Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Xây dựng quy trình phát hiện Papaya ringspot virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ bằng phương pháp sample pooling kết hợp kỹ thuật multiplex RT – PCR

TÓM TẮTPapaya ringspot virus PRSV được biết đến là một trong những loại virus phổbiến và có sức tàn phá nặng nề nhất đối với đu đủ trên toàn thế giới.. Thiệt hai đáng kế do PRSV đối với

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO _

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

=

XAY DUNG QUY TRINH PHAT HIEN Papaya ringspot virus GAY BỆNH DOM VÒNG TREN DU DU BẰNG PHƯƠNG PHAP SAMPLE POOLING KET HOP KY THUAT

MULTIPLEX RT - PCR

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện : NGÔ THANH THUY

MSSV : 18126168 Khóa : 2018 — 2022

TP Thủ Đức, 3/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIEN Papaya ringspot virus GÂY BỆNH DOM VÒNG TREN DU DU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SAMPLE POOLING KET HỢP KỸ THUẬT

MULTIPLEX RT - PCR

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiện

TS HUỲNH VĂN BIET NGÔ THANH THÚY

TP Thủ Đức, 3/2023

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Trường Đại học Nông Lâm đặcbiệt là thầy cô Khoa Khoa học Sinh học đã giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quýbáu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường

Em xin đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến CVHT — HDKH Thay TS HuỳnhVăn Biết — Người đã hướng dan, góp ý, tận tình giúp đỡ và động viên em trong suốtnhững năm học tập tại trường và trong quá trình xây dựng ý tưởng đề tài cho Khóa luậntốt nghiệp

Với lòng biết ơn sâu sắc và tình cảm chân thành, em xin gửi lời cảm ơn đến anh

Trương Quang Toản cùng với các anh chị, các bạn và các em trong Phòng 204 — Phòng

Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường Đại học Nông

Lâm TP HCM đã chỉ dạy và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu vàthực hiện đề tài tốt nghiệp

Con xin cảm ơn ba mẹ — người đã luôn ủng hộ, động viên giúp con vượt qua khó

khăn, tạo mọi điêu kiện cho con bước vào con đường nghiên cứu này.

Cảm ơn các bạn lớp DH18SM đã luôn đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên vàgiúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập

Mặc dù đã cô gắng rất nhiều, nhưng trong Khóa luận tốt nghiệp này không tránhkhỏi những thiếu sót Em kính mong quý Thầy Cô, quý Anh Chị có những ý kiến đónggóp, giúp đỡ dé dé tài của em được hoàn thiện hơn

Cuối cùng, em kính chúc quý Thầy/Cô/Anh/Chị thật nhiều sức khỏe và luôn trànđầy nhiệt huyết dé tiếp tục din dat nhiều thế hệ sinh viên tiếp theo trong sự nghiệpnghiên cứu và phát triển này

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Ngô Thanh Thúy, MSSV: 18126168, Lớp: DHI8SM (Số di động:

0981940050, Email: 18126168@st.hcmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ sinh họcTrường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khóa luận đo bảnthân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn trungthực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng về những camkết này

Tp Hồ Chí Minh,ngày tháng năm 2023

Người việt cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

1

TÓM TẮT

Papaya ringspot virus (PRSV) được biết đến là một trong những loại virus phổbiến và có sức tàn phá nặng nề nhất đối với đu đủ trên toàn thế giới Đây là virus gâybệnh đốm vòng xuất hiện phô biến và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất cũngnhư chất lượng du đủ ở Việt Nam Dé phát hiện sớm và chính xác sự hiện diện củaPRSV trên đu đủ nhằm phục vụ cho công tác kiểm soát bệnh, nghiên cứu đã thiết lậpquy trình phát hiện PRSV dựa trên phương pháp sample pooling kết hop multiplex RT—

PCR Trong nghiên cứu này, nhằm kiểm soát quá trình tách chiết nucleic acid, RNA bộ

gen đu đủ được sử dụng làm đối chứng nội và được khuếch đại cùng với đối chứng

dương mang gen mục tiêu cua PRSV Quy trình multiplex RT-PCR đã được xây dựng

dé phát hiện virus PRSV bằng cách tối ưu hóa các điều kiện phan ứng Hỗn hop hai cặpprimer được sử dụng dé khuếch đại hai đoạn gen khác biệt là 33 Ibp từ gen P3 của virus

và 675bp từ bộ gen actin của đu đủ Nghiên cứu cũng đã xây dựng được quy trình samplepooling mẫu gộp ở ngưỡng phát hiện là 1 mẫu đu đủ bệnh trong 1000 mẫu đu đủ Ứngdụng với 30 mẫu đu đủ thu thập thực địa, quy trình sample pooling kết hợp với multiplexRT-PCR có kết quả định tính tương tự với kết quả của phương pháp PCR

Từ khóa: Papaya ringspot virus, Sample pooling, Multiplex RT—PCR, du đủ

ill

Papaya ringspot virus (PRSV) is known as one of the most common and devastating papaya viruses worldwide It is a virus causes ringspot disease which occurs commonly and seriously affecting the productivity and quality of papaya in Vietnam.

To detect early and accurately the presence of PRSV in papaya for disease control, the study proved detected for PRSV based on sanple pooling and multiplex RT-PCR In this study, to control nucleic acid extraction, papaya genomic RNA was used as an internal control and was amplified together with a positive control carrying the target

gene of PRSV The multiplex RT-PCR method was developed to detect PRSV by

optimizing the reaction conditions A mixture of two primers was used to amplify two

distinct gene fragments, 331 bp from the P3 gene of PRSV and 675 bp from the papaya

actin genome The study also establish a sample pooling process at the detection threshold of 1 diseased papaya sample in 1000 papaya samples Applying with 30 papaya samples collected in the field, the sample pooling process combined with multiplex RT-PCR has qualitative results similar to those of the PCR method.

Keywords: Papaya ringspot virus, Sample pooling, Multiplex RT-PCR, papaya

IV

MỤC LỤCl7 (5 |, MEN mẽ .ẽa na 6 CC CC i

XAC NHAN VA CAM DOAN 0 1a<4 iiTOM TAT occ ccccccccccccecsessessessessessessessessessessessssessessssessssesssssesasstssessessssessessessessesseseeeeee iii

| a iv

80/9090 ÒÔÒÔÒÔÒÒ VvDANH SÁCH CHỮ VIET TẮTT 22 2¿2222EE+2E£2EE2EE2EEE2EE22E2221221222221222222 2e ixDANH SÁCH CAC BANG 0 cccssssssessesssessesssessessesssesssstessesssessessesssetieesessietsesseesseeseeseees x

Pe See | |; negang ta gai dhiEbiGiSi G0000 0000G00000/312010100000/0,004/0000001801,8 xiCHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 2-2222 2222E22E22E22E2512522112112112112112112121211212121 21 re |

LL, Dat VAI 1 H ÔỎ |125,2 G5116 ove iy HTOT-Ố LRsessesssseisuseobdtdasersindbcuagligasgsssgidgiuiugiBisgbgiszuikesSsiesssiSuialaressuioyusalouSDubsiDgutDkail 1

1.3 NOi dung thure W161 0117 2

CHUONG 2 TONG QUAN TAI LIBU 00 cccccccccsscsccsceseesessesesseesesesseseeeesesvseeseseseeseeeesd

