Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo xác điều kiện thích hợp và khả năng xử lý rác thải hữu cơ bằng các vi khuẩn ưa nhiệt

TÓM TẮTNghiên cứu được tiến hành dé xác định điều kiện môi trường tối ưu về nhiệt độ và pH trên 5 chủng vi khuẩn ưa nhiệt thuộc chi Bacillius có hoạt tính enzyme ngoại bao mạnh đã được p

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

—

KHẢO XÁC DIEU KIEN THÍCH HỢP VÀ KHẢ

NANG XU LY RAC THAI HỮU CƠ BANG

CÁC VI KHUAN ƯA NHIET

Nganh hoc : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : NGUYEN TAN HUY

MSSV : 19126065

Niên khóa : 2019-2023

TP Thủ Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG DAI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHẢO XÁC DIEU KIEN THÍCH HỢP VÀ KHẢ

NĂNG XỬ LÝ RÁC THÁI HỮU CƠ BẰNG

CÁC VI KHUAN ƯA NHIỆT

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS Nguyễn Hữu Trí Nguyễn Tan Huy

TP Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Em xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã

cho em được học tại trường, cho môi trường học tập và phát triển tri thức cũng như các

kỹ năng Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hữu Trí đã luôn nhiệt tình hướng dẫn,

động viên và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài Thầy đã truyền đạt những kinh

nghiệm, cho em những ý kiến hay giúp em hoàn thành khóa luận Em cũng xin cảm ơn

TS Biện Thị Lan Thanh, cô đã cho phép em vào phòng lab sử dụng môi trường và các

thiết bị dé em có thể thực hiện các thí nghiệm trong dé tài Em xin gửi lời cảm ơn đếnquý thầy cô và các bạn trong Khoa Khoa học Sinh học, đã luôn tạo điều kiện thuận lợi,

hỗ trợ giúp em hoàn thành đề tài nghiên cứu Em cũng xin cảm ơn gia đình luôn ủng hộ,động viên em và quan tâm Gia đình là chỗ dựa cũng là động lực dé em có gắng Em

cũng xin cảm ơn các anh, chị, bạn bẻ trong Lab Bio 311, cũng như các ban trong lớp

DHI19SHB các bạn khóa k45 cùng các anh em cùng sống với em đã luôn giúp đỡ vàđồng hành cùng em trong suốt thời gian học đại học

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Nguyễn Tan Huy, MSSV: 19126065, Lớp: DH19SHB thuộc ngành Công nghệSinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa luậntốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu

là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toan chịu trách nhiệm trước hội

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm

Người viết cam đoan

NGUYEN TAN HUY

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành dé xác định điều kiện môi trường tối ưu về nhiệt độ và

pH trên 5 chủng vi khuẩn ưa nhiệt thuộc chi Bacillius có hoạt tính enzyme ngoại bao

mạnh đã được phân lap, định danh và ứng dung thử nghiệm xử lý rác thải hữu cơ sinh hoạt Khả năng sinh trưởng của các chủng được xác định thông qua phương pháp đo

mật độ quang học (OD) đề xác định điều kiện môi trường tối ưu Điều kiện nuôi cấy tối

ưu cho các chủng vi khuẩn được xác định trong các khoảng nhiệt 40°C, 45°C, 50°C,

55°C và các giá trị pH 6,7,8,9 Kết quả khảo sát cho thấy ở nhiệt độ 50°C và pH§ cho

thấy vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng và phát triển tốt nhất chế phẩm lỏng từ các vi khuẩn

được nuôi tăng sinh theo điều kiện môi trường tối ưu là 50°C và pH8, mật độ vi sinh vật

được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Kết quả sau 16 giờ nuôi cây mật độ visinh trung bình dat là 3,9 x10Ÿ CFU/ml Phối trộn chế pham vi khuẩn với tỉ lệ 1% về

trọng lượng với với rác hữu cơ sinh hoạt đã được xay nhỏ Quá trình ủ được theo dõi

các thông số nhiệt độ, độ âm, pH khối lượng hao hụt sau 22 ngày ủ Các chỉ tiêu chấtlượng của mẫu ủ phân bón được phân tích gồm độ am, pH, tỷ lệ các kim loại nặng arsen

(TCVN 11403-2016), cadimi (TCVN 9290-2012), thủy ngân (TCVN 10676:2015), chi (TCVN 9290-2012), tỷ lệ C/N (C:TCVN 9294-2012, N:TCVN 8557-2010), hàm lượng

nito tong số (TCVN 8557-2010), nitơ hữu hiệu (TCVN 9295-2012), hàm lượng phosphohữu hiệu (TCVN 8559-2010), hàm lượng K20 hữu hiệu (TCVN 8560-2018), tổng visinh vật hiểu khí, Salmonella Sản phẩm sau ủ với chế phẩm vi sinh có các thông số tốthơn đáng kể so với mẫu ủ không chế phẩm tỷ lệ C/N (10,6/14,5), nitơ tổng số

(1,48/1,02) , nito hữu hiệu (0,206/0,176), phospho hữu hiệu (0,701/1,01), kali hữu hiệu

(1,3/1,28), vi sinh vật hiếu khí tổng số (4,55 x 108 CFU/ 2,7 x 108 CFU) Tuy số liệu rattốt nhưng các chỉ tiêu về hàm lượng nito tổng số, phospho hữu hiệu, va kali hữu hiệu

<2% chưa đáp ứng được quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-189:2019/BNNPTNT

về chất lượng phân bón

Từ khóa: vi khuẩn ưa nhiệt, Bacillus sp., xử ly chat thải hữu cơ, chế phẩm sinh học,

phân bón.

The study was conducted to determine the optimal environmental conditions of temperature and pH on 5 thermophilic bacterial strains of the Bacillius genus with strong extracellular enzyme activity that were isolated, identified and applied to to treat organic household waste The growth ability of the strains was determined through optical density measurement to determine optimal environmental conditions Optimal culture conditions for bacterial strains was determined in the temperature ranges 40°C, 45°C, 50°C, 55°C and pH values of 6,7,8,9 The results show that at a temperature of 50°C and pH8, bacteria have the optimal growth Liquid bacterial bioproduct preparation from bacteria were grown under optimal environmental conditions of 50°C and pH§, microbial density was determined by the colony counting method The result after 16

hours of culturing the average microbial density was 3.9 x10® CFU/ml Mix the bacterial

product at a ratio of 1% by weight with crushed organic household waste The incubation process is monitored for temperature, humidity, pH, and mass loss after 22 days of incubation Quality indicators of compost samples analyzed include moisture, pH, ratio

of heavy metals arsenic (TCVN 11403-2016), cadmium (TCVN 9290-2012), mercury (TCVN 10676:2015), lead (TCVN 9290-2012), C/N ratio (C:TCVN 9294-2012, N:TCVN 8557-2010), total nitrogen content (TCVN 8557-2010), effective nitrogen (TCVN 9295-2012) , effective phosphorus content (TCVN 8559-2010), effective K2O content (TCVN 8560-2018), total aerobic microorganisms, Salmonella The product after incubation with microbial preparations has significantly better parameters than the sample incubated without preparations, C/N ratio (10.6/14.5), total Nitrogen (1.48/1.02), effective nitrogen (0.206/0.176), effective phosphorus (0.701/1.01), effective potassium

(1.3/1.28), total aerobic microorganisms (4.55 x 108 CFU/ 2.7 x 108 CFU) Although the

data are very good, the indicators of total nitrogen content, effective phosphorus, and effective potasstum <2% do not meet national technical standards QCVN 01- 189:2019/BNNPTNT on fertilizer quality.

