4.1. Kết quả thiết kế primer
4.1.1. Thiết kế primer bằng Primer3
Sau khi đã chọn được gen đặc trưng, tiễn hành thiết kế primer cho đoạn gen bằng phần mềm ứng dụng Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/).
Kết quả trình tự primer đặc hiệu cho chi Erwinia và loài E. carotovora được trình
bày như Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Trình tự primer đã thiết kế
Tén primer Trinh tự primer Nhiệt độ (T,) Kích thước EuniF 5’ GCT ACC 3? 57,2°C
1202-1204 bp EuniR 5’ CAC ACA 3 548C
EcaF S "CLE ATT 3' 54.8
3 222 bp EcaR 5' ATA GTG 3 54,8°C
EuniF: Primer xuôi, EuniR: Primer ngược cua Erwinia sp.
EcaF: Primer xuôi, EcaR: Primer ngược cua Erwinia carotovora.
4.1.2. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer trên in silico PCR amplification Các cặp primer sau khi thiết kế được kiểm tra bằng phần mềm in silico PCR
amplification (http://insilico.ehu.es/PCR/).
Kết qua kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer EuniF, EuniR cho thay primer phát hiện tất cả các dong vi khuẩn thuộc chi Erwinia, cho band có kích thước khoảng 1202 - 1204 bp đúng với sản phâm PCR dự kiến (Hình 4.1). Sản phẩm khuếch đại được kiểm tra trên ngân hàng gen NCBI bằng công cụ Blast cho kết quả khuếch đại đặc hiệu với chi Ewinia với độ tương đồng 100%, giá trị E - value <0,001 (giá trị E - value càng thấp thì kết quả so sánh trình tự càng có ý nghĩa) và có độ bao phủ (mức độ có thé tạo cặp đối dé so sánh) là 100% (Hình 4.2). Do đó cặp primer EuniF - EuniR này có thé chuyên biệt cho chi vi khuẩn Erwinia.
Tương tự, kết quả kiểm tra cặp primer EcaF, EcaR phát hiện loài E. carotovora chỉ xuất hiện band có kích thước 222 bp ma không xuất hiện ở các loài Erwinia sp. khác
23
(Hình 4.3). Sản phẩm khuếch đại có độ tương đồng và độ bao phủ 100% (Hình 4.4). Vì
vay cặp primer nay có thê đặc hiệu cho loài vi khuân FE. carotovora.
In silico PCR Amplification
All records related to this experiment will be romoved from server after 72 h, or you may delete them now.
Primer 1 -> 5"-€Œ Acc-3"
Primer 2 -> 5°-C ACA-3"
No mismatches allowed. info
Selected strains
= Erwinia amylovora ATCC 49946 =~
Erwinia amylovora CFBP1430 Erwinia billingiae Eb661
Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043 Erwinia pyrifoliae OSM 12163
Erwinia pyrifoliae Ep1/96
nhu
4 - Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043
1 2 3 4 > 6 # 8
No. Bands @4) (2) (1) (1) (1) (1) (3) (3)
azez
iiss
1393 FC
Hình 4.1. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu cặp primer EuniF - EuniR trên Insilico.
