Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Xây dựng quy trình phát hiện ToMV (Tomato Mosaic Virus) và ToMMV (Tomato Mottle Mosaic Virus) bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ToMV Tomato mosaic virus và TOMMV Tomato mott

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ToMV (Tomato mosaic

virus) và TOMMV (Tomato mottle mosaic virus) BANG KY

THUAT MULTIPLEX RT - PCR

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : HÀ TUYET ANH

Mã số sinh viên: : 19126007

Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thú Đức, 08/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ToMV (Tomato mosaic

virus) và TOMMV (Tomato mottle mosaic virus) BẰNG KY

THUAT MULTIPLEX RT —- PCR

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS HUYNH VĂN BIẾT HÀ TUYET ANH

TP Thủ Đức, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu nhà Trường, BanChủ nhiệm Khoa cùng với các thầy cô Khoa Khoa học Sinh học — Trường Dai học NôngLâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo cơ hội học tập và truyền đạt cho em những kiếnthức bồ ích trong suốt thời gian học tập tại trường cùng với những lời nhận xét, góp ý

giúp cho đề tài của em thêm hoàn thiện

Em xin chân thành cảm ơn Viên nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường

— Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện và cung cấp

cơ sở vật chất dé em có thé hoàn thành khóa luận

Em xin được bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến thầy TS Huỳnh Văn Biết đã chỉdạy và tạo điều kiện tốt nhất, truyền đạt những kiến thức hữu ích cho em trong toan bộquá trình, anh Trương Quang Toản nhiệt huyết luôn quan tâm, đồng hành và tận tình

dạy bảo cùng với các anh, chị, các bạn làm việc tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử

đã giúp đỡ va động viên em Day là một cơ hội quý giá giúp em trau d6i thêm kinhnghiệm, kỹ năng và học hỏi rất nhiều điều đáng quý cùng với những trải nghiệm vô cùng

đặc biệt và đáng nhớ, là dấu mốc đầu tiên và cũng là nguồn hành trang lớn cho em ở

hành trình dài sau nảy.

Đặc biệt, con vô cùng biệt ơn mẹ đã là chỗ dựa cho con, tin tưởng và động viên con trong suôt thời gian qua, tạo mọi điêu kiện dé con có thê học tập và rèn luyện.

Với tât cả lòng biệt ơn và sâu sắc, xin chân thành cảm ơn!

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Ha Tuyết Anh, MSSV: 19126007, Lớp: DH19SHB thuộc ngành Côngnghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóaluận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên

cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước

Hội đồng về những cam kết này

Tp Hồ Chi Minh, ngày tháng năm

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

1

TÓM TẮT

Các loài virus thuộc chỉ Tobamo là mỗi đe dọa nghiêm trọng đối với ngành canh

tác cà chua, trong đó Tomato mosaic virus (ToMV) va Tomato mottle mosaic virus

(ToMMV) la hai loài gây thiệt hại về kinh tế nặng nề nhất với mức độ phô biến cao.Việc phát hiện chính xác sự hiện diện của virus dé phục vụ cho công tác kiểm soát bệnhhiện đang là vấn đề cần thiết Nghiên cứu được tiến hành để xây dựng quy trình pháthiện đồng thời cả 2 loài TOMV và ToMMV bằng kỹ thuật Mutiplex RT-PCR Nhằmkiểm soát quá trình tách chiết nucleic acid và tổng hop cDNA, mRNA của gene §-tubulin với kích thước 450 bp được sử dụng làm đối chứng nội Mẫu chuẩn dương mangbệnh được ly trích, tổng hợp cDNA, sản pham khuếch đại có kích thước 289 bp choToMMV và 595 bp cho ToMV Kết quả phân tích trình tự gene cho thấy độ tương đồng

cao khi so sánh các trình tự trên Ngân hang gene NCBI Quy trình đã được ứng vào mẫu

thực địa phát hiện 38/60 mẫu nhiễm trùng hợp hai loài virus với nhiệt độ tối ưu 53,7 °C

và nồng độ primer ToMV : ToMMV : TUB lần lượt là 0,2 : 0,2 : 0,4 uM đạt được độ

đặc hiệu cao, không xảy ra hiện tượng bắt cặp chéo trên các đối tượng gây bệnh khác

Từ khóa: Multiplex RT-PCR, Solanum lycopersicum, Tomato mosaic virus, Tomato

mottle mosaic virus, Tobamo

11

Viruses of the genus Tobamo poses a serious threat to the tomato industry, in which Tomato mosaic virus (ToMV) and Tomato mottle mosaic virus (TOMMY) are the two species causing the most economic losses with the high popularity Accurate detection of the presence of the virus for disease control is currently a necessary issue The study was conducted to develop a procedure for the simultaneous detection of both ToMV and ToMMV species by Multiplex RT-PCR technique To control nucleotide

acid extraction and cDNA synthesis, tomato genomic mRNA of the B-tubulin gene with

the size of 450 bp was used as an internal control Positive control were extracted, synthesized cDNA, and amplified products were 289 bp for ToMMV and 595 bp for ToMV The results of gene sequence analysis showed a high similarity when comparing sequences on the NCBI Gene Bank The process was successfully applied to field samples to detect 38/60 samples infected with two virus species with an optimum temperature of 53.7 °C and primer concentration ToMV : ToMMV : TUB of 0.2: 0.2: 0.4 uM achieves high specificity, and no cross-pairing occurs on other pathogens.

Keywords: Multiplex RT-PCR, Solanum lycopersicum, Tomato mosaic virus, Tomato mottle mosaic virus, Tobamo

iv

1.1 Đặt vấn G6 occ ccc cccccccecsceseesssesessessesssassesssnsessssssssassasssssassasasessessseeseeaeaeareaeeaeeeees |

122 Muertiunghiten GỮU soi sixg1200EĐEEEITERUEURDBRGSIEGEEERTEGIISESSRRGHISESIAHISVGTEBOIEGSEBMSIESNESUEg |

13s Nội đũñg NSIS: CU ¡se cuáscnngn Gà nó 0556014884684 3555563346131004124833301E115531144085445358:483838 1

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

7.1, Tỉng tran về rấy cỗ GHHseuecoeesasogtnoibibbiDietce,E803600000310001066030G6000)100G-50040g0955108006.50/198932 3

VN N3 r0 ï8‹ 6 on 3

2.1.2 Nguồn gốc va phân bÓ - 2-2 22©2122S92E12EE2231221221121122112112212211211221211 222 4

2.2 Gad tr] CA 8n -ä-Á 4

DD 3 Grr Me TA AU ss zs a rz cm een ema ea element 4

2.2.2 Giá trị kinh tẾ ccc ccc eesessecsessessessessessessessessessessesseesessessessessessessesansaeeseseeeaeses 62.3 Tình hình canh tác và sản xuất cà chua trên thế giới và ở Việt Nam 62.3.1 Tình hình canh tác va sản xuất ca chua trên thế giới -2 2- ¿552552 62.3.2 Tình hình canh tác và sản xuất cà chua ở Việt Nam -22¿+2z+2z+zz>s2 72.4 Sơ lược về tác nhân virus gây bệnh cà chua 22- 2252+S2+E2E£2E2E22E2Ez2Ezzze, 8

2.4.1 Virus khảm cà chua ( Tomato mosaic VITUS) - - 2525222222322 £+2£++eczzeeezess 8

2.4.2 Virus kham đốm cà chua (Tomato mottle mosaic ViTUS), 2-52 22 2+s2zz52 92.5 Một số phương pháp, kỹ thuật chân đoán virus ở cả chua - 102.5.1 Phương pháp chân đoán dựa vào triệu chứng -¿- 2¿©2++22++2z+szvxze 10

2.5.2 Phương pháp chân đoán dựa vào kính hiển vi điện t -2222z55522- 11

2.5.3 Phương pháp chân đoán dựa vào huyết thanh học -2- 2 22522252: 112.5.4 Kỹ thuật chân đoán dựa vào nucleic acid +©2¿+522s2z2z222zxzzxzzzecxez 11

hiện virus gây bệnh trên cả cua G5 2222213221251 3233 2511511211511 E1 11 1 1e xrr 14

2.7.1 Tình hình ứng dụng kỹ thuật Multiplex RT — PCR phát hiện virus gây bệnh cà

chua trên thế S16 co sesveecnnenn in HÀ 011 c1001104131360391611060010040400711500111600000014 70 14

2.7.2 Tình hình ứng dụng kỹ thuật Multiplex RT — PCR phát hiện virus gây bệnh trên

Gà chữa iG Viet NAM sen chn g2 cồn ng 2G ĐEEGRšhXÿöšt JRSSS3XugGhệt LSSENSSSESESGESSVSSSEESEGAS-SSSSSXELERESSENSER 14

