Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Ứng dụng kĩ thuật lamp trong phát hiện nhanh dịch tả heo Châu phi (ASFV)

; BỘ GIÁO DỤC VADAOTAOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC ỨNG DỤNG KĨ THUẬT LAMP TRONG PHÁT HIỆN NHANH DỊCH TẢ HEO CHAU PHI ASFV Ngành học : — CÔNG NGHỆ S

; BỘ GIÁO DỤC VADAOTAOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

ỨNG DỤNG KĨ THUẬT LAMP TRONG PHÁT HIỆN NHANH

DỊCH TẢ HEO CHAU PHI (ASFV)

Ngành học : — CÔNG NGHỆ SINH HOC

Sinh viên thực hiện : — NGUYÊN THỊ BÉ TƯ

Mã số sinh viên : 18126201

Nién khéa : 2018-2022

TP Thu Đức, 03/2024

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

-KHOA -KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KĨ THUẬT LAMP TRONG PHÁT HIỆN NHANH

DỊCH TẢ HEO CHAU PHI (ASFV)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc Nguyễn Thị Bé Tư

TP Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin cảm ơn sâu sắc đến cha, mẹ đã luôn tin tưởng, ủng hộ và tạo mọiđiều kiện tốt nhất đẻ tôi hoàn thành bậc đại học

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố

Hồ Chí Minh, quý thầy cô khoa Khoa Học Sinh Học đã tạo điều kiện cho tôi hoànthành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Bảo Quốc đã tận tình hướngdẫn, truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn và nhiều kinh nghiệm quý báotrong suốt quá trình thực hiện khoá luận

Tôi xin cảm ơn anh Nguyễn Mai Nghiệp đã luôn theo sát tôi và giúp đỡ tôi trong

tquá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thé lớp DH18SHB những người ban đã

đồng hành cùng tôi trong suốt 4 năm học tập và nghiên cứu ở trường Đại học NôngLâm Thành phó Hồ Chí Minh

Trân trọng cảm on!

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên là Nguyễn Thị Bé Tư, MSSV: 18126201, sinh viên lớp DH18SHB Emai:

18126201(@st.hcmuaf.edu.vn thuộc ngành Công nghệ sinh học Đại học Nông Lâm

Thành phố Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khóa luận do bản thân tôi trực tiếpthực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu hoàn toàn trung thực và kháchquan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng về những cam kết này

TP Thủ Đức, ngày 20 tháng 02 năm 2024

Người viét cam đoan

Nguyễn Thị Bé Tư

il

TÓM TẮT

Dịch tả heo Châu Phi (African Swine Fever Virus-ASFV) là tác nhân gây bệnh

sốt xuất huyết trên heo ở dạng cấp tính Dé tài “Ung dụng kỹ thuật LAMP trong phát

hiện nhanh dịch tả heo Châu Phi (ASFV)” được thực hiện với mục tiêu là xây dựng

quy trình LAMP đề phát hiện nhanh ASFV trực tiếp từ mẫu máu toàn phan của heo

Đề tài sử dụng 43 mẫu máu toàn phần dương tính với ASFV, 20 mẫu máu toàn phần

âm tính với ASFV do bệnh viện thú y trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí

Minh cung cấp Phương pháp LAMP kín sử dung master mix, 3 cặp mồi: F3-B3,

BIP-FIP, LB-LF (Wang va ctv, 2021) và dựa vào tín hiệu huỳnh quang dé phát hiện DNA

virus ASFV Tiến hành ly trích DNA từ nhóm mẫu thu thập được sau đó xây dựng quytrình LAMP phát hiện ASFV trên nền mẫu DNA và kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu củaLAMP Cuối cùng là xây dựng quy trình LAMP phát hiện ASFV trên nền mẫu máutoàn phan bằng phương pháp sốc nhiệt Kết quả của nghiên cứu này cho thay, phươngpháp LAMP kín có thể phát hiện nhanh ASFV trong vòng 30 - 40 phút LAMP kínphát hiện virus ASFV một cách nhanh chóng, hiệu qua cao, dang tin cậy và có thêgiảm bớt thời gian, chi phí cho quy trình chan đoán

