3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 07 năm 2022 đến tháng 12 năm
2022.
Đề tài khóa luận được thực hiện tại RIBE 302-304, phòng thí nghiệm Bệnh học và chân đoán phân tử, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Các mau vi khuân Erwinia sp. phân lập từ các mẫu lá cây hoa hồng và rau cải có dau hiệu bị bệnh thối nhữn. Tổng cộng có 10 mau lá hoa hồng được thu tại các vườn hoa hồng Tp. Thủ Đức, Quận 9 (Tp. Hồ Chí Minh) và 8 mẫu rau cải bị bệnh thối nhữn
thu tại các chợ nông sản Thủ Đức.
Mẫu đối chứng dương là vi khuan Erwinia carotovora được cung cấp bởi Khoa Nông Nghiệp, Trường Đại học Cần Tho, Thành phố Cần Thơ.
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
Máy tính, các phần mềm ứng dụng tin sinh học.
Dụng cụ thí nghiệm bao gồm: đĩa petri, que cấy vòng, que cấy trang, đèn côn, ống nghiệm, giá đựng ống nghiệm, micropipette, đầu tuýp, eppepdorf.
Các trang thiết bị: máy PCR (Mastercycler Nexus GSX1, Eppendorf - Đức), máy
ly tam Microfuge 16 (Beckman Coulter, Đức), may vortex (OSI Rotolab), cân điện tử
(ScoutPro, Trung Quốc), máy điện di gel (Mupid - Exu — Nhật Bản).
3.2.3. Môi trường và hóa chất
Môi trường nuôi cấy King B (peptone 20 g/l; MgSOx.7HaO 1,5 g/l; KaHPO¿ 1,5 g/l; Glycerol 15 ml/I; agar 20 g/l). Môi trường King B có bổ sung thêm khang sinh
Cycloheximide 0,1%.
Môi trường tang sinh LB (peptone 10 g/l; NaCl 10 g/l; yeast extract 5 g/l).
Hóa chat: STE buffer (pH = 8; Nacl 100 nM, Tris - HCl 10 nM, EDTA 1 mM), chloroform, Ethanol, Isopropanol, GelRed (TBR, Việt Nam), thang chuẩn 1 kb (BioLabs
- England), agarose, dung dich dién di TBE (Tris HCI: Borate: EDTA).
12
3.3. Phương pháp nghiên cứu
Thu mâu và xử lí mâu
— — Thiết kế và kiểm tra độ đặc hiệu Phân lập và chọn lọc Erwinia primer băng công cụ tin sinh học ứng
dụng
Ly trích DNA tông số
Thực hiện PCR VỚI Các
———| chung vi khuân phân |£———
lập
Ỷ Ỷ
Xây dựng quy trình PCR phát Xây dựng quy trình PCR phát hiện E. carotovora băng cặp hiện chi Erwinia bang primer đã
primer đã thiệt kê thiệt kê
Điện di và đánh giá kết quả
Hình 3.1. Sơ đồ quy trình thực hiện nghiên cứu.
3.3.1. Thiết kế primer
Primer là các trình tự oligonucleotide ngắn có thể bám đặc hiệu vào một vùng trình tự nhất định. Primer là điểm khởi đầu để DNA polymerase có thé thực hiện tổng hợp mạch bé sung mới cũng như xác định đoạn DNA được khuếch đại. Do đó, việc thiết kế primer sẽ quyết định mức độ đặc hiệu của phản ứng.
Phân tích so sánh hệ gen của Erwinia sp. trên web NCBI dé chọn lọc được đoạn trình tự đặc biệt cho vi khuẩn chi Erwinia và loài Erwinia carotovora.
Hai cap primer đặc hiệu của chi vi khuẩn Erwinia và loài Erwinia carotovora
được thiết kế bằng phần mềm Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) dựa trên đoạn
trình tự đặc biệt từ kết qua phân tích hệ gen của vi khuẩn.
Các cặp primer sau khi thiết kế sẽ được kiểm tra bằng phần mềm in-silico PCR amplification (http://insilico.ehu.es/PCR/) dé đánh mức độ bắt cặp cũng như độ đặc hiệu của các cặp primer đã thiết kế được có tính đặc hiệu chuyên biệt, phát hiện các gen của
loài mong muôn.
13
Ì Primer Aplus interface sautions | _EAQAWIKI Primer3 (v.0..0) Pick primers froma DNA sequence.