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2- 22©22222++2E++2EE22EECEEEEEEEEEEEerrrrrrrre 153.2 Vật liệu và hóa chất - + s+cs+s22x+E12E232212112111211211121121112111111211 21110 y6 15

8 2ele Vat LEO NSH Gi OU nganiisosenniasetittibsdYSE15050135814G975XG.NRESSSSIXSNGIGSENRSHUOINRIASHSDSSNEANREGHGKEI 15

3.2.2 Hóa chat nghiên Ctr cccccececsessesssessesesessesseessesseeesesseseeesessuetieestseeteeeseesess 15COR ae uã:ựng | ee 16

3.3 Phuong phap nghién CU 0 16

3.3.1 Kiểm tra mẫu chuẩn đương 2-2 2222222222E22EE22E222E22E2221221222122122222 2 e2 173.3.1.1 Kiểm tra đặc tính primer trên lý thuyết - 2 ©22222+22+22++2zz2z+zzxzzzzx 1Ÿ3.3.1.2 Một số tiêu chuẩn thiết kế và kiểm tra primer -2- 22552 5222z22+22z£2 173.3.1.3 Ly trích RNA mẫu chuẩn đương -2 2 222++2++2E2EE+£E+2E+zzxrzrrzrxeer 18

3.3.14 Xứ lý với enzyme DNase Ì:::.zccsssisississg11085511606101116016316304515515946581355154483580 18

3.3.1.5 Témg hop CDNA 0Ầ 19

3.3.1.6 Khuếch đại mẫu chuan dương ToMV và ToMMV -2 2222z5522 203.3.1.7 Điện đi sản phẩm PCR 2 2222222E22E22E122E22212212231221211221 2212212 203.3.1.8 Giải trình tự mẫn chuẩn đương c2 4112101016 cce 21

3.3.2 Xây dựng quy trình phát hiện virus ToMV ( Tomato mosaic virus) và ToMMV (

Tomato mottle mosaic virus) bằng kỹ thuật Multiplex RT — PCR - 213.3.2.1 Đối chứng nội cho kiểm soát quy trình 2 ©222s+2z2z++c+zz+zzzzzzz+ 21ASD, hầu sĩtniững HD pele noosankkoeaaniCiatgiscioSgiostd0dgi024050 18404080I2001701000066//080 223.3.2.3 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của hệ mồÌi - 2 2 22S2E22E22E22EE2EE2zxzzxcred 23

3.3.2.4 Khao sáb0Ð Cae HIỂU ¡ossesnndnbiesbiessssgtosbiosbbieslla3Esgiabga18xE44843993108058s803358853588E 24

3.5.3 Kháo cit ny trinh trên ei h ĐÃ «eceeneH4L HH4 ng 4465608806 26

CHƯƠNG 4 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả kiểm tra đối chứng đương - 2-2 ©2++22++2E++£E++EE++EE++EErzrxrzrxesrer 24.1.1 Kết quả kiểm tra đặc tinh primer trên lý thuyết - 2 2222222s+2zzzzzzcsz2 274.1.2 Kết quả ly trích đối chứng dương ToMV và TOMMY -5: : 294.1.3 Kết quả khuếch đại đối chứng đương ToMV và ToMMV - 294.1.4 Kết quả giải trình tự mẫu chuẩn đương - 2-22 2 2222+22E+2E+22xzxzzzzzzxe2 314.2 Kết quả xây dựng quy trình phát hiện virus ToMV (Tomato mosaic virus) vàToMMV (Tomato mottle mosaic virus) bằng kỹ thuật Multiplex RT — PCR 314.2.1 Kết quả thiết kế primer đối chứng nội cho phan ứng khảo sát quá trình tách chiết

0/9/21 31

4.2.2 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu primer TUB-E/TUB-R -2- 255225225222 324.2.3 Kết quả tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng Multiplex RT — PCR 334.2.3.1 Kết quả khảo sát nồng độ primer ToMV va primer ToMMV - 334.2.3.2 Kết quả khảo sát nồng độ primer TUB 2 2222222EE22Ez2Ezz2Ezz2zzzzc2 344.2.3.3 Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của hệ mồÌi -2- 2 2222222S222z2cze2 354.2.3.4 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu - 2 2252 2S22E2E225221121121121121121121121121 2 36

Vil

4.3 Kết qua áp dụng quy trình Multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời virus ToMV vaToMMV trên mẫu thực địa - + 2-2 522S+S22E2E92E2E22121215212121121211212121121212121 21121 xe 36CHUONG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ

5.1 KẾT Wate cece cccecccccececesceceececeesececececscescecsesecsvescavssecsveesscseseveveuseveesecsvsessvseseveesecees 42

5 9 TỔ H@ĐÏ ee 42TÀI LIEU THAM KHẢO 2-2 S£SE£EE£EEEEE2E2E21121121121211211211111211 2121 xe 43

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

vill

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

Bp : Base pairs

cDNA : Complementary deoxyribonucleic acid

ctv : Cộng tác viên

ELISA : Enzyme — Linked Immunosorbent Assay

FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations

LAMP : Loop —Mediated Isothermal Amplification

NCBI : National Center for Biotechnology Information

PCR : Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribonucleic acid

RT —PCR : Reverse transcription — Polymerase Chain Reaction

TNRV : Tomato necrotic ring virus

ToMV : Tomato mosaic virus

ToMMV : Tomato mottle mosaic virus

TUB : Beta-tubulin

ix

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Bang 2.1 Thành phần dinh dưỡng trong 100g cà chua ăn được - 2-52 5

Bang 3.1 Tên va trình tự primer dùng trong phan ứng PCR - 55555 <<++s+ 16

Bang 3.2 Thanh phan hóa chat và chu trình nhiệt cho phản ứng xử lý enzyme 19Bang 3.3 Thành phan hóa chat tổng hợp cDNA 222-222222222222222222222222222222222 19Bảng 3.4 Thanh phần hóa chat phản ứng RT — PCR khuếch đại ToMV và ToMMV 20

Bảng 3.5 Chu trình nhiệt dùng cho phan ứng khuếch đại ToMV và ToMMV 20

Bảng 3.6 Tỷ lệ nồng độ primer cho phản ứng khảo sát nồng độ primer ToMV va

510 — ,ÔỎ 22

Bảng 3.7 Tỷ lệ khảo sát nồng độ primer TUB 2-2222 5222222222E+22E22+zzxzzxz 23Bảng 3.8 Chu trình nhiệt dùng cho phan ứng khảo sát nồng độ primer 23Bang 3.9 Chu trình nhiệt sử dung cho khảo sát nhiệt độ bắt cặp của hệ môi: 24

Bảng 3.10 Các loài virus trong khảo sát độ đặc hiệu -5-5555<5+<++ 25

Bằng 4.1 Đặc tinh GÚa Priel sssscssscsoesusienssconsas sxuasaseneses 3545315 386635958384631330.26000800L303383005803 2]

Bang 4.2 Cấu trúc thứ cấp của priImer -2-©2¿©222222222EE22E+2EE2EE2EEeEErrrrerrrrer 27Bang 4.3 Cấu tric hetero-dimer (kcal/mole) của priimer - 2 2 2222522252 21Bang 4.4 Kết qua do OD mẫu đối chứng đương - 2222¿222222++22222+z2zzzz2 29Bang 4.5 Kết quả thiết kế primer đối chứng nội -2-c5¿55z2csscscscscscsc .3Ï

Bảng 4.6 Đặc tính primer TTU - cece cee 2+ 2121212 2 21H HH nh HH nàn nưy 32

Bang 4.7 Kết quả áp dụng quy trình vào mẫu thực địa -2 2222- 5525522222 40

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1 Sơ đò các bước thực hiện nghiên cứỨu - -. - 5555222222 * +22 £++zezzeeszeezxs 16

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gene mục tiêu ToMV với cặp primer

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gene mục tiêu ToMMV với cặp primer

(aes RE namenngnnuaetosiaisgtintDSDBI00SGG8000000200000:G2040300841000//IG4GUSTSGR.GG0S0N.UE.GIS00G0G0004 30

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra đặc hiệu primer TUB-F/TUB-R 32

Hình 4.4 Kết quả khảo sát nồng độ primer ToMV va primer ToMMV 33

Hình 4.5 Kết quả khảo sát nồng độ primer TUB 2- -2222222222E22EE222Ez22xzzzxz 34

Hình 4.6 Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của hệ mô 2- 225222222252 35

Hình 4.7 Kết quả điện di khảo sát độ đặc hiệu 2-22 ©5¿222222222222xz£zzzxzrxez 36

Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR ở Vườn 2+ 2222222E2222222Ez22zzxzez 37

Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR ở Vườn 2 2-©22©22222222222222zzzzcrxz 37

Hình 4.10 Kết quả điện di sản pham PCR ở Vườn 3 2-522222222222z2zzcz+2 38

Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR ở Vườn 4 - 2 2-522252222222222zz2Sc2 38

Hình 4.12 Kết quả điện di sản phâm PCR ở Vườn 5 -22©22255++22+sc5+ze2 39

Hình 4.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR ở Vườn 6 - 2522 ©2222222222z+2522 39

Hình 4.14 Kết quả điện di sản phâm PCR ở Vườn 7 -2-2-52252222222z+zzz=+z 39

XI

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cà chua (Solanum lycopersicum L.) là một loại rau quả được sử dụng làm thực

phẩm có nguồn gốc từ Nam Mỹ va trở nên phổ biến hơn tại Châu Âu vào cuối thé kỷ

16 Năm 2019, diện tích trồng cà chua trên thế giới là 5,03 triệu ha, với sản lượng 181triệu tan (FAOSTAT, 2021) Ở Việt Nam, cà chua được trồng và tiêu thụ phổ biến trongnước, trở thành loại rau ăn quả chủ lực nên được Bộ Nông nghiệp va Phát triển Nôngthôn (PTNT) ưu tiên phát triển, mở rộng diện tích canh tác

Song song với đó, việc canh tác cả chua gặp không ít khó khăn do bệnh hại gây

ra, chủ yếu đến từ các tác nhân như vi khuẩn, nắm, tuyến trùng, phytoplasma và virus

Bệnh do virus khó phát hiện, ty lệ lây lan cao nên đã ảnh hưởng rất nhiều đến việc trồngtrọt và xuất khâu cà chua Chi 7obzmovirus gây ảnh hưởng kinh tế nặng nề nhất, điển

hình là ToMV và ToMMV cùng gây nên triệu chứng khảm trên lá, hạt virus quan sát

dưới kính hiển vi có hình thái khó phân biệt

Do đó, việc xác định loài chính xác, tránh khả năng phản ứng huyết thanh họcchéo giữa các loài trong chỉ Tobamovirus gây bệnh trên cà chua nhằm giảm thiệt hại vềkinh tế cho người dân là việc ưu tiên hàng đầu Phương pháp Multiplex RT — PCR làphương pháp khuếch đại nhiều trình tự DNA trong cùng một phản ứng PCR bằng cách

sử dụng nhiều primer nên đáp ứng được tat cả các yêu cầu trên, thời gian thực hiện ngắn

và tiết kiệm hóa chất so với các kỹ thuật như RT-PCR, ELISA

Chính vì thế, đề tài “ Xây dựng quy trình phát hiện ToMV (Tomato mosaic virus)

và ToMMV (7omafo mottle mosaic virus) bằng kỹ thuật Multiplex RT — PCR” đượcthực hiện.

1.2 Mục tiêu nghiền cứu

Xây dựng được quy trình phát hiện virus ToMV (Tomato mosaic virus) va

ToMMV (Tomato mottle mosaic virus) bằng kỹ thuật Multiplex RT - PCR và ứng dụng

thành công quy trình trên mẫu thực dia.

1.3 Nội dung nghiên cứu

Xây dụng và chuẩn hóa quy trình phát hiện virus ToMV (Tomato mosaic virus)

và ToMMV (Tomato mottle mosaic virus) bang kỹ thuật Multiplex RT — PCR

1

Ap dụng quy trình phát hiện virus ToMV (Tomato mosaic virus) và ToMMV(Tomato mottle mosaic virus) bang kỹ thuật Multiplex RT — PCR trên mẫu thực địa.

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tống quan về cây cà chua

2.1.1 Phan loại khoa học

Giới (Regnum): Plantae

Phan ho (Subfamilia): Solanoideae

Tông (Tribus): Solaneae

Chi (Genus): Solanum

Loai (Species): Solanum lycopersicum

Phân loại cà chua là một van đề gây tranh cãi nhất từ trước đến nay Cà chuathuộc họ Solanaceae cùng với các cây trồng kinh tế quan trọng khác như tiêu, cà tím vàkhoai tây dựa trên sự giống nhau giữa lá và hoa

Năm 1753, cà chua được Carl Linnaeus xếp vào chi Solanum với tên gọi Solanum

lycopersicum L Tuy nhiên vào năm 1768, Philip Miller đã xếp nó vào chi Lycopersicon

và đặt tên là Lycopersicon esculentum Việc phân loại theo chi Lycopersicon được duy

trì bởi các nhà thực vật học như Muller (1940), Correll (1962), Symon (1981), D'Arcy (1991), Hunziker (2001) Tuy nhiên Wettstein (1891), Macbride (1962), Seithe (1962),

Fosberg (1987) lai sử dụng phân loại theo chi Solanum Các nghiên cứu da tiến hànhphân tích bộ gen lạp thể và thấy rằng cà chua có họ hàng rất gần với khoai tây nên đượcxem là một phần của chi Solanum (Darwin va ctv, 2003).

Phần lớn các nhà khoa học đã chap nhận và tái tích hợp ca chua vào chi Solanum

như Caicedo và Schaal (2004), Mueller và ctv (2005) với đặc điểm của chi này là cây

hằng niên hoặc lưu niên, tự thụ phan, hoa có màu vàng tươi, bao phan hợp nhất chạy

đọc theo các mép, lá có dang chân chim (Knapp và ctv, 2016).

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Việc xác định chính xác nguồn gốc cà chua là một van đề gây tranh cãi trong khihơn nhiều thế kỷ trước, cà chua được trồng trong các vườn trải dài từ Kazakstan đếnCalifornia Theo học thuyết về trung tâm phát sinh cây trồng của Vavilov, xác định được

bờ biển phía tây của Nam Mỹ, thuộc Peru là nơi phát sinh đầu tiên Pham vi hiện tại của

ho hàng ca chua hoang dã kéo dai từ mũi phía bắc của Chile ở phía nam, đến Ecuador ởphía bắc và đến nội địa từ Thái Bình Dương 100 đặm - 200 đặm, bao gồm cả quần đảo

Galapogos.

Cà chua được thuần hóa đầu tiên ở Trung Mỹ qua các bằng chứng về văn hóa,

ngôn ngữ và di truyền được khai quật bởi các nhà khảo cô học Họ đã tìm thấy ghi chép

về công thức chế biến cà chua như một món salad Ngoài ra, người Aztec ở Trung Mỹgọi cà chua là “xitomatl” với một số bộ lạc hoang đã gọi nó là “tomati”

Người Tay Ban Nha đã có công rat lớn trong việc phân phối ca chua khắp thuộcđịa của họ ở vùng biển Caribbean vào đầu thé ki XVI Họ cũng đưa nó đến Philippines,

từ đó di chuyên đến Đông Nam Á và sau đó là toàn bộ lục địa châu Á Người Tây BanNha cũng mang cà chua đến châu Âu, cụ thể vào năm 1544 ở Ý dưới tên gọi là pomo

d’oro.

Năm quốc gia san xuất cà chua hang dau thé giới là Hoa Kỳ, Trung Quốc, ThổNhĩ Kỳ, Ý và Án Độ Ở Hoa Kỳ, Florida, California và Georgia là những bang sản xuất

thương mại hàng dau, với khoảng 200 dặm vuông được canh tác vào năm 1997 Dự kiến

con số này sẽ tiếp tục tăng do những lợi ích sức khỏe được cho là có liên quan đến cachua trong chế độ ăn kiêng Ở Việt Nam cà chua được trồng chủ yếu tập trung ở vùng

đồng bằng trung du Bắc Bộ (Hà Nội, Hà Bắc, Hải Phòng ) và ở miền Nam (Lâm

Đồng, Tiền Giang, Long An, Tây Ninh, )

2.2 Giá trị cà chua

2.2.1 Giá trị dinh dưỡng

Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao Trong số các loại rau, củ,quả dùng làm rau thì cà chua là thực phẩm chứa vitamin, chất khoáng nhiều chat và cóhoạt tính sinh học mạnh mẽ rất có lợi cho sức khỏe Theo các nhà dinh dưỡng, người

trưởng thành hằng ngày chỉ cần sử dụng từ 100 g — 200 g cà chua chín đã cung cấp đủ

yêu câu về vitamin và khoáng chât của cơ thê.