Keywords: thermophilic bacterial, Bacillus sp., organic waste treatment, bacterial bioproduct, fertilizer.

MỤC LỤC

Trang

LOI CAM 09 i

XÁC NHẬN VA CAM ĐOAN «các HH9 Re 3020 c6 12 ii90V UNH-4£rFƑrm iii

ABS TRAC DT synn1090EES0AEGOISIGIIGEE0bhihhaf8tbiba3809iondsgttuệnthisgbedt9lbislanesiscpinaeipbilikosbcfoilisBooludsao 1V

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TẮTT - 2: 2222222E+2E22EE2EE222222E2E2221222222222xe2 viiDANH SÁCH CAC BẢNG - 2.222 21221121122121121121121121121121121121 1 re viiiDÁNH SÁCH GÁC TAI cerns cnsnnceninnsr eerie enainaneeriennnsiiensseceiareeniunascnnticeennse ixCHƯƠNG 1 MO DAU Lii.oeo cso cescsscsscssessesseeseesessesscsecsecsssssesessessessesstestssessessesaesaeseeees |

er 11.2 Mục tiêu đề tai ooo cccccccecccsscsessessesssesscsececssesrssesesseseesissssseseesesanseesesseseesneeeseeeees 1

1.3 NGi dung thyre 161 oo e -4a<- 1

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIBU - 2-5252 SE2SE2E2EE£EE2EEEEEEEEEEEeEErrrrrrrxee 2

2:1.) Tongsquan’ vi khuẩn wa rlltiel a csseceinnsvonnsanencnva msncmnanensnaenatnasnanewnummaroan 2

D1, Giới thiện về Chi Baer is acces cesses cise centres aa cimeananes la tntir areas in 2 2.1.2 Nguồn gốc các chủng Bacillus trong nghiên CUU csceccecccssecssessssesssseesseecseessecesecssecesseessesensess 3 2.2 Xử ly rác thải hữu cơ bằng các chủng vi sinh vật -25-25222S22v222E2EErErkrrrrrrrrrrrrrrree 6

ST, Erff án Tri HT dueaesueanrgniaeiekeoiadtrrgtttgtiitooiiStttgSioifigiuitgyrgoktospgfingiGipbtsbfoaussed 6

2.2.2 Xử lý rác thải hữu cơ bằng các chủng Vi sinh vật 2-22-2225 22+2EE2CE2EESExerxrrrxrerrree 6 5/015 Ý H8 lfBffE đệ GIN haaasborasttotgttanHitbistÐERSGDROEGUDHSDBEERii0GaiSuESENESDRuiltiushoilStoiiagie §

2.2.4 Tai Vidt Nam nh -4‹däÄäd䜌œgẶK Ò

2.2.5 on 4s5<

HƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHẬT srccsssescecncsserernenisensenaemcemenneecrcnmonrmenemes

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2 ©2+222+2+22x222122112712212211 2111112712112 10

3.23 Vat lig-va phiron® DHấP TIEHIỂH/EỨU ti becoisg16oáci<i6s8030004058126014-86GE003900053188464.-d0x811ãnnqk08.0d4 10

Ee 10

3.3 Phương pháp nghiên CUU cccecescseeeeesseseseseseeeesssesesseeesesessscseseeneesssesseseeesiesessesseseensasasssseeeeeene 10

3.3.1 Phương pháp xác định điều kiện nhiệt độ tối ưu cho các vi khuẩn ưa nhiệt - 10 3.3.2 Phương pháp xác định điều kiện pH tối ưu cho các vi khuẩn ưa nhiệt - -5- 12 3.3.3 Phương pháp tạo chế phẩm lỏng -2¿-©222©22222E22E+2222E222112221127112211211127112112 21 12

3.3.4 Thử nghiệm xử lý rác thải hữu cơ sinh hoạt bằng chế phâm VSV lỏng . - 13

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -22¿-©22+¿222E2+++2E2E2E22221122222122 222222 16

4.1 Xác định điều kiện nhiệt độ va pH tối ưu cho các vi khuẩn wa nhiệt -2- 5525525552 16 4.1.1 Xác định nhiệt độ tối ưu cho các vi khuẩn ưa nhiét 0 cesessseseessesseessessessessessessesseeseeseeaee 16

4.1.2 Xác định pH tối ưu cho các vi khuẩn ưa nhiệt -. 2-2 52255225222+22E2£EvEEE2EE2Exezxrxerxecree 19

4.2 Thử nghiệm tạo chế phẩm VSV lỏng 5-22 22222222922E2221222112221222112711221122711211 cxeg 22 4.3 Thử nghiệm xử lý rác thái hữu cơ sinh hoạt bằng chế phẩm VSV lỏng . - 23 4.3.1 Sự thay đổi nhiệt độ trong quá trình ủ phân 2-22 ©5+222222+2EE22EE2EEEEEEEEerkrrrrrrrrrrer 23

4.3.2 Sự thay đổi 4m độ trong quá trình ủ phân 2222 2 2+2ESE22EE2EE+EEEEEeEEzEEzEEzrxerxrrrrrree 24

4.3.3 Sự thay đổi pH trong quá trình ủ phân -. - 25222522 22E222E22E1221E221222121122112111211 22 26 4.3.4 Sự thay đổi khối lượng, độ cao nguyên liệu trong quá trình ủ phân - -: 5: 27

4.3.5 Đánh giá chất lượng sản phẩm sau ủ -©22-©222222222212222122212221122211221121112211211 E1 xe 29 CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA ĐỀ NGHỊ 2-22 2 2222222212212212212211211221211111211211211 2121 xe 32

5.1 S0) )H)ằ ::)H,),, , ,, 32

ST 2Ä TE Ï-aszoyostrxetttoiEfotBftGriogtAo2f-TO/4ES80r0tricfoifrcto33iTTrrrtiR90S23:00NHNndic23t4S-JNRERGSESNDEogiTIR3-g015n12018300n1S 32 TÀI LIEU THAM KHẢO 2-22222+22EEE2EEE2EEE2E2E2221127112711271121127112112011101.11 201 eee 33