2.1 on A120 .2.1.1 Nguồn gốc vã phân loại khoa học 122L H11012.2 2242242016111 x6 32.1.1.1 Phân loại khoa học - - ¿+ c2 2222 E332 8 3325183223832 11 12 1111511128111 re 32.1.1.2 Nguỗồn gốc 2-2222 2222222212211211221121121121121111121121111121111211 2111 ye 32.1.2 Đặc điểm thực vật học của CY 0901800100227 42.1.3 Cae yiểu TỔ ảnh lưỡng tiến cây ĐH srecceccccccscessaseecsnrancrsrnanrsrarmreriaaniarensiapnionseenait 4

"5: "31 ÔỎ 4

SO EE 4 2.1.3.3 Nhiệt AG oecceccecceeccessesssessesssessessvessessesssessessssssessesssessesssessesaesssesseesessesseesseeeeeaeeeeees 5

2.1.3.4 Gió và DIO cee csccecsesssessesssessessessessessessessvesiessesstessesssesiessessitssesststiessesneteeeeaeeeees 5

Bd A, GIAth Cua G8871)H/Ởịu ngang Bi2iga101g61G8004000135138101138801038380G100500013835838101000/8086/93836:g80qg04 5 2.1.4.1 Giá trị dinh đưỡng Sen 0110080056610 0s0.6 5

2.1.4.2 Giá trị thực phẩm ¿2-52 22S9212E125521221212212212122121121112112111211111121 11 xe 7

2.1.4.3 Giá trị trong y học cổ truyÈn + 2+ 22+22x22222212232221221231221231221221 22.22 7DAA Giá trị thương WAL cá si k2, kh gu g0 H80 0H /Á H4 HH4/.860 600 82.1.5 Tình hình san xuất du đủ ở Việt Nam va thé giới 2-2 2+222s+zzzzzxzzzzzz 82.1.5.1 Tình hình sản xuất đu đủ ở thé giới 2: 2222222E222222122522212212222221222222xe 82.1.5.2 Tinh hình sản xuất du đủ ở Việt Nam 2- 2¿2S+2E+2E2EE22E22E221 222222 ze 92.2 Sơ lược về sâu bệnh hại phổ biến trên cây đu đủ -2- 2222225522252: 102.0L BỆNH IAO COM HDD WAY LAs se cscs cass nh 16 146 aren sve ancien te 89130 dööfkSh5S,i034238406480ãG0A8038438380:8E 10

2.2.2 Bệnh do nắm gây ra 2 +22 2222121221211212212112112111121112112111211211121 21 c0, 10

2.2.3 Bệnh do tuyến trùng gây ra 2: 2+ ©S 2s 2112122121211211211211211211212121 21 xe 112,224 Ben do WINS! BAY Ti stxtxcsti106653803565526838428405219480553.002113138.IBEEXS4SSSHSEuGDĐSS8I31389505485 11

2.3 So lược về Papaya ringspot virus gây bệnh đốm vòng trên cây du đủ 11

7.5.1 NguÖn,gũc về NB Hỗ scence ersccexrssrcnsrpestacrccmnerencanuctacpenmnemsnanenmentamatees 112.3.2 PHAM load oo ÀẦ 118; 1 112.3.4 Sur dam nan :<4 122.3.5), JEiÊu;cHÚng Va WAC WAL cor conscnteencem ton aiee sreneseeeen ee ree aide 13 2.3.6 Bién phap phong trv eee eee 132.4 Các phương pháp chan đoán PRSV gây bệnh trên cây đu đủ - 14

2:4.1; Pưữơng phap đan Sat triệu.€hÚñE ceceeceeeseiinnoiiiarenbsodeDlniokissssedgE0S104402010008 14

JAD, HƯƠNG Phap Gầy GHỈ Hs sa cscc86016L60 n2 tdShicdnotgõsguoxghö SaEaohi45S¿ss C80880 0481481 tuoi 14

2.4.3 Phương pháp chân đoán bằng hiển vi điện tử -2-©22252++25++c5cze 142.4.4 Phương pháp huyết thanh học -22-©2¿25+22++2EE+2EE2EEEEEtEEEeEErzrrrerrree 152.4.5 Phương pháp chân đoán sinh học phân tử -2- 2 2222++2++2z++zxzzzzzzxzex 15

2.4.6 Cac 0ì i0 0n 15

2.5 Giới thiệu về kỹ thuật PCR, RT-PCR 22 222222E2EE22E2EE2EE22E222E22E.2zzcze 16

VI

2.5.1 KY non 16

2.5.2 KY thudt RT-PCR 0 ee 162.6 Giới thiệu về phương pháp sample pooling - 2: 22-222z+2z++2+zzxz+zzzz+z 17CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2 222222222£z2zz2zz2zz2222 183.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -2 2¿22222++22+222122EE2EE2EEEEEEcrErerkree 18

3.2 Vật liệu và hóa chất -¿+2¿+222E222121121123121121121121121121121212121212121 21 xe 1832s VALICIiripihH1ECiiieffHs <ese.esseexes-ssemooooergiroordttorcvEisdBirestindEcsi.mL1Min8nEmiesi12L0/560g0i1ữ0gE 18X1 TH asc SBA SS SA AS 18

3.2.3 Thiết bị và đụng CY ecccccccecessessesessessessssessesssesesessssusseessesesesusseesesssssesesueseeseenees 19

3.3 Phuong phap nghién CUu DƯ cece eee 19

Ce 11T er 193.3.1.1 Quy trình ly trích RNA tổng số bằng cột silica -2-©22©522222222222z£2 193.3.1.2 Xác định nồng độ và độ tinh sạch bằng máy quang phổ - 20

3.3.2 Tổng hop cDNA bang enzyme phiên mã ngược 2-2222 2z22z22+z£< 20

3.3.3 Phản ứng khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng kỹ thuật RT — PCR 20

3.3.4 Điện di sản phẩm sau phan ứng khuếch đại và giải trình tự - 203.3.5 Xây dựng quy trình phát hiện virus PRSV bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR 213.3.5.1 Thiết kế primer cho phản ứng multiplex RT—PCR 2 2: 552552: 213.3.5.2 Tối ưu hóa nhiệt độ cho phan ứng multiplex RT—PCR - 213.3.5.3 Tối ưu hóa nồng độ primer cho phan ứng multiplex RT-PCR 213.3.6 Xây dựng quy trình sample pooling trong nhận dạng virus PRSV gây bệnh đốmvũng trem cầy DU QUicsccsnemnesssaesceniensiam asa mas eraser meine cee EEE RAE 223.3.6.1 Phan ứng multiplex RT-PCR lần l 2 2¿©2222++22++2z2z+2zxzzx+zzxeex 2D3.3.6.2 Phan ứng multiplex RT-PCR lần 2 2 2+ 222+2E2E22E2212212221 22221222, 243.3.7 Phát hiện PRSV trên mẫu thu thập thực địa bằng quy trình sample pooling 243.3.7.1 Phát hiện PRSV trên mẫu thu thập thực địa bằng quy trình sample pooling 24

