DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện 03/2023 — 07/2023 tại phòng thí nghiệm Sinh học phân
tử, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm
Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu và hóa chất
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu được thu hái tại huyện Di Linh (Lâm Đồng) và Gia Nghĩa (Đăk Nông).
Tổng cộng có 60 mẫu được thu hái tại 7 vườn.
Vườn 1 (11 mẫu): 11°21°13.2”N - 108°00°46.1”E, huyện Di Linh, tinh Lâm Đồng.
Vườn 2 (9 mẫu): 11°36°45.5”N - 108°13°24.9”E, huyện Di Linh, tinh Lâm Đồng.
Vườn 3 (9 mẫu): 11°36°52.2”N - 108°13”05.6”E, huyện Di Linh, tỉnh Lâm Đồng.
Vườn 4 (10 mẫu): 11°37°57.9”N - 108°13°05.6”E, huyện Di Linh, tinh Lâm Đồng.
Vườn 5 (5 mẫu): 11°57“46.17N - 107°44’21.7”E, tô 4, p.Nghĩa Tân, TP Gia Nghĩa, tinh
Đăk Nông.
Vườn 6 (8 mẫu): 11°58°48.3”N - 107°43°5§.6”E, thôn Nam Ra, xã Dak Nia, TP Gia
Nghĩa, tỉnh Đăk Nông.
Vườn 7 (8 mẫu): 11°58’29.6”N - 107°39°14.4”E, tổ 4, p. Nghĩa Tân, TP Gia Nghĩa, tinh
Đăk Nông.
Đối chứng dương ToMV và ToMMV được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Sinh
học phân tử, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại Học
Nông Lâm Thành Phó Hồ Chí Minh. Đối chứng âm trong phản ứng PCR là mẫu không chứa cDNA mà chỉ có thành phan phan ứng và nước DEPC. Đối chứng mẫu khỏe (IC) là mẫu cDNA cà chua sạch bệnh.
3.2.2. Hóa chất nghiên cứu
Bộ EZ — 10 Spin Column Plant RNA Mini - PrepsKit (CatBSS23 14, BioBasic), Bộ kit DNase I (Cat#01046942, Thermo Fisher), Bộ kit SensiF AST cDNA Synthesis
(Cat#LF205, Bioline), MyTaqTM Mix (Cat#PM304, Bioline), Agarose (Cat#ES521, Bioline), TAE 10X (Cat#200328, BioBasic), GelRedTM loading buffer with Tricolor
1Š
(Cat#D012, TBR), HyperLadderTM 100bp (CaMW430, Bioline), HyperLadderTM
1kb (Cat#MW421,Bioline), Primer (Phù Sa Genomic).
Bảng 3.1. lên va trình tự primer dùng trong phản ứng PCR
. Kích thước `
Primer Trinh tự (5’ — 3’) , Nguôn sản phâm
ToMV —F AAGATGTCAAACCAACTTTA
ToMV-—R GAAACATCCAACTCAAGTACG P595b
(Sui va ctv, ToMMV—F CGACCCTGTAGAATTAATAAATATT
289 bp 2017) ToMMV -R CACTCTGCGAGTGGCATCCAAT
TUB - F AGATCTGGTCCCTATGG Le 450 bp Tự thiét kê TUB -R GTTCAAGTCACCAAAACT
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Cân phân tích 4 số PA 219, tủ an toàn sinh học, máy ly tâm lạnh Micro 22 R (Hettich, Đức), nồi hấp tiệt trùng, tủ lạnh -20 °C, tủ lạnh -70 °C, microwave, may đo quang phổ (Biodrop, Anh), buồng soi UV, máy LifeEco Thermo Cycler (Bioer, Trung Quốc), máy điện di Mupid One (Takara Bio, Nhật).
Dụng cụ: Eppendorf các loại, micropipette, chày nghiền mẫu, đĩa petri, ống falcon, đầu tip các loại, ống đong các loại,...
3.3. Phương pháp nghiên cứu
PCR Giải trình tự
————>
Ly trích Xử lý Tổng hợp Kiểm tra đối chứng
—> ——>
RNA enzyme cDNA —— dương
Thu mẫu Xây dựng quy trình Áp dụng trên mẫu
Multiplex RT - PCR dai tra
<q
Hình 3.1. Sơ đồ các bước thực hiện nghiên cứu.
