Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát hoạt chất lovastatin và tối ưu hóa phản ứng PCR để phát hiện các gene trong hệ gene sinh tổng hợp lovastatin của một số chủng nấm bào ngư (Pleurotus spp.)

TÓM TẮTNghiên cứu được tiến hành để phát hiện hoạt chất lovastatin bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phố siêu hiệu năng UPLC-MS/MS và tối ưu hóa phản ứng PCR nồng độ primer, nhiệt đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

-TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHAO SÁT HOAT CHAT LOVASTATIN VÀ TOI UU HÓA

PHAN UNG PCR DE PHAT HIEN CAC GENE TRONG HE GENE SINH TONG HOP LOVASTATIN CUA MOT SO

CHUNG NAM BAO NGU (Pleurotus spp.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT CHÁT LOVASTATIN VÀ TÓI ƯU HÓA PHAN UNG PCR DE PHÁT HIỆN CÁC GENE TRONG HE

GENE SINH TONG HỢP LOVASTATIN TRONG MOT SO

CHUNG NAM BAO NGU (Pleurotus spp.)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS LÂM VỸ NGUYÊN PHAN THỊ MAI THI

TP Thủ Đức, 3/2024

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp, em đã học hỏi rất nhiềukiến thức, kỹ năng và kinh nghiệm chuyên môn rất bổ ích, thiết thực từ quý Thầy Côanh chị và bạn bè Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Quý Thầy Cô Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, đặc biệt là quý Thầy

Cô Khoa Khoa học Sinh học đã tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức và kinh nghiệmcho em trong suốt quá trình học tập ở giảng đường Dai học

Em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy ThS Lâm Vỹ Nguyên đã tạo cho em cơ hội vàtrực tiếp hướng dẫn em hoàn thành đề tài này Trong quá trình thực hiện khóa luận, Thầyluôn tận tình chỉ dạy, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành tốt khóa luận

trong thời gian quy định.

Cảm ơn ThS Võ Thị Minh Thảo — Trung tâm Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiệnthiết bị, hóa chất để em hoàn thành đề tài và cho em cơ hội tiếp xúc với môi trường làmviệc thực tế

Cảm ơn Ba, Mẹ và gia đình đã luôn động viên, khích lệ, tận tụy chăm sóc và là

chỗ dựa tinh thần, vật chất giúp con vượt qua khó khăn trong suốt quá trình học tập

Xin gửi lời cảm ơn đến các ban Khoa Khoa học Sinh học — K19 đã chia sẻ, giúp

đỡ và quan tâm đồng hành cùng mình trong suốt bốn năm qua

Xin chân thành cảm on!

XÁC NHAN VÀ CAM DOAN

Tôi tên Phan Thi Mai Thi, MSSV: 19126168, Lop: DH19SHB thuộc ngành Công

nghệ Sinh hoc Trường Dai hoc Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khóaluận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên

cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước

hội đồng về những cam kết này

Tp Hô Chí Minh, ngày 10 tháng 04 năm 2024

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành để phát hiện hoạt chất lovastatin bằng phương pháp sắc

ký lỏng ghép khối phố siêu hiệu năng (UPLC-MS/MS) và tối ưu hóa phản ứng PCR (nồng

độ primer, nhiệt độ bắt cặp, thiết kế primer) tìm ra nguồn vật liệu có chứa hệ gene sinhtong hop lovastatin trong một số chủng nam bào ngư (Pleurotus spp.) Thiết kế primerđược dựa trên trình tự hệ gene tổng hợp lovastatin Kết quả nghiên cứu thí nghiệm pháthiện hoạt chất lovastatin, tiền chất lovastatin (lovastatin aciđ) có trong một số chủngnam bào ngư (Pleurofus spp.) và trong cum gene lovastatin chứa 18 gene có khả năngtham gia vào quá trình sinh tong hợp chất chuyển hóa có 5 gene trong số nay đã được

mã hóa các enzyme cần thiết cho sự hình thành lovastatin (lovA, lovB, lovC, lovD, lovG,

và lovF) và nồng độ primer tối ưu là 0,25 uM với nhiệt độ bắt cặp ở 60 °C Kích thướcsản phâm khuếch đại PCR tương đương với kích thước sản phẩm mong muốn Kết quảnghiên cứu cho thấy mức độ đặc hiệu của các cặp primer đã sử dụng trong nghiên cứu

có độ đặc hiệu cao dé phát hiện các gene trong hệ gene sinh tổng hợp lovastatin trongmột số chủng nắm bào ngư Pleurotus spp

Từ khóa: Pleurotus spp., lovastatin, lovastatin acid, PCR, UPLC-MS/MS.

il

Research was conducted to detect the active ingredient lovastatin using

ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS/MS) and optimize

the PCR reaction (primer concentration, annealing temperature, primer design) found

the source of material containing the lovastatin biosynthesis gene in some strains of

abalone mushroom (Pleurotus spp.) Primer design was based on the lovastatin synthase

genome sequence Results of experimental research discovered that the active ingredient

lovastatin, lovastatin precursor (lovastatin acid) is present in some strains of abalone mushrooms (Pleurotus spp.) and the lovastatin gene cluster contains 18 genes capable

of participating in the biosynthesis process five of these genes encoded the enzymes required for lovastatin formation (lovA, lovB, lovC, lovD, lovG, and lovF) and the optimal primer concentration was 0.25 uM with heat pairing degree at 60°C The size

of the PCR amplified product is equivalent to the desired product size The research results show that the specificity of the primer pairs used in the study has high specificity

to detect genes in the lovastatin biosynthetic genome in some strains of abalone mushroom Pleurotus spp.

Keywords: Pleurotus spp., lovastatin, lovastatin acid, PCR, UPLC-MS/MS.