VI

3.3.7.2 So sánh hiệu quả phát hiện PRSV của phương pháp sample pooling với phương

pháp RT —PCR từng mẫu đơn lẻ 2-2-2252 2S2E2SE2E£EE£EEE2EE2E2EE2E2E2EZErrrrree 24

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN - 2-52 22222E+2E+2E22E2EZEzErrerree 25

AV Kt aảàộaaạạA34+YÝ 25

4.1.2 Kết qua điện di sản pham RT — POR o c.cccccccccessessssssessessessessesssessesstesseeseesseens 254.1.3 Tối ưu hóa nhiệt độ cho phan ứng multiplex RT—PCR -2- 22552 264.1.4 Tối ưu hóa nồng độ primer cho phản ứng multiplex RT—PCR - 274.1.5 Xây dựng quy trình sample pooling trong nhận dang virus PRSV gay bệnh đốm

võng: tren cấy Gu ŨUssssessostexsocaB10466318/805608082145E003655800164.02718S45EELSiSBASEG4GG3ltiỦng HN HEIGBS6 28

4.1.6 Phát hiện PRSV trên mẫu thu thập thực địa bằng quy trình sample pooling 324.1.6.1 Phát hiện PRSV trên mẫu thu thập thực địa bằng quy trình sample pooling 324.1.6.2 So sánh hiệu quả phát hiện PRSV của phương pháp sample pooling với phương

pháp RT —PCR từng mẫu đơn lẻ - +22 522522E2E2E2EEEE2EE2EE2EE2EzEerrrrrrrerree 34

C5 (HH0) Utd eee ee ee ee ee ee ee 36

CHUONG 5 KET LUẬN VA DE NGHI oo.occccececcssessesessesseseeseeseeessessssesseeesceseaveseesees #ĩ

5.1 Kết luận 2-5-2222 2 E52111121212112112121121111111111121111112111111111101211122 1e 375.2 DG J1 5 37TAI LIEU THAM KHAO 07 PHU LUC 0o.ceccecccsscecsesssessecssessesssssessesssessessvsssessessiessesssessesssssessesssesseeaessessessesseseneeeeess 41

Vill

DANH SÁCH CHU VIET TAT

threshold cycle

cộng tác viên Deoxyribonucleic acid

Food and Agriculture Organization of the United Nations

National Center for Biotechnology Information Polymerase Chain Reaction

Papaya ringspot virus Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Ribonucleic acid

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

1x

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Bang 2.1 Giá trị dinh dưỡng có trong 100 g bộ phận có thé ăn được của cây đu đủ 6Bang 3.1 Tên và trình tự primer dùng trong phản ứng PCR eects 18Bang 3.2 Tổ hợp nồng độ primercho chín phản ứng 2: 22552222+22222zz252 22Bang 3.3 Thành phan các mức phan ứng (RNA đu đủ bệnh/RNA đu đủ khỏe) 23Bang 3.4 Thanh phần của các mức (RNA đu đủ bệnh/nước cất khử trùng) 23Bảng 4.1 Kết qua kiểm tra nồng độ RNA mẫu gộp (RNA đu đủ bệnh va RNA du đủ

|HỚE ) cung gi ongtintg84830161GG0195080858103006018013008080801854GHSSSESHH2G3EHBBRGHGSGRISGBSgĐGM-WSSBBISHHSIQEGMIGEE.GIS.R83.0 8.0010R3-g8 30

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 4.1 Kết quả điện di sản pham RT-PCR đoạn gen mục tiêu của virus PRSV vớiSap prữraierEESSVI15-E/ERS VŨ lộ Keang ung EhgENGIờ GHUENGẺGHESNSSSEIEG.HGS.AGBSSMSI.000285835⁄05E 25Hình 4.2 Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ cho phan ứng RT-PCR 2-5: 27Hình 4.3 Kết quả tối ưu hóa nồng độ của hai cặp prIimerđược sử dụng cho phản ứngmultiplex RT-PCR của PRSV và đối chứng nội 2 2 2222222E22E222222E22zzzxez 28Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR kiểm tra virus PRSV trên mẫu RNA đu

đủ bệnh pha loãng với nước cất khử trùng ở các mức .-. - 2252525225522 29Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm multiplex RT-PCR kiểm tra virus PRSV trên mẫusample pooling ở các mức pha loãng s:.:‹isssscoissisoiSnE010111 G0 6 1616016 14051535 6651895555 88g 31Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm multiplex RT-PCR ở mức gộp 30 mau .33Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm multiplex RT-PCR ở mức gộp 5 mu .33Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm multiplex RT-PCR các mẫu riêng lẻ của nhóm 2 vaMUO tgucgtttsS5EE9S609558100080181304S3EN\SGSSSEESSGESGSISS.NSSISQISGEDRBSEESG8E4SG0128iGG892E2G0LS.LG23)8MEBUBEĐSU 34Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR kiểm tra virus PRSV của 30 mẫu du đủ

XI

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Du đủ (Carica papaya Caricaceae) là một loại cây nhiệt đới phổ biến có nguồngốc ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ, là loài duy nhất trong Chi đu đủ (Carica), thuộc Họ đu

đủ (Caricaceae hay Papayaceae) Trong quả du đủ chín có hàm lượng dinh dưỡng cao,

theo phân tích thành phần hoá học, trong 100g thịt trái chín có chứa 86,6 % nước, 12,1

% tinh bột, 0,6 % protein, 0,3 % lipit, năng lượng là 50 calo, 0,7 % xơ, 0,5 % tro và khánhiều khoáng như: Kali (204 mg), Ca (34 mg), P (11 mg) Đặc biệt, đu đủ cung cấplượng vitamin rất phong phú: vitamin A (450 mg), C (74 mg), B1 (0,03 mg), P (0,5 mg),B2 (0,04mg) (Trần Thế Tục, 1998) Day là loại qua đặc sản của vùng nhiệt đới, có giátrị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao Ở Việt Nam, đu đủ được trồng rộng rãi trên phạm

vi cả nước, trồng nhiều nhất ở các vùng trung du đặc biệt là các tỉnh miền Đông Nam

Bộ Với các giống đu đủ được trồng phô biến là: đu đủ ta, đu đủ Mehico, đu đủ Trung

Quốc, du đủ Solo, du đủ Thai Lan, đu đủ Đài Loan,

Tuy nhiên việc sản xuất đang bị hạn chế bởi bệnh do Papaya ringspot virus(PRSV) (Gonsalves, 1998) Day là virus gây thiệt hại hang đầu đối với canh tác đu đủ

Do tính chất gây bệnh đặc trưng của virus là lây lan rất nhanh và không thê kiểm soátbang hóa chất hay bat kì phương thức nao ma chỉ có thé khắc phục bằng cách phòng trừ

và sử dụng giống kháng bệnh nên thiệt hại của bệnh rất nghiêm trọng Thêm vào đó,bệnh lại rất khó nhận biết ở giai đoạn sớm, đến khi ta quan sát được triệu chứng mộtcách rõ ràng thì đã quá muộn và thường không chính xác, gây nên nhiều thiệt hại nặng

nề Thiệt hai đáng kế do PRSV đối với việc canh tác đu đủ đã làm nảy sinh nhu cầu làmsao dé sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm bệnh Vì vậy, đề tài “Xay dựng quy trìnhphát hiện Papaya ringspot virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ bằng phương phápsample pooling kết hợp kỹ thuật multiplex RT — PCR” được thực hiện nhằm giúp pháthiện sớm mầm bệnh và ngăn chặn kịp thời, giúp giảm bớt thiệt hại do virus PRSV gây

ra.