IJTấi liệu tiếng Wi ets crs ee seresare cea eermearn ore were ER nears 33

2 Tai liu tiéng Ame 44H 33

vi

DANH SACH CAC CHU VIET TAT

: Tryptic Soya Agar : Tryptic Soya Broth : Vi sinh vat

: Dam tong số

: Đạm hữu hiệu : Lân hữu hiệu : Kali hữu hiệu : Cadimi

: Asen

: Thủy ngân : Chì

: Hàm lượng cacbon chia cho hàm lượng đạm tong số

vii

DANH SÁCH CÁC BANG

Bảng 2.1 Mẫu khuẩn và hoạt tinh enzyme có đường kính phân giải 5Bảng 4.1 Tốc độ sinh trưởng của các vi khuẩn (đ'”) và độ lệch chuẩn ở các điều kiệnt1 ra ti Ôi it 691000100300 000G130904G010)9010000088G000 6 36A 18Bang 4.2 Tốc độ sinh trưởng của các vi khuẩn (d"') và độ lệch chuẩn ở các điều kiện

CO, Pu nrneheceobeetkieorisvetsreietioitonstdtriirlteovitoirersElvisrcxgtSiotxcistresott, 21Bang 4.3 Mật độ tế bao ở các mẫu khảo sát tạo chế phẩm VSV lỏng 22Bảng 4.4 Số liệu đo nhiệt độ, độ âm và pH trong 22 ngày ủ phân a7Bang 4.5 Kết quả khối lượng, độ cao nguyên liệu trước và sau khi ủ phân 27Bang 4.6 Kết quả chất lượng sản phẩm sau ủ -2 22©2222222222z+2z2z+zczcez 29

viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Sơ đồ phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu - 5-5222: 11 Hình 3.2 So đồ phương pháp xác định pH tối ưu -2-©2z52z+22+z22+z£- 12 Hình 3.3 Sơ đồ phương pháp tạo chế phâm lỏng -2 22 ©22222222+z25+z£2 13

Hình 3.4 Sơ đồ phương pháp thử ngiệm khả năng phân giải chất hữu cơ 14

Hình 4.1 Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus ở 40°C 16

Hình 4.2 Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus 6 45°C 16

Hình 4.3 Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus ở 50°C 17

Hình 4.4 Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus ở 55°C 17

Hình 4.5 Tốc độ sinh trưởng của các vi khuẩn ở các khoảng nhiệt - 18

Hình 4.6 Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus ở pH 6 19

Hình 4.7 Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus ở pH 7 19

Hình 4.8 Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus ở pH 8 20

Hình 4.9 Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus ở pH 9 20

Hình 4.10 Tốc độ sinh trưởng của các vi khuân ở các khoảng pH 21 Hình 4.11 Chế phẩm VSV lỏng 2-22 ©2222222222E22EE22EE2EE22E222222222EEeEEcrrrer 22

PM Ne DS tấu Thi TH GG: ong ghe Ho cen ca ta ada asa 23

Hinh 4.13 Do nhiệt độ rac ủ trong thting eee eee eee eee eceeeseeeceseeseeeeeeeeeeseees 23

Hình 4.14 Sự thay đôi của độ âm trong quá trình U phân 2-2-2: 25 Hình 4.15 Sự biến thiên của pH trong quá trình ủ phân 2-2222: 26

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1.Đặt van đề

Van đề xử lý rác thải hữu cơ hiện nay đang là van đề nhức nhối và cấp thiết của xãhội Nó gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường, cuộc sống người dân và là nguy

cơ tiềm tàng của dịch bệnh Hiện nay tại Việt Nam chỉ có khoảng 10 - 15% rác thải hữu

cơ được tái chế và xử lý Phần còn lại đa phần chỉ được chôn lấp Tuy có nhiều mô hình

xử lý rác như đốt rác phát điện, xử lý chất thải rắn sinh hoạt thành phân vi sinh, chônlấp, điện khí hóa và đốt rác thông thường nhưng lại gặp nhiều khó khăn khi chọn lựa

công nghệ xử lý rác phù hợp Vì đa phan rác thải sinh hoạt ở Việt Nam có độ ẩm khá

cao khoảng 55 - 70%, gap rất nhiều khó khăn trong việc xử lý bằng mô hình đốt rác nênrác thải sau khi được thu gom sẽ được chôn lấp Mà việc ủ phân rác thải hữu cơ bằngcác vi sinh vật sẽ không bị ảnh hưởng bởi rác có độ âm cao, đồng thời còn góp phan tậndụng các nguôn lợi ích từ rác thải hữu cơ, bên cạnh giúp bảo vệ môi trường và tránh cáctình trạng phát sinh do quá trình chôn lắp rác thải Các vi khuan ưa nhiệt đã được tuyểnchọn từ suối nước nóng có hoạt tính enzyme ngoại bào mạnh cùng với khả năng ưa

nhiệt Nên việc ứng dụng xử lý rác hữu cơ bằng các vi khuẩn ưa nhiệt có hoạt tính

enzyme ngoại bào có thê sẽ là một giải pháp nhằm xử lý vấn đề rác thải hữu cơ

Nghiên cứu này thực hiện nhằm xác định điều kiện môi trường tối ưu cho các vikhuẩn ưa nhiệt được chọn từ đó tạo chế phẩm phù hợp nhằm chuyển hóa rác thải hữu

cơ sinh hoạt phân bón Các số liệu nghiên cứu trong đề tài sẽ đóng góp cho những nghiêncứu tiếp theo sau này

1.2 Mục tiêu đề tài

Tạo chế phẩm vi sinh xử lý rác thải hữu cơ Sản phẩm sau xử lý đạt điều kiện làmnguyên liệu sản xuất phân bón hữu cơ

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Xác định điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển các vi khuẩn

ưa nhiệt.

