Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Nhân giống cây khoai lang nhật (Ipomoea batatas L.) sạch bệnh Sweet Potato Feathery Mottle Virus (SPFMV) bằng phương pháp nuôi cấy mô

TÓM TẮTTừ nguồn vật liệu khởi đầu đã sàng lọc sạch bệnh virus Sweet Potato Feathery MottleVirus SPFMV đã nhân giống được cây khoai lang Nhật sạch bệnh SPFMV bằng phương pháp nuôi cấy mô.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

-KHOA -KHOA HỌC SINH HỌC

NHÂN GIONG CAY KHOAI LANG NHẬT (Ipomoea batatas L.) SACH BENH Sweet Potato Feathery Mottle Virus (SPFMV) BANG

PHƯƠNG PHAP NUÔI CAY MO

Nganh hgc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện : LE HOANG VAN KIM

Mã số sinh viên : 18126072

Niên khóa :2018 - 2022

TP Thủ Đức, 08/2023

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

-KHOA -KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

NHÂN GIONG CAY KHOAI LANG NHẬT (Ipomoea batatas L.) SACH BENH Sweet Potato Feathery Mottle Virus (SPFMV) BANG

PHƯƠNG PHAP NUÔI CAY MO

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS HUỲNH VĂN BIẾT LÊ HOÀNG VẠN KIMThS NGUYEN THỊ VÂN KHANH

TP Thu Đức, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Trước hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu và quý Thầy Cô của

trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, những người đã luôn quan tâm,

dạy bảo, truyền thụ cho em những kiến thức quý báu trong suốt 4 năm Đại học cũngnhư trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Huỳnh Văn Biết — là Cố van học tập

cũng như Hướng dẫn khoa học, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện

tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này

Em xin xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thạc sĩ Nguyễn Thị Vân Khanh, là Hướng

dẫn khoa học đã tận tình hướng dẫn quan tâm, lo lắng, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện

cho em dé có thé hoàn thành khóa luận tốt nghiệp nay

Em xm chân thành cảm ơn anh Lê Hoàng Độ thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh

học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉbảo, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian em thực hiện và

hoàn thành khóa luận nay.

Em xin cảm ơn tap thể lớp DH18SM đã đồng hành và giúp đỡ em trong suốt thời gian

học tập và nghiên cứu.

Cuôi cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đên gia đình, người thân, bạn bè, nhât là ba

mẹ những người đã luôn ủng hộ, động viên, tạo mọi điêu kiện tôt nhât cho em trong

suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên là Lê Hoàng Van Kim, Lớp DH18SM thuộc ngành Công nghệ Sinh hoc ,Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa luận tốt

nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là

hoàn toản trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội

đồng về những cam kết này

Tp, Ho Chi Minh, ngày tháng năm

Người việt cam đoan (Ký và ghi rõ họ tên)

TÓM TẮT

Từ nguồn vật liệu khởi đầu đã sàng lọc sạch bệnh virus Sweet Potato Feathery MottleVirus (SPFMV) đã nhân giống được cây khoai lang Nhật sạch bệnh SPFMV bằng

phương pháp nuôi cấy mô Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy phương pháp khử

trùng cho vật liệu khởi đầu đối với cồn 70° trong 40 giây kết hợp với HgCla 0,1%

trong 9 phút cho kết qua tốt nhất, đối với NaOCl (Javel) 5% trong 20 phút là phù hợp

nhất Tuy nhiên khuyến khích xử lý bằng Javel vì chồi sẽ phát triển tốt hơn và ít độchai hơn cho con người Môi trường nhân nhanh chồi phù hợp nhất là môi trường MS

có bé sung BA | mg/l, 20 g saccharose, 7 g agar với số chồi trung bình cao nhất (2,33lần) sau 2 tuần nuôi cấy Môi trường MS có bồ sung 0,3 mg/1 NAA , 0,5 mg/l GA3, 20

g saccharose, 7 g agar cho hiệu quả tốt nhất cho giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh của cây

hơn so với khi chi sử dung môi trường có bồ sung NAA Sau 3 tuần nuôi cấy, cây đạtchiều cao 3,2 em, 5,73 ré/cay, ré dai 4,8 cm