There is a newer version of Primer3 available at http://primer3.wimit.edu/
Paste source sequence below (9->3!, string of ACGTNacgtn ~ other leters weated as N — oumbers and blanks ignored). FASTA formar ok.
Please N-out undesirable sequence (vector, ALUs, LINEs, cic.) or use a Misarirnins Library (msgsaf library): | non '
[5 Pick left primer, Pick Rybedization probe (intemal Pick right primer, or use right primer Below Jor use ie primer below: 5(otlgo),or use oligo below: Sto 3! on opposite strand)
hàng A ing ety yo mượn
: Eg. 30.2 requires primers to sorooed the 2 bases at positions 50 and 51. Or mark the source sequence wih {and
cee eg. ATCTICCCCITCAT. means ha primers must flank the eenalCCCC
Excloded 1g. 40127 68.) fofDydex©lEcton of primer In the 7 bascs starting at 401 and the 3 Dates a 6%, mark the
Repons: sounce sequence with < and >: e.g. ATCT TCA... forbids primers in the central CCCC.
Product Size Ranges T15 358 15 83 151-488 404-89 1đỉ.488 61-388 ỏỉ-S:2 wi 1805 Nunsr To Rctum 5 ‘Max.2 Stability %©
Max Repeat Mispriming (1260 | Pair Max Repeat Mispriming 24.09
‘Max Template Mispoming 12.00 Pair Max Template Mispriming 24.00
General Primer Picking Conditions
Primer Size Min: [is] Ope 3] Max: (37
Primer Tm Min: ($70 | Ope: $ò© | Max: [63.6 | Max Tm Difference: (1006 | Table of shermodynamic parameters: | Sreslauer ot si 1988 (
Max: 288
So =
Primer GC% Min: [706] Ope
Hinh 3.2. Giao dién Primer3.
In silico PCR amplification
Input primers in fasta format Primer 1’ s-| be Primer 2’ 5-| ức
Migroorganism
APPLY TO ALL Erwinia vị
© Include plasmids (if available)
Allow mismatches, but in nucleotides in 3' end
Maximum length of bands 3000 nucleotides
a Degenerated nucleotides are allowed; A+T+G+C must be 10 or more.
Info
Hinh 3.3. Giao dién Insilico.
3.3.2. Thu mẫu và phan lập vi khuẩn Erwinia sp.
3.3.2.1. Phương pháp thu mẫu
Tiến hành thu thập các mẫu lá cây hoa hồng và rau cải có triệu chứng đặc trưng của bệnh thối nhiin. Kết quả thu thập được 10 mẫu lá hoa hồng tại các vườn trồng cây hoa hồng ở TP. Thủ Đức và 8 mẫu rau cải bị bệnh thối nhiin tại các chợ nông sản Thủ
Đức.
Mau sau khi thu sẽ tiến hành rửa bằng nước cat dé loại bỏ các bụi ban và các sinh vật biểu sinh. Cắt mẫu thành những đoạn nhỏ tại điểm tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe, cho vào cối sứ và nghiền nát bằng chày sứ, thêm vào cối khoảng 2 ml nước cất khử trùng. Hút phần dịch nghiền cho vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng King B lỏng và đem ủ ở 28°C trong 24h. Sau thời gian ủ tăng sinh mau sẽ được tiến hành các thí nghiệm tiếp theo dé phân lập vi khuan Erwinia sp. trên môi trường King B có bé
sung kháng sinh Cycloheximide 0,1%.
Hình 3.4. Mẫu lá có triệu chứng của bệnh thối nhiin.
(a) Mẫu lá hoa hông; (b) Mau lá rau cải.
14
3.3.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn
Mẫu sau khi được xử lý sau đó tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng King B lỏng khoảng 12h đến 24h.
