DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHUONG 3. VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP
3.1. Thời gian va địa điểm nghiên cứu Thời gian: Từ 8/2022 đến 12/2022.
Địa điểm nghiên cứu: Phong 204 — Phòng Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu
Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3.2. Vật liệu và hóa chất
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu đối chứng dương là mẫu lá đu đủ có kết quả xét nghiệm dương tính với PRSV,
do Phòng 204 — phòng SHPT, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường,
Đại học Nông Lâm TP. HCM cung cấp.
Mau lá du đủ thực địa được thu tại vườn có tọa độ 10°48'59.4"N 106°21'54.8"E ở Bình Hòa Nam, Đức Huệ, Long An, với số lượng là 30 mẫu.
3.2.2. Hóa chất
Bảng 3.1. lên và trình tự primer dùng trong phan ứng PCR
es Kích thước Noudn
Tên primer Trình tự 5° — 3 (bp) :
Tuo. D và PRSV613F TTGTGTACGACTTCTCACCGAA
613bp ety
PRSV613R CGAATGTCATCCAAAGACTGATGATAAAC eal) PRSV331F TGTGTACGACTTCTCACCGA Ty thiét
331bp kế PRSV331R CTTAACGCACAACTCAGCGTAT
ACTE TGGTCGTACAACTGGTATTG Tự thiết
675bp kế ACTR ACAATGGATGGACCAGACTC
Hóa chat dùng trong ly trích RNA EZ-—10 Spin Column Plant RNA Mini-Preps Kit (BioBasic, Canada), hóa chất dùng trong tổng hop cDNA SensiFAST cDNA Synthesis Kit (Bioline, Anh), hóa chất dùng trong PCR Mytaq TM Mix (Bioline, Anh), hoa chat ding trong dién di GelRedTM loading buffer with Tricolor (TBR, Viét Nam),
HyperLadder TM 100 bp (Bioline, Anh), HyperLadder TM 1kb (Bioline, Anh), TAE 10X (BioBasic, Canada).
18
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: máy ly tâm lạnh Micro 22 R (Hettich, Đức); cân phân tích 4 số PA 219;
tủ cấy vô trùng: máy PCR 2720; máy điện di ngang Mupid One; buồng soi UV;
microwave; tủ lạnh; máy đo quang phô BioDrop; máy lắc ống nghiệm Vortex ZX3; tủ say; nồi hấp khử tring, máy cất nước 1 lần.
Dụng cụ: chày nghiền mẫu chất phòng thí nghiệm; pipetman các loại; eppendorf 0,2 ml, 1,5 ml, 2 ml; đầu tip các loại; ống đong các loại; đèn côn; túi nilon chịu nhiệt;
RNA binding column
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Tach chiết RNA
3.3.1.1. Quy trình ly trích RNA tổng số bằng cột silica
Mau lá được tách chiết và thu RNA tổng số theo quy trình Spin Column Plant RNA Mini — Preps Kit. Suốt quá trình ly trích luôn được dam bao trong điều kiện nhiệt độ phòng, sạch khuẩn, các dau tip được hấp khử trùng và không có DNase va RNase. Quy trình thực hiện gồm các bước:
Bước 1: Cho khoảng 60 mg mẫu lá du đủ vào eppendorf 1,5 ml, thêm 450 uL dung dịch Buffer Rlysis-PG dé ly giải tế bào thực vật, nghiền mẫu trong tube bằng chày nghiền mẫu vô trùng cho đến khi mẫu mịn hoản toàn.
Bước 2: U mẫu đã nghiền ở nhiệt độ phòng trong 5 phút dé tế bào được ly giải
hoàn toàn.
Bước 3: Ly tâm tube trên 12.000 x g trong 5 phút. Sau đó chuyên khoảng 200 pL dịch nổi vào eppendorf 1,5 ml mới.
Bước 4: Thêm 1⁄2 thể tích ethanol (100 uL) vào tube trên va đảo đều nhẹ, nhằm giúp hỗ trợ gắn RNA vào màng hiệu quả hơn.
Bước 5: Chuyên toàn bộ hỗn hợp trên vào spin column (SC). Ly tâm 12.000 x g trong 30 giây ở nhiệt độ phòng. RNA sau khi giải phóng khỏi tế bào được giữ lại trên
cột lọc nhờ lớp màng ái lực với RNA.
Bước 6: Bồ sung 500 uL Universal GT Solution vào SC, ly tâm 12.000 x g trong
30 giây ở nhiệt độ phòng.
Bước 7: Bồ sung 500 uL Universal NT Solution vào SC, ly tâm 12.000 x g trong
30 giây ở nhiệt độ phòng.