Từ khóa: khoai lang Nhật, nuôi cấy mô, sạch bệnh SPFMV

1H

From the starting material source were screened for virus Sweet Potato Feathery Mottle Virus (SPFMV) that has propagated Japanese sweet potato by tissue culture method The research results of the topic show that the sterilization method for the starting material with 70° alcohol solution for 40 seconds combined to HgC]› 0,1% for

9 minutes is the best result, with NaOCl (Javel) 5% for 20 minutes is the most suitable However, the samples treated with Javel that is encouraged to use because shoots will grow better and it is less toxic to humans The most suitable multilication medium is

MS medium added to 1 mg/l BA, 20 g of saccharose, 7 g of agar with the highest average amount of buds (2,33 times) after 2 weeks of culture MS medium has

additional 0,3 mg/l NAA, 0,5 mg/l GA3, 20 g of saccharose, 7 g of agar that was the best effect in the period of complete plant formation than when used the medium has only additional NAA After 3 weeks of culture, the plant reaches a height of 3,2 cm, 5,73 roots/a plant, roots long 4,8 cm.

Key words: Japanese sweet potato, tissue culture, virus SPFMV free.

1V

MỤC LỤC

LOL CAM 09007 iXÁC NHAN VA CAM ĐOAN -5- 5222 1221221212121212122222212 re ii

¡my — ,ÔỎ iii

2.1 Giới thiệu khái quát về cây khoai lang - 2 2 22222+2E+2EE2EE22E+22E2EErzrrerrees 32.1.1 Nguồn gốc của cây khoai lang 2-2 2©22+2E2EE2EE2EEEEE2EE2EE22E2EEEEEErerrres 3

D100: PRE OAT sssssesessssytssi28:Ezotaoisliesggits:lingioiosgigzsgttgrgiliso2gioônttilcbibutrssẢngSùimiSư2ftb2dTirngiao.lozoiEsE 3

2.1.3 Đặc điểm thực vật, sinh trưởng và phát triển của cây khoai lang 42.1.3.1 Đặc điểm thực vật 2-5222 2122121221221212121121121112112111212111212212 211 xe 4

2.1.3.2 Đặc điểm sinh trưởng va phát triển 2: 222222222222E2E22EE22E22222222222zzxe2 4

2.1.4 Nguồn gen giống khoai lang trên thế giới và Việt Nam - 2-2222 552: 42.1.5 Các giống khoai lang Nhật được trồng ở Việt Nam - 2-22 52+sc2zczzczzczez 5

2.1.5.1 HLS18 (Ni 1i ƯĂẶẳặäaăẽ-.‹-‹:4 5 2.1.5.2: KOKEY 14 (Nhat Vai) ccoceverrerenvevensssmunr ere nsceannnmenvareeneracsnee 5 2.1.5.3 MURASA KIMASARI (Nhật tim) - 2c 2-22 212222 re 5 2.1.6 Các nghiên cứu trong va ngOải HƯỚC - + - + 5+ 2+2 2+ SE ri 6

2.2 So luge V6 nUGi CAY M6 An a4‹175 62.2.1 Lich str ni CAY M6 8n -.ẢdA4,.DH) 62.2.2 Các phương pháp nuôi cấy 06 o eccceesecceccecssessessesseeeseeseessecsecsssesecsecseeseeseeeseeees 72.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng -22-©22522222222E222E+2EE222E22E 22x22 cErrrrrrrrrree 7S171, TM di TH GNsnuaerratorriiigaktigHBAGGGRIGHGGIEDDSSGEIHNRSES01 200100006) 7

2.2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn 2-©22222222212211221122112211221121112112211211211211 1 xe 72.2.2.4 (of áo )0L nni 82.2.2.5 Nuôi cây hạt phan sescccccscacsssesesecsnunssscansscesseesvesmnaesneanusemcnsnenecuenewense 82.2.3 Lợi ích của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô -2- 2522552: 82.2.4 Các bước nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô 2 252+5222z+zz>22 §2.2.4.1 Chọn vật liệu và cấy +- 2+ ©222222212221221221122127112112712112112211211 21121 ee 81.4/13 NHÊn BhữrnesnonnesernnotontrnottsoprgtigEgoidigtitgfiSiNnsgiothto/gHSEMERGS0BGĐMGSEGgkESE 8