1.2 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng quy trình phát hiện — chan đoán bệnh PRSV (Papaya ringspot virus)

bằng phương pháp sample polling kết hợp kỹ thuật multiplex RT — PCR nhằm chan

đoán chính xác và hiệu quả nguồn bệnh trong quá trình phòng trừ bệnh hại do virus gây

ra.

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dụng 1: Xây dựng quy trình phát hiện virus PRSV bằng kỹ thuật multilex RT

—PCR

Nội dung 2: Xây dựng quy trình sample pooling phát hiện virus PRSV gây bệnh

trên cây đu đủ

Nội dung 3: Ứng dụng quy trình phát hiện PRSV bằng kỹ thuật sample pooling

trên các mẫu thu thập từ thực địa

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Sơ lược về cây đu đủ

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại khoa học

2.1.1.1 Phần loại khoa học

Du đủ có tên khoa học là Carica papaya là một cây thuộc ho Du đủ.

Giới (regnum) Plantae

(không phân hang) Angiospermae

(không phân hang) Eudicots

(không phân hang) Rosids

Bộ (ordo) Brassicales

Ho (familia) Caricaceae

Chi (genus) Carica

Loai (species) C Papaya

Ở một số nơi trên thé giới, đặc biệt là ở Australia và một vai đảo ở phía đông An

Độ, cây đu đủ được biết đến với tên gọi là papaw hay pawpaw Bên cạnh tên papaya rấtphô biến thì ở Nam A va Đông Ấn Độ nó còn có các tên gọi bị sai lệch đi như kapaya,kepaya lapaya hay tapaya.

Ở Pháp, trái du đủ được gọi là papaye, còn cây đu đủ là papayer, đôi khi được gọitheo tên nội dia là figuier des Iles Theo tiếng Tây Ban Nha, trái đu đủ được gọi là mélon

zapote, lechosa, papaya; còn cây du đủ có tên là papayo hay papayero, fruta bomba,

mamón hay mamona tùy thuộc vào từng nước Ở Brazil, tên thông dụng của nó là

mamao Ở Châu Âu, khi được phát hiện lần đầu tiên nó được đặt cho tên địa phương là

“free melon” (James, 1983).

2.1.1.2 Nguồn gốc

Chi Du đủ (Carica) có một loài đuy nhất là Du đủ (Carica papayai) thuộc Họ du

đủ (Caricaceae hay Papayaceae) Loài này có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của Châu Mỹ,

từ vùng đất thấp ở miền nam Mexico, miền đông Trung Mỹ, và bắc Nam Mỹ Nó đã

được người Tây Ban Nha đưa tới Philippines vào khoảng năm 1550 Từ đây nó đượcđưa vào khu vực nhiệt đới châu Á, châu Phi Ngày nay, du đủ được trồng lù phần lớn các

nước nhiệt đới như Brasil, An D6, Sri Lanka, Philippines, Việt Nam

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây Du đủ

Rễ: Là loại rễ chùm, có các nhánh rễ đâm ngang tương đương với độ rộng của tán

lá, rễ cây đu đủ ăn nông tập trung 6 tang dat từ 0 -30em Cây du đủ có bộ rễ nhỏ, giòn,

mềm không chịu được ngập tng hoặc khô hạn khi gặp thời tiết bat lợi

Thân: Thân cây đu đủ là dạng thân mềm, bán mộc, cây có màu xám xanh hoặc nâuxám, thân không phân nhánh khi đang trong giai đoạn sinh trưởng phát triển Cây đu đủ

có thân rỗng, có các mô yếu, thân hóa gỗ kém Trong điều kiện sinh trưởng, phát triểntốt cây có chiều cao trung bình từ 3 —7 m, mang một chùm lá trên phía ngọn

Lá: Lá du đủ mọc cách, so le, không có lá kèm Cuống dai 60 — 70 cm, rong Gan

lá hình chân vịt Trong các tháng có nhiệt độ cao, dinh dưỡng nước day đủ, du đủ có thé

ra 9— ]] lá.

Hoa: Hoa màu trắng phớt vàng nhạt, mọc thành chùm xim ở nách những lá già

Hoa đơn tính thường khác gốc, nhưng cũng có cây vừa mang cả hoa đực; hoa cái và hoa

lưỡng tính, hoặc có hoa cái và hoa lưỡng tính Cụm hoa đực phân nhánh nhiều, có cuống,rất dai Cụm hoa cái chỉ gồm 2 — 3 hoa

Quả: Quả mọng to, thịt quả đày, trong ruột quả có nhiều hạt đen Dạng quả đu đủ

thường tùy vào loại hoa đã thụ phan là hình trứng hay hình cầu do hoa cái phát triển,

hình thon dài do hoa lưỡng tính tạo thành.

Hạt: Thon gần tròn, mọc trong phần rồng của ruột quả Hạt già có màu xám hoặcđen và thường chìm trong nước Bên ngoài hạt có lớp vỏ lụa mỏng, cản thắm nước nêncần chà bóc vỏ trước khi gieo

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến cây Du đủ

Du đủ là cây có yêu cầu cao về nước đo có diện tích lá lớn song rất dé bị ing Do

cau trúc của lá và lớp bảo vệ trên bộ mặt lá, đu đủ chịu hạn rất kém Lượng nước du đủ

cần khoảng 1.300 — 1.500 mm trong năm Khi đủ nước và cấp nước kịp thời cây sẽ sinh

trưởng liên tục và cho năng suất cao Cây cần nhiều nước trong giai đoạn vươn cao, giaiđoạn hoa và giai đoạn nhanh lớn của quả Mùa đông hoặc thời tiết lạnh, cây cần ít nước.2.1.3.3 Nhiệt độ

Do có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới nên đu đủ cần nhiệt độ cao dé sinh trưởng vaphát triển, đây là yêu tố hạn chế sự phân bồ và phát triển của đu đủ Nhiệt độ thích hợpnhất cho cây sinh trưởng và phát triển là 25 — 30°C Khi nhiệt độ trên 44°C và cường độchiếu sáng mạnh, cây sẽ bị mat nước và héo Nhiệt độ thấp hơn 15°C, làm giảm sự ra lá,quả phát triển chậm và chất lượng quả kém Nếu nhiệt độ quá lạnh hoặc có sương muối,

bộ lá của cây bị tốn hại, các bó mạch bị vỡ làm chảy nhựa và dan đến chết nếu lạnh quádài Nhiệt độ —2°C là nhiệt độ gây chết đối với cây

2.1.3.4 Gió và bão

Do bộ rễ ăn nông và là thân thảo nên đu đủ chịu gió, bão rất kém nhất là thời kìcây đang mang quả Gió mạnh làm lá cây bị rách ảnh hưởng đến sinh trưởng và pháttriển của cây và quả, gió to là đồ cây, gây xây xát thân, làm chảy nhựa tạo điều kiện chonắm bệnh phát triển

2.1.4 Giá trị của cay Du đủ

2.1.4.1 Giá trị dinh dưỡng

Du đủ chín chứa tới 90% nước, 13% đường, không có tinh bột, có nhiều carotenoitacid hữu cơ, vitamin: A, B, C, 0,9% chất béo, xenluloz (0,5%), canxi, photpho, magié,sat, thiamin, riboflavin Trong 100g du du xanh có 74 —80 mg vitamin C va 500 —1.250