IV

MỤC LỤC

Trang

LOL CAM 00 i

XÁC NHẬN VA CAM ĐOAN -©22-222222122112271122112211221121121121121121 21121 xe 1i

(OS qoxusgsostndouEitEiEGiGortttTSCGigtidiigicdốthiEtgöobitgidigSiStdgidiSgi0232MG044000520G12003G20000zqggi-ndifE iii

PAST ST RACs stereo itor rl ta i i oa oui se sere Son nw DUS iv MUC LUC 5 V

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TẮT -2222crrrrrrrtrrtrrrrrrrrrrrrrrrrrrri vii

AE CH GáC TN i eeaasesnoarrodipseirnotsdgryssrirgttgtttssldvosg500888808 0g viiiDANET SÁCH: CÁC BIEN IT «.e«eeseseesseeinsiLOBL.2E00.2002010005001290306320079/800 000001 00c0000 033mm ix

ET TB accesses iste aon asm taeanetneeshdtoeaseastte |

EE, THẾ auugognhssis00050161081686026040E61003129635992701430705042309100024406012420080001452002383286560/002142680154 |1.2 Mute ti@u n 5

1/7 lỗi ung {He HIẾU seeaecsssiisdisie bieobilETtidirELGHIEUIRLERNSQIEEGIADGSEHIERIGAICREECGSRt28EEiis„ai 2

2.1 Tổng quan về nam bao ngư (Pleurotus spp.) -© 22-2222222222222222222EZSzscczseecre 32.1.1 Giới thiệu về nắm bào ngư (Pleurotus spp.) sssccsssssssssssessssseessssessvseessesseesesseseeseeeen 32.1.2 Chu trình sống và quá trình phát triển của nắm Pleurotus Spp - 32.1.3 Giá trị dinh dưỡng va được tính của nam bao ngư (Pleurotus Spp.) 62.2 Giới thiệu về lo vastatin 22- 2222x223 22212217112711E17111211121110.1111111 1xx ee 7

ee Neca MAS VAULT csssesiesdnliiddepisitiisssittoluidhoiikuià Svs citEeoggauiiulBnosoifugiek3diSorastiesliSliSaðugScordifinliaiklioifii01aucfn #

2.2.2 Sinh tong hop lovastatin 8n" ố 9

2.2.3 Ung Mung 1 aA.£2zœz«dœ£ŒHẶHặHHA., ẢẢẢẢ 11

2.3 Các phương pháp phát hiện Ïo vasfaf1n 5522222 S+22*+£z£+E+t+exeertsersrrersrsrree 12

2.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ siêu hiệu năng (UPLC-MS/MS) 12

2.3.2 Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) - + -c<cs+c+c+esrs 13

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 255555ccccccccccccrrrrrree 163.1 Thời giam rea on ce 16

3.2 Vat liệu Nehien 6 ilscecsecsccnemmewencnewnwewenemearenmanrmnenanen nanan 16

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu -s-2¿-©2s2+2E+£2EE22E312211122111222112111221112211 211.1 ee 163.2.2 Dung cu, 0c rẽ 16

3,3: Phương: Phap NSN Cl EỮUscscntseosiessvtgie8383080895550G903010831G0155NS045515138903449539339384905388 17

3.3.1 Phat hiện hoạt chat lovastatin bằng phương pháp sac ký long ghép khối phổ siêu

hved fans UP jGSNHGIN ỗ ÌuaenoanaantodgfoidtditSGEGRDhGSESI3H0NGGG.SG2AGNGHIISNREENGSHSHRSISIBENHESSS3H01SH2ESB 17

3.3.2 Tối ưu hóa phản ứng PCR dé phát hiện các gene trong hệ gene sinh tổng hoplovastatin của một số chủng nắm bào ngư Pleurotus SPỤ -2-©22225225222552 19CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2 -22¿222222+2E2E22222AetzErkerrrree 23

SS HUfÏÌLanugasasomubikescluiogigsldEkoribzEodersdtczuigSdfxdfimibiixganvitvgitsgbzbelgvioizg25aglirbitliszgdtimdnsiersgkbEishiE 234.1.1 Kết quả phát hiện lovastatin bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ siêu

hiệu năng (UPLC-MS/MS) 22:22 2222 221211112121212121211111111111112111111121 1c 23

4.1.2 Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR dé phát hiện các gene trong hệ gene sinh tổnghợp lovastatin của một số chủng nam bào ngư Pleurotus spp . -©52-5552 29

A Doe AG AA tia eS ra RCTS Po ih Suerte Determine 39

HHIUENNEHR KET LN VES NE sensaoonssrsoesetotootuitihoitbiigddotidokdthguiti0S00080020ã 41

8 ee 415.2 Đề nghii oe ceccececseessssesssseessseessvessssesssvessssessuessssessivessivesssvessanesssuessivesssssssesssuessacessseeeneess 41TAT TM TIENM TEEẾ EÍ neeeeeeoerenttenuercotisigetesgsr.oNGSiGGS01g02G010100301G0014i0g10g100g10g8 000 42

vi

DANH SACH CAC CHU VIET TAT

: Hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase : High Performance Liquid Chromatography : Liquid chromatography

: Low density lipoprotein : Liquid Chromatography with tandem mass spectrometry

: Mass spectrometry

: Nuclear Magnetic Resonance

: Polymerase Chain Reaction

Ultra Performance Liquid Chromatographytandem Mass

Spectrometry

Real Time Quantitative Reverse ‘Transcription Polymerase Chain Reaction

: Ribonucleic acid : Deoxyribonucleic acid : Deoxynucleotide triphosphate : Ribonuclease

: Cetyltrimethylammonium bromide : Tris Glacial Acetic Acid EDTA : Melting temperature

: Annealing temperature : Ultra-performance liquid chromatography : Potato Dextrose Broth

: Potato Dextrose Agar

: Limit of Detection : Limit of quantitation : Congenital heart disease

vil

DANH SÁCH CAC BANG

„ Chu trình nhiệt phản: ứng POR ca eecccineeoiEDi lo Di GID 21119106 0011608132151302c88 DA

Kích thước 18 đoạn gene sinh tổng hợp lo vasfafin -2-z222c+¿ 22

Ước lượng giá trị giới hạn (LOD) và giá trị định lượng (LOQ) 25

Trình tự nucleotide của các cặp mồi sử dung trong phản ứng PCR 29 Kết quả kiểm tra hệ gene sinh tổng hop lo vasfatin -. 2-22 39

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Một số loài nam thuộc chi Plewrotus SPỤ, -2-©22222222222EE2z+222Szzce 3

Hinh 2.2 Hình thái monokaryotic của Pleurotus SỤP 555 ScSccrsrsrsrsrsrsrsrres 4 Hình 2.3 Vòng đời cơ ban của các loài thuộc chi Basiđi01V€Ofđ 555-555 5 Hình 244 Cons Chức plan tũi 16 VHREBITiscsosseasssosientioiittitibidSGHGSEG-S4B130514803560382180353G2QBE2888G38 8 Hình 2.5 Cong thức phân tử của lovastatin a€1d ¿5-5222 +22 +222E+E+xzzerrerersrrsree 9