Từ khóa: Dich tả heo Châu Phi (ASFV), LAMP, máu toan phần

African Swine Fever Virus (ASFV) is the causative agent of acute hemorrhagic fever

in pigs The project "Application of LAMP technique in rapid detection of African swine fever (ASFV)" was carried out with the goal of developing a LAMP process to quickly detect ASFV directly from whole blood samples of pigs The project used 43 ASFV-positive whole blood samples and 20 ASFV-negative whole blood samples

provided by the Veterinary Hospital of Ho Chi Minh City University of Agriculture

and Forestry The LAMP assay has used a commercially available master mix, 3 primers pairs: F3-B3, BIP-FIP, LB-LF (Wang et al., 2021) and relies on fluorescence signals to detect ASFV viral DNA Extract DNA from the collected sample group, then develop the LAMP process to detect ASFV on the DNA sample base and test the

sensitivity and specificity of LAMP Finally, the LAMP process is developed to detect

ASFV on whole blood samples using the heat shock method The results of this study show that the closed LAMP method can quickly detect ASFV within 30 - 40 minutes.

The closed LAMP detects ASFV virus quickly, highly effectively, reliably and can

reduce the time and cost of the diagnostic process.

Keywords: African swine fever (ASFV), LAMP, whole blood

1V

MỤC LỤC

Trang

Bị TẾ HE TGồăggẽaarrtryyygggrriorratagattotyytrioorantayagrwegeessasasaeni iXÁC NHẬN VA CAM DOAN sees ecssscsversscsusvqesisvevsassnsevssavsnevsasnversvesssenuuvenenerverenorssnveees ii

Xây dựng quy trình LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) phát hiện

nhanh ASFV trực tiếp trên mẫu máu toàn phần -2¿222++2z++£z++£z+zzzzzzzrez 1

1.5; Nội Cutie tH HIẾTHT sa eecxscasnersess conensenenane canusanenewasisnsenaeaneseconssiansas neceueeumemnar coensaumeneseas 1

BOSC MeL ee Bee Os eee 22.1 Giới thiệu chung về virus dich tả heo châu phi (ASFV) -:-52-55+555+2 2

2.1.2 Chân đoán ASFV ¿52 22221221221221221221221221221221211221111121 11211111 1e re 4

"8.©áin 00 vi 4 225L GiGi HIẾU CHUN pes cisosg lGi902G1RGERS)NEGĐSAIEEEISGRGEBrS0GSROIGLSGSOHUINGESSALGESB)46/088 4

°8915: 1.0 52.2.3 Nguyên lý thiết kế mỗi cho phản ứng LAMP -©2¿5525222222E+2E+2zz>zzx2 52.2.4 Nguyên tắc co bản của phan ứng LAMP ccccccsccessessecsesseessessessseseeeseeseeeneeees 62.3 Một số nghiên cứu áp dung kỹ thuật LAMP 2 2¿22222E+2EE22EE222+22zzzze2 8CHUGNG 3 VAT LIEU VÀ PHUONG PHAP su neeneesesieesesoenaooieetososeoe 103.1 Thời gian va địa điểm nghiên ctr c.cccccecceeecsecsseesseesseesseesseesseesseessesssessseesseensees 10

1/8 0i) 200i n6 10

3.2.1 Vật liệu -2-©22222221222122122112112211211211211211111211211211211211211212121 1 ee 10

3.2.2 Hóa chất S311 112151515151 11 1151111313 11111511111111111111 010111111111 1111 1111011111111 xe 10

3.3 Phuong phap nghién 0u 01256 10

3.3.1 Thu nhận mau ieee cece ce cececececececececececececscecscecseseeesvevevevsvevevevsvevevevevecevaveverececesees 10

95S Toy Wet OA sec cascncnsnnsnareannemissmnnnonaaamunmonemamemassmnassiens 10

3.3.5» Thực hiện phan tne LAMP Meithiessicc-oucsunn.comemiecuatunnnnmmmumnunmnopctes 11

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN ©22©52222E+2E22E22E2E2E2EEErxee 134.1 Kết quả ly trích DNNA -2-©22-522222222221222122121122122112112211211211211211 2121 134.2 Kết qua phản ứng LAMP kín -2- 2 2 2S22E2EE2EE2EEEEESEE22E22122121121222122 2x2 144.2.1 Kết quả phan ứng chạy LAMP trên nền mẫu DNA -2-5z-: 144.2.2 Kết qua phan ứng LAMP kin của mẫu máu toàn phan -5- 174.2.3 Kết quả kiểm tra độ nhạy phản ứng LAMP kín của mẫu máu toàn phần 20CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ -2-©222222222222+22EE22EE2EEverxrerrree 22TÀI LIEU THAM KHẢO - 2-5 s+S22ES2EEEE2E21E2121212112112111211 111121211111 ce 23