IU caroten Du đủ còn có các vitamin BI, B2, các acid gây men va khoáng chất nhưkali, canxi, magié, sat va kém

Ngoài các dưỡng chat nói ở trên thì đu đủ xanh còn được các nhà khoa học pháthiện nó có chứa khoảng 4% chất nhựa latex nhựa có thể tìm thấy ở quả đu đủ xanh, lá

và thân cây Trong latex có chứa chất men tiêu hóa chất đạm (proteaza) va papain

Những chất có tác dung rất tốt cho sức khỏe con người Ước tính 1 năm có thé thu hoạch

được 100 g nhựa từ đu đủ Cùng với đó là các chất chymopapain va papaya protenaza

có trong qua du đủ xanh Papain giống như papain chứa trong da day và trysin trongtuyến tụy đều có tác dụng tiêu hóa trong các bộ phận này Bên cạnh đó papain còn có

tác dụng ức chế vi khuẩn, hạn chế Staphillococ va vi trùng thương hàn Ngoai ra, Papain

còn có tác dụng làm đông sữa và giảm độc đôi với toxin và toxanpunin.

La du đủ chứa hàm lượng ancaloit carpain, có tac dụng như glucozit trong dương

địa hoàng (digitalis) có tác dụng làm chậm nhịp tim và làm liệt amit.

Hat du đủ chứa 2 chất glucozit caricin va myrosin

Hàm lượng dinh dưỡng có trong các thành phần của cây đu đủ được công bố từTrung Mỹ và Cuba (James, 1983)

Bang 2.1 Giá trị dinh dưỡng có trong 100 g bộ phận có thé ăn được của cây đu đủ

Thành phần Trái Lá

Calories 23,11 —25,8

Lượng nước 85,9—92,6g 83,3 % Protein 0,081 — 0,34 g 5,6%

Thiamine 0,021 — 0,036 mg

Riboflavin 0,024 — 0,058 mg Niacin 0,227 — 0,555 mg

Ascorbic Acid 35,5 —71,3 mg 38.6%

Tryptophan 4-5 mg Methionine 1 mg

Lysine 15-16 mg

Magnesium 0,035 %

Phosphoric Acid 0,225 %

2.1.4.2 Giá trị thực phẩm

Du đủ phổ biến nhất là được sử dụng dưới dạng tươi sống Ngoai ra còn có thé sửdung làm món trái cây trộn, nước sốt trái cây, coctail, thêm vào kem, bánh Du đủchưa chín không bao giờ được ăn do nó chứa rất nhiều nhựa Thậm chí khi được sử dụnglàm salad nó cũng cần được bỏ vỏ, hạt, đun sôi đến khi mềm

Trái chín có thé loại bỏ vỏ, hạt, phần thịt cho vào các chai hoặc can chứa đề lên

men làm rượu trái cây.

Ở miền Đông Án Độ, lá đu đủ non có thể sử dụng nấu và ăn tương tự như rau bina

(rau Spinach).

Các chùm hoa đực được bán sang các nước Indonesia, New Guinea dé nấu (có thay

nước nau dé loại bỏ vị đẳng) và ăn như rau sống Ở Indonesia, hoa đôi khi được sử dụng

để làm kẹo

Ở Châu Phi, thân cây còn non có thể được sử dụng dé nau ăn

Sự hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học Italy và Somalia đã tìm thấy tronghat du đủ có chứa đến 18 acid amine gồm: glutamic acid, arginine, proline, aspatic acid,

proline, tyrosine, lysine, aspatic acid, glutamic acid.

Ngoài ra con ly trích được tinh dầu có mùi hương nhẹ từ hạt và tinh dầu này có thểđược sử dụng trong công nghiệp thực pham hay trong kĩ nghệ công nghiệp

2.1.4.3 Giá trị trong y học cỗ truyền

Cây đu đủ không chỉ cho quả ngon, có giá trị dinh dưỡng mà hầu như tất cả các bộphận của cây du đủ còn có thé sử dụng dé làm thuốc: từ hoa, lá, qua, nhựa, hạt, rễ

Trong các bài thuốc dân gian ở miền nhiệt đới, nhựa tươi được bôi lên những vếtsưng tay, trị mụn cóc, dém tàn nhang và được sử dụng như một bài thuốc trị giun san.Nhựa du đủ còn được sử dụng dé điều chế thuốc chữa lệch khớp xương, thuốc tiêm giảmđau đo các dây thần kinh gây nên

Trái còn xanh được sử dụng như một bài thuốc điều kinh va tay giun, trị ăn không

tiêu, táo bon, trị đau lưng mỏi gối Du đủ xanh nghiền nát với nước dùng bôi mặt hoặctay dé chữa các vết tàn hương ở mặt, tay, còn dùng chữa chai chân và bệnh eczema

Từ xa xưa dân gian ví lá đu đủ như một vị thuốc chữa bệnh, hỗ trợ ngăn ngừa vàgiảm nguy cơ mắc bệnh ung thư Lá khô được sử dụng dưới dạng thuốc hút với côngdụng làm dịu đi cơn hen suyễn hoặc sử dụng thay thế cho thuốc lá

Hoa được dùng trị bệnh vàng da Trong hoa đu đủ đực có hàm lượng lớn các chấtchống oxy hóa, folate va beta — carotene, những thành phan này có khả năng bảo vệ

thành mạch, giảm lượng cholesterol xấu trong cơ thé, ôn đường huyết áp, ngăn ngừa

tình trạng đột quy, đau tim Theo các nhà nghiên cứu Mỹ cho biết, các hoạt chấtcarotenoids và lycopene trong đu đủ có kha năng ức chế sự hình thành của các khối u

Từ đó giúp giảm nguy cơ mắc các chứng bệnh quái ác như bạch cầu, ung thư vú, ungthư tuyến tiền liệt,

Công dụng như một liều thuốc kháng sinh: những nghiên cứu tại trường Đại họcNigeria đã phát hiện thấy dịch trích từ quả đu đủ chín, chưa chín và từ hạt đều có hoạttính chống lại vi khuẩn G”; sử dụng với liều mạnh có thé chống lại cả vi khuẩn G-.Dịchthu từ hạt được ly trích, sản xuất ra aglycone của glucotropaeolin benzyl isothiocyanate(BITC) có tác dụng kim hãm và tiêu diệt vi khuẩn, nam

2.1.4.4 Giá trị thương mại

Cây đu đủ là cây ăn quả ngắn ngày, cho thu hoạch nhanh, đạt sản lượng cao, chiếm

ít diện tích, thích hợp với nhiều loại đất, có thê trồng xen với các cây trồng khác Trongvườn quả như xoài, nhãn, vải những năm đầu khi cây chưa giao tán có thể trồng xen

đu đủ Quả đu đủ được sử dụng với nhiều mục đích như ăn quả chín, làm rau, chế biến,

làm thức ăn chăn nuôi Quả đu đủ chín có giá trị dinh dưỡng cao được thị trường quảtươi các nước châu Âu, châu Mỹ, Nhật Bản rất ưa chuộng Quả đu đủ xanh chứa khoảng