LEE |“ 9

2.2.4.4 Trồng cây mô ra đất 2-22: ©22222222E22221221122112711271127112111211211211 221 xe 92.2.5 Các yêu tố ảnh hưởng trong nhân giống bang cây nuôi cấy mô 102.2.5.1 Lựa chọn mẫu cấy Lapsorststt0rblzBgSESSG/ENHIG19609E0TGDHB90NSDESGBEOSIDRSSGIDHEDSG2DNRESIEDGUIBGHIEIGRSĐMGE 102.2.5.5 Điều kiện nuối AY nnnnnnnornnnnnen-nannenernnnenesrannprenananpnanennnenennuanncensncorennmnceeneynin 102.2.6 Chất điều hòa sinh trưởng thưc vật - 2 52222222222222E2222E222EzEzrrrrev 11

Di DiG l < LAI Tlc¿sszsstbeseg120185850.4.0085g58 10 gsEf SB 48.đ80.0505aS0-g8.E9340-4832Hg50)7013825DL234E058130158-u8iL6AS4nh20gaisa0nx2 11 2.2.6.2 00s n7 12

2.2.3 Các phương pháp nhân giống invitro sạch bệnh - 2 2 225222z22z2222522 122.2.3.1 Phương pháp chan đoán bệnh virus 2 ¿+22+2+2E+2E+2E2E22E2Ez22zzzzzze2 12

7.2.3.7 Phong pháp Xử lý HHIẾT: sceecasiieiieiiieiilnesnnD dinavesnonaissllainemesivabioaamitewosentices 12

2.2.3.3 Phương pháp nuôi cấy mô phân sinh - 22 22©222222222222EE222Z222zz+zzcez 122.2.3.4 Nuôi cay mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý nhiệt - 2-2-5 122.3 Giới thiệu về virus SPFMV và bệnh virus SPEMV 2- 52 2252+E22z+£zzzzcsd 13

2.3.1 Virus Sweet Potato Feathery Mottle ÏÏiTIS - 55c se s+k+esseeeersererers 13

2.3.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo 22 S22S22E22E2E22522122121212112122 1122 xe, 131.371 Where ie te gauethaneioaaatitooiotiiiestggfGCGSEDSGGS0NGIGP.EG00000080S2NG 13

2.3.2 Bénh virus chan chim hai khoai lang — Sweet Potato Feathery Mottle Virus

(12 1S) a 13 2.3.2.1 Triệu chứng bệnh - ¿+52 2++ 22223 22E2E 2552125521 25521 2121211111111 E1.rke 13 252.2, Neuyensnhaniedy bend ;:czzcssisiess g9 12460002935040)G0G3E1SA050SE-SICBEEMGOG SLES3E026)813548 13

2.4 Các phương pháp phát hiện và chân đoán virus -2 22©22+72z22+22zzzzz2 14

2.4.1 Polymerase Chain Reaction (PCR) va Reverse Transcription Polymerase Chain

1051000 0050.900155 -. - 14

2.4.2 Phương pháp chân đoán bằng miễn dịch gắn enzyme (ELISA) - 14

VI

2.4.3 Phương phá đa hình các đoạn giới han —Restriction fragment length

9À/010390113589 3060211012515 — 15CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - -©22c2ccccccsscccxe 163,1 Thôi gins wails điểm eee eitinomananancneereoneremmmmmemaces 16

Sl lho tan tS DIE CW ics cocrresseseeeenmenceameneneansenue urea eee 16

eae | ee 16

3.5 Vật liệu nghiên CHU và phượng pháp nghiền COU src cccnnssnncnnscanincacnnaancamncsnernmnancnnes 16

Vet BŸ haseeassariaertootrontdstoctiSGGISIRGILS0G0004407G.022/GISTSNGi01A10-E 16

3.22, Phường phap HNghiÊH:GỮU sscsssessssesesiissnriirnesvisiiEiESnigtgitalg015S000103000005G0G090831558000GG12088 16

3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Kiểm tra cây sạch bệnh SPFMV bang kỹ thuật RT-PCR l63.2.2.2 Thí nghiệm 2: Tạo vật liệu khởi đầu invitro sạch bệnh SPFMV 18