OO SS 25

VI

DANH SACH CHU VIET TAT

: African Swine Fever

: African Swine Fever Virus

: Primer Backward Outer Primer : Backward Inner Primer

: Cộng tác viên : Enzyme-linked immunosorbent assay : Primer Forward Outer Primer

: Forward Inner Primer

: Hemagglutinin

: Loop Mediated Isothermal Amplification : Polymerase Chain Reaction

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 2.1 Các mỗi được dùng trong phan ứng LAMP 2- 2 22©52222+25z22522 6Bảng 3.1 Thanh phan sử dụng LAMP kín - 2 5222E22E22E22E22E22E22E2222222222e2 12Bảng 3.2 Các primer sử dụng trong đề tài - 2-52 2+ScEx E2 EEEEEEEExcEErrtret jbBang 4.1 Kết qua nồng độ va độ tinh sạch của DNA tổng số - 13Bảng 4.2 Kết quả thực hiện phản ứng LAMP đối với mẫu DNA dương tính với

Bảng 4.3 Kết quả thực hiện phản ứng LAMP đối với mẫu DNA âm tính với ASFV.17Bảng 4.4 Kết quả thực hiện phản ứng LAMP đối với mẫu máu toàn phần dương tính

Bang 4.4.(tt) Kết quả thực hiện phản ứng LAMP đối với mau máu toàn phan dương

tính với, AT Vi go net 5g 001110 G1E5g 8 SDQ2S0TREQATIEDIGSĐIXAGEISGESRREGGEBHSBDISEDASIGEENEENSSESREEITAGSANGUNNRESSSEE 19

Bảng 4.5 Kết quả thực hiện phản ứng LAMP đối với mẫu máu toàn phần âm tính với

Bảng 4.6 Thời gian, nhiệt độ ngưỡng phát hiện của phản ứng LAMP kín trong kiểm

4/00 TÍNH se sizssseessz6gsagi004<bá:agsg06438080808/548605g459ã0i24048800980340l8102804380)3g03803L00:8pgu4g8i80ghö 21

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Hình hiển vi điện tử của hạt virus gây bệnh dich tả heo Châu Phi 3

Hình 2.2 Các vị trÌ Primers; các gan te n0röá016610001385431539039883913953585X055553V0043350010380688330688 6

Hình 2.3 Tạo vật liệu khởi "—————— —————= 7

Hình 2.4 Tái bản kéo dài chuỗi DNA 5 5-5252 222222222222122232212221222222xerxcer 8

Hình 3.1 Quy trình xây dựng và phát triển kỹ thuật LAMP - - 11Hình 4.1 Đường khuếch đại phản ứng LAMP kin của các mau DNA BIT, B8T,

B121, B241, BAN, BON, BĐÓN: secce.creesemeesnesnesnercecc unease merenecenees 14

Hinh 4.2 Duong khuéch dai phan ứng LAMP của các mẫu DNA B34T, B35T, B36T,

B37T,.B38 0, B38 97, HÀ lien naennoniosinnnoiediosgig0216600583501383858SESSG/BSERSGBRHSHSESLAB.GD2AMESSGGHEMIGGE393E 15

Hình 4.3 Đường khuếch đại phan ứng LAMP các mau DNA B27T, B28T, B29T,

B30T, B311; B321: B33 sen on seer ve ercumcneae nae ean cat nein meena cere sree 15

Hình 4.4 Đường khuếch đại phản ứng LAMP kin các mau DNA B3T, B4T, BST,

BGI, Bil, BIOL, 71102227 ®Ẻ ốc 15

Hình 4.5 Đường khuếch đại phản ứng LAMP kín sử dụng hệ thống Mygo Mini L7Hình 4.6 Đường khuếch đại phản ứng LAMP kin sử dụng hệ thống Mygo Mini 18Hình 4.7 Kết quả kiểm tra độ nhạy của phản ứng LAMP - 20