Theo Tạ Thu Cúc (1985), hàm lượng Vitamin C trong quả tươi chiếm 17 mg

-35,7 mg Trọng lượng chất khô dao động 5% - 6%, trong đó đường dé tan chiếm 3%,

axit hữu cơ 0,5%, xenlulo 0,84%, chất keo 0,13%, protein 0,95%, lipit thô 0,2%, chấtkhoáng 0,6% (Nguyễn Viết Khoa, 2012)

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng trong 100g cà chua ăn được

Thanh phân Hàm lượng Thành phân Hàm lượng

Cà chua đem lại nhiều lợi ich cho sức khỏe con người như cải thiện thị lực, làm

sáng da, hỗ trợ giảm lượng đường trong máu, giúp ngủ ngon, giữ xương chắc khỏe, hỗtrợ trị các bệnh mạn tính, tốt cho mái tóc, giúp giảm cân Theo Đông y, cà chua có vịngọt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, giúp thông tiểu tiện và tiêu hóa tốt,chống hoại huyết, kháng khuẩn, dùng ngoài để chữa trứng cá, mụn nhọt, viêm tay vàdùng lá dé trị vết đốt của sâu bo Cà chua đặc biệt chứa nhiều lycopene va carotenoid,nhất là trong vỏ của cà chua chín, hai hợp chất thực vật này có liên quan đến việc cảithiện sức khỏe tim mạch, hỗ trợ ngăn ngừa ung thư và chống lại cháy nắng

Vào năm 2012, Taveira và ctv đã nghiên cứu về hoạt tính sinh học của những sản

phẩm phụ cà chua có chứa phenolics, carotenoids và alkaloids có tác dụng kiểm soát

bệnh Alzheimer va đái tháo đường, cũng như tác dụng gây độc tế bào ung thư dạ dày và

khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa Tuy nhiên, các thông số sinh hóa trong các sản

phẩm phụ cà chua như hạt và vỏ phụ thuộc vào giống cây trồng và vùng trồng trọt Ở

vỏ, mức độ các hợp chất phenolic, vitamin C và carotenoid bị ảnh hưởng bởi vùng canhtác là nặng nhất nhưng tiềm năng dinh dưỡng từ hạt vẫn rất cao bởi các đa dạng chất béo

mà không bi ảnh hưởng đáng kể bởi vùng sản xuất và giống cây trồng (Kabore và ctv,

2022).

2.2.2 Giá trị kinh tế

Qua cà chua chứa nhiều dưỡng chất quan trọng với các vitamin nhóm A,C vàlycopen, có thé ăn tươi hoặc chế biến món ăn, nước uống, làm sốt hoặc mứt Ngoài ra,hat ca chua còn có thé chiết tách lay dầu nên luôn là mặt hàng có giá trị kinh tế cao

Tính đến năm 1980, sản lượng cả chua trên toàn thế giới là 50,1 triệu tấn, trong

đó Châu Âu chiếm 29,1%, Châu A 23,6%, Bắc Trung Mỹ 18,3%, Châu Phi 10,2%,

Nam Mỹ 5,9% và các nước khác là 12,9% (Hoell và ctv, 1983) Lượng cà chua trao

đổi trên thị trường thé giới năm 1999 là 36,7 tan trong đó cà chua được dùng ở dạng

ăn tươi chỉ 5% - 7%.

Từ năm 2020 đến năm 2021, xuất khâu cà chua tăng 5,23% từ 9,82 ty USD lên10,3 tỷ USD Thương mại cà chua chiếm 0,00049% tông thương mai thé giới và là sảnphẩm được giao dịch nhiều thứ 350 trên thé giới (Đài quan sát mức độ phức tạp kinh tế

OEC, 2021).

Năm 2021, đã ghi nhận mức giá ca chua cao kỷ lục lên đến 65.000 đồng/kg vàtình trạng khan hiếm kéo đài trong những tháng cuối năm Vào 9 tháng đầu năm 2022,xuất khẩu cà chua đạt 172 nghìn tan với tổng giá trị lên đến 182 nghìn USD và tăng

36,3% sao với cùng kỳ năm 2021 (Bộ Công Thương, 2023).

2.3 Tình hình canh tác và sản xuất cà chua ở Việt Nam và trên thế giới

2.3.1 Tình hình canh tác và sản xuất cà chua trên thế giới

Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Liên hiệp quốc (2014), diện tích trồng cây

cà chua, sản lượng cũng như năng suất tăng qua các năm Năm 2008 diện tích trồng càchua là 4.249.179 ha với sản lượng 141.080.419 tan Năm 2010 điện tích tăng lên4.539.761 ha với sản lượng 152.007.674 tấn đem lại giá trị 71,1 tỉ đô la Đến năm 2012diện tích trồng cà chua trên thế giới là 8.803.680 ha đóng góp sản lượng 161.793.834

z

A

tan.

Cũng theo số liệu của FAOSTAT (2020), điện tích và sản lượng cà chua có hiệntượng giảm nhẹ nhưng nhanh chóng 6n định từ 159,02 triệu tan (2013) lên 180,77 triệutấn (2019) Mức gia tăng về sản lượng là do sự gia tăng mạnh về năng suất và sự giatăng về diện tích Với sản lượng trên, bình quân tiêu thụ cà chua tính theo đầu ngườikhoảng trên 23 kg quả/người/năm Điều đó khẳng định, cây cả chua là cây trồng quantrọng trong nền nông nghiệp của nhiều nước trên thế giới.

2.3.2 Tình hình canh tác và sản xuất cà chua ở Việt Nam

Ở Việt Nam, điện tích trồng cà chua tăng hàng năm, tập trung ở các tỉnh Đồng

bằng và Trung du Bắc bộ, Đồng bằng sông Cửu Long và vùng cao nguyên Đà Lạt Hàng

năm, diện tích chiếm 7% - 10% điện tích rau cả nước và chiếm 3% - 4% sản lượng rau.Riêng năm 2000, điện tích và sản lượng rau cả chua chiếm 29% tổng diện tích và sản

lượng rau cả nước.

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp chế biến nông san, cácnhà máy chế biến, nhà máy đóng hộp cà chua xuất khẩu ngày càng nhiều và yêu cầu

nguyên liệu cả chua ngày càng tang mang lại lợi nhuận không nhỏ cho nông dân Diệntích sản xuất cà chua cả nước trong những năm gần đây dao động khoảng từ 23 nghìn

ha - 25 nghìn ha Trong đó, các tỉnh thuộc khu vực phía Bắc và khu vực Lâm Đồng diệntích sản xuất khoảng trên 19,418 ha, chiếm 81,6% tổng diện tích sản xuất cà chua trong

nước (Theo Bộ khoa học và công nghệ, 2021) Đặc biệt, tỉnh Lâm Đồng có điều kiện

khí hậu đất đai thuận lợi cho việc sản xuất rau quanh năm, có độ cao 1000 m so với mặtnước biên, khí hậu ôn hòa mát mẻ rất thích hợp với các chuẩn loại rau ôn đới va á nhiệtđới Nhiều cơ sở sản xuất rau cu, quả của tinh đã được chứng nhận chứng chỉ GlobalGAP(Global Good Agricultural Practice), san phẩm rau củ, qua cũng được xuất khâu đến thị

trường các nước Đông Nam Á như: Đài Loan, Nhật Bản, Hàn Quốc, đồng thời cung ứng

cho nhu cầu thị trường trong nước ở các vùng trọng điểm như Thành phố Hồ Chí

Minh, Trong đó cây cà chua chiếm vị trí đứng đầu với diện tích 5,140 ha và sản lượng

221,820 tấn (Theo Sở khoa học và công nghệ, 2009)

Việt Nam là 1 trong 3 nước có san lượng sản xuất ngành rau quả lớn nhất trên thégiới sau Trung Quốc và An Độ (FAO, 2012) Theo số liệu thống kê, năm 2012 diện tíchtrồng ca chua cả nước đạt 23.917.8 ha, tăng 11,3% so với năm 2010 (21.178.2 ha) Năngxuất trung bình 252,6 tạ/ha — 257,9 ta/ha, sản lượng 616.890.6 tan, với sản lượng trên

tương đương bình quân đầu người đạt 7,3 kg/năm

2.4 Sơ lược về tác nhân virus gây bệnh cà chua

Các tác nhân virus gây bệnh trên cà chua thường xuất hiện do sự thay đổi môitrường, vectơ, vật chủ hoặc cấu trúc hệ gen của virus Bên cạnh đó, sự phát triển về giao

lưu thương mại quốc tế và biến đổi khí hậu cũng được coi là những tác nhân quan trọnggiúp virus lây lan nhanh chóng Có ít nhất 136 loại vi rút đặc trưng đã được báo cáo lâynhiễm vào cà chua trên thé giới, lớn hơn nhiều so với các loại rau khác Tobamovirus cô