Hình 2.6 Chu trình sinh tổng hợp lo vastatin -2¿¿222E2+2222E+2+222+z+2222zzzzrzcee 11Hình 4.1 Sinh khối nam của chủng nam bao ngư trên môi trường PDB sau 14 ngày 23Hình 4.2 Sắc ký đồ của chuẩn lovastatin ở các nồng độ -z+2-+ 24Hình 4.3 Phổ đồ của chuẩn lovastatin ở các nồng độ, -. - 225222222 24Hình 4.4 Kết quả của chủng bào ngư xám Bến Tre (XB.T2-9) 2¿22cs+2cs2 26Hình 4.5 Kết quả của chủng bào ngư xám Bến Tre (XBT2-14) - ¿2 n7Hình 4.6 Kết quá của chủng bào ngư xám Bến Tre (XB.T2-13) - +2 27Hinh 4.7 Két qua cua chung bao ngu xam Bến Tre (XBT2-21) c.cccccscessseessseeseesseeeeee 28Hình 4.8 Kết quả của chủng bào ngư trắng Sai Gòn (TSG2-la) 2 2+ 28Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dung primer lovA - -s- 30Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dung primer lovA -5- 31Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử đụng primer lovA -s¿-: 32

Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dung primer lo vB -s- 5+ 33

Hình 4.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dung primer lo vC 2- 52 33Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dung primer lovD - 34Hình 4.15 Kết quả điện đi sản pham PCR sử dung primer lo vE - 5=: 35Hình 4.16 Kết quả điện di sản pham PCR sử dung primer lovG - 35Hình 4.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dung primer lo vE -:- 36Hình 4.18 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dung primer lovR - 36Hình 4.19 Kết quả điện di sản phâm PCR sử dung primer lovT - s2 37Hình 4.20 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dung primer Aect -. -:- 37Hình 4.21 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dung primer LaeA - 38Hình 4.22 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dung primer E2-6 - 38

Pleurotus spp hay còn gọi là nam sò là một trong những giống nam được nuôi trồng

quan trọng nhất trên thế giới

Một số nghiên cứu cho thấy trong nấm Pleurotus có chứa hàm lượng lovastatin đượcđưa vào sử dụng như một loại thuốc dé điều trị các bệnh liên quan đến tim mạch, ungthư Lovastatin là chất ức chế enzyme HMG — CoA (Hydroxymethylglutaryl coenzyme

A reductase), làm hạ lượng cholesterol trong máu giúp ngăn chặn bệnh lý xơ vữa động

mạch Lovastatin được tim thấy đầu tiên vào năm 1979 trên vi nấm thuộc chủngAspergillus terreus và đã được đưa vào nghiên cứu dé sản xuất lovastatin Ở Việt Nam,

nam lớn đa số được dùng làm thực phẩm nên các nghiên cứu chỉ chú trọng đến điều kiện,

kỹ thuật nuôi trồng mà chưa có nhiều báo cáo đánh giá về tác dụng của các hoạt chất sinhhọc có trong nắm ăn đặc biệt là nắm bào ngư

Ngoài giá trị dinh dưỡng, nam bào ngư còn có nhiều đặc tính dược lý có kha năng

hỗ trợ điều trị một số bệnh Với mục đích khảo sát để phát hiện hoạt chất lovastatin cógiá trị được liệu trên nấm bào ngư nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát

hoạt chất lovastatin và tối ưu hóa phản ứng PCR dé phát hiện các gene trong hệ genesinh tổng hợp lovastatin trong một số chủng nam bào ngư (Pleurotus spp.)” dé hướngtới nghiên cứu các sản phẩm hỗ trợ phòng chống một số bệnh có nguồn gốc từ nắmbào ngư và có thé lai tạo thêm được nhiều chủng nam bào ngư mới mang lại giá trị

được liệu cao.

1.2 Mục tiêu đề tài

Phát hiện hoạt chất lovastatin, tối ưu hóa phản ứng PCR khảo sát tìm ra nguồn vậtliệu có chứa hệ gene sinh tổng hợp lovastatin trong một số chủng nấm bào ngư

(Pleurotus spp.)

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Phát hiện hoạt chất lovastatin bằng phương pháp sắc ký lỏng ghépkhối phổ siêu hiệu năng (UPLC-MS/MS) trong một số chủng nam bào ngư

(Pleurotus spp.).

Nội dung 2: Tối ưu hóa thiết kế primer, nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp trong phảnứng PCR dé khảo sát hệ gene sinh tổng hợp lovastatin của một số chủng nam bao ngư

(Pleurotus spp.).

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tống quan về nam bao ngu (Pleurotus spp.)

2.1.1 Giới thiệu về nắm bao ngư (Pleurotus spp.)

Nấm bảo ngư gồm nhiều loài thuộc Chi Pleurotus,c6 tên khoa học là Pleurotus

spp Theo chữ Hy Lạp Pleurotus có nghĩa mang một bên (Pleuron — bên cạnh) và mũ

nam có hình dang như vỏ sò (ostes — lỗ tai) Do có hình dạng giống vỏ sò nên nam baongư còn được gọi là nam sò Chi Pleurotus có tới 39 loài khác nhau về màu sắc, hình

dạng như nấm bào ngư xám (P sajor— cajM) hay (Pleurotus ostreatus), bào ngư trắng

(P florida) (Dinh Xuân Linh va ctv, 2010).

Pleurotus salmoneo - tramineus

(Nam bào ngư hông)

Pleurotus citrinopileatus Pleurotus pulmonarius (Nam bao ngu hoang kim) (Nam bao ngu xam)

Hình 2.1 Một số loài nam thuộc chi Pleurotus spp

(Nguon: Viện công nghệ sinh hoc ung dung)

Phan lớn chúng là nam ăn và được nuôi trồng thương mai Chi Pleurotus có sốlượng nam trồng lớn nhất, chiếm 25 % tổng sản lượng nam trồng trên thế giới và nhiềudạng do quá trình lai tạo Theo Phạm Thành Hỗ (2022), trong hệ thống phân loại

Pleurotus thuộc nhóm sau:

Giới (Regnum) : Nấm (Fungi)

Ngành (Phylum) : Nấm đảm (Basidiomycota)

Lớp (Class) : Nam tản (Agaricomycetes)

Bộ (Ordo) : Nấm tản (Agaricales)

Họ (Familia) : Nấm sò (Pleurotaceae)

Chi (Genus) : Nam sò (Pleurotus)

Nam bao ngư (Pleurotus) được trồng nhiều ở các nước Châu Âu, Châu Á và các nướcnhiệt đới, trong đó có Việt Nam Trước đây, nắm bào ngư chủ yếu mọc hoang dại và đượcgọi với nhiều tên tùy theo vùng miễn: miền Bắc gọi là nấm chân dai (nam hương trang),nam sò, còn nấm dai thường được gọi phd biến ở miền Nam (Nguyễn Lân Hùng, 2005)