60 — 70% các chất đinh dưỡng so với quả chín Chúng rất được coi trọng ở vùng ít cóđiều kiện sản xuất rau

Toàn bộ cây đu đủ trừ quả chín, đều chứa nhựa màu trắng chứa enzyme phân hủyprotein gọi là papain Nếu trồng dé thu nhựa, một cây du đủ cho khoảng 100 — 200 gnhựa khô (tương ứng 4% trọng lượng cây tươi hoặc 0,7 — 1,0% trọng lượng quả tươi) và

1 ha có thể thu 250 — 300 kg nhựa nguyên liệu Nhựa papain khô được dùng trong côngnghiệp chế biến thịt, chế biến sữa, công nghiệp làm thuốc tây, trong ngành y Vì vậy,nhựa papain đã và đang được một số nước trên thế giới quan tâm

2.1.5 Tình hình sản xuất đu đủ ở Việt Nam và thế giới

2.1.5.1 Tình hình sản xuất đu đủ ở thế giới

Du đủ là loại cây ăn quả nhiệt đới dé trồng, có năng suất cao và phẩm chat quảngon nên được nhiều nước khai thác để cung cấp quả tươi và làm nguyên liệu chế biếncác sản phâm trái cây công nghiệp.

Trong đầu thập niên 2010s sản lượng đu đủ toàn cầu đã đạt 11,22 triệu tan, chiếmkhoảng 15,36 % của tổng sản lượng quả nhiệt đới, so với xoài 38,6 triệu tan (52,86%),

dứa 19,41 triệu tấn (26,58%)

Sản xuất đu đủ toàn cầu đã phát triển đáng kể trong vài năm qua, chủ yếu là kếtqua của việc tăng sản xuất ở An Độ Du đủ đã trở thành một nông sản xuất khẩu quantrọng cho các nước đang phát triển, nơi mà doanh thu xuất khẩu của trái cây cung cấpsinh kế cho hàng triệu người, đặc biệt là ở Châu Á và Châu Mỹ La Tin Xuất khâu đu

đủ góp phần cung cấp ngày càng tăng của các sản phẩm thực phẩm lành mạnh trên thịtrường quốc tế

Ba nước xuất khẩu hàng đầu chiếm 63,28 % của tổng kim ngạch xuất khâu toàncầu của đu đủ giữa năm 2007 và 2009, với hơn một nửa sản phẩm của đu đủ xuất khâusang Hoa Kỳ.

Sản xuất đu đủ toàn cầu đang tập trung cao độ, với mười quốc gia hàng đầu chiếm

trung bình 86,32% của tông sản lượng trong giai đoạn 2008-2010 An Độ là nhà sảnxuất đu đủ hàng đầu thế giới, với thị phần 38,61% đu đủ xuất khâu trong giai đoạn 2008

— 2010, tiếp theo là Brazil (17,5%) và Indonesia (6,89%) Các nước sản xuất du đủ quantrọng khác trên thế giới và có sản phẩm xuất khẩu cho toàn cầu bao gồm Nigeria(6,79%), Mexico (6,18%), Ethiopia (2,34%), Cộng hòa Dân chu Congo (2,12%),

Colombia (2,08%), Thái Lan (1,95% ), và Guatemala (1,85%).

Hiện nay du đủ là loại cây ăn quả có thế mạnh ở các nước nhiệt đới, sản phẩm của

nó không những chỉ được tiêu thụ ở các vùng nhiệt đới mà có xu hướng ngảy càng được tiêu thụ mạnh mẽ ở các nước ôn đới.

Mỹ là nước nhập khẩu đu đủ lớn nhất thế giới Ở Mỹ đu đủ là loại cây ăn quả thếmạnh ở bang Hawaii và cũng được trồng hạn chế ở bang Florida Nói chung nhiều nướcnhiệt đới đang ngắm tới thị trường xuất khẩu đu đủ sang Mỹ

2.1.5.2 Tình hình sản xuất đu đủ ở Việt Nam

Ở nước ta hiện nay, do sâu bệnh, ứng nước và điều kiện thời tiết không thuận lợicho việc ra hoa, kết trái nên năng suất đu đủ trung bình chỉ khoảng 20 tân/ha (Sở NôngNghiệp và Phát Triển Nông Thôn tỉnh Tiền Giang, 2003)

Đồng thời ở Việt Nam, đu đủ chỉ được trồng với mục đích thu hoạch trái phục vụcho mục tiêu thực phẩm (ăn tươi, sản xuất nước ép hoa quả, bánh kẹo, ) và cũng chỉsản xuât với quy mô nhỏ và vừa, phục vụ cho nhu câu trong nước mà thôi.

9

2.2 Sơ lược về sâu bệnh hại phố biến trên cây đu đủ

2.2.1 Bệnh do côn trùng gây ra

Rệp sáp gồm 5 họ Asterolecanniidae

Coccidae

Diaspididae Margarodiae PseudococcidaeThường là loại rệp có mau trang xám, phát triển nhiều trong mùa nang Rệp cókích thước 2 — 3 mm, bám sát vào ngọn thân, lá, trái, bông chích hút nhựa cây, lá làmtrái kém phát triển và đễ bị nắm bồ hóng tấn công gây bệnh

Rệp dính (ray mém — Aphididae): Deo bam, chích hút ở trai, dot non hoặc ở mat

dưới lá.

Nhén đỏ (ray lửa — Tetranychus seximaculatus): Nhện có màu hồng nhạt đến đỏđậm, rất nhỏ (dưới 1 mm) nên phải quan sát kĩ mới phát hiện được, thường bám ở phíamặt dưới lá và trên trái Nơi bị chích hút nặng lá bị vang loang 16 từng đóm nhỏ, sau đó

bị cháy đi Khi bị nặng lá có thé bị cháy hoàn toàn

Ru6i đục trái (Toxotrypana curvicauda): Thường chỉ gây hai nặng khi trái để chíncây Ruồi đục vào trái để đẻ trứng, giòi nở ra sẽ gây thối trái

2.2.2 Bệnh do nam gây ra

Bệnh thối gốc ( do nam Pythium spp): Bệnh chủ yếu do loài Pythiumaphanidermatum gây ra Nắm bệnh tồn lưu trong xác bã cây bệnh có trong đất và sinhsản rất nhiều noãn bào tử dé lây lan Bệnh phát triển mạnh nhất khi trời nóng ẩm Am

độ quanh gốc cây càng cao, bệnh phát triển càng mạnh

Bệnh đốm lá (do nắm Phyllosticta sulata): Trên lá, đốm bệnh có hình tròn, hìnhtrứng, thon dai hay có hình dạng bat kì Vùng giữa vết bệnh có mau bạc trắng, viền có

màu vàng hay nâu Vùng bệnh khô và mỏng dan rồi rách đi Mầm bệnh tồn lưu rất lâu

trong xác lá cây bệnh và phát tán theo gió đề lây lan Do đó nên tiêu hủy xác lá bệnh détránh lây lan.

Bệnh cháy lá (do nam Helminthosporium rostratum): Phần chóp của các lá bên

dưới có các dém ting nước, lan dan vào bên trong lá làm lá bị nâu và khô đi Nếu nhiễm

nặng, cuông lá bị héo, mêm và lá bị rụng.

