DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHUONG 4. KET QUA VÀ THẢO LUẬN
4.1. Két qua
4.1.1. Két qua ly trich
Mẫu dương được ly trích RNA tổng số sau đó kiểm tra nồng độ va độ tinh sạch bằng máy đo quang phổ trước khi tiến hành tổng hợp cDNA. Nong độ RNA tổng số bằng 110,2 ng/uL và tỉ lệ A260/A280 đạt 2,096 cho thay mẫu RNA đủ tiêu chuẩn tinh sạch và đủ điều kiện tham gia các phản ứng tiếp theo.
4.1.2. Kết quả điện di sản phẩm RT — PCR
Sau khi thực hiện phản ứng RT — PCR, sản phẩm được diện di với thang chuẩn DNA 100 bp dé kiểm tra kích thước.
700bp >
600bp °
100bp ——>
Hình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR đoạn gen mục
tiêu của virus PRSV với cặp primer PRSV613-F/PRSV613-—
R. Thang chuẩn DNA (L), đối chứng âm (giếng 1), mẫu dương (giếng 2).
Theo kết quả điện di sản phâm khuếch đại từ mẫu cDNA trên gel agarose được thé hiện ở Hình 4.1, tại giếng 2 xuất hiện duy nhất một băng sản phẩm ở giữa vị trí băng 600 bp và 700 bp so với thang chuân tương ứng. Sản pham khuếch đại đoạn gen PRSV đúng với kích thước lý thuyết là 613 bp (Tuo và ctv, 2019). Ở vị trí giếng 1 (đối chứng âm) không xuất hiện băng sản phẩm. Kết quả khẳng định rằng cặp primer sử dụng trong
thí nghiệm là đặc hiệu, có sự hiện diện của gen virus PRSV.
25
Sản phẩm khuếch đại từ cDNA của virus đủ điều kiện cho thí nghiệm tạo dòng tiếp theo. Nhưng cần giải trình tự dé khang định chắc chắn đoạn gen khuếch đại là đoạn gen
virus PRSV.
Kết quả so sánh trình tự thu được trên Ngân hàng Gen NCBI cho thấy trình tự của phân đoạn gen khuếch đại được tương đồng ở mức 95,4% với trình tự gen mã sỐ MT470189,1 đã được công bồ bởi Tran va Yeh năm 2020. Điều này cho thay phan ứng PCR được thiết lập trong nghiên cứu này đã khuếch đại đúng phân đoạn gen của virus
PRSV.
4.1.3. Tối ưu hóa nhiệt độ cho phản ứng multiplex RT-PCR
Phản ứng RT-PCR gradient nhiệt độ đã được thực hiện dé xác định nhiệt độ tối ủ tối ưu cho phan ứng multiplex RT-PCR. Trong phản ứng RT-PCR đơn mồi, tat cả các primer hoạt động tốt trong phạm vi nhiệt độ được thử nghiệm (52—62°C).
Hình 4.2 cho thấy, khi nhiệt độ bắt cặp tăng dan thì bắt đầu xuất hiện các băng phụ và độ sáng của các băng phụ tăng dần theo mức tăng của nhiệt độ. Trong kết quả này, nhiệt độ ủ tối ưu cho cả hai cặp primer được xác định là 56°C, vì trong nhiệt độ này, kết qua băng sáng của hai cặp môi đều nhau và ít xuất hiện băng phụ. Chu trình nhiệt tối ưu
cho phản ứng multiplex RT—PCR được xác định là: 1 chu kì 94°C 4 phút, 35 chu kì 94°C 40 giây; 56°C 30 giây; 72°C 1 phút và 1 chu ki 72°C 5 phút.
L1 2 3 4 5 6 7 8
400bp 300bp 100bp
700bp 600bp
L 1 2 3 4 5 6 7 8
TOBHp—* | _— 9. HN
4.1.4. Tối ưu hóa nồng độ primer cho phan ứng multiplex RT-PCR
Đối với sự kết hợp các nồng độ primer khác nhau của hai cặp môi, hiệu quả khuếch đại PRSV và đối chứng nội là khác nhau.