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Dịch tả heo Châu Phi là một vấn đề nhức nhối của ngành chăn nuôi heo kéotheo thiệt hại nặng nề cho nền kinh tế đang bùng phát trở lại và diễn biến phức tạp ởmột số địa phương, khiến giá heo liên tục giảm sâu trong thời gian gần đây Bộ Nôngnghiệp và Phát triển nông thôn cho biết, trong 9 tháng trong năm 2023 cả nước đã tiêu

hủy hơn 34.000 con heo do nhiễm dịch tả châu Phi

Hiện nay, trên thị trường đã có rất nhiều kỹ thuật chân đoán dựa vào các xétnghiệm huyết thanh học và sinh học phân tử được áp dụng trong và ngoài nước đểphục vụ cho việc chân đoán virus ASFV Các phương pháp thông dụng nhất hiện nay

như xét nghiệm theo phương pháp miễn dịch (ELISA), PCR hoặc Realtime-PCR

Và gần đây phương pháp phân tử mới Loop Mediated Isothermal Amplification(LAMP) đã va đang được ứng dụng trong công tác chan đoán nhanh virus dịch tả heo

Châu Phi LAMP đã thu hút được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu và các cơ sở xét

nghiệm vì phương pháp này ngoài những đặc điểm điều kiện cần của một phản ứng thì

nó còn có các ưu điểm nổi bật như phản ứng khuếch đại được thực hiện trong điềukiện đẳng nhiệt, thời gian phản ứng ngắn, bước tách mạch đôi thành mạch đơn được

bỏ qua.

Chính vì những ưu điểm của phương pháp này, việc “Xây dựng quy trìnhLAMP phát hiện nhanh ASFV trực tiếp trên nền mẫu máu toàn phan” là rất khả thi, cótriển vọng, nhanh chóng và độ tin cậy cao

1.2 Mục tiêu đề tài:

Xây dựng quy trình LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) phát hiện

nhanh ASFV trực tiếp trên mẫu máu toan phan

1.3 Nội dung thực hiện:

- Thu mẫu và ly trích DNA.

- Xây dựng quy trình LAMP cho mẫu DNA đã ly trích

- Xây dựng quy trình LAMP phát hiện ASFV trên nền mẫu máu toàn phan

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu chung về virus dich tả heo châu phi (ASFV)

Vào ngày 19/2/2019, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã thông báo vềbệnh dịch tả heo Châu Phi (ASF) đã xuất hiện tại Việt Nam và công bố những vùngdịch đầu tiên ở hai tỉnh phía Bắc Tính đến hết ngày 07/04/2019, ASF đã xuất hiện ở

556 xã thuộc 91 huyện của 23 tỉnh, với hơn 89.600 con lợn bị tiêu hủy Bệnh dich nay

đã lan rộng và diễn biến phức tap, dự báo sẽ tiếp tục dién biến va ảnh hưởng tới nhiềutỉnh, thành phố trong thời gian tới, đặc biệt là các tỉnh miền Trung và miền Nam Ngày26/03/2019, Chính phủ đã thành lập Ban Chỉ đạo quốc gia phòng, chống dịch bệnhDịch tả heo Châu Phi Đây cũng là lần đầu tiên ASFV xuất hiện tại Việt Nam

Bệnh dịch tả heo Chau Phi (African swine fever - ASF) do virus ASF, thành

viên duy nhất của ho Asfarviridae gây ra ASF có khả năng gây chết heo bị nhiễm với

tỷ lệ lên tới 100% với các đặc trưng là sốt cao, xuất huyết đa cơ quan Bệnh ASF đượcMontgomery báo cáo lần đầu tiên ở Kenya vào năm 1921 và nhanh chóng lan ra một

số quốc gia Châu Phi Sau đó, ASF lan rộng ra khỏi biên giới Châu Phi, có một lần đầutiên ở Trung Âu vào năm 1957 và tái xuất hiện ở Georgia vào năm 2007 Tại Georgia,ASF tiếp tục lan rộng ra các quốc gia khác thuộc Đông Âu, gây thiệt hại nghiêm trọngtrước khi xuất hiện ở Trung Quốc, quốc gia có đàn heo lớn nhất thế giới, vào tháng

8/2018.