10

Bệnh phan trắng (do nam Oidium caricae): Mặt dưới lá bị đóng phan mau trắng,nếu nhiễm nặng lá sẽ phát triển kém, có thé bị biến dạng chút ít Trái cũng bị các đốmphan trắng tròn hay bầu dục và phát triển kém.

2.2.3 Bệnh do tuyến trùng gây ra

Bệnh do tuyến trùng Meloidogyne incognita và Rotylenchulus reniformis, cả hailoại tuyến trùng đều phá hoại rễ và gây thiệt hại cho đu đủ Cây con nhiễm nặng có thêchết, còn cây trưởng thành có thé giảm sức sinh trưởng

2.2.4 Bệnh do virus gay ra

Bệnh kham (do Papaya mosaic virus): Bệnh phổ biến và quan trọng ở nhiều nơitrên thế giới Ở Việt Nam, bệnh gây thiệt hại nặng ở Đồng bằng sông Cửu Long Câycon mới trồng cũng có thê nhiễm bệnh song thường thay ở cây đã được 1 — 2 năm tuổi

Bệnh đốm vòng (do Papaya ringspot virus): Cùng với bệnh khảm, bệnh đốm vòngcũng khá phổ biến và nghiêm trọng cho đu đủ ở Đồng bằng sông Cửu Long

2.3 Sơ lược về Papaya ringspo virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ

2.3.1 Nguồn gốc và phân bố

PRSV-p được phân lập và nghiên cứu lần đầu tiên vào năm 1949 trên cây du đủ ởHawaii (Jensen, 1949), sau đó bắt đầu xuất hiện nhiều báo cáo về loài virus này từ khắpcác khu vực trồng đu đủ trên thế giới Còn về vùng địa lý đầu tiên xuất hiện loài virus

này vẫn chưa được xác định chính xác

Phân bồ rộng khắp vùng Trung Đông, Nam và Trung Mỹ; Trung Quốc, Pháp, Đức,

An Độ, Ý, Mexico, Đài Loan, và đặc biệt là ở My

Chi (genus) Potyvirus

Loai (species) Papaya ringspot virus

2.3.3 Dac diém

11

Papaya ringspot virus (PRSV)— thuộc nhóm Potyvirus Là một virus với acid nhân

là RNA, sợi đơn (ssRNA, positive-strand viruses), xoắn ngoan ngoéo, kích thước sợi

760 — 800 nm, đường kính 12 nm với bộ gen có kích thước tông cộng là 12 kb Ở cây bịnhiễm, virus được tìm thấy trong tat cả các phần của cây, chúng tạo nên các thé vùi hìnhtrụ (cylindrical incusions— CI) hoặc vô định hình (amorphous inclusion— AT) trong tế

bào chất, không bào của mô cây bị nhiễm Song những tế bào này không chứa các virion,

trong khi đó nhựa cây thường chứa rất nhiều virion Mỗi một virion gồm khoảng 5,5 %nucleic acid và 94,5 % protein (Marc, 1997).

PRSV được chia làm hai dạng PRSV—w và PRSV-p Trong đó, PRSV-p xâm

nhiễm và gây hại trên hầu hết các loài đu đủ và cây thuộc họ bầu bí trên thế giới, cònPRSV—w chỉ xâm nhiễm trên những cây thuộc họ bau bí, không xâm nhiễm trên cây du

đủ (Gonsalves, 1998) Một vài nghiên cứu đưa ra giả thuyết rằng PRSV-p là một dạngđột biến từ dạng PRSV—w; song những nghiên cứu cụ thể về sự tiến hoá nay vẫn chưađược xác định rõ ràng Do theo những khảo sát về trình tự DNA mã hoá protein vỏ (coatprotein— CP) của virus ở Australia, trình tự nay rất giống nhau giữa hai loài P và W;

song loài PRSV-—w đã được tìm thay ít nhất là 20 năm trước khi phát hiện thấy loài

PRSV-p.

PRSV-p bao gồm một số loài, loài tìm thấy ở Hawaii khác với loài tìm thấy ở TháiLan hay Florida Do đó, phương pháp khống chế mầm bệnh ở mỗi vùng cũng khônggiống nhau (Marison, 2002)

2.3.4 Sự lan truyền

PRSV là một loài vi sinh vật sống kí sinh Chúng lây truyền từ cây chủ này sangcây chủ khác thông qua một vector Đó là hai loài aphids (ray mềm hay rệp muội), Aphisgossypii (rép bông) và Myzus persicae (rép đào), chúng mang theo virus trên cơ thể vatruyền sang cây khi chúng chích hút cây và truyền theo phương thức không bền vững

(non-persistant) Trong sự lây truyền bệnh, virus cần sự hiện điện của một protein là AI

(amorphous inclusion protein) đóng vai trò như một nhân tổ hỗ trợ cho sự lây truyền

thông qua côn trùng.

Ngoài ra, bệnh còn có thể bị lây truyền từ cây bệnh sang cây lành nếu con người

chạm vào cây bệnh rồi sau đó chạm vào cây lành hoặc lây truyền trực tiếp qua các vết

thương cơ học Bệnh lây lan nhanh nhất là ở các cây từ 5 — 6 tháng tuổi Virus không

12

truyền qua hat của trái bệnh Đồng thời virus không có khả năng tồn tại trong môi trườngđất và trong các mô cây đã bị chết.

Ở qua, lúc đầu vết bệnh là những đốm thâm xanh thẫm, sau đó lớn dan thành cácđốm hình nhẫn màu xanh thẫm Vết bệnh thường tập trung ở nửa trên của qua, gần vềphía cuống Khi quả già, chính các vết thâm này sẽ thối sâu vào bên trong quả gây hỏngquả Bệnh còn tạo các sọc dầu, màu xanh trên ngọn thân và cuống la

Trai bệnh bị nhạt do virus làm giảm lượng đường trong trai.

Cây du đủ ở bat kì độ tuổi nào cũng đều rất nhạy cảm với virus này, song đối vớicác cây còn non, khi bị nhiễm sẽ không chết, vẫn sống nhưng còi cọc và không có khảnăng cho trái.

2.3.6 Biện pháp phòng trừ

Hiện nay chưa có biện pháp hữu hiệu trong việc chữa trị bệnh dém vòng cho cây

đu đủ, vì thế nên kết hợp một số biện pháp dé hạn chế tác hại của bệnh như:

— Cần tìm kiếm, khảo nghiệm cũng như nhập nội các giống du đủ kháng bệnh

— Theo dõi, phát hiện và chặt bỏ sớm những cây đã bị bệnh, đem tiêu hủy.

— Thường xuyên làm sạch cỏ đại trong vườn đu đủ Tạo nguồn cây con sạch bệnh

trong vườn ươm, cách ly chống rệp

— Sử dụng các biện pháp hóa học dé diệt côn trùng truyền bệnh nhất là đối với rệpbông (Aphis gossypii) và rệp đào (Myzus persicae)

— Không nên trồng xen các loại rau cải, bầu bí, mướp trong vườn du đủ Hạn

chế việc làm cho cây bị sây sát tạo vết thương cơ giới cho virút xâm nhập

— Chăm sóc cho cây sinh trưởng và phát triển tốt, khỏe mạnh, giúp cây chống đỡvới bệnh được tốt hơn

13

— Thực hiện chọn lọc, vệ sinh đồng ruộng thường xuyên dé loại bỏ cây bệnh, bao

vệ cây đu đủ tới 12 tháng tuổi, sau đó thu hoạch chậm nhất tới 18 tháng tuổi thì chặt bỏ

để xây dựng vườn mới

2.4 Các phương pháp chan đoán PRSV gây bệnh trên cây đu đủ

2.4.1 Phương pháp quan sát triệu chứng

Dựa trên những mô tả sẵn có về các dạng bệnh virus dé phân biệt bệnh virus thực

vật với các triệu chứng do viroid, mycoplasma, tuyến trùng, bệnh không truyền nhiễm(do môi trường không thuận lợi) gây ra.