37 loài theo phân loại của virus Các Tobamovirus được chia thành các phân nhóm khác

nhau theo cấu trúc bộ gene, phạm vi máy chủ, thành phan axit amin của các protein.Virus khảm cà chua (ToMV) và virus khám đốm cà chua (ToMMV) là hai virus dé nhậnbiết, cùng biểu hiện triệu chứng tương tự nhau và gây thiệt hại kinh tế nặng nề

2.4.1 Virus khảm cà chua ( Tomato mosaic virus)

Nguồn gốc và phân bố

Tomato mosaic virus (ToMV) xuất hiện lần đầu tiên ở Châu Âu vào khoảng năm

1957, sau đó phân tán sang Trung Đông và Đông Á vào năm 1960 Tại thời điểm hiệntại, ToMV phân bố ở các vùng trồng ca chua trên toàn thế giới, gây thiệt hại hầu hết cácgiống cà chua thương mại trên đồng ruộng và trong nhà lưới

Đặc điểm

Virus kham cà chua (ToMV) thuộc chi 7o5anovirus, ho Virgaviridae, ky chủ

trên rau củ họ Solanaceae với virion là một hạt hình que có chiều đài khoảng 300 nm và

đường kính 18 nm Bộ gen là RNA dương sợi đơn (ssRNA), dai 6,4 kb mã hóa cho 4

protein lần lượt là 126 kDa, 183 kDa, 30 kDa, 175 kDa Protein 126 kDa và protein 183

kDa chịu trách nhiệm cho sự sao chép cua virus — replication protein, protein 30 kDa

thúc day tế bao di chuyển — movement protein và 175 kDa giúp bao vệ virus — coat

protein (Spence va ctv, 2001).

Theo Vũ Triệu Man (2007), ToMV có dang hình gay, kích thước 300 nm x 1,8

nm Vật chat di truyền là ARN Trong thành phan của virus chứa 5% axit nucleic, 95%protein Bộ gen bao gồm ARN, sợi đơn dài thang Thành phan axit nucleic 23% G, 28%

A, 19% C, 30% U Trong tan dư cây cà chua, ToMV có thé tồn tại 24 năm ở nhiệt độphòng Cũng ở nhiệt độ phòng, virus có khả năng sống và gây bệnh sau vài tháng, thậmchí ở nhiệt độ từ 0 °C — 2 °C virus vẫn có kha năng sống Khi nhiệt độ xuống dưới 20°C,ToMV đi vào dang tiềm ân và khi hoạt động trở lại thì độc tính của chúng hơn han các

Virus cũ.

Thiệt hại do ToMV khác nhau tùy thuộc vao giống cà chua bị nhiễm bệnh, thờigian nhiễm bệnh, chủng virus liên quan và các điều kiện môi trường, trung bình giảm từ20% - 25% năng suất, thời gian nhiễm virus càng sớm sẽ làm thiệt hại càng nặng nề hơn

(Di va ctv, 1992).

Sự lan truyền

Hạt từ quả cà chua bị nhiễm bệnh có thé chứa virus trong vỏ hạt hoặc nội nhũ,virion ToMV xâm nhập vào cây con thông qua các vết trầy xước cơ học hoặc ghép cành.Nếu cây bệnh được cấy, virus sẽ lây lan nhanh qua sự tiếp xúc cơ học của đất, nước,

công cụ canh tác của người chăm sóc (Broadbent, 1976).

Triệu chứng và cách phòng ngừa

Cây cà chua bị nhiễm bệnh có biểu hiện tán lá của cây ca chua bị ảnh hưởng cóđốm lốm đốm, với các vùng màu vàng nhạt và xanh đậm xen kẽ, phần sau thường dàyhơn và nồi lên trông giống như vết phông rộp Các lá có xu hướng trông giống như dương

xi với các đầu nhọn và các lá non có thé bị xoắn lại Qua có thé bị méo mó, các đốm

vàng và đốm hoại tử có thé xuất hiện trên cả quả chín và quả xanh và có thé có hiện

tượng thâm nâu bên trong thành quả Ở cây non, sự lây nhiễm làm giảm khả năng đậutrái và có thé gây biến dang và đốm toàn bộ cây có thể bị lùn đi và hoa bị đổi màu

Công tác quản lý và ngăn ngừa bệnh được thực hiện bằng cách sử dụng giốngkháng ToMV, kiểm tra hạt giống trước khi gieo bằng các phương pháp phân tử, theodõi, kiểm tra và loại bỏ cây nhiễm bệnh, vệ sinh dụng cụ canh tác và hạn chế tạo ra cácvết thương cho cây

2.4.2 Virus khảm đốm cà chua (Tomato mottle mosaic virus)

Nguồn gốc va phân bố

Virus khảm đốm cà chua (ToMMV) được phát hiện lần đầu tiên vào năm 2009trong một nhà lưới ở Mexico, sau đó được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới bao gồm

ca Hoa Ky, Israel, Brazil và Tây Ban Nha Ngoài ra, nó còn xuất hiện trên đậu gà ở Y

và cây tiêu từ tỉnh Vân Nam và Khu tự trị Tây Tạng ở Trung Quốc

Đặc điểm

Phân tích trình tự bộ gen so sánh đã phân loại ToMMV là một loải virus mới với

80% trình ty nucleotide tương đồng với TMV và 85% trình ty nucleotide tương đồngvới ToMV (Li và ctv, 2013) Qua một số nghiên cứu đã chứng minh ToMMV có phản

ứng huyết thanh học chéo với ToMV, tuy nhiên các đặc điểm về phân tử của loài virusnày vẫn chưa được nghiên cứu sâu.

Ký chủ của ToMMV được ghi nhận trên cà chua và ớt chuông Ngoài ra, vẫn có

ghi nhận về ToMMV trên đậu Hà Lan ở tỉnh Vân Nam (Trung Quéc) Cac nghiên cứu

đã chỉ ra rằng phạm vi vật chủ của ToMMV có thể rộng hon, vi virus có thé được truyềnmột cách cơ học sang các loài Solanaceae khác Ở Trung Quốc, người ta đã quan sátthay sự lây nhiễm hỗn hợp giữa TOMMV với virus khảm lá xanh nhẹ trên ca tím( Solanum melongena ) gây ra các triệu chứng và thiệt hại về năng suất, nhưng tình trạngvật chủ của Solanum melongena đôi với TOMMV vẫn chưa được làm rõ

Cà chua nhiễm bệnh có biểu hiện biến dạng lá, khảm, đốm và hoại tử, cây còi

cọc nghiêm trọng, hoa bị rụng và không đậu quả Trong các thí nghiệm được thực hiện

trên một số giống cà chua ở Trung Quốc, người ta đã chứng minh rang ToMMV có thévượt qua tính kháng ToMV ở một số giống Do đó, công tác giám sát và quản lý bệnh

trở nên khó khăn hơn rất nhiều, yêu cầu về kiểm tra hạt giống trước khi gieo trồng và vệ

sinh dụng cụ là cách duy nhất đề tránh bệnh lây lan

2.5 Một số phương pháp, kỹ thuật chan đoán virus ở cà chua

2.5.1 Phương pháp chan đoán dựa vào triệu chứng

Đây là phương pháp căn cứ vào các triệu chứng đặc trưng của bệnh đã được théhiện ra bên ngoài trên cây hoặc các bộ phận bị bệnh Phương pháp này có đặc điểmnhanh, khá chính xác và đòi hỏi người chân đoán phải năm được đặc điểm triệu chứngcủa nhiều loại bệnh cây và biết phân loại chúng Tuy nhiên, một triệu chứng có thé donhiều nguyên nhân khác nhau gây ra và mức độ nặng, nhẹ phụ thuộc vào giống cây, điềukiện chăm sóc, khí hau, nén phương pháp còn một phan phiến diện, cần kết hợp nhiềuphương pháp với nhau dé chân đoán nguyên nhân gây bệnh một cách chính xác (Vũ

Triệu Mân, 2003).