19
Bước 8: Ly tâm 12.000 x g trong 30 giây ở nhiệt độ phòng dé cột được khô hoàn toàn. Các thành phần proteins, polysaccarides hoặc các sắc tố màu xanh lá còn sót lại được rửa trôi nhờ muối có trong dung dịch đệm rửa, các dung dịch điệm rửa được bổ sung ethanol giúp loại bỏ lượng muối thừa còn trong cột. Bước này rất quan trọng dé
loại bỏ ethanol thừa.
Bước 9: Dat SC vào eppendorf 1,5 ml mới, thêm 50 nL RNase-free Water, gitr ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Ly tâm 12.000 x g trong 30 giây ở nhiệt độ phòng.
Bước 10: 50 wL dung dịch chứa RNA được lưu trữ -80°C.
3.3.1.2. Xác định nồng độ và độ tinh sạch bằng máy quang phố
Chất lượng RNA được kiểm tra bằng bằng máy đo quang phổ Biodrop (Anh) dé xác nhận nồng độ (ng/uL) và độ tinh sạch Azso/A2so đạt khoảng 1,8 — 2,0 thì sẽ được dùng dé tổng hợp cDNA.
3.3.2. Tong hợp cDNA bằng enzyme phiên mã ngược
RNA sau khi ly trích được dùng cho phan ứng tổng hợp cDNA. Quy trình tổng hợp cDNA được tiến hành theo SensiFASTTM cDNA Synthesis Kit. Quá trình pha trộn mẫu được thực hiện trong tủ ấy vô trùng, RNA và các hóa chất tông hợp luôn được bảo quản trên khay đá dé hạn chế anh hưởng chất lượng mẫu. Phản ứng có tổng thé tích là 10 uL, gồm 2 wL TransAmp Buffer, 0,5 pL Reverse Transcriptase, 2 uL RNA mau ly
trích, 5,5 uL nước DEPC (Biobasic). Phan ứng thực hiện trên may luân nhiệt (Applied
biosystems 2720 Thermal Cycler), diễn ra trong một chu kỳ 25°C — 10 phút, 42°C — 15 phút, 48°C — 15 phút, 85°C — 5 phút, cDNA được ủ ở 4°C sau khi phản ứng kết thúc.
3.3.3. Phản ứng khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng kỹ thuật RT - PCR
Phương pháp RT — PCR dùng dé khuếch đại đoạn gen đặc hiệu nhận biết virus trên khuôn mẫu cDNA, tạo nên số lượng lớn đoạn gen mục tiêu cho bước tạo dòng tiếp theo.
Phan ứng thực hiện trên máy luân nhiệt (Applied biosystems 2720 Thermal Cycler), mỗi phản ứng mỗi phản ứng có thể tích là 25 uL gồm các thành phan: 12,5 pL My Taq mix, 2 uL cDNA, 0,5 pL primer PRSVF (nồng độ 0,2 1M), 0,5 nL primer PRSVR (nồng độ
0,2 uM), 9,5 wL nước DEPC (Biobasic). Chu trình nhiệt độ — thời gian được thực hiện
theo nghiên cứu của Tuo và ctv (2014), gồm 3 giai đoạn: giai đoạn 1: 94°C — 4 phút, giai đoạn 2 gồm 35 chu ky: 94°C — 40 giây, 58°C — 30 giây, 72°C — 1 phút, giai đoạn 3: 72°C
— 5 phút, ủ ở 4°C.
3.3.4. Điện di sản phẩm sau phan ứng khuếch dai và giải trình tự
20
Sau quá trình khuếch đại sản phẩm RT — PCR sẽ được điện di bằng máy điện di ngang Mupid One nhằm kiểm tra kích thước mẫu DNA và được tinh sạch trước khi tạo dòng. Quá trình điện di thực hiện trên gel agarose 1,5% với hiệu điện thế 100 V, trong 30 phút. Sau điện di xong, miếng gel agarose được đưa vào bộ phận soi gel và ghi nhận kết quả.
Đoạn gen đã bắt cặp với primer đặc hiệu được gửi giải trình tự tại Công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa. Sau khi có kết quả, đoạn gen sẽ được kiểm tra độ tương đồng so với các trình tự đã được công bồ trước đó trên Ngân hàng gen NCBI.
3.3.5. Xây dựng quy trình phát hiện virus PRSV bang kỹ thuật multiplex RT-PCR Phản ứng multiplex RT-PCR được thực hiện nhằm phát hiện đồng thời virus PRSV cùng với đối chứng nôi. Đối chứng nội được sử dụng với mục đích kiểm soát quá trình tách chiết RNA, cũng như đảm bảo chất lượng của nucleic acid sau ly trích.