Graphic Summary Alignments Taxonomy
Sequences producing significant alignments Download Y _— Select columns Y Show °
select all 100 sequences selected nBank Graphics Distance tree of results | MSA Viewer
Descrten SceaticName cece Sere Cover vane | tame A228 Asean
~| ele | v v
Enwinía amylovora strain FB-20 chromosome, complete genome Erwinia amylovora 2313 16051 100% 00 100.00% 3803601 gij1839295992JCP0502401
Envinia amylovora strain FB-86 chromosome, complete genome Enwinia amylovora 2313 16051 100% 0.0 100.00% 3804074 9ij1839292215)CP050258.1
Enwinia amylovora strain FB-207 chromosome. complete genome Enwinia amylovora 2313 16051 100% 00 100.00% 3804074 gii1939289402/CP0502631
Enwinia amylovora strain FB-307 chromosome, complete genome Erwinia amylovora 2313 16051 100% 00 100.00% 3803872 gji1839284701/CP0502421
Envinia amylovora strain T93238 chromosome, complete genome Enwinia amylovora 2313 16045 100% 0.0 100.00% 3804073 gjii839281001/CP0502441
Enwinia amylovora strain E-2 chromosome complete genome Erwinia amylovora 2313 16051 100% 0.0 100.00% 3806898 giii285316316/CP0249701
Envinia amylovora isolate CP201324 chromosome. complete genome Enwinia amylovora 2313 16036 100% 0.0 100.00% 3804067 gj2246736555/CP0765891
Enwinia amylovora isolate CP200930 chromosome, complete genome Erwinia amylovora 2313 16036 100% 00 10000% 3903962 9i/2246733080)CP076590.1
Erwinia amylovora isolate CP201142 chromosome complete genome Enwinia amylovora 2313 16020 100% 0.0 100.00% 3804022 j/2246729547/CP076591 1
Envinia amylovora isolate CP20130204 chromosome, complete genome Enwinia amylovora 2313 15968 100% 0.0 100.00% 3803641 gii224723150/CP076593.1
hover to see tne title ke click to show alignments Alignment Scores [MM <40 [40-50 [50-50 [80-200 Mm>=200 @
100 sequences selected @
Distribution of the top 316 Blast Hits on 100 subject sequences
Hình 4.2. Kết qua Blast sản phẩm khuếch đại của cặp primer EuniF - EuniR.
24
In silico PCR Amplification
All records related to this experiment will be romoved from server after 72 h, or you may delete them now.
Primer 1 -> 5'-CT šATT-3"
Primer 2 -> S'-AT 'GTG-3"
No mismatches allowed. info
Selected strains
4 - Erwinia amylovora ATCC 49946 a 2 - Erwinia amylovora CFBP1430
Is - Erwinia pyrifoliae DSM 12163 2⁄4
6 _- Erwinia pyrifoliae Epi/96
4 - Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043
1 2 3 4 5 6 7 8 No No No No No No No 100 bp bands bands bands bands bands bands bands
DNA ladder
ì 8 ks § 3
§
No. Bands (2)
Hình 4.3. Kết qua kiểm tra độ đặc hiệu cặp primer EcaF - EcaR trên Insilico.
Graphic Summary Alignments Taxonomy
Sequences producing significant alignments Download Y Select columns Y Show 9
Select all 100 sequences selected GenBank Graphics Distance tree of results MSAViewer a ae Max Total Query E — Per.
Pu Rl San So |0me (value | Met |e Âossn
v v Vv v v
Pectobacterium atrosepticum strain 36A chromosome, complete genome Pectobacterium atr.. 427 427 100% 3e-15 100.00% 4965575 gilt285295834)CP024956.1 Pectobacterium atrosepticum strain 214 complete genome Pectobacterium al.. 427 427 100% 3e-115 100.00% 4991806 gil672931090/CP009125 1 Pectobacterium atrosepticum strain JG10-08, complete genome Pectobacterium atr.. 427 427 100% 3e-115 100.00% 5004926 giê4l743550/CP0077441 Pectobacterium atrosepticum strain CFBP1526 chromosome, complete genome Pectobacterium atr.. 427 427 100% 3e-15 100.00% 492339 gi2053354922P0361631 Pectobacterium atrosepticum strain Greent chromosome, complete genome Pectobacterium at... 427 427 100% 3eff§ 100.00% 4959719 gi204739639(P0552241
Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043. complete genome Pectobacterium atr.. 427 427 100% 3e-115 100.00% 5064019 ij496094911BX950851.4
Descriptions JẤđ/0////U Ji Alignments Taxonomy
‘Qhover to see the tle cick to show alignments Alignment Scores <40 (40-50 (50-80 [90-200 f>=20 @
100 sequences selected (?)
Distribution of the top 100 Blast Hits on 100 subject sequences pep tr“ —T+r——
1 40 80 120 160 200
Hình 4.4. Kết qua Blast sản phẩm khuếch dai của cặp primer EcaF - EcaR.