10

2.5.2 Phương pháp chan đoán dựa vào kính hiển vi điện tử

Kính hiển vi điện tử có thể quan sát chính xác hình thái, cầu tạo của virus,phytoplasma, viroide có kích thước rất nhỏ mà kính hiển vi thông thường không quansát được dựa trên dịch chứa virus lấy trực tiếp trên lá cây bệnh hoặc dịch chiết đã đượclàm tinh khiết Phương pháp thứ hai là dùng lát cắt cực mỏng nhờ may Ultra microtom,nhuộm màu mẫu bị cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật

bị bệnh (Hà Thị Tuyết Phượng, 2009)

2.5.3 Phương pháp chan đoán dựa vào huyết thanh học

Phương pháp huyết thanh học dựa vào cơ sở kháng nguyên gặp kháng thê đặc

hiệu với nó thì xảy ra phản ứng kết tủa hoặc phản ứng ngưng kết trên các đối tượngvirus, vi khuẩn, nắm Một nghiên cứu trước đây của Almeida và ctv (2018) đã phát hiệnTMV, ToMV trên cà chua và PMMoV trên hồ tiêu bằng kỹ thuật DAS-ELISA, phươngpháp này cho kết quả nhanh và tiện lợi, tuy nhiên khi kiểm tra độ nhạy của DAS-ELISAsong song với RT-PCR trên các mẫu đất lại nhận thấy rằng phương pháp RT-PCR chokết quả tốt hơn khi phát hiện TMV ở độ pha loãng 1.105, còn DAS-ELISA có độ pha

loãng 1.102 Cũng vào năm 2018, Sui và ctv đã thực hiện phản ứng ELISA với TMV,

ToMV, ToMMV cho thấy khả năng phát hiện TOMMV khi sử dụng kháng thé đặc hiệuTMV và ToMV, chứng tỏ phản ứng huyết thanh học chéo giữa các loại Tobamoviruscao, rất khó phát hiện loài virus chính xác

2.5.4 Kỹ thuật chan đoán dựa vào nucleic acid

Biểu hiện bệnh do virus rất phức tạp và khó có thể phân biệt, nhất là ở giai đoạn

ủ bệnh Việc kiểm soát sự phát tán của virus không đơn giản, do chúng có khả năng tontại cao va dé dàng tạo ra các biến chủng mới Chan đoán bệnh thông qua việc phát hiện

vật chất di truyền đặc trưng của virus (DNA hoặc RNA) bằng kỹ thuật sinh học phân tửcũng đã thu được nhiều kết quả tích cực trong việc phát hiện sớm sự có mặt của virusvới kết quả nhanh và chính xác ( Vũ Tuấn Nam va ctv, 2021)

2.5.4.1 Kỹ thuật Real time PCR

Kỹ thuật Real time PCR bao gồm các thành phần cơ bản như đNTP, DNAPolymerase, DNA mạch khuôn, cặp mồi và dung dịch đệm Điểm khác biệt đó là Real

time PCR sử dụng chất phát huỳnh quang dé máy có thé phát hiện và đo được cường độ

tín hiệu từ chất này Khi phản ứng nhân bản xảy ra tới một chu kỳ nhất định, cường độtín hiệu huỳnh quang sẽ bắt đầu có sự gia tăng rõ rệt và tương quan với số lượng bản

11

sao DNA được tạo ra Kết quả được thé hiện dưới dạng biểu đồ quan sát được qua mỗi

chu kỳ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về hiệu quả khuếch đại DNA mục tiêu (Phạm Hùng

Vân, 2009) Một số quy trình Real time RT-PCR điển hình chan đoán virus gây hại ở càchua bao gồm quy trình Real time RT-PCR định lượng virus Tomato yellow leaf curl

Sardinia virus (TYLCSV) của Mason và ctv (2008); quy trình Real time RT-PCR phát

hiện Potato spindle tuber viroid (PSTVd) và Tomato chlorotic dwarf viroid (TCDVd) cua Bakker va ctv (2015), quy trình Real time RT-PCR phát hiện virus Jomato Mottle

Mosaic Virus (ToMMV) va Tomato Brown Rugose Fruit Virus (ToBRFV) của Tiberini

va ctv (2022)

2.5.4.2 Kỹ thuật LAMP

Nguyên tắc chung của LAMP là sử dung 4 mỗi khác nhau được thiết kế đặc hiệu

dé nhận biết 6 trình tự riêng biệt trên gen đích Ưu điểm của phương pháp này là hiệu

quả khuếch đại gen rất cao trong khi thời gian phản ứng ngắn và nhiệt độ phản ứng chỉ

dao động trong khoảng 60 — 65 °C nhưng vẫn có tỉ lệ dương tinh giả cao Các nhà khoahọc đã thành công trong việc xác định một loạt virus gây bệnh trên cà chua bằng kỹ

thuật LAMP và RT- LAMP như 7oÖacco mosaic virus (Liu và ctv, 2010), Tomato

chlorotic spot orthotospovirus (Sui va ctv, 2018), Tobacco mosaic virus trên hoa cúc

(Salit va ctv, 2022), Cucumber mosaic virus ( Blat va ctv, 2013) cho thay tim nang ratlớn của kỹ thuật này tuy nhiên phải khắc phục được nhược điểm dương tinh giả va tối

ưu các cặp primer khi sử dụng.

2.5.4.3 Kỹ thuật giải trình tự

Giải trình tự của gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide này

trên phân tử DNA (Phạm Hùng Vân, 2009) Năm 2013, Li va ctv đã thực hiện giải trình

tự bộ gen hoàn chỉnh của một loài thuộc chi Tobamovirus mới trong cà chua Sau khi

tách RNA nhỏ (sRNA) khỏi RNA tổng số bằng điện di trên gel polyacrylamide, thư viện

sRNA được xây dựng và được giải trình tự trong Illumina HiSeq 2000 Kết quả BLASTchỉ ra rằng TOMMV có liên quan chặt chẽ nhất với ToMV, với ty lệ tương đồng là 85%,

phù hợp tiêu chi phân loài TOMMV là một loài mới hay kết quả nghiên cứu của Salit và

ctv vào năm 2022 đã giải trình tự hoàn chỉnh của loài ToMV trên hoa cúc tại Thái Lan

và nhận thấy sự tương đồng 98% các trình tự của ToMV trên ngân hàng gen NCBI

12

2.6 Giới thiệu về kỹ thuật RT — PCR

Vào năm 1985, Kary Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản để khuếch

đại nhanh nhiều bản sao (amplification) của các đoạn DNA mà không qua tạo dòng, đóchính là kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR được áp dụng dé chân đoán các bệnh virus hạithực vật có genome ở dạng DNA, cho phép chân đoán nhanh, nhạy, đặc hiệu và tính linh

hoạt cao (Naidu và Hughes, 2002).

Đối với đối tượng virus có vật chất di truyền là RNA, cần phiên mã ngược RNA

thành cDNA ở một eppendorf riêng trước khi thực hiện phản ứng (Two step RT-PCR)

hay thực hiện phản ứng chung một eppendorf (One step RT-PCR) Tương tự như kỹ

thuật PCR, RT-PCR cũng cần primer forward va primer reverse, 4 deoxy nucleosidetriphosphate, Taq polymearase, MgCl: và Bufer dé thực hiện phản ứng (Nayak va Mani,

2021).

Theo Phạm Hùng Vân (2009), về mặt nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ

gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:

1 Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94°C, các liên kết hydro sẽ bị

phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn

2 Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 — 65°C, các đoạn mồi sẽ bắt cặp

bố sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu

3 Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72°C, Taq polymerase sẽ sử dụng

dNTP để kéo dài đầu 3’ của mồi va tạo ra mạch bồ sung

2.7 Giới thiệu về kỹ thuật Multiplex RT — PCR

Multiplex RT-PCR là một phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhằm khuếch

đại nhiều trình tự chỉ trong một phản ứng PCR Trong quá trình phân tích PCR đa mồi,

nhiều trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cả các thành phanđược bồ sung vào cùng một ông phản ứng

Phương pháp này giúp rút ngắn thời gian thực hiện, tiết kiệm hóa chất mà lại

không ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm Multiplex PCR hay Multiplex RT-PCR cónhiều ứng dụng rộng rãi, có thế xác định sự có mặt cùng lúc nhiều tác nhân khác nhau

như virus, vi khuân và các tác nhân xâm nhiễm khác.

13

2.7 Tình hình ứng dụng kỹ thuật Multiplex RT — PCR trên thế giới và Việt Nam

phát hiện virus gay bệnh trên cà chua

2.7.1 Tình hình ứng dụng kỹ thuật Multiplex RT — PCR phát hiện virus gay bệnh

cà chua trên thế giới

Nam 2002, Letchert và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR-RFLP phát hiện va

phân biệt phản ứng chéo giữa 5 loài Tobamovirus gồm Tobacco mosaic virus (TMV),Tomato mosaic virus (ToMV), Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV), Pepper mild mottle virus (PMMV), Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMYV) trên cà độc dược.

Năm 2011, Kumar và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR để pháthiện virus khảm thuốc lá (TMV: Tobacco mosaic virus) và virus khảm cà chua (ToMV:

Tomato mosaic virus) trong hạt tiêu và cà chua.

Năm 2018, Zarzyñska và cộng sự đã phát triển kỹ thuật multiplex RT-PCR để

phát hiện 7omafo spotted wilt virus (TSWV) và Tomato yellow ring virus (TYRV) trên

ca chua.