16
3.3.1. Kiểm tra mẫu chuẩn dương
3.3.1.1. Kiểm tra đặc tính primer trên lý thuyết
Primer khuếch đại mẫu chuẩn dương tham khảo từ nghiên cứu của Sui va ctv (2017) được kiểm tra bằng phần mềm Oligo Analyzer (https://www.idtdna.com/calc/analyzer) và phan mềm BLAST (NCBI, Hoa Kỳ) nhằm đánh giá các thông số của mồi về Tm, %GC, kích thước sản phẩm PCR tạo thành, hairpin (kẹp tóc), self— dimer, hetero — dimer, độ tương dong. Sau khi kiém tra, cap primer dat tiêu chuẩn về mặt lý thuyết sé được tổng hop tại Công Ty Công ty Cổ phan Phù Sa
Genomics (Việt Nam).
3.3.1.2. Một số tiêu chuẩn thiết kế va kiểm tra primer
Theo Anton Yuryev (2007), một số tiêu chuẩn về thiết kế primer can phai dat được bao gồm:
Chiều dai primer tốt nhất nằm trong khoảng 18 — 25 base pair.
Các môi có hiệu quả khuếch đại tốt nhất là những mỗi có các base loại G, C tập trung thành nhóm và chiếm tỉ lệ khoảng 40% - 60%. Ngoài ra, các base cuối ở đầu 3’
hay gần đầu 3’ của các mỗi này nên là G,C, GC hoặc CG.
Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi là một thông số quan trọng có ảnh hưởng lớn đến kha năng bắt cặp của môi với DNA khuôn mẫu. Dé đạt hiệu quả tốt nhất, nhiệt độ nóng chảy của primer nên nằm trong khoảng 50 °C - 72 °C. Ngoài ra, nhiệt độ nóng chảy của hai mỗi không nên cách biệt quá nhiều, tối đa khoảng 5 °C.
Trong cau trúc của méi không được có những vùng trình tự có thé tự bắt cặp bổ sung nhau vì những vùng này có thé hình thanh cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop) chặt chẽ làm giảm hiệu quả nhân ban của môi. Ngoài ra, cần tránh chọn những môi có khả năng bắt cặp bổ sung chặt chẽ với nhau ở đầu 3’ do điều này có thé dẫn tới việc tạo các mồi dimer, self— dimer,....làm giảm hiệu suất của phan ứng PCR.
Mức năng lượng (AG) hình thành nên cấu trúc thứ cấp của môi phải > - 9kcal/mol. Nếu mức năng lượng (AG) <-9kcal/mol thì Tm nên ở mức 60 °C trở lên.
Giá trị xác suất tương đồng xuất hiện không ngẫu nhiên (E) khi dùng phần mềm BLAST càng nhỏ thì mức độ tương đồng càng cao.
17
3.3.1.3. Ly trích RNA mẫu chuẩn dương
Mẫu chuẩn dương được tách chiết và thu nhận RNA tổng số theo hướng dẫn của EZ-10 Spin Column Plant RNA Mini-Preps Kit. RNA được ly trích trong điều kiện đảm bao sạch, các dau tip không có RNase va DNase.
Quy trình ly trích RNA từ lá của cây ca chua bị bệnh dựa theo sự hướng dan của bộ kit EZ-10 Spin Column Plant RNA Mini-Preps Kit (Biobasic). Đầu tiên khoảng 50 mg mẫu được cho vào eppendorf 1,5 mL. Thêm 450 L dung dich Buffer Rlysis-PG được thêm vào dé ly giải tế bao thực vật, nghiền mau trong tube bằng chảy nghiền mẫu vô trùng cho đến khi mẫu mịn hoàn toàn. Mẫu được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để tế bào được ly giải hoàn toàn. Tube mẫu được ly tam 12,000 xg trong 5 phút. Sau đó, 200 uL dich nổi được chuyên vào eppendorf 1,5 mL mới. Tiếp theo, 100 pL Ethanol được thêm vào tube và đảo đều nhẹ, nhằm giúp hỗ trợ gắn RNA vào màng. Toàn bộ hỗn hợp trên được chuyển vào cột (spin column). Cột được ly tâm 12,000 xg trong 30 giây ở nhiệt độ phòng, dung dịch đi qua cột được loại bỏ. RNA sau khi giải phóng khoi tế
bào được gitr lại trên cột lọc nhờ lớp màng ai lực với RNA. Universal GT Solution được
bồ sung 500 uL vào cột, sau đó cột được ly tâm 12,000 xg trong 30 giây ở nhiệt độ phòng, dung dich di qua cột được loại bỏ. Universal NT Solution được bồ sung 500 pL
vào cột, sau đó cột được ly tâm 12,000 xg trong 30 giây ở nhiệt độ phòng, dung dịch đi
qua cột được loại bo. Cột được ly tâm 12,000 xg trong 30 giây ở nhiệt độ phòng để cột
được khô hoàn toàn. Cột được đặt vào eppendorf 1,5 mL mới, 50 uL RNase-free Water được thêm vào cột và g1ữ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Cột sau đó được ly tâm 12,000
xg trong 30 giây ở nhiệt độ phòng, cột được loại bo và giữ lại phần dung dịch. Dung
dich chứa RNA được lưu trữ -80 °C.