Theo Phạm Thành Hỗ (2022), nam bào ngư được khuyến khích trồng nhiều ở cácnước đang phát triển nhằm tạo nguồn thực phẩm bổ sung, đồng thời xử lý các phế liệunông lâm nghiệp dé tránh ô nhiễm, lại làm giàu chất hữu cơ cho đất Do có nhiều ưu thénên nấm bào ngư được nghiên cứu nhiều hon nam rơm Ở miền Nam khoảng thời gian

từ tháng 11 đến tháng 2 khí hậu lạnh hơn nam bào ngư mọc tốt cho năng suất cao

Nam bào ngư được khuyến khích trồng ở các nước đang có nền kinh tế phát triểnnhằm cung cấp nguồn thức ăn chứa protein thực vật Việc nuôi trồng nắm bào ngư giúpích cho việc tận dụng các chất thải nông nghiệp làm nguyên liệu nuôi trồng, giải quyếttình trạng gây 6 nhiễm và góp phần cung cấp cho đất nguồn ni tơ hữu cơ tốt cho sự pháttriển của hệ vi sinh vật (Nguyễn Hữu Hỷ và ctv, 2015)

2.1.2 Chu trình sống và quá trình phát triển của nam Pleurotus spp.

Nam bào ngư Pleurotus thuộc ngành Basidiomycota, vậy nên vòng đời của các

loài thuộc chi Pleurotus cơ bản có các giai đoạn chính tương tự như vòng đời chung của ngành Basidiomycota.

Chu trình sống của nam đảm Basidiomycota gồm có hai pha chính: pha đơn bội(monokaryon) và pha song nhân (dikaryon) Trong suốt vòng đời của ngànhBasidiomycota trải qua chín giai đoạn (Hình 2.3) bao gồm:

(1) Bào tử nảy mầm (Germination)

(2) Hình thành các sợi nấm đồng nhân (Homokaryotic mycelia)

(3) Hai sợi đồng nhân dung hợp nguyên sinh chất (Plasmogamy)

(4) Hình thành sợi nam song di nhân (Heterokaryotic dikaryon)

(5) Hình thành quả thé (Fruit body)

(6) Hình thành đảm ở tai nắm trưởng thành (Basidia)

(7) Dung hợp nhân (Karyogamy)

(8) Quá trình giảm phân (Meiosis)

(9) Hình thành 4 bào tử dam (Basidiospores)

— Pha don bội đồng nhân (Homokaryotic haploid phase)

=—— Pha song di nhân (Heterokarvotic dikaryotic phase)

—mmmms Pha lưỡng bội (Diploid phase) - Chu ky v6 tinh (Asexual cycle)

== Chu ky v6 tinh (Asexual cycle)

Hình 2.3 Vong đời co bản của các loài thuộc chi Basidiomycota.

(Cao Ngọc Kim Thoa, 2021)

Vòng đời của loài thuộc Basidiomycota bắt đầu từ pha đơn bội có các bào tử đảm

nảy mầm tạo thành các sợi nắm đồng nhân (các sợi này giống nhau về mặt đi truyền),trong mỗi khoang của sợi nấm sẽ chỉ chứa một nhân Các sợi nam này có thể nhân lênđộc lập nhờ chu trình sinh sản vô tính (Asexual cycle) hoặc có thé dung hợp vách tế bào

và nguyên sinh chất (còn gọi là plasmogamy) Khi hai sợi đồng nhân có kiểu đi truyềntương hợp nhau tiếp xúc nhau thì dan đến sự dung hợp vách tế bao và nguyên sinh chất.Sau khi dung hợp, các nhân sẽ di chuyển và bắt cặp với nhau tạo thành sợi nam song dinhân với mỗi khoang của sợi nấm chứa hai nhân khác nhau từ đây bước vào pha songnhân Ở hệ sợi song dị nhân, các sợi nắm cũng có thể nhân lên độc lập nhờ chu trìnhsinh sản vô tính hoặc tiếp tục phát triển hình thành quả thể Khi tai nam trưởng thành,chỉ tại một số tế bào đặc biệt nằm ở lớp ngoài cùng, gọi là đảm, sự dung hợp hai nhânmới xảy ra và kết quả làm các tế bào đảm từ dạng song nhân chuyển sang dạng lưỡngbội (diploid) Đảm lưỡng bội trải qua quá trình giảm phân tạo ra bốn bào tử đơn nhânmới Các đơn nhân này sẽ di chuyển vào trong các bào tử đảm nằm trên cuống đảm Kết

thúc vòng đời, các bào tử hoàn chỉnh được phát tán vào môi trường (Cao Ngọc Kim

Thoa, 2021).

Ở các giai đoạn hệ sợi đồng nhân và hệ sợi song dị nhân, các sợi nam đồng nhân

và song di nhân có thé trải qua hoặc không trải qua chu kỳ sinh san vô tinh bằng cách

tạo ra các bào tử vô tính — oidia (bào tử vách mỏng) hoặc chlamydospores (bao tử vách

dày) Nếu bao tử vô tinh là đơn nhân thì sẽ tái tao lại sợi nam đồng nhân bố mẹ Nếubào tử vô tính là song nhân thì sẽ hình thành lại sợi nấm song dị nhân

2.1.3 Giá trị dinh dưỡng và được tính của nấm bào ngư (Pleurotus spp.)

Nam bào ngư cung cấp đạm thực vật tốt cho cơ thé, kha năng tiêu hóa của nam đạt

90 % có thé so sánh với thịt do hàm lượng protein có trong nam khô chiếm từ 10 - 40 %tùy loài (Patel, 2012; Maftoun và ctv, 2013) Theo Nguyễn Lân Dũng (2003), nắm bảongư là thực phẩm ăn ngon và có nhiều giá trị đỉnh dưỡng cao do trong nam có nhiềuacid amin thiết yếu va các vitamin nhóm B như BI, B2, B5 (Niacin), B6 va vitamin

nhóm C Nam chứa 20 — 25 % protein (trọng lượng khô), béo thấp va 8 loại acid amin

thiết yếu như Glutamic, Valin, Isoleucine, Leucin, Methionine, Phenylalanine,

Threonine, Tyrosine (Nguyễn Lan Dũng, 2003)