Năm 2023, Schoen và cộng sự đã thực hiện RT-PCR phat hiện Tomato mottle

mosaic virus (ToMMV) ở hạt giống cả chua

2.7.2 Tình hình ứng dụng kỹ thuật Multiplex RT — PCR phát hiện virus gầy bệnh trên cà chua ở Việt Nam

Năm 2006, Huỳnh Vĩnh Khang đã nghiên cứu virus (TMV, CMV) gây bệnh trên

cây ớt tại huyện Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh bằng kỹ thuật Elisa và xây dựng quy trình

phát hiện CMV bằng kỹ thuật RT-PCR

Năm 2015, Nguyễn Xuân Dững đã xây dựng quy trình phát hiện Cucumbermosaic virus, Tomato mosaic virus, Potato virus X va Potato virus Y bang ky thuat RT-PCR phục vu công tac tầm soát bệnh virus trên dưa leo, cà chua và khoai tây

Năm 2017, Nguyễn Thị Thảo đã nghiên cứu virus (TSWV, ToMV, TNRV,WSMoV) gây bệnh trên cà chua tại Hà Nội bang kỹ thuật Elisa và xây dựng quy trìnhphát hiện TNRV bằng kỹ thuật RT-PCR

14

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện 03/2023 — 07/2023 tại phòng thí nghiệm Sinh học phân

tử, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm

Thành Phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và hóa chất

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu được thu hái tại huyện Di Linh (Lâm Đồng) và Gia Nghĩa (Đăk Nông).Tổng cộng có 60 mẫu được thu hái tại 7 vườn

Vườn 1 (11 mẫu): 11°21°13.2”N - 108°00°46.1”E, huyện Di Linh, tinh Lâm Đồng.Vườn 2 (9 mẫu): 11°36°45.5”N - 108°13°24.9”E, huyện Di Linh, tinh Lâm Đồng

Vườn 3 (9 mẫu): 11°36°52.2”N - 108°13”05.6”E, huyện Di Linh, tỉnh Lâm Đồng

Vườn 4 (10 mẫu): 11°37°57.9”N - 108°13°05.6”E, huyện Di Linh, tinh Lâm Đồng.Vườn 5 (5 mẫu): 11°57“46.17N - 107°44’21.7”E, tô 4, p.Nghĩa Tân, TP Gia Nghĩa, tinh

Đăk Nông.

Vườn 6 (8 mẫu): 11°58°48.3”N - 107°43°5§.6”E, thôn Nam Ra, xã Dak Nia, TP Gia

Nghĩa, tỉnh Đăk Nông.

Vườn 7 (8 mẫu): 11°58’29.6”N - 107°39°14.4”E, tổ 4, p Nghĩa Tân, TP Gia Nghĩa, tinh

Đăk Nông.

Đối chứng dương ToMV và ToMMV được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Sinh

học phân tử, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại Học

Nông Lâm Thành Phó Hồ Chí Minh Đối chứng âm trong phản ứng PCR là mẫu khôngchứa cDNA mà chỉ có thành phan phan ứng và nước DEPC Đối chứng mẫu khỏe (IC)

là mẫu cDNA cà chua sạch bệnh.

3.2.2 Hóa chất nghiên cứu

Bộ EZ — 10 Spin Column Plant RNA Mini - PrepsKit (CatBSS23 14, BioBasic),

Bộ kit DNase I (Cat#01046942, Thermo Fisher), Bộ kit SensiF AST cDNA Synthesis

(Cat#LF205, Bioline), MyTaqTM Mix (Cat#PM304, Bioline), Agarose (Cat#ES521,

Bioline), TAE 10X (Cat#200328, BioBasic), GelRedTM loading buffer with Tricolor

1Š

(Cat#D012, TBR), HyperLadderTM 100bp (CaMW430, Bioline), HyperLadderTM

1kb (Cat#MW421,Bioline), Primer (Phù Sa Genomic).

Bảng 3.1 lên va trình tự primer dùng trong phản ứng PCR

289 bp 2017)

ToMMV -R CACTCTGCGAGTGGCATCCAAT

TUB - F AGATCTGGTCCCTATGG Le

450 bp Tự thiét kê TUB -R GTTCAAGTCACCAAAACT

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: Cân phân tích 4 số PA 219, tủ an toàn sinh học, máy ly tâm lạnh Micro

22 R (Hettich, Đức), nồi hấp tiệt trùng, tủ lạnh -20 °C, tủ lạnh -70 °C, microwave, may

đo quang phổ (Biodrop, Anh), buồng soi UV, máy LifeEco Thermo Cycler (Bioer,

Trung Quốc), máy điện di Mupid One (Takara Bio, Nhật).

Dụng cụ: Eppendorf các loại, micropipette, chày nghiền mẫu, đĩa petri, ống

falcon, đầu tip các loại, ống đong các loại,

3.3 Phương pháp nghiên cứu

PCR Giải trình tự

————>

Ly trích Xử lý Tổng hợp Kiểm tra đối chứng

—> ——>

RNA enzyme cDNA —— dương

Thu mẫu Xây dựng quy trình Áp dụng trên mẫu

Multiplex RT - PCR dai tra

<q

Hình 3.1 Sơ đồ các bước thực hiện nghiên cứu

16

3.3.1 Kiểm tra mẫu chuẩn dương

3.3.1.1 Kiểm tra đặc tính primer trên lý thuyết

Primer khuếch đại mẫu chuẩn dương tham khảo từ nghiên cứu của Sui va ctv

(2017) được kiểm tra bằng phần mềm Oligo Analyzer

(https://www.idtdna.com/calc/analyzer) và phan mềm BLAST (NCBI, Hoa Kỳ) nhằm

đánh giá các thông số của mồi về Tm, %GC, kích thước sản phẩm PCR tạo thành, hairpin

(kẹp tóc), self— dimer, hetero — dimer, độ tương dong Sau khi kiém tra, cap primer dattiêu chuẩn về mặt lý thuyết sé được tổng hop tại Công Ty Công ty Cổ phan Phù Sa

Genomics (Việt Nam).

3.3.1.2 Một số tiêu chuẩn thiết kế va kiểm tra primer

Theo Anton Yuryev (2007), một số tiêu chuẩn về thiết kế primer can phai datđược bao gồm:

Chiều dai primer tốt nhất nằm trong khoảng 18 — 25 base pair

Các môi có hiệu quả khuếch đại tốt nhất là những mỗi có các base loại G, C tậptrung thành nhóm và chiếm tỉ lệ khoảng 40% - 60% Ngoài ra, các base cuối ở đầu 3’hay gần đầu 3’ của các mỗi này nên là G,C, GC hoặc CG

Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi là một thông số quan trọng có ảnh hưởng lớnđến kha năng bắt cặp của môi với DNA khuôn mẫu Dé đạt hiệu quả tốt nhất, nhiệt độnóng chảy của primer nên nằm trong khoảng 50 °C - 72 °C Ngoài ra, nhiệt độ nóng chảycủa hai mỗi không nên cách biệt quá nhiều, tối đa khoảng 5 °C

Trong cau trúc của méi không được có những vùng trình tự có thé tự bắt cặp bổsung nhau vì những vùng này có thé hình thanh cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop) chặt chẽlàm giảm hiệu quả nhân ban của môi Ngoài ra, cần tránh chọn những môi có khả năngbắt cặp bổ sung chặt chẽ với nhau ở đầu 3’ do điều này có thé dẫn tới việc tạo các mồidimer, self— dimer, làm giảm hiệu suất của phan ứng PCR

Mức năng lượng (AG) hình thành nên cấu trúc thứ cấp của môi phải >

-9kcal/mol Nếu mức năng lượng (AG) <-9kcal/mol thì Tm nên ở mức 60 °C trở lên

Giá trị xác suất tương đồng xuất hiện không ngẫu nhiên (E) khi dùng phần mềmBLAST càng nhỏ thì mức độ tương đồng càng cao

17

3.3.1.3 Ly trích RNA mẫu chuẩn dương

Mẫu chuẩn dương được tách chiết và thu nhận RNA tổng số theo hướng dẫn của

EZ-10 Spin Column Plant RNA Mini-Preps Kit RNA được ly trích trong điều kiện đảmbao sạch, các dau tip không có RNase va DNase

Quy trình ly trích RNA từ lá của cây ca chua bị bệnh dựa theo sự hướng dan của

bộ kit EZ-10 Spin Column Plant RNA Mini-Preps Kit (Biobasic) Đầu tiên khoảng 50

mg mẫu được cho vào eppendorf 1,5 mL Thêm 450 L dung dich Buffer Rlysis-PG

được thêm vào dé ly giải tế bao thực vật, nghiền mau trong tube bằng chảy nghiền mẫu

vô trùng cho đến khi mẫu mịn hoàn toàn Mẫu được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để

tế bào được ly giải hoàn toàn Tube mẫu được ly tam 12,000 xg trong 5 phút Sau đó,