Kiểm tra độ tinh sạch của RNA ở bước sóng 260/280 nm bang cách dùng 1 pL sản phẩm RNA tổng số đã được ly trích để xác định nồng độ (ng/ul) và độ tinh sạch RNA bằng mỏy đo quang phụ (Biodrop, Anh). Kết quả tỉ lệ A2ứo/A2so nam trong khoảng 1,8 — 2,0 là đủ tiêu chuẩn tinh sạch. Sau khi kiểm tra nồng độ các mẫu ly trích, tiễn hành pha loãng RNA ở các mẫu về cùng một nồng độ.
3.3.1.4. Xử lý với enzyme DNase I
Dịch trích RNA sau ly trích vẫn có khả năng tồn tại Dnase làm suy giảm sản phẩm phiên mã ngược. Xử ly enzyme Dnase I được thực hiện theo hướng dẫn bộ kit DNase I (Thermo Fisher, Hoa Kỳ) với sự hỗ trợ của máy luân nhiệt (LifeEco Thermo
18
Cycler) cho các bước ủ. Trong quá trình thao tác với dịch trích RNA, mẫu và hóa chất luôn được đặt trên đá, đảm bảo chất lượng RNA cho thí nghiệm. Thao tác phối trộn các thành phần phản ứng được thực hiện trong tủ an toàn sinh học.
Bảng 3.2. Thành phần hóa chất và chu trình nhiệt cho phản ứng xử lý enzyme Thành phần Thê tích Chu trình nhiệt
DNase I 1 ul
Buffer lu 37 °C - 30 phút RNA 8 ul
Ngừng phan ứng
EDTA 1 ul 65 °C - 10 phut
Tong thé tich 11 pl 3.3.1.5. Téng hop cDNA
RNA sau khi xử ly enzyme được tổng hop cDNA theo hướng dan thực hiện
của SensiFASTTM cDNA Synthesis Kit. Enzyme reverse transcriptate có vai trò phiên
mã ngược RNA thành cDNA sợi thứ nhất. Sử dụng máy luân nhiệt (LifeEco Thermo Cycler) cho các bước ủ. Trong quá trình thao tác, mẫu và hóa chất luôn được đặt trên
đá, đảm bảo chất lượng RNA cho thí nghiệm. Thao tác phối trộn các thành phần phản ứng được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Bang 3.3 Thành phần hóa chất tổng hợp cDNA
Thành phần Thể tích
RNA 1 pl 5X TransAmp Buffer 1 pl
Reverse trancriptase 0,25 ul H:O không chứa nuclease 2,75 ul
Tổng thể tích 5 ul
Chu trình nhiệt cho phản ứng phiên mã ngược:
Gắn primer ở 25 °C trong 10 phút
Tổng hợp ở 42 °C trong 15 phút và 48 °C trong 15 phút Biến tính ở 85 °C trong 5 phút
Giữ ở 4 °C hoặc làm lạnh trên đá
19
cDNA được tổng hợp (5 ul) có thé dem sử dụng ngay trong phản ứng PCR hoặc trữ ở -20 °C đề thực hiện PCR sau.