2.1.1 Cấu trúc ASFV

ASFV là một loại virus có DNA mạch kép lớn, hình nhị thập diện va là thành

viên duy nhất của họ Asfarviridae, chi Asfivirus (Dixon và ctv, 2005) Virus được tạothành từ bốn lớp tập trung và một màng ngoài hình lục giác (Hình 2.1) đạt được bằngcách nảy mam qua mang tế bao (Salas và Andrés, 2013) Sự nhân lên của ASFV chủyếu xảy ra trong tế bào vi khuẩn nhiễm trùng, mặc dù một giai đoạn sớm của sự nhânlên cũng đã được miêu tả trong hạt nhân Bộ gen virus có độ dài từ 170 đến 193 kb vàchứa 150 - 167 khung đọc mở Virus được phân loại và phân loại con dựa trên các biếnthể nhỏ trong một khu vực biến đổi trung tâm (central variable region - CVR) trongkhu vực trung tâm được bảo tồn Các chuỗi genome hoàn chỉnh đã có sẵn cho 15chủng virus ASFV Châu Phi và Châu Âu cho đến nay, đến từ các vùng và chủ nhân

khác nhau (heo nuôi, heo rừng và ve) Những chủng virus này có mức độ độc hại khác

nhau và da dạng gen đáng ké (De Villiers va ctv, 2010)

Virus ASFV mang độ phức tap cao: qua phân tích kỹ thuật điện di hai chiều, cóthé nhận biết tới ít nhất 28 protein cấu trúc tồn tại trong các hạt virus bên trong tế bào

và 54 protein trong các hạt virus ngoài tế bao sau quá trình tinh chế Đã có hơn 100protein do virus sản sinh được ghi nhận trong vi khuẩn nhiễm trùng Macrophage heo(Esteves và ctv, 1986) Protein gắn kết p12 va p24 có thé được phát hiện trong mangngoài của các hạt virus ngoài tế bào, trong khi protein p150, p37, p34 và p14 được xácđịnh ở lõi virus Vỏ bên ngoài cũng chứa protein hemagglutinin (HA) (sự tương đồngcủa virus với CD2 của tế bao), đây là glycoprotein duy nhất được biết đến trong hạtvirus Một số protein ASFV có tính kháng nguyên mạnh, bao gồm thành phan cau trúc

chính của vỏ boc virus (p72) cũng như các protein mang p54, p30 va p12 Hon 50

protein virus đã gây ra phản ứng kháng thé trong heo nhiễm trùng hoặc đã phục hồi.Chúng có thể được sử dụng như kháng nguyên trong chân đoán miễn dịch học, tuy

nhiên, vai trò của chúng trong việc kích thích miễn dịch bảo vệ vẫn chưa được làm rõ

(Neilan và ctv, 2004).

Các hạt ASFV vẫn 6n định trong môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh

ở pH 4-10, nhưng chúng bi vô hiệu hóa trong vải phút ở pH dưới 4 hoặc cao hơn 11.5.

Các hạt trong huyết thanh có thể giữ được khả năng lây nhiễm trong 6 năm ở 5°C

(41°F) và có thé giữ được khả năng lây nhiễm trong vai ngày ở pH 13.4 trong môi

trường chứa 25% huyết thanh ASFV bị vô hiệu hóa bang cách đun nóng ở 60°C

(140°F) trong 30 phút hoặc 56°C (133°F) trong 70 phút (Mebus, 1988) Nhiều dungmôi hữu cơ có thể vô hiệu hóa virus bằng cách phá vỡ màng lipid, nhưng ASFV chống

lại protease và nuclease.

Hình 2.1 Hình hiển vi điện tử của hạt

virus gây bệnh dịch tả heo Chau Phi.

3

2.1.2 Chan đoán ASFV

Việc chan đoán bệnh dich tả heo Châu Phi là việc xác định các con vat đã hoặctừng bị nhiễm virus Một kết quả chân đoán dương tính liên quan đến việc phát hiện vàxác định các kháng nguyên, kháng thé hoặc DNA cụ thé của ASFV trong các mẫuchân đoán lay từ heo thông qua cách cô lập virus, xét nghiệm huyết thanh hoặc phân

tích phân tử Các thủ tục chân đoán phòng thí nghiệm cho ASFV được chia thành hai

nhóm: Sinh học phân tử (PCR, Realttme-PCR, LAMP ) và huyết thanh học (Elisa,

HAD ).