Nội dung 2: Thử nghiệm tạo chế phẩm VSV lỏng

Nội dung 3: Thử nghiệm xử lý rác thải hữu cơ sinh hoạt bằng chế phẩm VSV lỏng

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TAI LIEU

2.1 Téng quan vi khuẩn ưa nhiệt

2.1.1 Giới thiệu về chi Bacillus

Theo Miljakovié, D va ctv năm 2020, “Chi Bacillus được thành lập vào năm 1872

bởi Cohn và bao gồm hơn 200 loài và phân loài được mô tả thuộc ngành Firmicutes.Dựa trên các đặc điểm hình thái, vi khuẩn thuộc chi này được mô tả là vi khuẩn hìnhque, Gram dương, hiểu khí hoặc ky khí tùy nghỉ và có catalase dương tính Do khả năngsinh lý rộng rãi và khả năng hình thành nội bào tử, Bacillus spp Có khả năng chống lạicác điều kiện môi trường bắt lợi và có mặt khắp nơi trong nhiều môi trường sống, bao

gồm cả đất Bacillus spp đại diện cho vi khuẩn đất và vi khuẩn vùng rễ chiếm ưu thé,

chúng chiếm tới 95% quần thể vi khuẩn Gram dương Hơn nữa, chúng là một trongnhững vi khuẩn nội sinh phổ biến nhất

Bacillus là một nhóm lớn và đa dang của vi khuẩn không gây bệnh và gây bệnh.Hầu hết các loài Bacillus, cũng như các sản phẩm của chúng, được coi là an toàn chomục đích sử dụng trong môi trường Những vi khuẩn này được ưu tiên thương mại hóa

vì khả năng tiết ra một số chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học, tạo ra nội bảo tử cực

kỳ bền vững và phát triển nhanh chóng trong các môi trường khác nhau Do đó, chúngduy trì khả năng tồn tại và có thé dé dang được xây dựng và lưu trữ Quan thé Bacillusspp có thê tồn tại trong đất và vùng rễ thực vật mà không có bắt kỳ tác động lâu dài nàođối với các quần thé vi khuẩn khác Bacillus thuong mai cac ché pham dựa trên đượcphát triển và phân phối trên toàn thé giới nhóm vi khuẩn có lợi Bacillus subtilis, Bacillus

amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium,

Bacillus velezensis, Bacillus thuringiensis nhóm vi khuẩn có hai như Bacillus cereus,

Bacillus anthracis g4y ngộ độc thực phẩm hoặc bệnh than

Đại diện của chi Bacillus là các vi sinh vật đa chức năng với nhiều ứng dụng trong

cả quá trình lên men truyền thống và công nghệ sinh học hiện đại Bacillus spp có một

số đặc tính có lợi Chúng đóng vai trò là môi trường nuôi cấy ban đầu cho các loại thựcpham lên men truyền thống khác nhau và là nhà sản xuất enzyme, kháng sinh và peptit

hoạt tính sinh học quan trọng trong công nghệ sinh học Chúng cũng được sử dụng làm

men vi sinh cho người, trong thuốc thú y và làm phụ gia thức ăn cho động vật có tầm

quan trọng cho ngành nông nghiệp (Todorov và ctv, 2022).

2.1.2 Nguồn gốc các chủng Bacillus trong nghiên cứu

Vi khuẩn ưa nhiệt phô biến trong môi trường sống của đất và núi lửa và có thànhphan loài hạn chế (Zeikus, J G, 1979) Các vi khuẩn ưa nhiệt chỉ giới hạn ở vi khuân

và cô khuẩn (Cowan, 1992) Vi khuẩn chịu thường là các vi khuân có khả năng sinh bào

tử, có hình que (Zeikus, J G, 1979) Vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng phát triển ở nhiệt

độ cao, thường cao hơn 45°C.

Vi khuẩn ưa nhiệt được chọn thực hiện nghiên cứu trong dé tài là các vi khuẩn

được phân lập tại ba địa điểm suối nước Bình Châu (Bà Rịa — Vũng Tàu), suối nước

nóng Trường Xuân (Khánh Hòa), suối nước nóng Bang (Quảng Bình) và một địa điểm

ủ phân compost tại Trường đại học Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh Sàng lọc, định

tính hoạt tính enzyme ngoại bảo có khả phân giải protease, amylase, cellulose và lipase Xác định được 5 chủng chi Bacillus enzyme ngoại bảo mạnh và định danh tới loài Bacillus licheniformis (NS5, NW6), Bacillus amyloliquefaciens (NS3), Bacillus subtilis (NW8, CP23) (Toản, 2022).

Bacillus licheniformis là vi khuân gram dương, hình thành bao tử, ky khí tùy ý,

hình que và đơn lẻ, có nhiều hình thái khuẩn lạc khác nhau Kích thước của vi khuẩn từ1,5 - 3,5 im x 0,8 im Có kha năng sinh nội bào tử cho phép nó sống trong các điềukiện môi trường khắc nghiệt Bacillus licheniformis có hoạt tính protease, amylase,cellulose (Toàn, 2022) Bacillus licheniformis được tìm thấy trong nhiều môi trườngkhác nhau, nhưng đặc biệt là trong dat và trong lông chim Bacillus licheniformis có lợiích công nghệ sinh học cao với nhiều ứng dụng hiện tại và tiềm năng, bao gồm sản xuất

các hop chất hoạt tính sinh học được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, chang hạn như nuôi

trồng thủy sản, nông nghiệp, thực phẩm, y sinh, dược phẩm và xử lý rác

Bên cạnh đó việc sử dung Bacillus licheniformis như một vectơ biểu hiện dé sanxuất enzyme và các sản phẩm sinh học khác cũng đang được quan tâm do có sẵn cáccông cụ thao tác di truyền mới Hơn nữa, bên cạnh việc sử dụng rộng rãi như một chếphẩm sinh học, các ứng dụng công nghệ sinh học khác của các chủng B licheniformisbao gồm: kết tụ sinh học, khoáng hóa sinh học, sản xuất nhiên liệu sinh học, xử lý sinhhọc và hoạt động chống màng sinh học (Muras, 2021)

Bacillus amyloliquefaciens được Fukomoto phát hiện vào năm 1943 nhờ khả nang

sinh œ-amylase và protease Thời gian đầu, loài vi khuẩn này được xem là dòng khác

của Bacillus subtilis mang rất nhiều đặc điểm tương đồng với các loài Bacillus subtilis,Bacillus licheniformis va Bacillus pumilus Bằng các phương pháp phân loại thôngthường rất khó có thé phân biệt giữa chúng Đến năm 1987, Bacillus amyloliquefaciensmới được tách ra thành một loài riêng dựa vào kết quả lai DNA lần lượt là 23, 15 và 5%

so với các loài Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis va Bacillus pumilus (Richard, 2009).

Vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus amyloliquefaciens đều là Gram đương, hình thànhnội bào tử và hình que Có kích thước 0.5 um đến 20 pm, Về mặt phân loại hoc, Bacillus

amyloliquefaciens thuộc nhóm Bacillus subtilis , họ Bacillaceae, lớp Bacilli và ngành

Firmicutes Cho đến nay, gồm bốn loài vi khuẩn: Bacillus amyloliquefaciens , Bacillussiamensis , Bacillus velezensis và Bacillus nakamurai Ching được phân phối rộng rãi

trong các hốc khác nhau bao gồm đất, thực vật, thức ăn và nước Sự hồi sinh trong khai

thác bộ gen đã gây ra sự tập trung ngày càng tăng vào các ứng dụng công nghệ sinh học

của các loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus amyloliquefaciens Các thành viên của

Bacillus amyloliquefaciens được gọi là vi khuẩn thúc day tăng trưởng thực vật do kha

năng cố định dam, hòa tan phốt phat và sản xuất siderophore và phytohormone, cũngnhư các hợp chất kháng vi sinh vật Hơn nữa, chúng cũng được báo cáo là sản xuất nhiềuloại enzyme khác nhau bao gồm a-amylase, protease, lipase, cellulase, xylanase,pectinase, aminotransferase, barnase, peroxidase va laccase Cac hợp chất khang khuẩn

có kha năng ức chế sự phát triển của mam bệnh bao gồm các peptide và polyketide phiribosome cũng được sản xuất bởi các vi khuan này Trong Bacillus amyloliquefaciens ,các chủng Bacillus velezensis khác nhau có triển vọng sử dụng làm chế phẩm sinh họccho động vật và cá Khai thác bộ gen đã tiết lộ các ứng dụng tiềm năng của các thànhviên của Bacillus amyloliquefaciens đề loại bỏ thuốc trừ sâu organophosphorus

(Ngalimat và ctv, 2021).

Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương, hiểu khí, có hình que và có thể tạo nộibào tử, có khả năng sông ở các điều kiện khắc nghiệt Vi khuan Bacillus subtilis có chiềudai 1,5 — 10 um, đường kính 0,25 — 1 um, có hai đầu tròn Bao tử hình bầu dục nhỏ, kíchthước 0,8 - 1,8 um, được bao bọc bởi vỏ gồm nhiều lớp màng có thành phan lipoprotein,

peptidoglycan (Yu và ctv, 2014) Vi khuẩn Bacillus subtilis thường được tìm thay ởrom, ra và lớp trên cùng đất cũng như trong ruột của nhiều loài động vật Cũng có thé

được tìm thấy ở nơi có nhiệt độ cao như suối nước nóng, phân compost (Zeikus, 1979;

Hong và ctv, 2009) Bacillus subtilis có tiềm năng sinh tổng hợp các hoạt chất có hoạttính kháng khuân, cùng với có nhiều hoạt tính enzyme bền vì nhiệt và bên cạnh đó các

vi khuẩn cũng được ứng dụng trong các việc chuyền gen tạo các sản phẩm thích hợp với

nhu cầu con người hiện nay (de Boer Sietske và Diderichsen, 1991; Kaspar và ctv,

2019) Vi khuẩn Bacillus subtilis ở Việt Nam được nghiên cứu, tìm hiểu ứng dụng xử

lý các chất thải, nước thải hữu cơ và nông nghiệp Ứng dụng làm thức ăn cho động vật,

phân bón, (Điệp và ctv, 2015; Nguyên và Lan, 2018; Nguyên và ctv, 2018).

Theo nghiên cứu và khảo sát Toàn năm 2022 thì hoạt tính các vi khuẩn chịu nhiệt

có hoạt tính enzyme ngoại bào mạnh như các enzyme protease, amylase, cellulose, chitin

được trình bay ở bảng 2.1 Bên cạnh đó vi khuẩn Bacillus subtilis (NW8) còn có hoạt

tính enzyme Lipase có đường kính phân giải 26,13 + 0,57.

Bảng 2.1 Mẫu khuân và hoạt tính enzyme có đường kính phân giải

Hoạt tính enzyme

Tên vi khuẩ

PROYL SOMES Protease Amylase Cellulose Chitin

2.2 Xử lý rác thải hữu cơ bằng các chủng vi sinh vật

2.2.1 Rác thải sinh hoạt là gì?

Rác thải sinh hoạt là những chất thải rắn được tạo ra từ hoạt động sinh hoạt của

con người tại các khu dân cư, bao gồm các loại chất thải như thức ăn thừa, giấy báo, bao

bì, chai lọ, vỏ hộp, vải thải, đồ chơi, vật dụng gia đình, rác thải điện tử, Rac thải sinhhoạt chiếm tỷ lệ lớn trong tổng sản lượng chất thải của một địa phương, đặc biệt là trongcác thành phố lớn

Trong báo cáo hiện trạng môi trường năm 2021 thi tại thành phố Hồ Chí Minh,lượng chất thải rắn phát sinh cũng không ngừng gia tăng Theo số liệu báo cáo thì tổngkhối lượng chat thải rắn đô thị phat sinh khoảng 9000 - 9500 tan/ngay trong đó chat thảirắn sinh hoạt khoảng 8900 tan/ngay Mà tỷ lệ gia tăng lượng chất thải rắn sinh hoạtkhoảng 5 - 6%/năm Trong khi 69% tỉ lệ rác thải rắn sinh hoạt này chỉ được chôn lấp.Trong chất thải rắn sinh hoạt rác có hàm lượng hữu cơ chiếm tỷ lệ lớn ước tính khoảng

54 - 77% Nhưng rác thải hữu cơ rat dé phân huỷ khi chỉ chôn lấp gây hôi thối, phát triển

vi sinh vật, gây ô nhiễm, mắt vệ sinh môi trường xung quanh và ảnh hưởng tới sức khỏecon người Thường ở các khu tập trung rác và bãi chôn lấp sẽ là nơi thu hút, phát sinhnhiều van đề về môi trường, nơi phát triển của các động vật và côn trùng gây bệnh truyềnnhiễm cho con người, vật nuôi Nên việc xử lý rác thải hữu cơ không hợp lý là một trongnhững nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng tới sức khỏe và cuộc sốngngười dân xung quanh cũng là một sự lãng phí lớn về kinh tế Khi không tận dụng được

nguôn rác thải này làm tài nguyên đầu vào cho các nganh sản xuất khác

2.2.2 Xw lý rác thải hữu cơ bằng các chủng vi sinh vật

Theo Marcus Porcius (160 TCN) quá trình ủ phân có từ rất lâu đời, ít nhất là từthời kỳ đầu của Đề chế La Mã U phân sinh học (composting) là một quá trình tự phânhủy sinh học của các chất thải hữu cơ dạng ran, hiểu khí và tự sinh nhiệt (Bertoldi và

ctv,1983; Finstein va ctv, 1975).

Ma u phan compost được xem là một phương pháp xử lý rác hữu cơ don giản, hiệu

quả dựa trên hoạt động của vi sinh chuyên hóa rác chất thải hữu cơ thành phân bón hữu

cơ Bên cạnh đó, nhờ các vi sinh vật hỗ trợ giúp xử lý nước thải ô nhiễm, khử mùi hôicủa rác thải hữu cơ Về bản chất thì đây là quá trình phân hủy các thành phần hữu cơtrong rác thải, có sự tham gia của vi sinh vật trong điều kiện môi trường thích hợp (nhiệt

độ, độ âm, không khí ) để tạo thành phân bón hữu cơ mà phát triển phân bón hữu cơ

6

là hướng đi tat yếu của nông nghiệp Việt Nam kể cả trước mắt và lâu dai, có khả nănglàm tăng năng suất cây trồng, nâng cao chất lượng nông sản và duy trì độ phì nhiêu củađất Hiện có 2 phương pháp chủ yếu dé sản xuất phân compost chủ yếu là ủ ky khí và ủhiểu khí.

