường King B có bésung kháng sinh Cycloheximide 0,1%.

Hình 3.4 Mẫu lá có triệu chứng của bệnh thối nhiin.

(a) Mẫu lá hoa hông; (b) Mau lá rau cải.

14

3.3.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Mẫu sau khi được xử lý sau đó tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng King B

lỏng khoảng 12h đến 24h

Chuẩn bị 6 ống nghiệm có chứa 9 ml môi trường LB đã được hấp vô trùng đượcđánh số thứ tự từ 1 đến 6 Dùng micropipette hút 1 ml dung dich tăng sinh cho vào ốngnghiệm thứ nhất, lắc đều, được nồng độ 101 Hút tiếp 1 ml từ ống nghiệm 1 sang ốngnghiệm 2, vortex, được nồng độ 107, cứ tiếp tục làm tương tự cho đến ống nghiệm cuốicùng Chọn 3 ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10%, 105, 10° ding micropipette hút

100 ul từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường King B có bổ sung kháng sinh

Cycloheximide 0,1% (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần), đùng que cấy trang dé trang đều dichkhuẩn cho thật khô Sử dung paraffin quan đĩa lại dé tránh nhiễm khuẩn từ bên ngoài,sau đó đem đi ủ ở nhiệt độ 28°C trong 48h Quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa, choncác khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuân Erwinia sp dùng que cấy vòng bat và ria lại trên môitrường King B dé làm thuần Cay ria cho đến khi có khuẩn lạc thuần, sau khi làm thuầntiến hành bắt khuẩn lạc dé tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng LB dé ly trích thuDNA tổng số và giữ nguồn các chủng vi khuẩn đã phân lập được (tỷ lệ 7 ml LB có

khuẩn: 3 ml glycerol)

3.3.2.3 Kiếm tra các phản ứng sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn Erwinia sp

Nhuộm Gram:

Mục đích: phương pháp nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm là Gram

âm và Gram dương dựa trên các đặc tính hóa lý của vi khuẩn

Phương pháp: dùng một miếng lam nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng, làm vết bôi vikhuẩn Sau đó cô định vi khuẩn trên ngọn lửa đèn cồn Nhuộm với Crystal violet trong

1 phút, sau đó rửa với nước Tiếp tục nhuộm với dung dịch Lugol trong | phút, sau đórửa với cồn 96° đến khi giọt cồn chảy xuống không còn màu xanh Rửa tiếp với nước.Nhuộm bồ sung phẩm màu Safarin trong 30 giây, sau đó rửa với nước Phơi khô lam và

quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần (nếu quan sát dưới vật kính 100X

phải nhỏ thêm giọt dau soi kính) Nếu là vi khuẩn Gram dương sẽ bắt mau tim, vi khuẩnGram âm sé bắt màu hồng Chọn lọc những mẫu là vi khuẩn Gram âm, hình que dé tiễnhành các thí nghiệm tiếp theo

lŠ