Việc nhận biết các dấu hiệu lâm sàng của ASFV thường là dấu hiệu đầu tiêncho thấy virus đang hiện điện trong quần thể heo, vì ASFV thường lây lan nhanhchóng trong quan thé dé bị nhiễm Do đó, việc chân đoán sớm dẫn đến việc thực hiệnnhanh chóng các biện pháp kiểm soát là rất quan trọng Việc chân đoán ASFV bị phức

tạp bởi sự giống nhau của một loạt các bệnh khác, như là dịch tả heo cỗ điển (CSF),

hội chứng da - thận trên heo (PDNS), và hội chứng rối loan sinh sản và hô hấp ở heo

(PRRS).

Việc phát hiện nhanh chóng, đáng tin cậy, nhạy va đặc trưng cho ASFV do đó

là cần thiết, không chỉ cho việc thực hiện các biện pháp kiểm soát để ngăn chặn sự lâylan của ASFV, mà còn trong việc chân đoán phân biệt các bệnh trên heo khác có các

triệu chứng lâm sang tương tự.

Trong việc chan đoán Bệnh dich tả heo Châu Phi (ASFV), các mẫu như máu

trong chất chống đông (EDTA), lách, hạch bạch huyết, gan và nước bọt được khuyếnnghị gửi đến phòng thí nghiệm Nếu việc xử lý bị trì hoãn thì việc giữ cho các mẫu này

ở nhiệt độ càng thấp càng tốt trong quá trình vận chuyền (lưu trữ ở nhiệt độ -80°C) làrất quan trọng Trong môi trường nhiệt đới nơi việc duy trì nhiệt độ thấp là một tháchthức, một nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng giấy lọc có thê được sử dụng đề thu

thập mau, cho phép phát hiện phân tử và xác định gen của ASFV ngay cả sau khi lưu

trữ ở nhiệt độ cao trong thời gian dai.

2.2 Kỹ thuật LAMP

2.2.1 Giới thiệu chung

Kỹ thuật khuếch đại DNA đẳng nhiệt thông qua vòng lặp (LAMP) là một kỹthuật rất triển Vọng trong việc chân đoán bệnh nhờ vào sự đơn giản, hiệu quả về chỉphí và tốc độ Nó chỉ yêu cầu một thiết lập tối thiểu gồm các primer, DNA polymerase,

và một nguồn nhiệt được điều chỉnh dé tạo ra một lượng lớn các bản sao DNA mụctiêu trong vòng một giờ dưới điều kiện đẳng nhiệt LAMP cũng có thể phát hiện cácchuỗi RNA mục tiêu bằng cách kết hợp reverse transcriptase, đưa ra một lựa chọn thaythế hấp dẫn cho phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được sử dụng rộngrãi với độ đặc hiệu được cải thiện thông qua việc sử dụng nhiều primer.

Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rang kỹ thuật LAMP có độ nhạy đáng

kể hơn so với kỹ thuật PCR, với độ nhạy lên đến 100 lần hoặc cao hơn Hơn nữa,LAMP có thé kết hợp với các kỹ thuật quang phổ, độ đục, hoặc màu sắc, cho phépquan sát kết quả một cách trực quan Các nhà nghiên cứu cũng đã tiến bộ trong việckhắc phục hạn chế của LAMP về đa dạng hóa, cho phép phát hiện một phạm vi rộnghơn các mục tiêu Nhìn chung, LAMP cung cấp độ đặc hiệu và độ nhạy vượt trội sovới PCR, hiện tại là tiêu chuẩn vàng cho việc chan đoán bệnh truyền nhiễm Hơn nữa,

kỹ thuật LAMP mang lại những lợi thế về yêu cầu dao tạo thấp hơn, nhu cầu thiết bị

và hiệu quả về chi phí so với các kỹ thuật chan đoán khác Do đó, LAMP đã được chú

ý trong việc phát hiện các bệnh truyền nhiễm khác nhau Tùy thuộc vào tình trạng cụthé, LAMP có thé sử dụng các ma trận mẫu khác nhau, bao gồm lay máu từ tĩnh mạch,chọc ngón tay, bông thắm mũi họng, nước tiêu, hoặc dom (đàm), cho phép linh hoạttrong việc thu thập mẫu cho mục đích chân đoán

2.2.2 Đặc điểm

- Phan ứng khuếch đại được thực hiện trong điều kiện dang nhiệt

- Thời gian phản ứng ngắn, bước tách mạch đôi thành mạch đơn được bỏ qua

- Được sử dụng hiệu quả trong chân đoán, có thể khuếch đại được RNA khi có các

phan ứng phiên mã ngược xảy ra.