Kết quả Hình 4.3 cho thấy khi nồng độ primer của virus cao hơn nồng độ primer
của đôi chứng nội thì băng sáng ở vị trí khuêch đại của virus sáng hơn của đôi chứng
27
nội và ngược lại. Điều này có thể là do sự cạnh tranh của các primer với nhau, nồng độ primer thấp dẫn đến hiệu quả bắt cặp kém làm giảm khả năng khuếch đại, nên khi điện di sẽ xuất hiện băng mờ và ngược lại, khi nồng độ môi cao thì kha năng khuếch đại cao và kết quả điện di sẽ cho băng sáng rõ. Kết quả sản phẩm sau khi điện di ở các mức nồng độ khác nhau cho thấy khi nồng độ primer cân bằng nhau là 0,2 uM với PRSV;
0,2 uM với đối chứng nội cho kết quả sáng , đều và đẹp nhất.
L123 4 5 6 7 89
700bp
600bp———*
300bp———* — en an Ge Ge = SE ce
Hình 4.3. Tối ưu hóa nồng độ của hai cặp primer được sử dung cho phản ứng multiplex RT-PCR của PRSV và đối chứng nội. Sản phẩm khuếch đại của PRSV và đối chứng nội được biểu thị bằng các kích thước tương ứng 331bp và 675bp. Thang chuẩn DNA (1); (1) 0,4: 0,1; (2)
0,4: 0,2; (3) 0,4: 0,4; (4) 0,2: 0,4; (5) 0,2: 0,2; (6) 0,2: 0,1; (7) 0,1: 0,4; (8) 0,1: 0,2; (9) 0,1: 0,1
4.1.5. Xây dựng quy trình sample pooling trong nhận dạng virus PRSV gây bệnh
đốm vòng trên cây đu đủ
Nhằm kiểm tra sự hiện điện của RNA đu đủ trong các mẫu sample pooling ở các mức mẫu gộp, thí nghiệm kiểm tra virus trên mẫu pha loãng RNA đu đủ bệnh trong nước DEPC tương ứng với các mức mẫu gộp đã được tiến hành và thu được kết quả như
Hình 4.4.
28
700bp
600bp———‡
300bp
Hình 4.4. Kết quả điện di sản pham RT-PCR kiểm tra virus PRSV trên mẫu RNA đu đủ bệnh pha loãng với nước DEPC ở các mức. Thang chuẩn DNA (L); (+) đối chứng dương; (—) đối chứng âm; 1: 10; 2: 20; 3: 30; 4: 40;
5. 90; 6: 100; 7: 150; 8: 200; 9: 250; 10: 300; 11: 1000; 12: 10000; 13:
100000.
Kết quả kiểm tra phát hiện PRSV ở các mức pha loãng RNA đu đủ trong nước DEPC ghi nhận các đoạn khuếch đại tương ứng với vị trí đoạn khuếch đại sản phẩm mẫu đối chứng dương của virus và đối chứng nội ở tất cả các giếng thuộc các mức pha loãng từ 10—10.000 lần. Điều này đã chứng minh rằng: trong mẫu gộp, cho dù số lượng mẫu đu đủ bệnh thấp hơn nhiều lần (<=10.000 lần) so với RNA của mẫu đu đủ khỏe (trong điều kiện cùng nồng độ) thì lượng RNA của đu đủ vẫn đủ dé thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mục tiêu.
Tiếp theo, dé tiến hành khảo sát mức độ phát hiện virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ bằng phương pháp sample pooling (phương pháp mẫu gộp), thực hiện song song thí nghiệm tương tự đối với các mức mẫu gộp mà ở đó RNA đu đủ bệnh được pha loãng
trong RNA đu đủ sạch.
Tiến hành pha loãng các mẫu RNA bệnh và RNA đu đủ khỏe về cùng một khoảng nồng độ, sau đó gộp thành các mức mẫu khác nhau và các mức mẫu sẽ được đo lại nồng
độ.
29
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra nồng độ RNA mẫu gộp (RNA đu đủ bệnh và RNA đu đủ
khỏe).
V§ập mẫu Nồng độ RNA (ng/pL) mất Nông độ RNA (ng/uL)
10 51,1 200 50,1 20 50,3 250 49,3 30 51,0 300 51,4 40 50,3 1000 50,6 50 49,3 10000 49,3 100 51,2 100000 49,8 150 50,3
Sau khi kiểm tra nồng độ RNA ở các mức mau gộp khác nhau có kết quả dao động ở mức 49,3 ng/L với 51,4 ng/uL. Các mẫu gộp sẽ được thực hiện phản ứng multiplex
RT-PCR với các cặp primer đặc hiệu.