3.2.2.3 Thi nghiệm 3: Tạo môi trường nhân nhanh chồi thích hợp cho cây khoai lang

3.2.2.4 Thi nghiệm 4: Tạo ra môi trường ra rễ thích hợp cho cây khoai lang Nhật dé

tao cay hoan Chimh D0 21

3.2.2.5 Thi nghiệm 5: Ảnh hưởng của môi trường có bồ sung 0,3 mg/l NAA va GA3

đôi với sự phát triên rễ của cây khoai lang Nhật - - - 552cc ++csererrerrrrrrke 22

3.3 Xử lý số liệu ¿- -222222212211211211211211211211211211211211211211211211211211211212 2 xe 24

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN - 2 2252+E2E2E2E22E22E22E2Eezree 25

4.1 Thí nghiệm 1: Kiểm tra cây sạch bệnh virus SPFMV bằng ký tHUẬ zsesse 25

dS Ka Cee eee eee ee ee ee es ee ee 25

4.2 Thi nghiệm 2: Tạo vật liệu khởi 0/1077 2)4.2.1 Kết quả khi xử lý khử trùng bang dung dịch HgC]s 0,1%% 5-52: 254.2.2 Kết quả khi xử lý khử trùng bang dung dich NaOCl (Javel) 5% - 264.3 Thí nghiệm 3: Tạo môi trường nhân nhanh chồi thích hợp cho cây khoai lang Nhật

ee ee 28

4.4 Thi nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự phát triển rễ của cây khoai

lang Nat eee 29

4.5 Thi nghiệm 5: Ảnh hưởng của môi trường có bồ sung 0,3 mg/l NAA và GA3 đốivới sự phát triển rễ của cây khoai lang Nhật - ¿©22©522222E22E22E22E222222222x2zce2 31CHUONG 5 KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ - 2 22522222E2E22E22E22E222222222.2xe2 33

A b6 , TT 33

vil

TÀI LIEU THAM KHẢO -2-2222222+2EEEEEEE.EEEEtrrrrrrrrrrrrrrrrrrr.34

PHU LỤC -22222222222211112222211112222211222222 122222222 eerree

vill

DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT

NAA : 1-naphthaleneacetic acid

RNA : Ribonucleic acid

pl : microlit

1X

DANH SÁCH CÁC BANG

Bang 3.1 Khao sát ảnh hưởng của nồng độ HgCh 0,1% đến hiệu quả khử tring chồi ở

các khoảng thời gian khác nhau - 552 +3 SE TH ng ng ng như 19

Bảng 3.2 Khảo sát anh hưởng của nồng độ NaOCl (Javel) 5% đến hiệu quả khử trùngchỗồi ở các khoảng thời gian khác nhau -. 2: 22©2222S22E22EE£EE2EE£EE2EEzEEezErzrxrres 20

Bảng 3.3 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 3 5 5555 £+*£+£+v+vrerrerrrres 21 Bảng 3.4 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 4,-0.0 eee eee eeeeeceeeeeeeeeeeeeeeeneeeeaees 22

Bang 3.5 Các nghiệm thức trong thí nghiệm Š - eee ceeceeceeeeeeeeeeeeeee 23

Bang 4.1 Kết quả khử trùng chổi khoai lang sau hai tuần nuôi cấy với nồng độ HgCh

0,1% ở các khoảng thời gian khác nhau eee - 22+ 2+ *++E£+£vEzxEreErrrerrrrrrrrrrrerrke 26

Bảng 4.2 Kết quả khử trùng chỗi khoai lang sau hai tuần nuôi cấy với nồng độ NaOCl

(Javel) ở các khoảng thời gian khác nhau 2 + 322 E SE ESEEsekerkrrrrerkrrerek 26

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của BA đến hệ số phát sinh chi, chiều cao trung bình chồi của

Gây Khoai lang ND At sa eeasesseseiennidiiinndsiiidSELEE13905883E5E9991830-08114001900531856//40102/18180148 28

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến số rễ, chiều dài rễ và chiều cao của cây

KÍỚấI, lati: NIE se cra csssnasnsnsun ng Gà Gia dán chà be angi 3RESEES3À48LiG SiuSg38258GL254.G130-48E0255 518338384885 30

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của môi trường có bổ sung 0,3 mg/1NAA và nồng độ GA3 đến

số rễ, chiều dai rễ và chiều cao của cây khoai lang Nhật -2- 255 52+55s>5+ 31

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình ảnh cay khoái lato si ccsseniii-kkiiana si th 2n Hà E4 GHẾ SE thú G4 H382 4840984:88 3