4.2. Kết qua phân lập vi khuẩn Erwinia sp.
Kết quả thu thập được 10 mẫu lá hoa hồng tại các vườn trồng cây hoa hồng ở Thủ Đức, quận 9 (TP. HCM) va 8 mẫu rau cải bị bệnh thôi nhữn tại các chợ nông sản Thủ Đức. Mẫu được phận lập trên môi trường King B có bổ sung kháng sinh Cycloheximide 0,1%, chọn những khuan lạc đặc trưng dé tiếp tục cấy ria trên môi trường King B đến khi tạo dòng thuần. Theo mô tả của Bareswill và cvt, (1997) khuẩn lạc có màu trắng đục, tròn, lồi, nhay, bong, mép khuẩn lac tròn nhẫn.
Kết qua nhuộm Gram.
Hình 4.6. Hình thai vi khuân sau khi nhuộm Gram (100X).
Erwinia sp. là vi khuẩn Gram âm, hình que nên sau khi nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi, ghi nhận các dòng vi khuẩn là có dang hình que và bắt màu hồng với
thuôc nhuộm.
26
Kết quả phản ứng catalase.
Hình 4.7. Vi khuẩn sui bọt có phản ứng catalase.
Theo Roopa và ctv (2014), tất cả các loài vi khuẩn thuộc chi Erwinia đều cho phan ứng catalase dương tính. Kết quả kiểm tra phản ứng catalase trong dung dịch H2O2 3% cho thay 39 dong vi khuan phân lập đều dương tinh.
Kết quả kiểm tra sự phát quang của khuẩn lạc.
Khuẩn lac Erwinia sp. cấy trên môi trường King B sẽ không phát quang khi chiếu tia UV bước sóng 366 nm (Bereswill va ctv, 1977). Kết quả ghi nhận 39 dong vi khuân
phân lập được đều không phát quang.
Bang 4.2. Kết qua phân lập Erwinia sp.
Địa điểm thu mẫu Số lượng Số khuẩn lạc nghi ngờ Kí hiệu
Thủ Đức 8 14 HI — HI4
Quận 9 2 2) H15 — H19
Chợ nông sản (Thu Đức) 8 20 Cl >C20
Tổng cộng 18 39
HT: mau hoa hồng, C: mau rau cải.
27
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của các đòng vi khuẩn phân lập
Dòng vi Nhuộm Phát Dong vi Nhuộm Phat
khuẩn Gram Catalase quang khuan Gram Catalase quang
Cl G + - HI G + :
C2 G + : H2 G + : C3 G + : H3 G + "
Cá G + : H4 G + : C5 Œ + - HS Œ + - Có G 1 : H6 Gc + : C7 G + - H7 Œ + -
C8 G ch - HS G + -
C2 G + : H9 G + “
C10 G ” 7 H10 G sp
C11 G + - HII đỡ + a
C12 G + - H15 G re - C13 G of - HI3 G + - C14 G ofe 2 H14 Œ # “ cls G + - H15 G fe :
C16 G + - H16 G + -
C17 G + - H17 G đề - C18 G fi - H18 G + :
C19 G + : H19 G + -
C20 G + - Tổng 39
G: Gram âm, +: dương tính, -: không phát quang.
4.3. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA
Tiến hành phan ứng PCR 16S rRNA với cặp primer 63F - 1489R khuếch dai vung trinh ty 16S rRNA dé khang định các mau DNA ly trích được có bộ genome của vi khuẩn. Hình 4.9 cho thấy DNA của 39 mẫu vi khuẩn đã khuếch đại thành công trong PCR với sản phẩm có kích thước khoảng 1500 bp, sáng, rõ chứng tỏ quá trình ly trích DNA tổng số có chất lượng tốt, không xuất hiện hiện tượng phân hủy DNA tổng số.
28
Dựa vào kết quả trên có thê khăng định DNA của 39 mẫu ly trích là từ vi khuẩn và được sử dụng cho phản ứng PCR ở các thí nghiệm tiếp theo.