3.3.1.6. Khuếch đại mẫu chuẩn dương ToMV và ToMMV
Thực hiện phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gene đặc hiệu nhận biết virus trên khuôn mẫu cDNA tạo ra số lượng lớn bản sao bằng máy LifeEco Thermo Cycler (Bioer, Trung Quốc) với hai cặp primer ToMV-F, ToMV-R hay ToMMV-F, ToMMV-R có kích thước đoạn khuếch đại lần lượt là 595 bp và 289 bp với thành phần ( Bảng 3.4) và
chu trình nhiệt (Bảng 3.5) được tham khảo từ nghiên cứu của Sui va ctv (2017).
Bảng 3.4. Thanh phần hóa chất phản ứng RT — PCR khuếch đại ToMV và TOMMV Thành phần Nông độ gốc Nông độ cuối Thé tích (w])
Master mix 2X 1X 135 Primer forward 10 uM 0,2 uM 0,5
Primer reverse 10 uM 0,2 uM 0,5 Nước DEPC 9,5 cDNA 2
Tổng thé tích 25 Bảng 3.5. Chu trình nhiệt dùng cho phan ứng khuếch đại ToMV và ToMMV
Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian Số chu kỳ Tiên biến tính 95°C 5 phút 1
Bién tinh 95°C 30 giây
Bắt cặp 5⁄55 30 giây 40
Kéo dai 72°C 40 giây
Hậu kéo dài 7c 7 phút | Bảo quản 4°C foe) 1
3.3.1.7. Điện di sản phẩm PCR
Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cau trúc của các nucleic acid tích điện âm nên dưới tác động của điện trường sẽ di chuyển về cực dương. Sau khi hoàn tất quá trình khuếch đại, sản phẩm RT — PCR sẽ được điện đi bằng máy điện di ngang Mupid One (Takara Bio, Nhật) nhằm kiểm tra kích thước mẫu DNA.
Quá trình điện di thực hiện trên gel agarose 1,5% với hiện điện thé 100 V, trong 30 phút.
20
Sau khi điện di xong, miếng gel agarose được đưa vào bộ phận soi gel và ghi nhận kết
quả.
3.3.1.8. Giải trình tự mẫu chuẩn dương
Đoạn gen đã bắt cặp được gửi giải trình tự tại Công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa. Sau khi có kết quả, các trình tự được xử lý bằng phần mềm Bioedit 7.2 và đối chiều với những trình tự đã được công bồ trước đó trên ngân hàng gene NCBI.
3.3.2. Xây dựng quy trình phát hiện virus ToMV ( Tomato mosaic virus) va
ToMMV ( Tomato mottle mosaic virus) bằng kỹ thuật Multiplex RT — PCR 3.3.2.1. Đối chứng nội cho kiểm soát quy trình
Thiết kế primer đối chứng nội cho phản ứng khảo sát quá trình tách chiết
Nucleic acid
Chứng nội (Internal control) là các gen luôn biểu hiện bên trong tế bào, còn gọi là các gen giữ nhà (house keeping genes), được khuếch đại song song với DNA đích nhưng cho sản pham khuếch đại có kích thước khác sản phẩm khuếch dai của DNA đích, nhờ vậy có thé phân biệt được khi điện di nhằm kiểm soát quá trình ly trích và
phiên mã ngược. Tùy thuộc vào việc cho chứng nội vào phản ứng ở các giai đoạn khác
nhau sẽ mang đến các vai trò khác nhau bao gồm: kiểm soát được sự tách chiết trên mẫu bệnh phẩm, xác định kết quả là âm tính thật hay giả do còn ức chế hiện điện trong mẫu tách chiết nếu được cho vào PCR, kiểm soát quy trình khuếch đại DNA có đạt được độ
nhạy hay không.
Nhằm khang định trong mỗi phản ứng PCR không có hiện tượng ức ché, dé tài tổng hợp một đoạn amplicon dựa trên vùng gen § - tubulin dùng làm chứng nội (IC) do gene này có tính ôn định, trình tự bảo tồn cao giữa các loài va ít biến đổi về mức độ biểu hiện giữa các mô và loại tế bào khác nhau.
Primer được thiết kế tuân thủ theo nguyên tắc của Anton Yuryev (2007) và kiểm tra độ đặc hiệu bằng công cu Primer Blast trên Ngân hàng gene (NCBI). Sau đó tổng hợp tại Công Ty Cổ phan Phù Sa Genomics (Việt Nam).