Ngày nay, các nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học trong nam bao ngư

càng được quan tâm nhiêu hơn, cụ thê là đã có nhiêu công trình nghiên cứu chỉ ra các

dược tính của nấm bào ngư ví dụ như khả năng kháng ung thư, kháng khối u, khángviêm khớp Về mặt y học, nam ăn cũng có những đặc tính khác như phòng ngừa vàchữa bệnh nhờ vào các hoạt chất chống nấm, kháng độc tố, chất chống oxy hóa Nắm

còn giúp hạ huyết áp, tăng sự miễn dịch của cơ thé, chéng béo phì, giảm mỡ máu, ức

chế khối u và cũng tốt cho bệnh nhân tiêu đường Các thành phần hoạt tính sinh họctrong nam gồm các hợp chất có trọng lượng phan tử cao (polysaccharide, peptide vàprotein) và trọng lượng phân tử thấp (terpenoid, este axit béo và polyphenol) Các hoạtchất này tác động tích cực đến sức khỏe cộng đồng do có sự tham gia của các hoạt chất

có trong chiết xuất của nam bao ngư, có thé được thêm vào khẩu phần ăn như chất lợikhuẩn hoặc được dùng như chất bao quan tự nhiên có nguồn gốc thực vật hoặc là thànhphan của thực pham đặc chế dành riêng cho bệnh nhân Các nghiên cứu còn phát hiệnchất kháng sinh Pleurotin trong nam bào ngư có thé ding trong hóa trị và xạ trị như mộtphương pháp điều trị thay thế và cũng tác động tốt đối với các bệnh nhân mắc bệnh trầm

cảm (Golak Siwulska và ctv, 2018).

2.2 Giới thiệu về lovastatin

2.2.1 Lovastatin

Lovastatin là nhóm thuốc statin, lần đầu tiên được cục Quản lý thực phẩm và dược

phẩm Hoa Kỳ chấp nhận đưa vào sử dụng năm 1987 Lovastain được phát hiện đầu tiên

ở chủng nam Aspergillus terreus và được nghiên cứu rộng rãi trên các chủng nam khác

như Penicillium, Doratomycetes, Eupenicillium, Gymnoascus, Phoma Trichoderma và Pleurotus spp (Wasser va ctv, 2002) Lovastatin co tac dung tang tinh sinh hoc cua co

xương tại vùng tôn thương, giảm tai biến tim mach bao gồm cả co tim, nhồi máu, độtquy bằng cách ngăn chặn xơ vữa động mạch ở những bệnh nhân có hoặc không có triệu

chứng của bệnh động mạch vành (Seenivasan va ctv, 2008; Radha va ctv, 2013).

Trong những năm gần đây, statin cũng đã được báo cáo là có các hoạt tính sinh

học khác và nhiều công dung trong điều trị bệnh Statin là một nhóm dược chat rất thành

công trong việc làm giảm mức cholesterol trong máu; giảm nguy cơ bị sức khỏe tấn

công hoặc đột quy Statin là chất ức chế hydroxymethylglutaryl - coenzyme reductase

(HMG - CoA), men này chuyên HMG - CoA thành mevalonate, hình thành trong quátrình sinh tổng hợp cholesterol Nhóm statin bao gồm: lovastatin, mevastatin,atorvastatin, pravastatin, rosuvastatin, fluvastatin va simvastatin Statin có thé duoc chiathành statin tự nhiên có dẫn xuất ban tổng hop va statin có nguồn gốc tổng hợp Được

sàng lọc từ nhiều loại nắm đề tìm kiếm các hợp chất có thé ức chế HMG - CoA reductase.

Từ đó, đã tìm thấy một hợp chất được tạo ra bởi một chủng Penicillium citrinum banđầu được đặt tên là ML236B hoặc mevastatin va sau đó được gọi là compactin (Endo

va ctv, 1976) Ngay khi hiểu được tiềm năng của hợp chat mới nay, các nhà khoa học từMerck đã bắt đầu sàng lọc chủng nấm của riêng họ Họ đã phân lập được chủng

Aspergillus terreus tạo ra một statin hiệu qua hon lovastatin (Alberts và ctv, 1980).

Lovastatin là hoạt chất có trong các sản pham men gạo đỏ, được dùng làm chất bổsung vào chế độ ăn uống Trong các sản phẩm như vậy, lovastatin chủ yếu được gọi là

monakolin K và kèm thêm 13 monacolin tự nhiên có trong men gạo đỏ để làm giảm

lipid tổng và cholesterol tổng trong máu Các sản phẩm này được hàng triệu ngườithường xuyên sử dụng như một liệu pháp bổ sung và thay thé làm giảm tổng lượng lipid

một nhóm hydroxyl và một naphtalen được hydro hóa một phần với nhóm thế hydroxyl

được este hóa với dư lượng axit 2-metylbutyric Phan tử lovastatin có công thức hóa học

là C2sH36Os, có khối lượng phân tử là 404,5 g/mol, có tên thông thường là Mevinolin,

Monacolin K.

Hình 2.5 Công thức phân tử của lovastatin acid.

(Albert, 1980)

Hình 2.5 cho thấy công thức phân tử của lovastatin acid có công thức hóa học làC›4H:sOs khối lượng phân tử là 422,6 g/mol, tên thông thường là Mevinolic acid, tiềnchất của lovastatin

Dé phát hiện hoạt chat lovastatin đã có một số nghiên cứu đã tìm ra bang cách đánhgiá phương pháp phé công hưởng từ hạt nhân (NMR) về tổng hàm lượng statin và ứcchế HMG - CoA reductase trong thực phẩm bổ sung men gạo đỏ (Monascus spp.)

(Lachenmeier va ctv, 2012) Ngoài ra, hàm lượng lovastatin thường được sử dung

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với tia cực tím phát hiện ở bước

sóng 238 nm Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm lên

men, theo đó các cột pha đảo phân tích C18 được ôn định trong các pha động khác nhau,

và các dạng axit lovastatin và lacton dé dàng được phân tách và định lượng Tuy nhiên,

một số báo cáo đã tập trung vào điện di mao quản để định lượng lovastatin trong môi

trường canh thang (Nigovic và ctv, 2013).

2.2.2 Sinh tong hop lovastatin

Năm 1985, Endo va ctv đã nghiên cứu ban đầu dựa trên nấm Monascus ruberchỉ ra rằng monacolin L và J là chất trung gian trong con đường sinh tổng hợplovastatin Người ta đã chứng minh rằng monacolin L là chất đầu tiên được tổng hợp

từ 9 phan tử axetate va lần lượt được chuyên thành monacolin J bằng quá trình

hydroxyl hóa Trong phản ứng hydroxyl hóa, !8O2 đã được tích hợp vào monacolin J

thông qua hoạt động của hệ thống monooxygenase liên quan đến cytochrom P - 450

có trong dịch chiết xuất của M ruber (Komagata va ctv, 1989) Các nghiên cứu sau

đó đã chứng minh sự biến đổi của monacolin J thành lovastatin (Kimura và ctv, 1990).Nghiên cứu trên nam Aspergillus ferreus, sử dụng tiền chất được đánh dau (Chan và