Phương pháp ủ phân ky khí là quá trình phân hủy xảy ra bằng cách sử dụng các visinh vật không sử dụng oxy dé phát triển Ở phương pháp này, các vi sinh vật ky khíchiếm ưu thế và tạo ra các hợp chất trung gian như khí metan, axit hữu cơ, hydro sunfua

và các chất khác Khi thiếu oxy, các hợp chất này tích tụ và không chuyển hóa thêm,

nhiều hợp chất trong số này có mùi hôi mạnh và một số có độc tính với thực vật Vì ủ

yếm khí là một quá trình ở nhiệt độ thấp, nó đề lại các hạt cỏ đại, mầm bệnh và ít chấtdinh dưỡng bị mat đi trong quá trình này Hơn nữa, phương pháp ủ ky khí này thườngmắt nhiều thời gian hơn so với ủ hiếu khí

Ủ phân hiếu khí là quá trình ủ phân ở trong điều kiện có nhiều oxy Trong quá trình

ủ nhiệt độ sinh ra làm tốc độ phân hủy chất béo, protein và carbohydrate phức tạp nhưcellulose và hemi - cellulozo diễn ra nhanh hơn Tại phương pháp nảy, các vi sinh vậthiếu khí sẽ phân hủy các hợp chất hữu cơ và tạo ra CO2, nhiệt, nước và mun Hơn nữa,quá trình này giúp tiêu diét vi sinh vật và các mầm bệnh cũng như các hạt cỏ dai gây hạitrong dat Phương pháp ủ hiếu khí thường làm cho nhiều chất dinh dưỡng bị mat đi từ

nguyên liệu nhưng phương pháp này hiệu quả vả hữu ích hơn so với các phương pháp khác Thời gian ủ khá nhanh chỉ sau 20 - 45 ngày thì rác được phân hủy hoàn toàn Nhiệt

độ ủ trong vài ngày đầu tạo ra từ đống ủ có thé đạt 60 - 70°C

Trong 2 mô hình ủ compost thì mô hình ủ phân theo phương pháp hiếu khí đơngiản và tiết kiệm được xem là một trong những giải pháp phù hợp Tại các quốc gia đangphát triển do tích hợp nhiều ưu điểm dé áp dụng với chi phí đầu tư không lớn, thuận tiệntrong khâu vận hành hệ thống, giảm công đảo trộn và chi phí tổn hao nhiên liệu Cácmau phan compost sau ủ cần phân tích các chỉ tiêu chất lượng sản phẩm phân hữu cơsinh học Nhằm đáp ứng các chỉ tiêu chất lượng của phân bón được xác định theo các

tiêu chuẩn của Việt Nam

Tuy nhiên, việc phát triển mô hình xử lý chất thải hữu cơ tại nguồn gắn với điềukiện thực tế, đặc biệt là với tính chất đa dang của nguồn rác thải phát sinh liên tục, vấn

đề rút ngắn thời gian ủ nhưng vẫn phải đảm bảo các tiêu chí chất lượng, phân tích đầu

ra tiêu thụ sản phẩm tạo thành cần được nghiên cứu thêm.

7

2.2.3 Ý nghĩa tỷ lệ C/N

Chỉ số C/N là tỷ lệ giữa lượng cacbon (C) và lượng nitơ (N) trong một mẫu hữu

cơ Cụ thé C là chất hữu cơ (organic matter — OM) và N là Nitơ tổng số Ty lệ C/Nđược sử dụng một cách rộng rãi như là một chỉ số đánh giá tốc độ phân hủy chất hữu

cơ và chất lượng phân hữu cơ Bên cạnh đó tỉ lệ này ảnh hướng đến sự phát triển của

vi sinh vật Nếu tỷ lệ cao vị sinh vật sẽ bị hạn chế phát triển làm thời gian ủ lâu hơn.Ngược lại, nếu tỉ lệ C/N quá thấp dẫn đến dư thừa lượng Nitơ, lượng Nitơ thừa có thể

bị bay hơi vào không khí dưới dạng amomiac hay nitơ oxit, và phát sinh mùi hôi gây ô

nhiễm môi trường xung quanh (Robert Rynk và ctv, 1992).

Nên những chất hữu cơ có tỉ lệ C/N cao chẳng hạn 40% Carbon và 0.5% Nito, séphân hủy chậm hon so với những chat hữu cơ có tỉ lệ C/N thấp, chang han 40% Carbon

và 4% Nitơ Hàm lượng hữu cơ trong đất sẽ tăng lên nếu chất hữu cơ bổ sung có tỉ lệC/N cao, vì không có đủ nito để sự phân hủy được hữu hiệu Hơn thế nữa, hàm lượng

nito thay vi được khoáng hóa bổ sung, lại bi giảm di do quá trình bat động hóa nito của

vi khuẩn, do chất hữu cơ bé sung không có đủ nito dé chúng phát triển Chất hữu cơ bổ

sung có tỉ lệ C/N thấp sẽ được phân hủy trọn vẹn và nhanh chóng với nito được khoáng

hóa Một số nitơ sau khi được khoáng hóa có thê được sử dụng trở lại để phân hủy nhữngchất hữu cơ có tỉ lệ C/N cao trước đó chưa phân hủy được Bởi vậy, hàm lượng chất hữu

cơ trong môi trường nhiều khi sẽ bị giảm đi do quá trình phân hủy vật chất hữu cơ có tỉ

lệ CN thấp mới được thêm vào đất

C/N = mức độ phân giải chất hữu cơ

2.2.4 Tại Việt Nam

Việt Nam là một nước chuyên về nông nghiệp từ lâu đời Ở nước ta có khoảng 26

triệu ha đất nông nghiệp và sử dụng hơn 10 triệu tan phân bón mỗi năm Lượng phânbón dư thừa sẽ bị rửa trôi vào đất và nước gây ra tình trạng ô nhiễm, làm đất canh tác bị

bạc màu và thoái hóa nghiêm trọng.

Trong đó lượng chat thải ran sinh hoạt có ty lệ rác hữu cơ cao vẫn chưa được tận

dụng triệt dé Bên cạnh đó lượng lớn chất thải hữu cơ từ chăn nuôi và ở các nghành côngnghiệp Nên Việt Nam rất có tiềm năng phát triển phân bón hữu cơ lớn vì có nền nôngnghiệp lớn với nhiều phụ phế phẩm và khi tận dụng được nguồn rác hữu cơ Chuyểnthành phân bón hữu cơ sẽ làm giảm lượng phân bón hóa học giảm tác động tiêu cực đến

môi trường Mà tại Việt Nam từ đầu những năm 90 của thế kỷ XX cho đến nay, phânhữu cơ vi sinh mới chính thức được đưa vào các chương trình nghiên cứu cấp nhà nước.