Kiểm tra độ đặc hiệu của primer đối chứng nội
Xác định primer đối chứng nội được thiết kế có khuếch đại đúng trình tự mục tiêu từ mạch khuôn cDNA mà không khuếch đại từ mạch khuôn DNA với chỉ tiêu sản phâm PCR sau khi điện di xuất hiện băng sáng đậm, rõ và chỉ hiện đối với dịch trích RNA đã xử lí enzyme và tổng hop cDNA, ngược lại không xuất hiện băng đối với dich
21
trích RNA chưa xử lí. Tổng thé tích phản ứng 12,5 pL với thành phan phản ứng như
Bảng 3.4 và chu trình nhiệt Bảng 3.5.
3.3.2.2. Khảo sát nồng độ primer
Mỗi một phản ứng Multiplex RT — PCR bao gồm rất nhiều thành phần và chúng có thé cạnh tranh với nhau, đặc biệt là các primer. Những primer này có nồng độ xác định và sẽ cạn kiệt dần sau từng chu kỳ. Hiện tượng cạnh tranh có thể làm giảm khả năng phát hiện các mục tiêu có nồng độ thấp hoặc các mục tiêu không được nhân bản hiệu quả. Do đó, việc tối ưu hóa nồng độ và dam bảo những cặp mdi nhân bản các mục tiêu khác nhau không thé bắt cặp với nhau là điều rất quan trọng.
Khảo sát nồng độ primer ToMV và ToMMV
Đề lựa chọn nồng độ primer tối ưu cho phản ứng một cách chính xác và khách quan nhất, nồng độ primer được khảo sát ở ba mức khác nhau từ 0,1 pM — 0,3 uM, tổ hợp thành 9 phản ứng (Bảng 3.6). Tổng thé tích phan ứng là 12,5 pL bao gồm 6,25 pL Master mix, thé tích primer dựa theo tổ hợp khảo sát, cDNA 1 pL, còn lại là nước DEPC trong tổng thé tích phản ứng, chu trình nhiệt dựa theo Bang 3.7. Kết quả sau điện di được quan sát trên đèn UV trong buông soi gel và ghi nhận kết quả.
Bang 3.6. Tỷ lệ nồng độ primer cho phản ứng khảo sát nồng độ primer ToMV va
ToMMV
Nồng độ primer ToMV (uM) Nồng độ primer ToMMV
(uM) 0,1 0,2 0,3
0,1 0,1: 0,1 0,1 : 0,2 0,1 : 0,3 0,2 0,2 : 0,1 0,2 : 0,2 0,2 : 0,3 0,3 0,3 : 0,1 0,3 : 0,2 0,3 : 0,3
Nồng độ primer tối ưu được chọn phải cho kết quả các băng sáng đậm, nét, không tạo ra băng phụ cũng như dimer. Nếu các nồng độ cho kết quả đều nhau, ưu tiên chọn nồng độ thấp nhất nhằm tiết kiệm hóa chất, đảm bảo giá thành thấp, thực tế hóa việc
ứng dụng vào công tác phát hiện bệnh trong canh tác.
22
Bảng 3.7. Chu trình nhiệt dung cho phản ứng khảo sát nồng độ primer
Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian Số chu kỳ Tiên biến tính 95°C 5 phut 1
Bién tinh 95°C 1 phút
Bắt cặp Sã%C 1 phút 40
Kéo dài 12G 1 phút 20 giây
Hậu kéo dài T25 7 phút | Bảo quản 4°c co 1
Khảo sát nồng độ primer TUB
Tìm ra nồng độ tối ưu cho primer TUB trong quy trình phát hiện ToMV va ToMMV bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR ở các mức nồng độ từ 0,2 uM - 0,5 uM nhằm giảm hiện tượng cạnh tranh giữa các primer với nhau (Bảng 3.8). Thanh phan phản ứng gồm 6,25 wL Mastermix, thé tích primer dựa theo tổ hợp khảo sát, cDNA 1
uL, nước DEPC chiếm thể tích còn lại, tổng thé tích phản ứng là 12,5 wL được thực hiện theo chu trình nhiệt ở Bảng 3.7. Tiêu chí chọn nồng độ primer thích hợp dựa vào kích thước sản phẩm, độ sáng đậm của vạch sản phẩm và ít dimer nhất.