Chuẩn bị 6 ống nghiệm có chứa 9 ml môi trường LB đã được hấp vô trùng được đánh số thứ tự từ 1 đến 6. Dùng micropipette hút 1 ml dung dich tăng sinh cho vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều, được nồng độ 101. Hút tiếp 1 ml từ ống nghiệm 1 sang ống nghiệm 2, vortex, được nồng độ 107, cứ tiếp tục làm tương tự cho đến ống nghiệm cuối cùng. Chọn 3 ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10%, 105, 10° ding micropipette hút 100 ul từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường King B có bổ sung kháng sinh Cycloheximide 0,1% (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần), đùng que cấy trang dé trang đều dich khuẩn cho thật khô. Sử dung paraffin quan đĩa lại dé tránh nhiễm khuẩn từ bên ngoài, sau đó đem đi ủ ở nhiệt độ 28°C trong 48h. Quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa, chon các khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuân Erwinia sp. dùng que cấy vòng bat và ria lại trên môi trường King B dé làm thuần. Cay ria cho đến khi có khuẩn lạc thuần, sau khi làm thuần tiến hành bắt khuẩn lạc dé tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng LB dé ly trích thu DNA tổng số và giữ nguồn các chủng vi khuẩn đã phân lập được (tỷ lệ 7 ml LB có khuẩn: 3 ml glycerol).
3.3.2.3. Kiếm tra các phản ứng sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn Erwinia sp.
Nhuộm Gram:
Mục đích: phương pháp nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm là Gram âm và Gram dương dựa trên các đặc tính hóa lý của vi khuẩn.
Phương pháp: dùng một miếng lam nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng, làm vết bôi vi khuẩn. Sau đó cô định vi khuẩn trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm với Crystal violet trong 1 phút, sau đó rửa với nước. Tiếp tục nhuộm với dung dịch Lugol trong | phút, sau đó rửa với cồn 96° đến khi giọt cồn chảy xuống không còn màu xanh. Rửa tiếp với nước.
Nhuộm bồ sung phẩm màu Safarin trong 30 giây, sau đó rửa với nước. Phơi khô lam và quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần (nếu quan sát dưới vật kính 100X phải nhỏ thêm giọt dau soi kính). Nếu là vi khuẩn Gram dương sẽ bắt mau tim, vi khuẩn Gram âm sé bắt màu hồng. Chọn lọc những mẫu là vi khuẩn Gram âm, hình que dé tiễn hành các thí nghiệm tiếp theo.
lŠ
Kiểm tra phản ứng catalase:
Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí và ky khí tùy nghi chứa chuỗi điện tích có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các ton thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (HzO2)
thành HaO và giải phóng O2, gây hiện tượng sti bọt khí.
Phương pháp: Nhỏ vài giọt H2O>2 lên vi khuẩn phân lập, quan sát và ghi nhận hiện tượng sui bọt. Vi khuẩn Erwinia sp. cho phản ứng dương tính với catalase.
Kiểm tra sự phát huỳnh quang:
Khuan lạc Erwinia sp. cay trên môi trường King B sẽ không phát quang khi chiếu
tia UV bước sóng 366 nm (Bereswill va ctv, 1997).
3.3.3. Ly trích DNA vi khuẩn va kiểm tra chất lượng DNA tống số 3.3.3.1. Quy trình ly trích DNA vi khuẩn
DNA vi khuẩn được ly trích theo phương pháp của Sambrook và ctv, 2001.
Bước 1: Dùng micropipette hút 1 ml dich tăng sinh vi khuẩn cho vảo tube 1,5 ml, sau đó cho vào máy ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nổi thu tủa (bước nảy lặp lại 3 lần).
Bước 2: Rửa cặn khuẩn bang STE. Hút 400 pl dung dich STE cho vào phan tủa còn lại vortex dé rửa, sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nôi (bước này lặp lại 2 lần).
Bước 3: Dung micropipette hút 400 pl Lysis buffer, vortex va đem u ở nhiệt độ 65°C trong 1 giờ.
Bước 4: Sau thời gian ủ, hút 300 ul dung dich PCI cho vào tube, đảo đều, ly tâm
13000 vòng/phút trong 10 phút.
Bước 5: Dùng micropipette hút 300 ul dich nổi cho vào tube mới, sau đó thêm
100 pl chloroform (3:1), ly tâm 13000 vòng/phút trong 8 phút.
Bước 6: Hút 200 ul dich nổi cho vào tube mới, sau đó thêm 100 pl Isopropanol, đảo nhẹ cho đồng nhất mẫu rồi mang đi ủ lạnh trong 30 phút. Dem ly tâm 13000 vòng/phút trong 13 phút, bỏ dịch nổi thu kết tủa.
Bước 7: Rửa tủa, hút 480 ul ethanol 70% cho vào tube, ly tâm 13000 vòng/phút
trong 10 phút, loại bỏ dich nổi (bước nay lặp lại 2 lần), sau đó dé khô tự nhiên.