200 uL dich nổi được chuyên vào eppendorf 1,5 mL mới Tiếp theo, 100 pL Ethanolđược thêm vào tube và đảo đều nhẹ, nhằm giúp hỗ trợ gắn RNA vào màng Toàn bộ hỗnhợp trên được chuyển vào cột (spin column) Cột được ly tâm 12,000 xg trong 30 giây

ở nhiệt độ phòng, dung dịch đi qua cột được loại bỏ RNA sau khi giải phóng khoi tế

bào được gitr lại trên cột lọc nhờ lớp màng ai lực với RNA Universal GT Solution được

bồ sung 500 uL vào cột, sau đó cột được ly tâm 12,000 xg trong 30 giây ở nhiệt độphòng, dung dich di qua cột được loại bỏ Universal NT Solution được bồ sung 500 pL

vào cột, sau đó cột được ly tâm 12,000 xg trong 30 giây ở nhiệt độ phòng, dung dịch đi

qua cột được loại bo Cột được ly tâm 12,000 xg trong 30 giây ở nhiệt độ phòng để cột

được khô hoàn toàn Cột được đặt vào eppendorf 1,5 mL mới, 50 uL RNase-free Water được thêm vào cột và g1ữ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút Cột sau đó được ly tâm 12,000

xg trong 30 giây ở nhiệt độ phòng, cột được loại bo và giữ lại phần dung dịch Dung

dich chứa RNA được lưu trữ -80 °C.

Kiểm tra độ tinh sạch của RNA ở bước sóng 260/280 nm bang cách dùng 1 pLsản phẩm RNA tổng số đã được ly trích để xác định nồng độ (ng/ul) và độ tinh sạch

RNA bằng máy đo quang phô (Biodrop, Anh) Kết quả tỉ lệ A2øo/A2so nam trong khoảng1,8 — 2,0 là đủ tiêu chuẩn tinh sạch Sau khi kiểm tra nồng độ các mẫu ly trích, tiễn hành

pha loãng RNA ở các mẫu về cùng một nồng độ

3.3.1.4 Xử lý với enzyme DNase I

Dịch trích RNA sau ly trích vẫn có khả năng tồn tại Dnase làm suy giảm sảnphẩm phiên mã ngược Xử ly enzyme Dnase I được thực hiện theo hướng dẫn bộ kit

DNase I (Thermo Fisher, Hoa Kỳ) với sự hỗ trợ của máy luân nhiệt (LifeEco Thermo

18

Cycler) cho các bước ủ Trong quá trình thao tác với dịch trích RNA, mẫu và hóa chất

luôn được đặt trên đá, đảm bảo chất lượng RNA cho thí nghiệm Thao tác phối trộn các

thành phần phản ứng được thực hiện trong tủ an toàn sinh học

Bảng 3.2 Thành phần hóa chất và chu trình nhiệt cho phản ứng xử lý enzyme

Thành phần Thê tích Chu trình nhiệt

RNA sau khi xử ly enzyme được tổng hop cDNA theo hướng dan thực hiện

của SensiFASTTM cDNA Synthesis Kit Enzyme reverse transcriptate có vai trò phiên

mã ngược RNA thành cDNA sợi thứ nhất Sử dụng máy luân nhiệt (LifeEco ThermoCycler) cho các bước ủ Trong quá trình thao tác, mẫu và hóa chất luôn được đặt trên

đá, đảm bảo chất lượng RNA cho thí nghiệm Thao tác phối trộn các thành phần phản

ứng được thực hiện trong tủ cấy vô trùng

Bang 3.3 Thành phần hóa chất tổng hợp cDNA

Thành phần Thể tích

RNA 1 pl 5X TransAmp Buffer 1 pl Reverse trancriptase 0,25 ul H:O không chứa nuclease 2,75 ul

cDNA được tổng hợp (5 ul) có thé dem sử dụng ngay trong phản ứng PCR hoặctrữ ở -20 °C đề thực hiện PCR sau.

3.3.1.6 Khuếch đại mẫu chuẩn dương ToMV và ToMMV

Thực hiện phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gene đặc hiệu nhận biết virus trênkhuôn mẫu cDNA tạo ra số lượng lớn bản sao bằng máy LifeEco Thermo Cycler (Bioer,Trung Quốc) với hai cặp primer ToMV-F, ToMV-R hay ToMMV-F, ToMMV-R cókích thước đoạn khuếch đại lần lượt là 595 bp và 289 bp với thành phần ( Bảng 3.4) và

chu trình nhiệt (Bảng 3.5) được tham khảo từ nghiên cứu của Sui va ctv (2017).

Bảng 3.4 Thanh phần hóa chất phản ứng RT — PCR khuếch đại ToMV và TOMMV

Thành phần Nông độ gốc Nông độ cuối Thé tích (w])

Bảng 3.5 Chu trình nhiệt dùng cho phan ứng khuếch đại ToMV và ToMMV

Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian Số chu kỳ

Tiên biến tính 95°C 5 phút 1

Bién tinh 95°C 30 giây

Bắt cặp 5⁄55 30 giây 40

Kéo dai 72°C 40 giây

Hậu kéo dài 7c 7 phút |

Bảo quản 4°C foe) 1

3.3.1.7 Điện di sản phẩm PCR

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cau trúc của các

nucleic acid tích điện âm nên dưới tác động của điện trường sẽ di chuyển về cựcdương Sau khi hoàn tất quá trình khuếch đại, sản phẩm RT — PCR sẽ được điện đi bằng

máy điện di ngang Mupid One (Takara Bio, Nhật) nhằm kiểm tra kích thước mẫu DNA.Quá trình điện di thực hiện trên gel agarose 1,5% với hiện điện thé 100 V, trong 30 phút

20

Sau khi điện di xong, miếng gel agarose được đưa vào bộ phận soi gel và ghi nhận kết

quả.

3.3.1.8 Giải trình tự mẫu chuẩn dương

Đoạn gen đã bắt cặp được gửi giải trình tự tại Công ty TNHH Dịch vụ và Thươngmại Nam Khoa Sau khi có kết quả, các trình tự được xử lý bằng phần mềm Bioedit 7.2

và đối chiều với những trình tự đã được công bồ trước đó trên ngân hàng gene NCBI

3.3.2 Xây dựng quy trình phát hiện virus ToMV ( Tomato mosaic virus) va

ToMMV ( Tomato mottle mosaic virus) bằng kỹ thuật Multiplex RT — PCR

3.3.2.1 Đối chứng nội cho kiểm soát quy trình

Thiết kế primer đối chứng nội cho phản ứng khảo sát quá trình tách chiết

Nucleic acid

Chứng nội (Internal control) là các gen luôn biểu hiện bên trong tế bào, còn gọi

là các gen giữ nhà (house keeping genes), được khuếch đại song song với DNA đíchnhưng cho sản pham khuếch đại có kích thước khác sản phẩm khuếch dai của DNA

đích, nhờ vậy có thé phân biệt được khi điện di nhằm kiểm soát quá trình ly trích và

phiên mã ngược Tùy thuộc vào việc cho chứng nội vào phản ứng ở các giai đoạn khác

nhau sẽ mang đến các vai trò khác nhau bao gồm: kiểm soát được sự tách chiết trên mẫubệnh phẩm, xác định kết quả là âm tính thật hay giả do còn ức chế hiện điện trong mẫutách chiết nếu được cho vào PCR, kiểm soát quy trình khuếch đại DNA có đạt được độ

nhạy hay không.

Nhằm khang định trong mỗi phản ứng PCR không có hiện tượng ức ché, dé tàitổng hợp một đoạn amplicon dựa trên vùng gen § - tubulin dùng làm chứng nội (IC) dogene này có tính ôn định, trình tự bảo tồn cao giữa các loài va ít biến đổi về mức độ biểuhiện giữa các mô và loại tế bào khác nhau

Primer được thiết kế tuân thủ theo nguyên tắc của Anton Yuryev (2007) và kiểm

tra độ đặc hiệu bằng công cu Primer Blast trên Ngân hàng gene (NCBI) Sau đó tổnghợp tại Công Ty Cổ phan Phù Sa Genomics (Việt Nam)

Kiểm tra độ đặc hiệu của primer đối chứng nội

Xác định primer đối chứng nội được thiết kế có khuếch đại đúng trình tự mụctiêu từ mạch khuôn cDNA mà không khuếch đại từ mạch khuôn DNA với chỉ tiêu sảnphâm PCR sau khi điện di xuất hiện băng sáng đậm, rõ và chỉ hiện đối với dịch tríchRNA đã xử lí enzyme và tổng hop cDNA, ngược lại không xuất hiện băng đối với dich

21