- Tính đặc hiệu và độ nhạy cao

- Hiệu quả khuếch đại cao, số lượng bản copy nhiều

2.2.3 Nguyên lý thiết kế mỗi cho phản ứng LAMP

Một cách đề thiết kế mỗi cho phản ứng LAMP là dựa vào khuôn là đoạn trình

tự nucleic của gene cần phát hiện Mỗi bộ môi cho phản ứng LAMP bao gồm bốn loạimôi đoạn F3c, F2c va Fle ở đầu 3' và đoạn B1, B2 và B3 ở đầu 5' (Hình 2.2 và Bảng2.1) để nhận dạng sáu vùng trình tự riêng biệt trên gene đích

Hinh 2.2 Cac vi tri primers (Tran Thi Thanh Huyén, 2018).

Bảng 2.1 Các mỗi được dùng trong phản ứng LAMP (Vũ, 2015)

Primer Cầu trúc

FIP (Forward Inner Primer) Chita đoạn F2 ở dau 3' có trình tự

bồ sung với đoạn F2c trên gen mục

tiêu và một đoạn ADN có trình tự

giống hệt đoạn Fle ở đầu 5'

F3 Primer (Forward Outer Chita đoạn F3 có trình tự bổ sung

Primer ) với đoạn F3c trên gen mục tiêu.

BIP (Backward Inner Primer) Chứa đoạn B2 ở đầu 3' có trình tự

bổ sung với đoạn B2c trên gen

mục tiêu và một đoạn ADN có

trình tự giống hệt đoạn Ble ở đầu

5%

B3 Primer (Backward Outer) Chứa đoạn B3 có trình tự bổ sung

với đoạn B3c trên gen mục tiêu.

2.2.4 Nguyên tắc cơ bản của phản ứng LAMP

Kỹ thuật LAMP là một kỹ thuật nhân rộng DNA xoắn kép ở nhiệt độ không đổi(khoảng 60 - 65°C) trong vòng 15 - 60 phút Dé thực hiện phương pháp này, cần cóenzyme Bst DNA polymerase, dNTP, các mỗi đặc biệt và DNA-HBV

Phương pháp LAMP bao gồm ba giai đoạn: tạo vật liệu khởi đầu, sao chép vakéo đài chuỗi DNA, và lặp lại chu trình này nhiều lần

Bước 1 - Tạo vật liệu khởi đầu

Trong quá trình phản ứng LAMP, một trong những mồi, ví dụ như FIP, sẽ gắnkết với trình tự DNA mục tiêu Đầu tiên, phần F2 của môi FIP sẽ ghép nối với phan

F2c trên gen mục tiêu (Hình 2.3B), khởi đầu cho quá trình kéo dài chuỗi do enzyme

Bst polymerase, tạo ra sợi mới theo hướng 5’ - 3’ (Hình 2.3C).

Tiếp theo, quá trình khuếch dai gen với F3 được thực hiện; mồi F3 ghép nối tại

vị trí F3c, tiến hành quy trình tổng hợp DNA trên sợi khuôn DNA mục tiêu (Hình2.3D); Sợi mới được tạo ra, thay thế và cùng lúc giải phóng đoạn DNA được tổng hợp

từ FIP ra khỏi hỗn hop phản ứng (Hình 2.3 E, F)

Trên trình tự DNA của sợi đơn mới được giải phóng, phần Fle tự ghép nối vớiF1, tạo thành cấu trúc vòng ở đầu 5’ Tương tự, mỗi BIP và B3 cũng theo cách tương

tự dé tạo thành đoạn DNA sợi don chứa cấu trúc vòng ở ca hai đầu (Hình 2.3 I) Cấutrúc này sẽ là cau trúc khởi đầu cho quá trình tai bản (chu kỳ lặp lai LAMP)

F3c F2cFle Target DNA BI B2 B3

F3 F2 Fl _ BleB2eBäe = Sete

“3 F3c F2cFle a BI B2 B3 = Fi Ble B2c B3c

Ey Ors 3 : 5 vn hà, SỐ B3 [ETPZmer]

Fier? ` DNA Polymerase - Fie Ÿ B2 pies

with strand displacement activity 7]

Hình 2.3 Tạo vật liệu khởi đầu (Tran Thị Thanh Huyền, 2018)