Kết qua multiplex RT-PCR lần 1 thể hiện ở Hình 4.5 cho thấy sự xuất hiện của các băng sáng tương ứng với vị trí băng sản phẩm mẫu đối chứng dương của virus và đối chứng nội ở các mức pha loãng 10 —1000. Nhận thấy khi pha loãng, trong mẫu gộp, dù số lượng RNA đu đủ bệnh thấp hơn nhiều lần (<=1000 lần) so với RNA mẫu du đủ sạch (trong điều kiện cùng nồng độ) thì lượng RNA của du đủ bệnh vẫn đủ đề thực hiện phan ứng khuếch đại đoạn gen mục tiêu. Như vậy, nồng độ RNA mẫu du đủ bệnh (50,1 ng/uL) đủ đề thực hiện phản ứng khuếch đại khi được pha loãng 1000 lần với RNA đu
đủ sạch và không phát hiện được virus khi pha loãng ở mức 10.000 và 100.000. Giới
hạn phát hiện này cao hơn so với các mức mẫu gộp pha loãng với nước cất. Kết quả này có thê giải thích như sau: khi pha loãng RNA mẫu bệnh trong RNA mẫu sạch, sự hiện diện số lượng lớn RNA sạch có thể gây cản trở sự bắt cặp của primer với đoạn gen mục
tiêu, ức chê sự khuêch đại của đoạn gen mong muôn.
30
700bp 600bp ——>
300bp ———*
|
Hình 4.5. Kết quả điện di san phẩm multiplex RT-PCR kiểm tra virus PRSV trên mẫu sample pooling ở các mức pha loãng (a) lần 1 (b) lần 2.
Thang chuẩn DNA (L); (+) đối chứng dương; (~) đối chứng âm; 1: 10; 2: 20;
3: 30; 4: 40; 5: 50; 6: 100; 7: 150; 6: 200; 9: 250; 10: 300; 11: 1000; 12:
10000; 13: 100000.
Các đoạn gen mục tiêu tồn tại trong sản phẩm PCR lần 1 có thé tiếp tục nhân lên thông qua 1 phản ứng multiplex RT-PCR với đầy đủ các thành phan phản ứng. Vì vậy, sản phẩm của multiplex RT-PCR lần 1 sẽ được tiếp tục sử dụng làm khuôn mẫu dé tiến hành PCR lần 2. Kết quả điện di sản phẩm multiplex RT-PCR lần 2 trong Hình 4.5 cho thấy, xuất hiện các băng sáng ở các mức pooling từ 10 —1000 có kích thước tương đồng với kích thước sản phẩm của đối chứng dương virus và đối chứng nội. Kết quả cho thấy không xuất hiện sản phâm khuếch đại ở mức 10.000 và 100.000. Điều nay khang định rang, nồng độ RNA đu đủ bệnh (50,1 ng/uL) du dé thực hiện phan ứng khuếch đại được pha loãng 1000 lần với RNA đu đủ sạch và không phát hiện được virus PRSV khi pha loãng ở mức 10.000 và 100.000 lần.
Qua các thí nghiệm được tiến hành nhận thay rang ở các mức mẫu gop thấp, băng sáng rõ, chỉ xuất hiện băng mờ ở mức pha loãng cao là 1000 lần. Điều này có thể được giải thích là do ở các mức mẫu thấp thì nồng độ RNA đu đủ bệnh sẽ cao hơn đối với các
31
mức mẫu lớn và ngược lại. Vì vậy, khi thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR, các đoạn gen mục tiêu trong mẫu RNA du đủ bệnh sẽ được khuếch đại lên số lượng nhiều hơn, đồng thời sự cản trở của RNA đu đủ khỏe cũng ít hơn so với các mức mẫu lớn và ngược lại. Nồng độ RNA đu đủ bệnh càng cao và bị RNA đu đủ khỏe cảng trở ít thì băng càng sáng và ngược lại. Vì vậy băng điện di có xu hướng mờ dần ớ các mức mẫu lớn. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Minh Lệ (2020), kết quả nghiên cứu phát hiện được DNA khoai mì bệnh trong mẫu DNA pooing ở mức mẫu gộp 2000 bằng kỹ thuật Multiplex — PCR và có kết qua băng mờ dần ở mức mẫu DNA pooling lớn. Thêm vào đó, Danh Hiếu (2021) cho kết quả phát hiện virus gây bệnh khảm trên cây cà chua khi thực hiện phương pháp sample pooling trên mẫu RNA cà chua, qua 2 lần phản ứng PCR kết luận rằng ngưỡng phát hiện virus gây bệnh lên đến mức pha loãng 300 lần với mẫu RNA cà chua sạch. Kumar và ctv (2010) tiễn hành nghiên cứu VỀ virus gây bệnh khảm trên cây cà chua cho kết quả phát hiện virus kham ca chua ở mức pha loãng 10°
với RNA ca chua sạch. Kết quả này có thé được giải thích rằng, việc kiểm tra giới han phát hiện của mẫu mục tiêu phụ thuộc nhiều vào loại mầm bệnh, tải lượng mam bệnh trong mỗi mẫu và độ nhạy của xét nghiệm phát hiện, do đó phải xác nhận riêng biệt từng trường hợp. Nhìn chung, các xét nghiệm có độ nhạy và độ đặc hiệu tốt hơn khi số lượng mẫu trên mỗi nhóm thấp vì các mẫu pha loãng lớn hơn có thé tạo các ức chế phản ứng
hoặc làm loãng mục tiêu dưới ngưỡng phát hiện (Tara va ctv, 2020).