ctv, 1983; Greenspan va ctv, 1985; Moore và ctv, 1985; Shiao và ctv, 1987) chỉ ra

rằng quá trình sinh tổng hợp lovastatin cũng bat đầu từ các don vị axetate được liênkết với nhau theo kiêu từ đầu đến cuối dé tạo thành hai chuỗi polyketide (Hình 2.5).Nhóm methyl hiện diện trong một số statin ở chuỗi bên hoặc ở các dẫn xuất C6 từmethionine, và được chèn vào cấu trúc trước khi đóng vòng (Shiao và ctv, 1987).Chuỗi chính sau đó được xi lanh hóa và trong một số statin được este hóa bởi chuỗibên tại C§ Các nguyên tử oxy có trong chuỗi chính được đưa vào sau đó bằng quátrình oxy hóa hiếu khí (Alberts và ctv, 1980; Greenspan va ctv, 1985; Moore va ctv,1985) Do đó, người ta đã chứng minh rằng lovastatin được tạo ra từ axetate thông

qua con đường polyketide (Moore và ctv, 1985).

Quá trình sinh tổng hợp lovastatin được nghiên cứu đầu tiên trên chủng nấm

Aspergillus terreus và hình thành cụm gene loavastatin chứa 18 gene có kha năng

tham gia vào quá trình sinh tổng hợp chất chuyển hóa LovB mã hóa lovastatinnonaketide synthase (LNKS) tổng hợp dehydromonacolin L với sự tham gia của cácsản phẩm của lovC và lovD Sản phẩm của lovA biến đổi monacolin L thànhmonacolin J Sản phẩm của lovF là lovastatin diketide synthase (LDKS) vì nó kết hợp

2 phân tử axetat và polyketide tổng hợp chuỗi bên 2-methylbutyryl-S LovD mã hóamột esterase hợp nhất cả hai polyketide dé tạo thành lovastatin LovE và lovH là cácgen bình thường, trong khi các sản phẩm của lovT và lovR tham gia vào quá trình vậnchuyển và kháng thuốc Monacolin L được tạo thành bởi các phản ứng ngưng tụ liêntiếp của các đơn vị malonat và axetat (axetyl-CoA và malonyl-CoA) đại diện cho sựkết hợp từ đầu đến đuôi của 9 axetat LovB và lovC xúc tác cho khoảng 35 phản ứng

dé tạo thành dihydromonacolin L Thioesterase lovG được phát hiện là nguyên nhângiải phóng sản phẩm từ lovB Con đường sinh tổng hop lovastatin được thực hiện bởimột loại enzyme duy nhất LovA là một monooxygenase cytochrome P450 và xúc tác

quá trình chuyên đổi axit dihydromonacolin L thành axit monacolin L và sau đó thành

axit monacolin J Thông qua nhánh khác, diketide, 2-methylbutyryl-CoA được tổnghợp từ acetyl-Co và malonyl-CoA bởi polyketide synthase LovF Cuối cùng, mộttransferase, được mã hóa bởi lovD, kết nối hợp chất này với monacolin J để tạo ra

10

dạng axit cua lovastatin hoặc axit mevinolinic do vậy lovastatin được hình thành từ

hai chuỗi đơn vị polyketide và mỗi chuỗi polyketide có một nhóm methyl dẫn xuất

D#ytwomonacoen (_ Monecokn | Monacotn J

lovA lo lovG lovD lovE lovF lovH ORF15 ORF16 ORF17 oprxg

ORF1 ORF2 lovC LovR LovT ORF12 ORF14

Modified from Mulder et al 2015

Hình 2.6 Chu trình sinh tổng hợp lovastatin

(Mulder, 2015 )

Cơ chế hoạt động của lovastatin được chuyên hóa thành dạng hoạt động của nó làaxit beta-hydroxy trong dạ dày và có chức năng ức chế cạnh tranh 3-hydroxy-3-

methylglutaryl-coenzyme A (HMG - CoA) reductase Enzyme này tham gia vào bước

giới han tốc độ tong hợp cholesterol Cac chat ức chế HMG-CoA cũng lam giảm nồng

độ protein phản ứng C nhạy cảm cao (hsCRP), cải thiện chức năng nội mô, giảm viêm

tại các vị trí mảng bám mạch vành, ức chế kết tập tiểu cầu và có tác dụng chống đôngmáu Ngoài ra, giảm cholesterol huyết thanh sẽ kích thích biểu hiện thụ thé LDL trên tế

bảo gan, làm tăng thêm quá trình dị hóa LDL.

2.2.3 Ứng dụng

Theo Gibbons và ctv (2003) cho thấy sự ức chế HMG-CoA reductase bởilovastatin tạo ra nhiều chuyển hóa của các isopernoid Chúng rất quan trọng trong việckiêm soát sự phát triển và biệt hóa của tế bào Do đó, lovastatin cho thấy tác dụng da

hướng Lovastatin đã được chứng minh là làm giảm bệnh tim mạch vành (CHD) ở bệnh

nhân, bằng cách giảm mức cholesterol trong huyết tương Các thử nghiệm lâm sàng đãchứng minh rằng statin không chỉ làm giảm mức cholesterol trong huyết tương mà cònlàm giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân (Seenivasan và ctv, 2008) Lovastatin kiểm soátCHD bang cách cải thiện phản ứng nội mô; duy trì sự ôn định của mảng bám và ngănngừa sự hình thành huyết khối (Pickin và ctv, 1999) Sự hình thành cholesterol đã bị

11

ngăn chặn bởi lovastatin, bằng cách ức chế enzyme HMG - CoA, đây là enzyme quantrọng đề hình thành mevolanat từ 3-hydroxy 3-methylglutaryl coenzyme A (Alberts và

ctv, 1980).

Theo Zamvil (2002) cho rang những bệnh nhân sử dung lovastatin đã cho thay khanăng ngăn ngừa bệnh đa xơ cứng Các nghiên cứu cho thấy rang lovastatin đã ức chếyếu tô hoại tử khối u (TNFa), ngoài ra còn làm giảm mức độ phản ứng viêm Nhữngphan ứng này xảy ra do sự điều chỉnh của tế bào trình điện kháng nguyên (APCID và sự

ức chế MHCIL

Nghiên cứu tác dụng cua lovastatin trong quá trình trưởng thành của xương; các

nghiên cứu đã được thực hiện bằng cách tiêm các hạt nano lovastatin với liều caolovastatin Kết quả cho thấy rằng các liều lượng cao kích thích sự hình thành xương cao,

và việc tiêm lovastatin tại các vị tri cụ thé sẽ chữa lành vết gãy xương dui và giảmkhoảng cách gãy xương vỏ não Những sự hình thành xương này được quan sát rõ ở liều

lượng cao, nơi có sự kích thích hình thành xương dài ở chuột Những nghiên cứu này

cho thấy rằng lovastatin có thể được sử dụng dưới dạng hạt nano, có thể được sử dụng

trong việc sửa chữa gãy xương (Garret và ctv, 2007).