Bước 2 - Sao chép và kéo dài chuỗi DNA

Trong giai đoạn này, môi FIP sẽ kết nối với phần F2c của cấu trúc DNA gốchình vòng và bắt đầu quá trình tổng hợp sợi DNA thay thế Cùng lúc đó, phần F1 ởđầu 3’ sẽ được kéo dai và tạo thành cấu trúc vòng tại điểm kết thúc của trình tự BIP

Cấu trúc vòng của trình tự BIP sau đó được kéo dai, tạo ra hai loại cau trúc mới:

một là cấu trúc sợi kép có gấp khúc ở giữa (Hình 2.4), hai là một sợi đơn với cau trúcvòng ở cả hai đầu (Hình 2.4) Hai loại cấu trúc này tiếp tục làm khuôn mẫu cho mỗiBIP trong các chu kỳ tái bản tiếp theo

Sản phẩm cuối cùng của quá trình này là một tập hợp các đoạn DNA gốc hình

vòng với cau trúc gấp khúc và có chiều dài chênh lệch nhau bằng chính chiều dai của

đoạn DNA mục tiêu (Hình 2.4).

Hình 2.4 Tái bản kéo dài chuỗi DNA (Trần Thị Thanh Huyền, 2018).

Bước 3 - Lặp lại chu kỳ

Trong quá trình này, các môi FIP và BIP của cả hai sợi khuôn liên tục thayphiên nhau dé tổng hợp DNA bồ sung và tạo ra cấu trúc vòng ở cuối mỗi sợi Quátrình nay tiếp diễn, có thé tạo ra từ 10° đến 10!° bản sao DNA mach trong khoảng thờigian từ 15 phút đến 1 giờ

Khi mẫu là RNA, có hai cách tiếp cận: Cách thứ nhất là tạo cDNA trước, sau đótiến hành phản ứng LAMP như bình thường; Cách thứ hai là thực hiện phản ứng RT-LAMP (phan ứng LAMP ngược), phương pháp này yêu cầu bé sung enzyme phiên mã

ngược.

2.3 Một số nghiên cứu áp dụng kỹ thuật LAMP

Ứng dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện bốn loại virus gây bệnh tai xanh (PRRS),dịch tiêu chảy cấp (PED), dịch tả heo (CSF) và bệnh còi cọc đo circo virus (PCV2)

trong 425 mẫu phân thu thập ngẫu nhiên trên địa bàn 6 tỉnh Hà Nội, Thái Nguyên, Phú

Thọ, Yên Bái, Quảng Ninh, Thái Bình (Phạm Minh Hằng và ctv, 2020)

Phát hiện Salmonella trong các loại thực phẩm bằng kỹ thuật LAMP dé pháthiện nhanh và chính xác các chủng vi khuẩn Salmonella spp dựa trên bộ mỗi

invA2 chuyên biệt cho vùng gen invA của vi khuẩn Salmonella (Nguyễn Phạm

Trúc Phương và ctv,2022).

Ung dụng phương pháp LAMP để xác định tác nhân gây bệnh là vi khuẩn E.colimột cách nhanh chóng và hiệu quả, sản phẩm của phản ứng có thê được phát hiện bằng

mắt thường dưới sự có mặt của một loại chỉ thị kim loại là calcein mà không cần phải

điện đi trên agarose, phản ứng LAMP có thể phát hiện sự có mặt của gen độc tố eae ởnông độ rat thấp là 1,5 pg/ul (Trần Thị Thanh Huyền va ctv, 2020)

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 8 năm 2023 đến tháng 12 năm 2023 Tại Phong thínghiệm Bệnh học và Chân đoán bệnh sinh học phân tử (RIBE 302,304), Viện nghiêncứu Công Nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ

Hóa chất ly trích: bộ dụng cụ AccuRive Viral sDNA/RNA Prep Kit

Hóa chất trong quy trình LAMP: Master mix, GelRed (TBR, Viet Nam),

agarose, dung dịch chạy điện di TBE (Tris HCl: Borate: EDTA).

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Ly trích DNA từ 43 mẫu máu toàn phần dương tính, 20 mẫu máu toàn phần âm

tinh sử dụng bộ dụng cụ AccuRive Viral sSDNA/RNA Prep Kit Sau ly trích chọn ngẫu

nhiên 10 mẫu dương và 10 mẫu âm (Bang 4.1) dé tiến hành kiểm tra chất lượng DNAbằng máy do nồng độ DNA (BioDrop, Anh)