C2 *ŒG9' 464 f5” Gr %7 * Ct Co GIÓ 7TGl]l Be)
Cl Cla Gide Giả (GIÓ Clio (C19. CO C20 (})
H3 H4 HS Hồ H7 H§ H9 HI0 (-)
L ii. Hil3 Hl4 HI5 H16 H17 His HI9 (-)
Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR 16S rRNA. (L) ladder 1 kb;
(-) doi chứng âm.
4.4. Kết quả xây dựng phản ứng PCR phát hiện chi Erwinia
4.4.1. Kết quả phản ứng PCR với cặp primer EuniF - EuniR trên 39 mẫu vi khuẩn
phân lập
29
Sử dụng cặp primer EuniF - EuniR để thực hiện phản ứng PCR phát hiện chỉ Erwinia trên 39 mẫu DNA vi khuẩn phân lập được, thành phan phản ứng và chu trình nhiệt như Bảng 3.3 và Bang 3.4. Kết quả cho thấy cặp primer EuniF - EuniR phát hiện chi Erwinia khuếch đại thành công trên 39 mẫu phân lập với kích thước sản pham khuếch đại khoảng 1202 - 1204 bp giống với kích thước sản phẩm dự kiến.
1202 - 1204 bp
1202 - 1204 bp
2Ó 00009 26/020 le 3Ù: 33.34 35 36 37 33 39 (-)
1202 - 1204 bp
———
4.4.2. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer EuniF va EuniR
Tiến hành phan ứng PCR với cặp primer EuniF - EuniR ở nhiệt độ 56°C sử dụng 5 mẫu đối chứng là loai vi khuẩn Ralstonia solanacearm, Bacillus megaterium; Bacillus subtillis; Lactobacillus plantarum; Bacillus licheniformis. Điện di sản pham PCR cho thay cặp primer phát hiện cho chi Erwinia vẫn co khả năng khuếch đại trên các dòng vi khuẩn đối chứng khác nhưng sản phẩm khuếch đại không cùng kích thước so với loài đối chứng là Erwinia carotovora. Điều này cho thay cặp primer phát hiện chi Erwinia van chưa thật sự đặc hiệu cho chi Erwinia, tuy nhiên van có sự khác biệt về mặt kích thước sản phẩm khuếch đại (Hình 4.1 1).
30
1202 - 1204 bp
Hình 4.11. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu primer phát hiện
chi Erwinia. (L) ladder 1 kb; (+) Erwinia carotovora; (-)
Đối chứng âm; (1) Ralstonia solanacearum; (2) Bacillus
megaterium; (3) Bacillus subtillis; (4) Lactobacillus plantarum; (5) Bacillus licheniformis.
4.5. Kết qua khảo sát và xây dựng quy trình PCR phát hiện loài E. carotovora 4.5.1. Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp
Sử dung cặp primer EcaF - EcaR dé thực hiện phản ứng PCR phát hiện loài E. carotovora dựa trên mẫu đôi chứng dương là vi khuan E. earofovora với thành phần
phản ứng và chu trình nhiệt như Bang 3.5 và Bang 3.6. Cap primer EcaF (Ta=54,8°C)
và EcaR (Ta=54.8°C) nên tiến hành khảo sát nhiệt độ trong khoảng từ 55°C đến 65°C.
Sản phẩm dự kiến của cặp primer phát hiện loài E. carotovora có kích thước dự kiến là 222 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR Hình 4.12 cho thay ở nhiệt độ 55°C, 58°C, 60°C cho sản phâm khuếch đại đa band nên nhiệt độ chưa tối ưu cho phản ứng PCR. Khi tăng nhiệt độ bắt cặp lên 63°C thì cặp primer khuếch đại đặc hiệu và cho sản phâm đơn band đúng với kích thước sản phẩm dự kiến là 222 bp.
222 bp
Hinh 4.12. Kết quả khảo sát nhiệt độ bat cặp của primer EcaF và EcaR. (L) ladder 1 kb;
(1)(2) Doi chứng dương E. carotovora.