Hình 4.1 Kết qua RT-PCR phát hiện SPEMV 2.25-222222222-.EEE.cccee 25Hình 4.2 Mau được khử tring bằng Javel 5% va HgCl›; 0,1% sau 2 tuần a7Hình 4.3 Chồi khoai lang sau 2 tuần nuôi cấy -2- 2 2 2+2++2++2++zzzzxzzxzzxczxez 29Hình 4.4 Rễ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy ở thí nghiệm 4 2- 22222222222 30Hình 4.5 Rễ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy ở thí nghiệm 5 2: 225225522 32

XI

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ở Việt Nam, khoai lang là cây lương thực truyền thống đứng thứ 3 sau lúa, ngô Theo

Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, sản lượng thu hoạch của khoai lang hàngnăm của cả nước dao động trong khoảng 1,2 đến 1,5 triệu tan Một trong những giống

khoai lang có triển vọng sản xuất lớn là khoai lang Nhật do có hàm lượng dinh dưỡng

cao và được nhiều người ưa chuộng, đồng thời đem lại nguồn thu nhập khả quan cho

người dân Mặc dù người dân đã có kinh nghiệm trồng khoai lang nhưng giống bị

thoái hóa, lẫn tạp, sâu bệnh, virus tấn công làm suy giảm chất lượng và năng suất

giống, đặc biệt là bệnh virus Sweet Potato Feathery Mottle (SPFMV) còn gọi là viruschân chim hại khoai lang, là một loại bệnh phổ biến thường thấy trên khoai lang gâythiệt hại về năng suất và chất lượng cây

Khi sử dụng các phương pháp truyền thống như nhân giống bằng hom, củ gây rakhông ít khó khăn, giống thường bi tạp, nhất là gây thoái hóa giống, không cung ứng

được số lượng lớn trong thời gian ngắn ở quy mô sản xuất Để nâng cao năng suất và

sản lượng khoai lang thì cần phải có giống tốt Việc ứng dụng phương pháp nuôi cấy

mô trong nhân giống khoai lang nhằm góp phan quản lý tốt nguồn gen và có thể cung

ứng trong thời gian ngắn theo hợp đồng số lượng cây giống đồng đều, sạch bệnh dé

trồng trên quy mô sản xuất, làm nguồn nguyên liệu cho chế biến, phục vụ cho tiêu thụ

nội địa và xuất khẩu

Do đó, để tạo ra giống khoai lang Nhật sach bệnh, chất lượng và đảm bảo năng suất

hơn so với phương pháp truyền thống nên đề tài “Nhân giống khoai lang Nhật(Ipomoea batatas L.) sạch bệnh Sweet Potato Feathery Mottle Virus ( SPFMV) bang

phương pháp nuôi cấy mô” được thực hiện

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tai được thực hiện nhằm nhân giống khoai lang Nhật sạch bệnh SPFMV bằngphương pháp nuôi cấy mô

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1 Tạo nguồn vật liệu sạch bệnh SPFMV

Nội dung 2 Tạo môi trường nhân chéi thích hợp cho cây khoai lang Nhật

Nội dung 3 Tạo môi trường ra rễ thích hợp cho cây khoai lang Nhật dé tạo cây hoàn

chỉnh.

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu khái quát về cây khoai lang

2.1.1 Nguồn gốc của cây khoai lang

Theo Đặng Minh Hằng (2014) khoai lang có nguồn gốc ở Nam Mỹ khoảng 5000 năm

trước công nguyên Dấu tích củ khô tồn tại lâu nhất được khám phá tại Caves của

Chilca Canyon thuộc Peru (Engel, 1970) Người ta cũng tìm thấy sự hiện diện của

khoai lang đầu tiên tại vùng Mayan của Trung Mỹ Năm 1492, khoai lang được khám

phá bởi Christophe Columbus trong cuộc thám hiểm tìm ra châu Mỹ Ông đã đưa nó

vào Tây Ban Nha được gọi là khoai tây Tây Ban Nha, mãi đến sau này mới được gọi làkhoai lang Khoai lang được mở rộng theo hai con đường: Con đường từ Tây Ban Nha

giới thiệu vào châu Âu sau đó truyền tới châu Phi, vào An Độ và Tây An.Con đườngkhác vào Trung Quốc là do người Tây Ban Nha, đưa vào vùng Combatfami năm1674.Một người Anh đưa vào Nhật năm 1615 Khoai lang được tiếp tục đưa vào