4.1.6. Phát hiện PRSV trên mẫu thu thập thực địa bằng quy trình sample pooling 4.1.6.1. Phát hiện PRSV trên mẫu thu thập thực địa bằng quy trình sample pooling
Sau khi xây dựng thành công quy trình sample pooling va multiplex RT-PCR, tiến hành áp dụng quy trình đã xây dựng được phát hiện virus PRSV trên 30 mẫu đu đủ thu
thập thực địa.
Đầu tiên, tiến hành kiểm tra PRSV với hình thức gộp tổng 30 mẫu đu đủ thực địa.
Kết quả điện di Hình 4.6 xuất hiện băng sáng tại vị trí khuếch đại tương ứng với vị tri khuếch đại của đối chứng dương, cho thấy rằng trong số 30 mẫu đu đủ thu thập thực địa có mẫu đương tính với virus PRSV.
32
700bp 600bp 300bp
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm
multiplex RT-PCR ở mức gộp 30 mẫu. Thang chuẩn DNA (1); ); (+) đối chứng dương; (—) doi chứng âm; (T) 30
mau.
Nhằm thuận tiện cho việc xác định mau du đủ dương tính cụ thé, tiến hành sang lọc bằng cách phân nhóm, cụ thể là phân thành 6 nhóm trong đó 5 mẫu cùng một nhóm.
Kết quả Hình 4.7 cho thấy nhóm 2 và 6 xuất hiện băng sáng tại vị trí khuếch đại tương ứng với vị trí khuếch đại của đối chứng dương, chứng tỏ rang trong 2 nhóm nay có mẫu dương tính với virus PRSV. Như vậy, có thê loại bỏ nhóm 1, 3, 4, 5 vì cho kết quả âm
tính.
L + - -| tH th IV V VI
700bp_ „
600bp———>
300bp ——>
Hinh 4.7. Kết quả điện di san phẩm multiplex RT-PCR ở mức
gộp 5 mẫu. Thang chuẩn DNA (L); ); (+) đối chứng dương; (-) đối chứng âm; (1) nhóm 1 (mẫu 1-5) (2) nhóm 2 (mẫu 6— 10) (3) nhóm 3 (mẫu 11—15) (4) nhóm 4 (mẫu 15-20) (5) nhóm 5 (mau 21-25) (6)
nhóm 6 (mẫu 26-30).
33
Tiếp theo, tiến hành kiểm tra virus cho từng mẫu trong nhóm 2 và 6. Kết quả ở Hình 4.8 cho thay mẫu số 9 trong nhóm 2 và mẫu số 27 trong nhóm 6 xuất hiện băng sáng tại vị trí khuếch đại tương ứng với vị trí khuếch đại của mẫu đối chứng đương, còn các mẫu còn lại thì không. Có thê kết luận rằng, trong tổng số 30 mẫu đu đủ thu thập thực địa thì có 2 mẫu dương tính với virus PRSV, đó là mẫu số 9 và mẫu số 27, các mẫu còn lại thì cho kết quả âm tính.