3.3.5.1. Thiết kế primer cho phản ứng multiplex RT-PCR
Sử dụng phần mềm Primer 3 thiết kế các cặp primer cho các cặp gen phản ứng với các thông số thích hợp. Primer sử dụng cho gen đối chứng nội được thiết kế dựa trên trình tự gen actin của đu đủ. Đoạn gen virus đặc hiệu ban đầu (613 bp) của vùng gen P3 được thiết kế ngắn lại thành đoạn gen mới với kích thước từ 300 — 400 bp.
Đề kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer sử dụng trong phản ứng PCR bằng
công cụ BLAST primer.
3.3.5.2. Tối ưu hóa nhiệt độ cho phản ứng multiplex RT-PCR
Thực hiện phản ứng RT — PCR gradient nhiệt độ bắt cặp cho từng cặp primer (virus và đối chứng nội) với thể tích 12,5 pl, chứa 6,25 wL MyTaq Mix (2X), 4,75 uL Nuclease free H2O, 0,25 uL (10 uM) mỗi loại primer xuôi va primer ngược, và 1 pL mẫu cDNA trên máy luân nhiệt (apllied biosystems 2720). Dé xác định nhiệt độ ủ tốt nhất dé khuếch đại chính xác, ngăn chặn các sản phẩm không đặc hiệu, PCR khảo sát nhiệt được thực
hiện với | chu kỳ 94°C trong 4 phút; 35 chu ky: 94°C trong 40 giây; 52 — 62°C trong 30
giây (với mức tăng 2°C mỗi mẫu thử); 72°C trong 1 phút; 1 chu kỳ 72°C trong 5 phút.
Sản phẩm của phản ứng được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose
1,5% trong dung dịch đệm TAE 0.5X trong 30 phút. Gel sau điện di được quan sát trên
đèn UV trong buồng soi gel và ghi nhận kết quả.
3.3.5.3. Tối ưu hóa nồng độ primer cho phản ứng multiplex RT-PCR
21
Dé khuếch đại đồng thời virus và đối chứng nội bang cách sử dụng tổ hop primer (PRSV331-F/R + ACT-F/R), chín phản ứng cho tổ hợp nồng độ primer(0,4 uM; 0,2 uM hoặc 0,1 uM của mỗi cặp môi) (Bang 3.2), các thông số chu kỳ đã được tối ưu hóa.
Đối với multiplex RT-PCR, thành phan phản ứng gồm 6,25 wL MyTaq Mix (2X), 0,4 uM; 0,2 uM hoặc 0,1 1M mỗi cặp môi, 1 uL mau cDNA và còn lai la Nuclease free H2O sao cho tổng thể tích là 12,5 pL. Chu trình nhiệt cho phản ứng gồm: 1 chu ky 94°C
trong 4 phút; 35 chu ky: 94°C trong 40 giây; 52 — 62°C trong 30 giây (với mức tang 2°C
mỗi mẫu thử); 72°C trong 1 phút; 1 chu ky 72°C trong 5 phút trên máy luân nhiệt (apllied
biosystems 2720).
Sản phẩm của phản ứng được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose
1,5% trong dung dịch đệm TAE 0.5X trong 30 phút. Gel sau điện di được quan sát trên
đèn UV trong buồng soi gel và ghi nhận kết quả.
Bảng 3.2. Tổ hợp nồng độ primer cho chin phan ứng
Nong độ primer virus Nông độ primer đối chứng nội (uM)
(uM) 0,1 0,2 0,4 0,1 0,1/0,1 0,1/0,2 0,1/0,4 0,2 0,2/0,1 0,2/0,2 0,2/0,4 0,4 0,4/0,1 0,4/0,2 0,4/0,4
3.3.6. Xây dựng quy trình sample pooling trong nhận dang virus PRSV gay bệnh
đốm vòng trên cây du du
Dựa trên quy trình li trích RNA ở trên, li trích một lượng lớn RNA mẫu lá đu đủ sạch và mẫu lá đu đủ bệnh làm vật liệu và đồng thời làm đối chứng dương và âm trong suốt quá trình thực hiện sample pooling.
Sau khi ly trích tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ (ng/uL) của RNA bằng máy đo quang phố Biodrop (Anh). Sau đó tiến hành pha loãng nồng độ về mức tương
đương 50 + 2 ng/L.