Malaysia và các nước Nam Á, Đông Nam Á

Theo Lê Quý Đôn (1756), cây khoai lang được đưa vào Việt Nam từ Philipines vào

cuối đời Minh ở thế ky XVI (trích dẫn bởi Hoàng Kim, 2017)

Loài Impomoea batatas

Theo Luong Ngọc Toàn va cộng sự (1978) cây

khoai lang thuộc họ Bìm bìm (Convolvulaceae) có

55 chi khoảng 1650 loài, trong đó chỉ Impomoea

va chi lớn nhất với khoảng 600 loài Ở Việt Nam

có 13 chi và 76 loài (trích dẫn bởi Hoàng Kim, ae ; 5

2017) Hình 2.1 Hình ảnh cây khoai lang.

2.1.3 Đặc điểm thực vật, sinh trưởng và phát triển của cây khoai lang

2.1.3.1 Đặc điểm thực vật

Theo Đặng Minh Hằng (2014) đã nêu ra các đặc điểm thực vật của khoai lang Về rễ,khoai lang sau khi trồng 3-4 ngày sẽ mọc rễ mới Trong điều kiện khô hạn hoăc nhiệt

độ và âm độ thấp thì khoai mọc rễ non chậm Rễ mọc đầu tiên ở các đốt thân dưới đất

Rễ khoai lang chia làm ba loại :rễ con, rễ đực và rễ củ Thân khoai lang chủ yếu làthân bò, nhưng cũng có những giống thân đứng hoặc thân leo Chiều dài thân có khi

tới 3 - 4m, trung bình khoảng 1,5 - 2m, đường kính thân thường nhỏ trung bình khoảng

0,3 - 0,6cm Trên thân có rất nhiều đốt, mỗi đốt mang một lá Chiều dài đốt trung bìnhkhoảng 3 - 7cm Tiết diện thân thường tròn hoặc có cạnh, một số giống trên thânthường có lông Màu sắc thân cũng tuỳ giống khác nhau: Trắng vàng, xanh đậm, xanhnhạt, Lá khoai lang mọc cách, có cuống đài (trên dưới 10cm) Nhờ có cuồng đài nên

lá khoai lang có thé xoay chuyên phiến lá ra ngoài ánh sáng mặt trời Hình dang màu

sắc lá phụ thuộc vào giống: Hình tim, mũi mác, xẻ thùy (nông, sâu hoặc chân vit).

Màu lá vàng nhạt, xanh, xanh đậm Có một số giống, màu sắc lá thân và màu sắc lá

ngọn cũng khác nhau Hoa thường mọc ở nách lá hoặc đầu ngọn thân, hoa hình chuông

có cuống dài Tràng hoa hình phễu, màu hồng tía, cánh hoa dính liền, mỗi hoa có mộtnhị cái và 5 nhị đực cao thấp không đều nhau và đều thấp hơn nhị cái Quả khoai langthuộc dạng quả sóc, hình hơi tròn, có 3 mảnh vỏ, mỗi quả có 1 - 4 hạt Hạt khoai lang

thường có màu nâu đen, hình bầu dục hay đa giác, vỏ cứng do đó có thể duy trì khả

năng sống được 20 năm hoặc lâu hơn

2.1.3.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Khoai lang có 4 thời kỳ sinh trưởng và phát triển: Moc mam và ra rễ; phân cành va tạo

củ; Tăng trưởng thân lá; Phát triển của củ

2.1.4 Nguồn gen giống khoai lang trên thế giới và Việt Nam

Nguồn gen giống khoai lang lớn nhất toàn cầu có ở Trung tâm Khoai tây Quốc tế(Centro Internacional de la Papa — CIP) với 7007 mẫu giống, gồm 5920 mẫu giốngkhoai lang trồng Ipomoea batatas và 1087 mẫu giống khoai lang hoang dai Ipomoeatrifida và các loài Ipomoea khác Khoai lang Mỹ nỗi tiếng về chất lượng cao, phô biến

là các giống khoai lang ruột củ màu cam đậm, đẻo và có hương vị thơm Khoai langNhật cũng nối tiếng về chất lượng cao Khoai lang Trung Quốc cho năng suất cao,chịu lạnh nhưng chất lượng không ngon so với khoai lang Nhật, Mỹ khi trồng ở Việt

4

Nam Nhược điểm của khoai lang Mỹ khi trồng ở Việt Nam là độ bột, vị thơm, chấtlượng và thị hiếu không bằng khoai lang Nhật, thời gian sinh trưởng dai (trên 115

ngày) (Hoàng Kim và ctv, 2017).