2.3 Các phương pháp phát hiện lovastatin

2.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối pho siêu hiệu năng (UPLC-MS/MS)

Theo Dunn (2019) cho rằng phương pháp UPLC-MS/MS là một kỹ thuật hóa họckết hợp khả năng phân tách vật lý của sắc ký lỏng với khả năng phân tích khối lượngcủa phép đo khối phổ bao gồm hai phần sắc ký lỏng và khối phổ, được sử dụng chonhiều ứng dụng có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao, cung cấp khả năng phân giải khốilượng và sắc ký cao, chế độ thu thập dữ liệu linh hoạt cho phép nhận dạng các chất

chuyển hóa và thu thập dữ liệu dé phân tích hàng trăm hoặc hàng nghìn mau và chất

chuyên hóa phục vụ cho nghiên cứu kiểu hình và kiểu gene, tiêu thụ dung môi ít và rútngắn thời gian phân tích, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay

hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Trong những năm gần đây, sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) đã trở nên đặc

biệt phô biến do khả năng phân tách các phân tử nhỏ nhanh hơn Kỹ thuật này, được

sử dụng để tách các thành phần có trong hỗn hợp nhiều thành phần, đã tìm thấy ứngdụng trong nhiều lĩnh vực chang hạn như hóa học, dược phẩm, thực phẩm và hóa sinh

Nó là một công cụ quan trọng trong cả nghiên cứu và sản xuất UPLC đã tạo ra những

12

khả năng mới dé phân tích các chất mà không làm giảm chất lượng của sản phẩm thuđược Do đó, kỹ thuật này là một cột mốc quan trong trong sac ky lỏng (Gumulka vàctv, 2022) Kỹ thuật UPLC đã cải thiện đáng kế quy trình tối ưu hóa phương pháp vithời gian phân tích ngắn hơn và cho phép phân tích nhiều điều kiện thử nghiệm hơn

so với HPLC thông thường.

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) đã trở nên đặc biệt phổ biến do khả năng phântách các phân tử nhỏ nhanh hơn Kỹ thuật này, được sử dụng dé tách các thành phần cótrong hỗn hợp nhiều thành phan, đã tìm thấy ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, chang hannhư hóa học, dược pham, thực phẩm và hóa sinh Nó là một công cụ quan trọng trong

cả nghiên cứu và sản xuất UPLC đã tạo ra những khả năng mới để phân tích các chất

mà không làm giảm chất lượng của sản phẩm thu được

Khối phô là loại thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử củacác hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỷ số giữa khối lượng vàđiện tích (m/z) của chúng Các ion có thé tao ra bằng cách thêm hay bớt điện tích củachúng như loại bỏ electron, proton hóa Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z

và phát hiện, từ đó có thé cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử hợp chat.Cấu tạo của một thiết bị khối phố gồm 3 thành phần chính: nguồn ion, bộ phận phân tíchphổ và bộ phận phát hiện

Dé phân tích các hợp chất và nền mau phức tap cũng như nâng cao độ phân giải,tốc độ, và độ nhạy, sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC - Ultra Performance LiquidChromatography) ngày càng được đưa vào sử dụng rộng rãi Cái tiến lớn nhất của hệ

thống sắc ký UPLC so với HPLC (High Performance Liquid Chromatography) là ở cột

phân tích, với đường kính nhỏ hon 2 mm và kích thước hạt nhỏ hơn 2 umn, nhờ đó tang

đáng ké số lượng đĩa lý thuyết Hệ thống này giảm lượng dung môi sử dung ít nhất 80%

so với HPLC và thời gian chạy ngắn hơn khoảng 1.5 phút Kích thước hạt nhỏ nên ápsuất trong hệ cũng lớn hơn so với HPLC, thể tích tiêm mẫu nhỏ hơn, những nguyênnhân trên góp phần tăng đáng kế độ phân giải, độ nhạy và hiệu năng với kết quả nhanh

hơn và tiêu thụ ít dung môi làm giảm chi phí, thân thiện với môi trường (Chawla và

ctv, 2016).

2.3.2 Phuong phap Polymerase Chain Reaction (PCR)

Người đặt nền móng trong việc ứng dụng kỹ thuật PCR là Kary Mullis(1985).PCR dựa trên việc sử dụng khả năng của DNA polymerase để tổng hợp chuỗi

13

DNA mới bổ sung cho chuỗi mẫu được cung cấp Bởi vi DNA polymerase chỉ có théthêm một nucleotide vào nhóm 3' - OH có sẵn, nên nó cần một đoạn prImer đề nó có théthêm nucleotide đầu tiên Yêu cầu này giúp có thể phác họa một ving cụ thé của trình

tự mẫu mà nhà nghiên cứu muốn khuếch đại Khi kết thúc phản ứng PCR, trình tự cụthé sẽ được tích lũy thành hàng tỷ bản sao (bộ khuếch đại)

Nguyên lý hoạt động của phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau.Mỗi chu kỳ được thực hiện gồm 3 bước như: (1) biến tính; (2) bắt cặp; (3) kéo dài

(1) Biến tính DNA (denaturation): ở điều kiện nhiệt độ cao phân tử DNA từ mạch

đôi tách ra thành dạng mạch đơn, thường là 94 °C - 95 °C trong vòng 30 giây - 4 phút.

(2) Bắt cặp (anealation): nhiệt độ nhỏ hơn nhiệt độ nóng chảy Tm (meltingtemperature) của các primer cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực

nghiệm nhiệt độ dao động trong khoảng 40 °C - 70 °C tùy thuộc Tm của các primer sử

dụng và kéo đài từ 30 - 60 giây tùy thuộc vào kích thước sản phẩm khuếch đại

(3) Kéo dai (extension): đưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lầnlượt gắn vào primer theo nguyên tắc b6 sung với mạch khuôn Mach mới được tạo thành

từ primer được nối dai Nhiệt độ phản ứng là 72 °C

Thành phần phản ứng phản ứng PCR bao gồm các thành phần phản ứng như sau:(1) Taq DNA polymerase: là enzyme chịu nhiệt để xúc tác tổng hợp đoạn DNA

mục tiêu từ khuôn chủng.

(2) Primer: là yếu tố quyết định đến tính hiệu quả và chuyên biệt của phản ứngkhuếch đại Primer là yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất đến sự thành công hay thất bại của

quy trình phản ứng PCR.