31
4.5.2. Kết quả khảo sát nồng độ primer
Thực hiện phản ứng PCR khảo sát nồng độ primer của phản ứng phát hiện /oài E. carotovora dựa trên mẫu đối chứng. Tiến hành khảo sát trên 4 nồng độ primer 0,3 - 0,5 - 0,8 - 1. Kết quả Hình 4.13 cho thay ở nồng độ 0,3 uM thì band xuất hiện mờ còn nồng độ 1 uM thì cho kết quả band sáng nhưng thành phan dimer - primer nhiều nên chọn nồng độ 0,8 uM là nồng độ tối ưu cho phản ứng PCR phát hiện loài E. carotovora.
Hình 4.13. Kết quả khảo sát nồng độ primer EcaF va EcaR. (1) ladder 1 kb; (-) Đối chứng âm; (1) 0,3 uM:
(2) 0,5 uM; (3) 0,8 uM; (4) 1 uM.
4.5.3. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện loài
E. carotovora.
Phan ứng PCR kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer EcaF - EcaR được thực hiện trên các mẫu đối chứng là vi khuẩn Ralstonia solanacearm và các loài vi khuẩn Bacillus.
Kết quả điện di sản phẩm PCR Hình 4.14 cho thay primer chỉ khuếch đại được sản pham 222 bp ở loài E. carotovora mà không khuếch dai cho các dòng vi khuẩn khác và đặc biệt Ralstonia solanacearm là một loài vi khuan thuộc nhóm Pseudomonas có cùng nhóm với E. carotovora. Từ đó khẳng định cặp primer EcaF - EcaR đã thiết kế là đặc
hiệu cho loài E. carotovora.
Kết quả do OD của mẫu DNA đối chứng đương E. carotovora có nồng độ trung bình là 36,7 ng/pl và A260/A280 là 1,894 nhằm xác định giới hạn thấp nhất hàm lượng DNA của vi khuẩn mà phương pháp PCR có thé phát hiện được. Xác định bởi sự pha loãng của acid nucleic được tinh sạch. Kiểm tra độ nhạy của phản ứng PCR, mẫu DNA của đối chứng dương E. carotovora sẽ được pha loãng ở các mức pha loãng là 10 lần, 100 lần, 1000 lần, 10000 lần, 100000 lần, sau đó tiến hành phản ứng PCR với thành
32
phan phản ứng va chu trình nhiệt như Bang 3.7 và Bảng 3.8. Kết quả điện di Hình 4.15 cho thấy phát hiện 100% DNA vi khuẩn E. carotovora ở nồng độ pha loãng tối thiểu
1000 lần tương ứng nồng độ DNA là 36,7 x 103 ng/ul.
222 bp
—
Hình 4.14. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu
cua primer EcaF và EcaR. (L) ladder 1 kb;
(+) Erwinia carotovora; (-) Đối chứng âm;
(1) Ralstonia solanacearum; (2) Bacillus megaterium; (3) Bacillus subtilis; (4) Lactobacillus plantarum, (5) Bacillus licheniformis.
222 bp
Hình 4.15. Kết qua kiểm tra độ nhạy phan ứng
PCR phát hiện loài E. carotovora. (L) Ladder I kb;
(1) 10; (2) 100; (3) 1000; (4) 10000; (5) 100000;
(-) đối chứng âm.
4.6. Kết quả phản ứng PCR phát hiện loài E. carotovora trên các dòng vi khuẩn
phân lập
Từ kết quả xây dựng thành công quy trình PCR phát hiện loài E. carotovora dựa trên đối chứng dương, tiễn hành thực hiện phản ứng PCR phát hiện loài E. carotovora
33
trên 39 dong vi khuẩn đã phân lập. Phản ứng được thực hiện theo quy trình đã xây dựng, Hình 4.16 kết quả cho thấy các giếng số 2 (mẫu C2), giếng 3 (mẫu C3), giếng 12 (mẫu C12), giếng 13 (mẫu C13), giếng 14 (mẫu C14), giếng 15 (mẫu C15), giếng 16 (mẫu C16), giếng 19 (mẫu C19), giếng 20 (mẫu C20), giếng 22 (mẫu H2), giếng 24 (mẫu H4), giếng 28 (mẫu H8), giếng 32 (mẫu H12) primer khuếch đại sản phâm PCR có cùng kích thước với sản phâm ở mẫu đối chứng dương là 222 bp. Các dòng vi khuẩn còn lại không xuất hiện sản phẩm PCR có thé là các loài Erwinia sp. khác. Sau đó dé kiểm tra kết quả PCR, chọn mẫu đã cho kết quả đương tính với vi khuẩn E. carotovora (mẫu C2) dé tiến
hành giải trình tự vùng 16S rRNA.