2.1.5 Các giống khoai lang Nhật được trồng ở Việt Nam

Theo Hoang Kim va ctv (2017), nguồn gen giống khoai lang Việt Nam chủ yếu đượcthu thập, đánh giá và bảo tồn tại Trung tâm Tài nguyên Thực vật, thuộc Viện Khoahọc Nông nghiệp Việt Nam với 528 mẫu giống đã được tư liệu hoá (trong đó có 344mẫu do Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc chuyên đến)Viện Cây Lương thực và Cây Thực phẩm (FCRI) có 118 mẫu giống, Trung tâmNghiên cứu Thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc năm 2009 có 7§ mẫu giống.TrườngĐại Học Nông Lâm thành phó Hồ Chi Minh có 30 mẫu giống

2.1.5.1 HL518 (Nhật đỏ)

HL51§ (Nhật đỏ) có nguồn gốc Nhật Bản do Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệmNông nghiệp Hưng Lộc nhập nội hat lai, tuyên chọn và giới thiệu từ công ty FSA,được Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn công nhận giống năm 1997 Hiên phổ

biến ở các tỉnh phía Nam Thời gian sinh trường của cây từ 95-110 ngày Năng suất củ

tươi của giống là 17-32 tan/ha, tỷ lệ chất khô 27-30%, chất lượng củ luộc ngon, vỏ củ

màu đỏ đậm, thịt củ màu cam đậm, dang củ đều dep, dây xanh tím

2.1.5.2 KOKEY14 (Nhật vàng)

Kokey14 (Nhật vàng) có nguồn gốc Nhật Bản do Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệmNông nghiệp Hưng Lộc nhập nội năm 1997 từ công ty FSA Giống được tuyển chọn

và giới thiệu năm 2002 Thời gian sinh trường của cây từ 110-120 ngày Năng suất củ

tươi của giống là 15-34 tan/ha, tỷ lệ chất khô 29-31%, chất lượng củ luộc ngon, vỏ củ

màu đỏ, thịt củ màu vàng cam, dạng củ đều đẹp, dây xanh

2.1.5.3 MURASA KIMASARI (Nhật tim)

Murasa Kimasari (Nhật tím) có nguồn gốc Nhật Bản do Trung tâm Nghiên cứu thựcnghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc nhập nội năm 1994 từ công ty FSA Giống được tuyểnchọn và giới thiệu năm 2002 Hiện được trồng ở vùng đồng bằng sông Cửu Long Thời

gian sinh trường của cây từ 105-110 ngày Năng suất củ tươi của giống là 10-20 tan/ha,

tỷ lệ chất khô 27-30%, chất lượng củ luộc ngon, vỏ củ màu tim sam, thịt củ màu tim

đậm, dạng củ đều đẹp, dây tím xanh

2.1.6 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

Năm 2014, Vũ Thị Thúy Hằng và ctv đã nghiên cứu xây dựng được quy trình tái sinh

cây khoai lang, Ipomoea batatas (L.) Lam., sử dụng đốt mang mắt ngủ làm mô cấy.Kết quả chồi tái sinh hiệu quả trong điều kiện nuôi cấy thoáng khí trên môi trường MS

có bồ sung 8g/l agar, 3% saccharose, Img/1 BAP, 0,5 mg/l NAA, 20% nước dừa va tạo

rễ hiệu quả trên môi trường MS có bồ sung 8 g/l agar, 3% saccharose, 0,3 mg/l NAA.Nam 2021, Nguyễn Thị Lâm Hai va ctv đã nghiên cứu nhân nhanh invitro giống khoai

tầng vàng (Colocasia esculenta (1.) schott) tai huyện Thanh Sơn tỉnh Phú Thọ Kết quả