Bước 8: Thêm 50 ul TE buferr, bao quản -20°C.
16
3.3.3.2. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn trình tự 16S rRNA để kiểm tra chất lượng DNA tổng số
Sau khi ly trích DNA từ các mẫu vi khuẩn phân lập được, tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA với cặp primer 63F - 1489R. Phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA nhằm kiểm tra chất lượng DNA đã ly trích có đủ điều kiện làm mạch khuôn cho các thí nghiệm kiểm tra primer tiếp theo hay không.
Phản ứng được thực hiện với thành phần phản ứng Bảng 3.1 và chu trình nhiệt Bảng
3.2.
Bang 3.1. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA
Thành phần Nông độ gốc Nông độ cuối Thể tích (ul)
Buffer 5X 1X 2 Taq Polymerase 5U 1U 0,1
Primer F 10 ng/ul 0,5 ng/Hl 0,5 Primer R 10 ng/Hl 0,5 ng/ul 0,5 DNA khuôn 1
H,O 5,9
Tổng 10 ul
Bảng 3.2. Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Tiền biến tính 95°C 3 phút l
Biến tính 95°C 30 giây
Bat cap eC 30 giây 35
Kéo dai 72°C 30 giây
Hậu kéo dai HE 5 phút i Bao quan 4°C
Phản ứng PCR 16S rRNA bao gồm giai đoạn tiền biến tinh ở nhiệt độ 95°C trong 3 phút, sau đó thực hiện 35 chu kỳ gồm giai đoạn biến tính 30 giây ở 95°C, bắt cặp 30
giây ở 52°C, kéo dài 30 giây ở 72°C. Sau cùng thực hiện 1 chu kỳ ở giai đoạn hậu kéo
dai ở 72°C trong 5 phút. Tat cả các sản phẩm sé được bảo quản ở 4°C.
T7
Sản phẩm PCR sau phản ứng được nhuộm bằng GelRed (TBR, Việt Nam) va dién di trén gel agarose 1%, trong dung dich dém TBE 0,5X, hiéu dién thé 100V trong 25 phút. Kết quả được quan sát bang máy chụp UV.
3.3.4. Xây dựng quy trình PCR phát hiện chi vi khuẩn Erwinia
3.3.4.1. Thực hiện phản ứng PCR phát hiện chi Erwinia
Các DNA của chủng vi khuẩn phân lập được thực hiện phản ứng PCR với cặp primer EuniF - EuniR có thành phan phản ứng Bảng 3.3 và chu trình nhiệt Bang 3.4.
Bang 3.3. Thành phan phản ứng PCR phát hiện chi vi khuẩn Erwinia
Thành phần Nông độ gốc Nông độ cuối Thể tích (11)
Buffer 5X 1X 2
Taq Polymerase 5U IU 0,1 Primer F 10 ng/ul 0,5 ng/HÌ 0,5 Primer R 10 ng/ul 0,5 ng/ul 0,5 DNA khuôn 1
H,O 59
Tong 10 pl
Bang 3.4. Chu trình nhiệt phan ứng PCR phát hiện chi vi khuẩn Erwinia
Giai doan Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Tiền biến tính 95°C 3 phut |
Biến tính 95°C 30 giây
Bat cap 56°C 30 giây 35
Kéo dai IPC 30 giây
Hậu kéo dai 72°C 5 phút | Bảo quản 4°C
Tiến hành phản ứng PCR phát hiện chi vi khuẩn Erwinia trên 39 mẫu DNA vi khuẩn ly trích với cặp primer Euni-F và Euni-R. Quy trình PCR được thực hiện với nhiệt độ bắt cặp là 56°C. Sản phẩm PCR sau phản ứng được điện di trên gel agarose 1%, trong dung địch đệm TBE 0,5X, hiệu điện thế 100V trong 25 phút. Kết qua được quan sát bằng máy chụp UV.
18
3.3.4.2. Kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer EuniF và EuniR
Đề kiểm tra độ đặc hiệu của cặp prmer EunIF và EunIR thực hiện phản ứng PCR trên 5 mẫu DNA vi khuẩn đã được định danh (Ralstonia solanacearum; Bacillus
megaterium; Bacillus subtillis; Lactobacillus plantarum; Bacillus licheniformis) được
cung cap bởi phòng thí nghiệm Bệnh học và chan đoán phân tử, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Phản ứng PCR này sẽ được thực hiện theo thành phần phản ứng Bảng 3.3 và chu trình nhiệt Bảng 3.4. Và sản phẩm PCR sau phản ứng được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1%, trong dung dịch đệm TBE 0,5X, hiệu điện thế 100V trong 25 phút.