16 17 18 19 20
222 bp
21 22 Oa 24 25 26 Ye 2s 29° G) G&G)
L
Hinh 4.16. Két qua phản ứng PCR phát hiện loài E. carotovora
trên các dong vi khuân phân lập. (1) Ladder 1 kb; (+) Doi chứng dương; (-) Doi chứng âm.
34
Kêt quả giải trình tự va so sánh trên cơ sở dir liệu.
Sequences producing significant alignments Download ~ Select columns ~ Show | 100v | @
select all 100 sequences selected GenBank Graphics Distanc sults MSA Viewer
Max Quay E
Na...
Seientine Name
ne 2 Score Score Cover value ce. Len
Pactobacterum... 1838 1838 94% 0.0 1419 K
Eeclobacletlum... 1032 1632 94% 00 137W
Pectobacterum... 1832 12620 97% 00 5003614 C Psclobncleilum.... 1832 1632 97% 00 1382 Pactobactenum.. 1032 12797 97% 0.0 4099090
2 07% 00 9715% 4862013 € Esclobnclerlum... 1832. 12
Pactobactonum... 1027 1627 94% 00 1470
Pestobacterum... 1827 1827 97% 00 1461 E Eaclobnclerlum.... 1623 00 1603k Peglobiclerlum... 1821 1821 97% 0.0 1504 Ƒ
Peclobacleium . 1820 1820 97% 00 1600
Hình 4.17. Kết quả so sánh trình tự của mẫu C2 trên ngân hàng gen
NCBI.
Kết quả giải trình tự mẫu C2 được so sánh với các trình tự của loài E. carotovora đã công bố trên ngân hàng gen NCBI bằng công cụ Blast, kết qua cho thấy sản phẩm khuếch đại có độ tương đồng cao đến 98,2% so với trình tự đã công bố trên NCBI. Từ kết quả trên kết luận rằng mẫu C2 là vi khuẩn E. carotovora.
—H— KC113175.1 Erwinia amylovora strain KSI 1412 93 MWB44752.1 Erwinia amylovora strain Ea76
MT778067.1 Erwinia tasmaniensis Et1/99
= —. MT776430.1 Erwinia tasmaniensis Et1/99
JF494830.1 Erwinia billingiae strain PW208
85 Am. KR088353.1 Erwinia bilingiae strain BK18
==. . AB713559.1 Erwinia chrysanthemi gene for 16S rRNA 73 GU362078.1 Erwinia chrysanthemi strain IMI 389157
75 L—T — MT579574.1 Pectobacterium atrosepticum strain JB107 99 MG591808.1 Pectobacterium atrosepticum strain SJY-4 OP458448.1 Pectobacterium atrosepticum strain Pa-CP3 TT MW486657.1 Pectobacterium aroidearum strain MTL1911110202
69 L——— OM721736.1 Pectobacterium aroidearum strain XYmy-A1
MT322310.1 Erwinia papayae strain 2 CCRP2 16S ribosomal RNA gene 34 GU936993.1 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum strain KNU28210
L—_ HW622345.1 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum strain Wudahuaya
51 -—— Erw-63F H11 23
|____ xx525243.1 Pectobacterium carotovorum strain 141108
73 _—T.. ectobacterlum sp. strain
45
Hinh 4.18. Két qua phân tích cây phát sinh loài dựa trên trình tự ving 16S rRNA.
(Erw-63F H1123) Mau C2.
68
35
GQ464391.1 Uncultured Enterobacteriaceae bacterium clone 2-1