Bảng 3.8. Tỷ lệ khảo sát nồng độ primer TUB
Nông độ primer ToMV / ToMMV Nồng độ primer TUB (uM) đã tối ưu mục 3.3.2.2
(uM)
X X:02 X:03 X:04 X;0,5 0,2 0,3 0,4 0,5
3.3.2.3. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của hệ moi
Theo Lưu Thị Dung va ctv (2015), tùy thuộc vào từng nhiệt độ khác nhau trong
phản ứng mà kích thước tạo thành sản phẩm của phản ứng RT-PCR sẽ khác nhau. Khi tiến hành thiết kế mồi, nhiệt độ gắn mồi thích hợp của từng cặp môi cũng được thé hiện.
Tuy nhiên một số trường hợp hóa chất hoặc hoạt động của từng loại máy PCR mà nhiệt độ gắn môi trên thực tế có thé sai khác so với lý thuyết phần mềm.
Nhiệt độ bắt cặp được khảo sát nhằm lựa chọn nhiệt độ tối ưu cho primer gan vao mach khuôn do nhiệt độ bắt cặp nếu quá cao gây giảm hiệu quả bắt cặp, ngược lại nếu nhiệt độ quá thấp gây nên hiện tượng dương tính giả.
23
Sử dụng nồng độ primer tối ưu ở thí nghiệm trước (mục 3.3.2.2) dé thực hiện khảo sát nhiệt độ từ 52 °C — 60 °C. Thành phan phan ứng chứa 6,25 pL Master mix, thé tích primer từ nồng độ đã tối ưu, cDNA 1 pL, nước DEPC với tổng thé tích 12,5 pL được thực hiện bằng máy luân nhiệt LifeEco Thermo Cycler với chu trình nhiệt như Bang 3.9. Sau khi phản ứng PCR kết thúc, tiễn hành chạy điện di ở hiệu điện thé 100 V trong 30 phút sau đó đọc kết qua. Gel sử dụng dé chạy điện di là gel agarose 1,5% hòa tan trong dung dịch TAE 1X. Nhiệt độ bắt cặp cho tín hiệu băng càng sáng và càng đậm nhất khi điện di chính là nhiệt độ tối ưu của hệ mỗi. Nếu các mức nhiệt độ cho kết qua vạch tín hiệu đều nhau, nên ưu tiên chọn nhiệt độ cao hơn nhằm tăng độ đặc hiệu của primer có thé gắn vào mạch khuôn.
Bảng 3.9. Chu trình nhiệt sử dụng cho khảo sát nhiệt độ bắt cặp của hệ moi
Giai doan Nhiệt độ (°C) Thời gian Số chu kỳ Tiên biến tính 95 5 phút 1
Bién tinh 95 1 phut
Bắt cặp i lg 1 phat 40
Kéo dai 72 1 phút 20 giây
Hậu kéo dai 72 7 phút 1 Bao quan 4 œ 1
T*: Day nhiệt độ khảo sát ở các mức 52 °C; 53,7 °C; 55,1 °C; 57,2 °C; 58,6 °C; 60 °C 3.3.2.4. Khao sát độ đặc hiệu
Khao sát kiểm tra cặp primer có khuếch dai đúng trình tự RNA mục tiêu không nghĩa là cặp primer chỉ bắt cặp với trình tự RNA của ToMV và ToMMV mà không bắt cặp với RNA của các virus gây bệnh khác. Tiến hành thực hiện phản ứng Multiplex RT- PCR với các tác nhân khác cùng họ hoặc cùng gây bệnh trên cà chua được cung cấp bởi
Phòng thí nghiệm Sinh hoc phan tử, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh hoc và Môi trường
bằng phương pháp Sample Spike ở Bảng 3.10. Trong 7 đối tượng khảo sat, Tomato
Spotted Wilt Virus (TSWV) va Cucumber mosaic virus (CMV) cùng gây bệnh trên ca chua với triệu chứng kham và vàng lá tương tự như triệu chứng của ToMV và ToMMV
gây ra nhằm lẫn trong chân đoán nếu dựa vào triệu chứng bệnh.
Ở phương pháp Sample Spike, sử dụng mau lá cà chua khỏe trộn với mẫu đương tính các đối tượng khảo sát, ly trích RNA và tổng hợp cDNA. Áp dụng quy trình
Multiplex RT-PCR đã xây dựng lên các mẫu này. Điện di trên gel agarose 1,5% với hiện
24