Tính đến nay, đã có nhiều đề tài nghiên cứu cơ bản và chuyên sâu về việc tuyên chọn

các chủng vi sinh vật phù hợp dé phân giải các chất hữu cơ khác nhau, rút ngắn thời gian

xử lý, tăng chất lượng phân vi sinh Với xu hướng chuộng các sản phẩm hữu cơ và thânthiện với môi trường việc xúc tiến sản xuất phân hữu cơ từ nguồn rác thải hữu cơ trongchất thải rắn sinh hoạt là vấn đề cấp thiết

2.2.5 Trên thế giới

Phân bón hữu cơ, chủ yếu đến từ phụ phẩm cây trồng như cám gạo, các loại hạt códầu khác nhau và các sản phẩm phụ từ động vật như bột xương thịt, bột máu, bột cá vàbột cua, đôi khi được phân biệt với phân động vật hoặc phân hữu cơ làm từ chất thảiđộng vật Chúng chứa hàm lượng chất dinh dưỡng đặc biệt cao, ví dụ như Nitơ trongkhô dầu và bột huyết và Phospho trong cám gạo và bột xương thịt, đồng thời cũng cóhàm lượng chất hữu cơ cao và nhiều loại vi chất đinh dưỡng nói chung (Blatt, 1991;

Cayuela và ctv, 2008).

Cây trồng hữu cơ trồng trong chậu được sản xuất trong nhà kính bao gồm cây

cảnh Việc sử dụng phân bón hữu co trong các loại cây trồng trong chậu đặt ra những

thách thức liên quan đến khối lượng chất trồng hạn chế trong chậu, điều này hạn chế cảtổng lượng phân bón phù hợp và khối lượng đối với cộng đồng vi sinh vật chịu trách

nhiệm khoáng hóa phân bón hữu cơ (Treadwell và ctv, 2007).

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện: Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2023 đến tháng 03/2024,

tại phòng Vi sinh (Bio 311), Khoa Khoa học Sinh học, trường Đại học Nông Lâm Thanh

phó Hồ chi Minh Địa chỉ: Khu phố 6, phường Linh Trung, Thành phố Thủ Đức

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

5 chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis (NS5, NW6), Bacillus amyloliquefaciens(NS3), Bacillus subtilis (NW8, CP23) được thu tai suối nước nóng Bình Châu (Bà Rịa

— Vũng Tàu), suối nước nóng Trường Xuân (Khánh Hòa), suối nước nóng Bang (Quảng

Binh) và mẫu phân compost (Trường đại học Nông Lâm TP.HCM) từ nghiên cứu trước.

Thiết bị dụng cụ: Nồi hap khử trùng, cân điện tử, máy cô quay, máy do OD, tủ cấy,

tủ ủ lắc, máy vortex, máy lắc mẫu Cốc thủy tinh, bình thủy tinh, micropipet, ốngnghiệm, eppendorf 1,5 ml, đĩa petri, đèn cồn, que cấy và một số dụng cụ cơ bản kháctrong phòng thí nghiệm khác, nhiệt kế, máy đo độ pH đất 4 trong 1, đo pH, độ âm củađất, đo nhiệt độ, đo ánh sáng, thước

Hóa chất: Môi trường Trytone Soya Aga ethanol, môi trường Tryptic Soya Broth,

HCl, NaOH.

3.3 Phuong pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp xác định điều kiện nhiệt độ tối ưu cho các vi khuẩn ưa nhiệt

Mỗi chủng vi khuẩn được tăng sinh trong 5 ml môi trường tăng sinh TSB trong 48

giờ Cho 1 ml môi trường tăng sinh vào 100 mL môi trường TSB (pH 7) trong chai thủy

tinh trong khoảng nhiệt độ từ 45°C đến 55°C, lắc với tốc độ 180 vòng/phút trong 48 giờ.Nhằm xác định sự phát triển của vi sinh vật cứ 3 giờ đo mật độ quang học (OD) của cácmẫu tăng sinh ở bước sóng 540 nm Giá trị trung bình OD540 nm của ba lần lặp lại chomỗi khoảng 3 giờ đo Từ các số liệu đó tính tính tốc độ tăng trường và xác định nhiệt độmôi trường tối ưu trên phần mềm Microsoft Excel 2013 Nhằm xác định nhiệt độ tối ưucho các chủng vi khuẩn ưa nhiệt dùng cho các thí nghiệm tiếp theo

10

Các mau khuẩn được trữ trong glycerol ở

-10°C.

Cay trải 50 um mẫu từ glycerol trên môi trường

TSA.

Lấy khuẩn lạc đơn từ môi trường TSA tăng sinh

vi khuẩn trong môi tường TSB

Cấy ria kiểm tra mẫu

Lấy khuẩn lạc đơn tăng sinh khảo sát nhiệt độ

tối ưu với 3 lần lặp lại

Do OD trong 48 giờ, khoảng 3 giờ do 1 lần,

phân tích số liệu, tính tốc độ tăng trường và xác

định nhiệt độ môi trường tối ưu trên phần mềm

Do OD, tinh tốc độ tăng trưởng

và xác định nhiệt độ môi trường

tối ưu và phân tích số liệu trên

Microsoft Excel 2013.(5)

Hình 3.1 Sơ đồ phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu

1]

3.3.2 Phương pháp xác định điều kiện pH tối ưu cho các vi khuẩn ưa nhiệt

Từ nhiệt độ tối ưu đã được xác định trước, dùng nhiệt độ tối ưu nhằm xác định pH

tối ưu cho sự phát triển của vi sinh vật ưa nhiệt phân lập được, mỗi chủng vi khuẩn được

tăng sinh trong 5 ml môi trường tăng sinh TSB trong 48 giờ Cho | ml môi trường tăng sinh vào 100 mL môi trường TSB (pH 6 - 9) trong chai thủy tinh trong khoảng nhiệt độ

tối ưu với vi sinh vật, lắc với tốc độ 180 vòng/phút trong 48 giờ Sự phát triển của vi

sinh vật được xác định bằng cách đo mật độ quang học (OD) của các mẫu cấy ở bước

sóng 540nm sau 3 giờ liên tục trong 48 giờ Giá trị trung bình của kết quả đo OD lặp

lại ba lần sau 3 giờ đo Từ các số liệu đó tính tính tốc độ tăng trường và xác định nhiệt