(3) Bốn loại nucleotide (dATP, đTTP, dGTP, dCTP): thường được sử dụng ở nồng

độ 200 uM/mỗi loại nucleotide Nếu nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại sảnphẩm dương tính giả hay tạp nhiễm Sự mat cân bằng trong thành phần các nucleotide

lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase

(4)Nồng độ Mg?': cũng là một nhân tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại, nồng

độ MgCl càng cao càng làm giảm độ đặc hiệu của Taq DNA polymerase Nong độ tối

ưu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thường nồng độ tối ưu này

phải được xác định riêng cho từng phản ứng.

14

(5) Buffer: để duy trì pH, Tris - Cl, điều chỉnh pH giữa 8,3 — 8,8 ở nhiệt độ phòng,

có nồng độ 10 mM trong phản ứng, khi ủ ở 72 °C (nhiệt độ ở pha kéo dài), pH của toàn

bộ hỗn hợp phản ứng khoảng 7,2.

(6) DNA: chứa trình tự mục tiêu, có thé được thêm vào hỗn hợp dưới dạng chuỗi

đơn hay chuỗi đôi DNA dạng vòng thì không hiệu quả bằng DNA ở dạng thắng Nồng

độ DNA mẫu ở khoảng 50 ng/uL là thích hợp cho một phản ứng PCR.

độ biểu hiện gen trong khối u, vi khuẩn hoặc các tình trạng bệnh khác Mặc dù PCR làmột kỹ thuật có giá trị nhưng nó cũng có những han chế Bởi vì PCR là một kỹ thuật có

độ nhạy cao, bat kỳ hình thức nhiễm ban nào của mẫu bằng một lượng nhỏ DNA đều cóthể tạo ra kết quả sai lệch (Bolognia va ctv, 2008; Smith va ctv, 2009)

Ung dụng kỹ thuật PCR đề khuếch dai gene lovD từ DNA bộ gene của Aspergillusterreus trong quá trình sinh tông hợp các chất tương tự lovastatin (Xie va ctv, 2006)

Trong chuẩn đoán bệnh ung thư giúp tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện

gene APC trong ung thư đại tràng, gene BRCA I- BRCA 2 trong ung thư vú, gen

NF-1,2 trong u xơ thần kinh; xác định độc tố của vi sinh vật và còn được dùng dé nghiêncứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn (Mai Văn Tuấn, 2012)

15

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện: 6 tháng

Địa điểm: Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh Số 2374, quốc

lộ 1,khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vật liệu: 5 chủng nắm bao ngư Pleurotus spp được phân lập, định danh và lưu trữ

tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học ứng dụng (ABI).

Bảng 3.1 Danh sách các chủng nam bào ngư (Pleurotus spp.) được khảo sát

STT Tên địa phương Kí hiệu

| Bào ngư Xám Bên Tre XBT2-9

2 Bào ngư Xám Bến Tre XBT2-13

3 Bao ngu X4m Bén Tre XBT2-14

4 Bào ngư Xam Bến Tre XBT2-2I

5 Bao ngu Trang Sai Gon TSG2-la

3.2.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

3.2.2.1 Dụng cụ

Đầu tip - pipet các loại từ 0,5 uL đến 1000 pL, ống đong, dia petri, tube, mang lọc,giấy lọc, đèn côn, cốc thủy tinh, eppendorf, khay đựng eppendorf, ống nghiệm thủy tinh,bình cầu 25 mL, ống sinh hàn hồi lưu, cột tách, que cấy trải,vial thủy tinh 1.5 mL, erlen

(500 mL), bình duran 100 mL, 500 mL

3.2.2.2 Thiét bi

May PCR (hang Benchmark), May ly tam Eppendorf 5424R (hang Eppendorf),

May vortex (Stuart), Tủ lạnh (-20 °C và -4 °C), Hệ thống sắc ký lỏng ghép hai lần khốiphô (UPLC-MS/MS), Bề rửa siêu âm Elmasonic S 300H, Elma, Đức, Máy đọc gel DNA

(Cleaver scientific), Cân 2 số và cân 4 số (Metter Toledo), Máy ủ nhiệt khô Thermo

Mixer (Eppendorf), Nồi hap AUTO CLAVE (hãng HIRAYAMA)

16

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phát hiện hoạt chất lovastatin bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phố

siêu hiệu năng (UPLC-MS/MS).

Các chủng nam được nuôi cấy hoạt hóa trên môi trường PDA trong 4 ngày Sau

đó các chủng nam được nuôi cấy tăng sinh trong 5 bình tam giác chứa 40 mL môi trườngPDB Điều kiện nuôi cấy: môi trường lỏng, ở nhiệt độ 27 °C, môi trường có độ pH = 5,hấp ở 121 °C Sau khoảng 14 ngày nuôi cấy, thu hệ sợi bằng giấy lọc và sấy khô ở 50

°C đến khi trọng lượng không đổi Sau khi sấy khô hệ sợi (5 chủng) ở Bảng 3.1 tiếp tụctiến hành quy trình xử lý mẫu (quy trình tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí

Minh) như sau:

(1) Cân 2,55 g hệ sợi nam bào ngư sau khi đã được sấy khô và nghiền nhỏ bỏ vàotúi lọc, chuẩn bị bình cầu có chứa dung môi acetonlitrile (ACN) (tỷ lệ chủng: tỷ lệ dung

môi là 1:50 w/v).

(2) Chiết Soxhlet trong 3 tiếng ở 60 °C

(3) Thu được địch chiết, sau khi chiết Soxhlet đem đi cô quay ở 60 °C, làm lạnh ở

5 °C, 150 vòng/phút, cô quay cho acetonitrile bay hơi còn lại trong bình khoảng 10 —15

mL địch chiết và đồ ra ống falcon, sau đó đem đi thôi khô cho acetoniltrile (ACN) còntrong dịch chiết bay hơi hoàn toàn

(4) Thu địch chiết cô cạn thêm 2 mL methanol (MeOH) vào sau đó đem đánh sóngsiêu âm cho địch chiết và dung môi hòa tan hoàn toàn

(5) Lọc qua màng lọc 0.45 um và dé trong vial sau đó tiến hành phân tích lovastatinbằng hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ siêu hiệu năng (UPLC-MS/MS) được tự độngtối ưu trên hệ thống MS qua các điều kiện phân mảnh, điều kiện nguồn và khí

Chuẩn bi mẫu trắng: hút 1-2 mL MeOH (Merck) vào ống vial, sau đó được phântích trên hệ thống UPLC-MS/MS Mẫu không phát hiện thấy lovastatin được sử dụng

làm mâu trang.

17