3.3.5. Khảo sát và xây dựng quy trình phản ứng PCR phát hiện loài E. carotovora
3.3.5.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp
Mỗi cặp primer khuếch đại cho mỗi đoạn gen sẽ có một khoảng nhiệt độ bắt cặp tối ưu đề khuếch đại gen đó. Vì vậy phản ứng khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu được thực hiện trên mẫu đối chứng có sẵn và từ đó nhiệt độ tối ưu nhất sẽ được chọn là nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng phát hiện mẫu DNA vi khuẩn phân lập.
Tiến hành thực hiện phản ứng PCR trên mẫu đối chứng dương là vi khuẩn Erwinia carotovora và tôi ưu hóa với các nhiệt độ bắt cặp (Ta) của phản ứng từ 55°C đến 65°C. Các nhiệt độ của thử nghiệm này dựa trên nhiệt độ bắt cặp của cặp primer đã thiết kế (mục 3.3.1) với nhiệt độ primer EcaF: 54,8°C và primer EcaR: 54,8°C. Thanh phan phan ứng và chu trình nhiệt được trình bay ở Bang 3.5 và Bang 3.6, ghi nhận kết quả từ đó chọn ra nhiệt độ bắt cặp tối ưu nhất dé thực hiện các phản ứng tiếp theo.
Bảng 3.5. Thành phan phản ứng PCR khảo sát nhiệt độ bat cặp phát hiện E. carotovora Thành phần Nông độ gốc Nông độ cuối Thể tích (wl)
Buffer 5X 1X 2 Taq Polymerase 5U 1U 0,1
Primer EcaF 10 ng/ul 0,5 ng/HÌ 0,5 Primer EcaR 10 ng/ul 0,5 ng/ul 0,5 DNA khuôn 1
H,O 5,9
Tổng 10 pl
19
Bang 3.6. Chu trình nhiệt phản ứng PCR khảo sát nhiệt độ bat cặp phát hiện E. carotovora Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Tiền biến tính 95°C 3 phút 1 Bién tinh 95°C 30 giây
Bat cap 55°C- 65°C 30 giây 35
Kéo dai TLC 30 giây
Hậu kéo dai 725G 5 phút | Bảo quản 4C
Sản phâm PCR sau phản ứng được nhuộm bằng GelRed (TBR, Việt Nam) va dién di trén gel agarose 1%, trong dung dich dém TBE 0,5X, hiéu dién thé 100V trong 25 phút. Kết quả được quan sát bằng may chụp UV.
3.3.5.2. Khảo sát nồng độ primer
Sau khi đã xác định được nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng PCR phát hiện loài E. carotovora, tiên hành thí nghiệm khảo sát nồng độ primer của phan ứng. Thi nghiệm khảo sát trên 4 nồng độ primer từ 0,3; 0,5; 0,8; 1 uM nhằm chon ra nồng độ primer tối ưu nhất dé phản ứng PCR phát hiện loài vi khuẩn E. carotovora đạt hiệu qua cao và cho kết quả điện di có band sáng rõ dé quan sát nhất. Thành phần phản ứng và
chu trình nhiệt được trình bảy ở Bảng 3.5 và Bảng 3.6.
3.3.5.3. Kiểm tra độ đặc hiệu và độ nhạy của cặp primer EcaF - EcaR
Từ thí nghiệm khảo sát nhiệt độ bắt cặp và khảo sát nồng độ cặp primer EcaF - EcaR dựa trên đối chứng dương E. carotovora cho phản ứng với nhiệt độ bắt cặp là 63°C và nồng độ primer tối ưu là 0,8 uM cho một phản ứng. Từ đó tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của primer cần thực hiện phản ứng PCR trên 5 mẫu DNA vi khuẩn đã được định
danh (Ralstonia solanacearum, Bacillus megaterium, Bacillus subtillis; Lactobacillus
plantarum; Bacillus licheniformis) được cung cấp bởi phòng phòng thi nghiệm Bệnh học và chân đoán phân tử, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt
như Bảng 3.7 và Bảng 3.8.
20