độ môi trường tối ưu trên phần mềm Microsoft Excel 2013 Nhằm xác định pH tối ưu

cho các chủng vi khuẩn ưa nhiệt dùng cho các thí nghiệm tiếp theo

(0) Lấy khuẩn lạc đơn từ môi trường TSAChọn khuẩn lạc đơn môi

trường TSA (0)

làm khảo sát nhiệt

(1) Tang sinh ở nhiệt độ tối ưu được xác định

ở các khoảng pH với 3 lần lặp lại

(2) Do OD trong 48 giờ, khoảng 3 giờ do 1 Tăng sinh trong môi trường

TSB 100ml trong các khoảng lần, phân tích số liệu, tính tốc độ tăng

pH 6,7,8,9 ở nhệt độ tối ưu trường và xác định pH môi trường tối ưu

được xác định (1) trên phần mềm Microsoft Excel 2013

|

Đo OD, tính tốc độ tăng trưởng

và xác định pH môi trường tôi

ưu và phân tích sô liệu trên

được xác định ở nội dung trước trong 24 giờ dé nhân giống cấp I Nhân giống cấp I đơn

lẻ và nuôi cấy thu sinh khối với mỗi chủng vi khuẩn Bacillus được chọn với tỷ lệ tiếp

12

giống 10% so với thé tích môi trường TSB nhân giống cấp II, lắc với tốc độ lắc 180vòng/phút ở nhiệt độ và pH tối ưu trong 24 giờ Các chủng vi khuẩn sau khi được nhân

giống cấp I được bồ sung 10% giống vào 300 ml dịch tăng sinh môi trường TSB dé nhân

giống cấp II (các chủng khuẩn đơn lẻ) với với tốc độ lắc 180 vòng/phút, nhiệt độ và pHtối ưu Khảo sát mật độ trung bình các vi khuẩn, trong khoảng 12-24 giờ nuôi cay nhằmxác định mật độ trung bình các vi khuan Bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ở các nồng

độ pha loăng 10° và 10° lặp 2 lần ở các nồng độ pha loãng, trang khuẩn trên môi trườngđĩa thạch TSA đếm khuan và tính mật độ VSV trung bình Xác định thời gian nuôi cấy

dé các vi khuân > 108 CFU/ml, sau đó thu sinh khối tươi làm chế phẩm sinh học

Từ mẫu khuẩn lạc don

tăng sinh trong môi

(0) Lay khuẩn lạc don từ môi trường TSA làm khảo sát tăng

sinh trong môi trường TSB 5 ml trong 24 giờ.

(1) Nhân giống và nuôi cấy thu sinh khối các chủng vikhuẩn đơn lẻ với tỷ lệ bằng nhau Tỷ lệ tiếp giống 10%

so với môi trường TSB (50 ml) Với nhiệt độ tối ưu, pH

tối ưu với tốc độ lắc 180 vòng/phút trong 24 giờ

(2) Nhân giống và nuôi cấy thu sinh khối các chủng vikhuẩn đơn lẻ với tỷ lệ bằng nhau Tỷ lệ tiếp giống 10%

so với môi trường TSB (300 ml) Với nhiệt độ tối ưu,

pH tối ưu với tốc độ lắc 180 vòng/phút trong 12 - 16 giờ.(3) Xác định mật độ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, khixác định mật độ > 10Ÿ CFU/ml.

(4) Thu sinh khối tươi

Hình 3.3 Sơ đồ phương pháp tạo chế phẩm lỏng

3.3.4 Thử nghiệm xử lý rác thải hữu cơ sinh hoạt bằng chế phẩm VSV lỏng

Chất thải hữu cơ sử dụng dé ủ phân bao gồm hỗn hợp chất thai rắn hữu cơ sinhhoạt bao gồm các loại thức ăn thừa, rau, củ quả hỏng, vỏ, hạt trái cây, những thực phẩmhữu cơ hết hạn (bánh mì, rau, cơm thừa, rau cau ) tại các hộ gia đình tại đường số 9phường Linh Chiều, Tp.Thủ Đức Sau đó băm nhỏ trộn đều

13

(0) Thu gom rac thải hữu cơ từ các hộ gia

Thu gomráe tat fete ox đình, băm nhỏ va trộn đều.

trộn đều và băm nhỏ (0)

(1) Phun đều chế phẩm với tỷ lệ 5% so với

khôi lượng rác hữu cơ.

Phun chế phẩm, ủ (2) Do các chỉ tiêu nhiệt độ, pH và độ 4m

thùng xốp (1) trong 22 ngày ủ.

(3) Tổng hợp kết quả, vẽ biểu đồ trên

Đo và theo dõi các chỉ tiêu phần mềm Microsoft Excel 2013 và

ủ trong 22 ngày (2) gửi mẫu phân tích các chỉ tiêu phân

| bón hữu cơ.

Tổng hợp kết quả, xử lý kết quả, vẽ biểu đồ và

phân tích các chỉ tiêu phân bón hữu cơ (3)

Hình 3.4 Sơ đồ phương pháp thử nghiệm khả năng phân giải chất hữu cơ.Rac không xử lý chế phẩm (đối chứng) và rác được phun chế pham chứa vi khuẩn

với tỷ lệ 1% (v/w) và rác được cho vào thùng xốp có dung tích 20 lít, nén chặt (cân trọng

lượng tươi trước ở từng thùng) với 3 lần lặp lại ở mẫu ủ có bé sung chế phẩm Khối

lượng rác ở mỗi thùng là 5kg Theo dõi các chỉ tiêu thùng ủ trong vòng 22 ngày nhưnhiệt độ, âm độ, pH

Phân tích các chỉ tiêu phân bón hữu cơ sau ủ được thực hiện tai Trung tam phân

tích và dịch vụ Khoa học Công nghệ miền Nam, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp

miên Nam.

Một số chỉ tiêu chất lượng phân bón được xác định theo các tiêu chuẩn của Việt

Nam (QCVN 01-189:2019).

Nhiệt độ được đo trực tiếp bằng nhiệt kế

Khối lượng và chiều cao khối ủ được xác định bằng phương pháp cân và đo đạc

Độ am được do bằng máy đo độ ẩm và xác định theo phương pháp sấy khô đến

khối lượng không đổi

14

Các chỉ tiêu sau ủ về các hàm lượng Nitơ tổng số và Nitơ hữu hiệu; hàm lượngphốt pho hữu hiệu; hàm lượng K2O hữu hiệu; Tổng vi sinh vật hiếu khí; vi khuẩn

Salmonella; hàm lượng chì (pb); hàm lượng Arsen (As); ty lệ C/N; hàm lượng cadimi

(Cd); hàm lượng thủy ngân (Hg).

15

CHƯƠNG 4 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Xác định điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu cho các vi khuẩn ưa nhiệt

4.1.1 Xác định nhiệt độ tối ưu cho các vi khuẩn ưa nhiệt

Thời gian (giờ)

Hình 4.1 Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus 6 40°C

Thời gian (gid)

Hình 4.2 Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus 6 45°C

16

Thời gian (gid)

Hình 4.3 Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus 6 50°C

Thời gian (gid)

Hình 4.4 Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus ở 55°C

17