L + - 6 7 8 9 10 26 27 28 29 30
— — — Mm am ——— ee —
600bp——> sam —_—
300bp——> — = — —
Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm multiplex RT-PCR các mẫu riêng lẻ của nhóm 2 và 6. . Thang chuẩn DNA (L); (+) doi chứng dương; (—) đối
chứng âm; (1 — 5) mẫu thực địa 6 — 10; (6 — 10) mẫu thực địa 26 — 30.
4.1.6.2. So sánh hiệu quả phát hiện PRSV của phương pháp sample pooling với
phương pháp RT - PCR từng mẫu đơn lẻ
Quy trình sample pooling xây dựng được đã phát hiện được 2 mẫu dương tính với PRSV trong tổng số 30 mẫu du đủ thực địa. Kết quả hoan toàn trùng khớp với kết qua PCR phát hiện PRSV cho từng mẫu riêng lẻ (Hình 4.9).
Tuy nhiên, so với phản ứng PCR phát hiên bệnh cho từng mẫu riêng lẻ thì quy trình sample pooling phát hiện ra mẫu dương tính chỉ thông qua 17 phản ứng, giúp tiết kiệm được thời gian, chi phí, công sức hon so với phản ứng PCR từng mẫu riêng lẻ phát
hiện PRSV thông qua 30 phản ứng.
34
700bp
600bp———*
300bp ——>
L + - 11 12 13 1415161718 19 20
700bp
600bp———*
300bp———*
+ - 2122 23 2425 26 27 28 29 30
700bp 600bp 300bp
35
4.2. Thảo luận
Đã khuếch đại và ứng dụng thành công đối chứng nội trong việc kiểm soát chất lượng và quy trình tách chiết nucleic acid với đoạn gen được sử dụng là DNA của đu đủ và có kích thước đoạn gen khuếch đại là 675 bp.
Đã tối ưu hóa thành công quy trình multiplex RT-PCR với chu trình nhiệt tối ưu
là: 1 chu kì 94°C 4 phút, 35 chu ki 94°C 40 giây; 56°C 30 giây; 72°C 1 phút va 1 chu kì
72°C 5 phút và nồng độ primer tối ưu được xác định là 0,2 uM của virus và 0,2uM của đối chứng nội. Quy trình sample pooling cũng đã được xây dựng thành công với mức mẫu gộp là 1/1000 (1 mẫu bệnh trong 999 mẫu khỏe), mức gộp này thấp hơn so với thí nghiệm pha loãng với nước (<=10.000 lần), có thể là đo khi pha loãng RNA mẫu bệnh trong RNA mẫu khỏe, khi thực hiện phản ứng PCR thì DNA của mẫu du đủ khỏe gây cản trở sự bắt cặp của cặp primer virus là ức chế sự khuếch đại đoạn gen mong muốn.
Kết quả thử nghiệm phát hiện virus trên 30 mẫu đu đủ thu thập thực địa của phương pháp sample pooling (gộp mẫu) giống với kết quả phát hiện PRSV của phương pháp RT-PCR cho từng mẫu đơn lẻ, đều phát hiện 2/30 mẫu đu đủ dương tính với PRSV.
Tuy nhiên, phương pháp sample pooling giúp tiết kiệm thời gian, chí phí, hóa chất, công
sức hơn (qua 17 phản ứng) so với phương pháp RT-PCR cho từng mẫu (qua 30 phản ứng). Điều này có ý nghĩa trong việc phát hiện bệnh sớm trên đu đủ, từ đó đưa ra các bệnh pháp điều trị cũng như phòng ngừa tránh phát triển thành dịch bệnh nhằm giảm chi phí, nâng cao năng suất, chat lượng cây trồng cho người nông dân. Từ đó, nghiên cứu đưa ra các biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh kịp thời cho các vườn đu đủ.
Dựa vào kết quả của thí nghiệm trên, nghiên cứu đã xây dựng được quy trình mẫu gop để nhận dạng và phát hiện virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ qua 2 lần thực hiện
phản ứng multiplex RT— PCR trên mau gop ở mức 1/1000 (1 mẫu bệnh trong 999 mẫu khỏe). Quy trình mẫu gộp gồm:
Bước 1: Ly trích RNA
Bước 2: Pha loãng RNA về cùng nồng độ (50+ 2 ng/uL)
Bước 3: Mẫu gộp RNA (1mẫu bệnh/mẫu khỏe, số mẫu < 1000 mẫu) Bước 4: Tổng hợp cDNA
Bước 5: Phản ứng multiplex RT — PCR
Bước 7: Điện di kiểm tra kết quả
36