Triệu chứng bệnh virus bao gồm hai nhóm chính là: Nhiễm hệ thống (còn gọi lànhiễm toàn cây) và nhiễm bộ phận (còn gọi là chết hoại cục bộ) Nhóm nhiễm hệ thốngthường tạo hiện tượng khám lá (ringspot), còn nhóm nhiễm bộ phận thường tạo vết chếtcục bộ (nécrotic local lésion) Một điều cần chú ý là bệnh virus thường có hiện tượng

mất triệu chứng (latent periode) Hiện tượng này đôi lúc gây ra sự nhầm lẫn giữa cây

bệnh và cây khỏe.

2.4.2 Phương pháp cây chỉ thị

Cây chỉ thị thực chất cũng là những cây kí chủ (có thé là cây trồng hay cây dai)nhưng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện bệnh nhanh Đây là một phươngpháp khá chính xác trong nghiên cứu bệnh virus thực vật.

Cây chỉ thị cũng được chia làm hai nhóm: Cây nhiễm bệnh cục bộ (tạo ra các vếtchết trên lá, thân ) và cây nhiễm bệnh hệ thống ( thường tạo ra triệu chứng toàn thânnhư kham lá, biến vàng, lùn cây )

2.4.3 Phương pháp chan đoán bằng hién vi điện tử

Trong tế bao kí chủ, virus thường tạo thành các dang kết tinh vô định hình hoặc cóhình dạng đặc trưng bởi vô số cá thé virus kết hợp với nhau Các tinh thé này không phảilúc nào cũng có thé quan sát thấy, song ta có thể nhuộm màu rồi quan sát đưới kính hiển

vi quang học thông thường với độ phóng đại 80 lần

Phương pháp đơn giản là sử dụng dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay đã đượclàm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lưới đồng dé quan sát trên kính hiển vi điện

tử Đây là phương pháp trực tiếp và đơn giản nhất

— Có thê sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phương pháp xem trực tiếp để phânbiệt trong trường hợp nghi ngờ mẫu lẫn virus khác Phương pháp này giúp ta xác định hai virus là khác nhau trong một mẫu Phương pháp này được gọi là IEM method.

14

— Người ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng Ultramicrotom va nhuộm mẫu được

cắt, quan sát sự hiện diện của virus trong mẫu được cắt.

2.4.4 Phương pháp huyết thanh học

Là phương pháp sử dụng rộng rãi, đặc hiệu và nhanh chóng dé chan đoán virusthực vật.

Ba phương pháp chính thử huyết thanh

— Phương pháp kết tủa: Dựa trên cơ sở hỗn hợp virus và kháng huyết thanh, tạo sựkết tủa trong dung dịch hay trong gel

— Phương pháp liên kết: Trong phương pháp này virus tiêu thé hoặc kháng thé chohấp thụ Phan ứng dương gây nên các tiêu thể lớn liên kết thành khối với nhau, tăngphản ứng virus-kháng thể

— Liên kết miễn địch men

+ ELISA: Thử nghiệm ELISA có nhiều dang, tuy nhiên tất cả đều liên quan đếnđĩa nhựa nhiều lỗ đã được xử lý đặc biệt, do đó bề mặt đĩa sẽ liên kết được với protein

(virus hoặc khang thé) Do tinh dac hiéu, khang thé sé bat cac khang nguyén dac hiéu.

Kế tiếp cho chất nền thích hop vào thi màu sắc sẽ biến đổi nơi có kháng thé gắn vớienzyme được giữ lại trên đĩa, nghĩa là có virus bệnh cần chân đoán

+ DIBA hoặc FIPSA: Phân tích miễn dịch điểm giống như ELISA, nhưng mẫudịch cây được đưa vào từng điểm trực tiếp trong màng nitrocellulose hoặc nylon Mangnày liên kết tất cả protein bao gồm cả virus Sau đó, sự có mặt của virus được xác địnhbằng kháng huyết thanh có gắn với enzyme

2.4.5 Phương pháp chan đoán sinh hoc phân tử

Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, từ năm 1980 các phương pháp sinh

học phân tử đã phát triển mạnh mẽ và mang lại nhiều thành tựu to lớn cho việc chanđoán, phát hiện và nghiên cứu bản chất virus gây bệnh như phương pháp DNA probe,hybridation, PCR Nhờ các phương pháp này chỉ cần với một lượng nhỏ DNA hay RNAthu từ cây chủ, ta có thể khuếch đại chúng lên, qua bản gel điện di ta có thể xác định sựtồn tại của chúng

2.4.6 Các phương pháp khác

Đối với một số loại bệnh cây còn dùng phương pháp hóa học dé chân đoán dựavào sự xuất hiện màu sắc như dùng dung dịch CuSO4 3% dé chân đoán bệnh virusCucumis virus 2.

15

Phương pháp huỳnh quang đề chân đoán mô quả, hạt bị bệnh dựa vào đặc tính của

mô bệnh và của kí sinh vật có khả năng phát sáng trong khi chiếu nguồn tia sáng có đủ

độ đài sóng nhất định (nguồn sáng thường dùng là đèn thạch anh)

Phương pháp đo độ nhớt của dịch cây cũng là phương pháp có thé dùng dé chanđoán bệnh lý của một số trường hợp cây bị bệnh

2.5 Giới thiệu về kỹ thuật PCR, RT-PCR

2.5.1 Kỹ thuật PCR

Vào năm 1985, K Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản để khuếch đạinhanh nhiều bản sao (amplification) của các đoạn DNA mà không qua tạo dòng Kỹthuật này được gọi là polymerase chain reaction, viết tắt là PCR, được hiểu là phan ứngpolymerase dây chuyền (Phạm Thành Hỏ, 2006)

Hỗn phản ứng PCR chứa DNA bộ gen có trình tự mục tiêu, 2 primer

oligonucleotide xuôi và ngược, 4 deoxy nucleoside triphosphat bao gồm dTTP(deoxythymidine triphosphat), dCTP (deoxycytidine triphosphate), dATP (deoxyadenosin triphosphate) va dGTP (deoxyguanosine triphosphate), Taq

polymearase, MgCl2 va Bufer (Nayak va Mani, 2021).

Theo Pham Hùng Vân (2009), về mặt nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt của PCR sẽgồm 3 giai đoạn nhiệt độ:

1 Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94°C, các liên kết hydro sẽ bị phá

vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn

2 Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 — 65°C, các đoạn primer sẽ bắtcặp bé sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu

3 Giai đoạn kéo dai: Nhiệt độ được đưa lên 72°C, Taq polymerase sẽ sử dụng

dNTP dé kéo dai đầu 3’ của primer và tạo ra mạch bồ sung

16