3.3.6.1. Phản ứng multiplex RT-PCR lần 1
Sau khi nồng độ RNA của mẫu đu đủ khỏe và bệnh được đưa về nồng độ pha loãng 50 +2 ng/uL, tiến hành trộn mẫu theo các mức gộp mẫu từ 10 đến 100.000 uL
Phương thức gộp mẫu được thực hiện như sau:
Viniu gop = Ì WL RNA đu đủ bệnh + VRNA du đủ khỏe
22
Bảng 3.3. Thành phần các mức phản ứng (RNA đu đủ bệnh/RNA đu đủ khỏe)
VRNAbệeh — VRNA khỏe VRNAbệenh — V RNA khỏe
V mẫu gộp V mẫu gộp
(uL) (uL) (uL) (uL)
10 1 9 200 1 199 20 1 19 250 1 249 30 1 29 300 1 299 40 1 39 1000 1 999 50 1 49 10000 1 9999 100 1 99 100000 1 99999 150 1 149
Các mức mẫu lớn sau khi chuẩn bị xong, một lần nữa được đo lại nồng độ RNA để đảm bảo rằng các mức mẫu có cùng nồng độ RNA. Sau đó, các mẫu gộp được sử dụng để tiến hành tổng hợp cDNA và tiến hành phản ứng multiplex RT-PCR dé khảo sát mức độ phát hiện virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ.
Song song đó, RNA đu đủ bệnh cũng được pha loãng trong nước sinh học phân tử
(DEPC) ở các mức tương tự như pha loãng trong RNA du đủ khỏe dé kiểm tra sự hiện diện của RNA đu đủ bệnh bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR.
Phương thức thực hiện mẫu đối chứng như sau:
Vv pha loãng — | uU RNA đu đủ bệnh + 'Vnước DEPC
Bảng 3.4. Thành phần của các mức (RNA đu đủ bệnh/nước DEPC)
V RNA bénh V nước V RNA bénh V nước V pha loãng V pha loãng
(uL) (ul) (uL) (uL)
10 1 9 200 1 199 20 1 19 250 1 249 30 1 29 300 1 299 40 1 39 1000 1 999 50 1 49 10000 1 9999 100 1 99 100000 1 99999 150 1 149
23
Các mức sau khi chuẩn bị xong được sử dụng dé tiến hành tổng hợp cDNA, sau đó thực hiện phan ứng multiplex RT-PCR kiểm tra sự hiện diện của RNA đu đủ bệnh.
3.3.6.2. Phan ứng multiplex RT-PCR lần 2
Các sản pham multiplex RT-PCR của các mức mẫu sau quá trình thực hiện phan ứng multiplex RT-PCR trên tiếp tục được sử dụng như là DNA khuôn mẫu dé tiễn hành thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR lần 2 trong việc phát hiện virus gây bệnh đốm
vòng đu đủ.
Kết quả được ghi nhận bằng phương pháp điện di các sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE 0.5X, sử dụng 5 uL sản phẩm PCR và 1 pL GelRed bơm vào từng giếng, điện di trong 30 phút. Gel sau khi điện di được quan sát trên đèn UV trong buồng soi gel.
3.3.7. Phát hiện PRSV trên mẫu thu thập thực địa bằng quy trình sample pooling 3.3.7.1. Phát hiện PRSV trên mẫu thu thập thực địa bằng quy trình sample pooling
30 mẫu lá đu đủ thu thập từ thực địa được ly trích RNA theo hình thức gộp 30 mẫu thành một mẫu và tiến hành kiểm tra nồng độ trước khi thực hiện tổng hợp cDNA. Sau đó thực hiện phản ứng PCR và điện di kiểm tra kết quả.
Sau khi có kết quả điện di gộp 30 thì tiến hành phân 30 mẫu thành 6 nhóm, mỗi nhóm gộp 5 mẫu (nếu kết quả ở trên đương tính), ly trích RNA, tổng hợp cDNA, thực hiện phản ứng multiplex RT—PCR và điện di kiểm tra kết quả.
Nếu trong 6 nhóm có kết quả dương tính thì tiến hành ly trích RNA từng mẫu của nhóm đó, tong hop cDNA và thực hiện phản ứng PCR, điện di kiểm tra kết quả. Nhóm có kết quả âm tính thì có thê kết luận tất cả mẫu của nhóm âm tính.
3.3.7.2. So sánh hiệu quả phát hiện PRSV của phương pháp sample pooling với
phương pháp RT — PCR từng mẫu đơn lẻ
Ly trích RNA 30 mẫu lá du đủ thu thập thực địa, sau đó tổng hợp cDNA, thực hiện phản ứng RT — PCR trên từng mẫu đơn lẻ và điện di dé kiểm tra kết qua. Sau khi có kết qua của hai phản ứng RT — PCR va sample pooling, tiến hành so sánh khả năng phát
hiện virus PRSV.
24