nghiên cứu cho thấy môi trường nhân nhanh tối ưu đối với chồi khoai lang tầng vàng

là môi trường MS có bố sung 1 mg/l BA với 9,65 chồi và môi trường ra rễ phù hợpnhất là môi trường MS có bổ sung 0,3 mg/l NAA La Việt Hồng và ctv (2021) đãnghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ đốt thân cây khoai lang Hoang Long (Jpomoea batatas).Kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần tạo nội nhũ phù hợp nhất cho đốt thân là MS,1% sodium alginate và 50 mM calcium chlodride Việc bổ sung NAA 0,2 mg/l vàBAP 0,2 mg/l vào nội nhũ là phù hợp nhất dé kích thích khả năng ra rễ va bật chồi của

cây khoai lang.

Nam 2015, Jin Hee Ki và ctv đã nghiên cứu xây dựng được hệ thống nhân giống mộtbước cây khoai lang Kết quả với môi trường có chứa 0,5 mg/l BA và 1 mg/1 Kn chồitốt nhất và môi trường 0,25 mg/1 IBA kết hợp 0,5 mg/l NAA hiệu quả nhất với rễ.Năm 2018, Mengs va ctv đã nghiên cứu nhân giống invitro cây khoai lang bằng môi

trường chéi bên Kết quả cho thấy sự hình thành mô Callus tốt nhất là ở môi trường

MS có bồ sung 2mg/1 IAA kết hợp với 2 mg/l kinetin và sự hình thành chồi tốt nhất ởmôi trường MS có bồ sung 0,5 mg/l BAP va môi trường MS có bồ sung 1 mg/1 kinetin

2.2 Sơ lược về nuôi cấy mô

2.2.1 Lịch sử nuôi cay mô

Nuôi cay mô được Haberlandt thử nghiệm đầu tiên vào năm 1902 Ông đã nuôi cấy tế

bào được tách ra từ lá của một số cây một lá mầm như: Erythonimum, Oritogalum và

Tradescantia nhưng đều không thành công Năm 1934, White đã thành công trong

nuôi cấy đầu rễ của cà chua (Lycopersicum esculentum ) trong môi trường lỏng chứa

muối khoáng, glucose và nước chiết nắm men Kỹ thuật tach va nuôi cấy tế bào đơn

được phát triển từ năm 1954 đến 1959 Hilderbrandt và Riker đã tách các tế bào của

mô sẹo thành một huyền phù của các tế bào đơn cây đậu (Phaseolus vulguris) Năm

6

1960, Cooking đã thành công khi dung cellulose phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực

vật và thu được các tế bào tròn, không có vỏ được gọi là protoplast Từ năm 1960 đến

1964, Morel đã thành công trong nhân giống cây lan (Cymbidium) thông qua nuôi cấyđỉnh sinh trưởng Nozeran đã ứng dụng nuôi cấy mô trong việc là trẻ háo cây nho, câykhoai tây Kê từ đó nuôi cấy mô được ứng dụng trên quy mô thương mại ở nhiều câytrồng có giá trị kinh tế như chuối, cây ăn quả có muối và đóng góp to lớn cho ngànhnông nghiệp thế giới (Hà Thị Tuyết Phượng, 2010)

Ngày nay nuôi cấy mô thực vật đã được ứng dụng mạnh mẽ ào thực tiễn chọn giống vànhân giống

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô

2.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian được nuôi cấy trên môi trường thích hợp sẽphát triển thành một hay nhiều chéi Sau đó tiếp tục vươn thân, ra lá và rễ, trở thànhcây hoàn chỉnh (Hà Thị Tuyết Phượng, 2010)

2.2.2.2 Nuôi cây mô seo

Mô seo là khối tế bào phát triển vo t6 chức, được hình thành khi đỉnh sinh trưởng hay

nhu mô đươc nuôi cấy trên môi trường giảu auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh

thành cây hoan chỉnh trong điều kiện môi trường không có các chất kích thích sinhtrưởng tạo mô sẹo Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống cây mẹ và từ một cụm tếbao mô sẹo có thé tái sinh cùng lúc nhiều chồi hơn là từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.Tuy nhiên mức độ biến di tế bào soma sẽ cao hơn so với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.(Hà Thị Tuyết Phượng, 2010)

2.2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cay trên môi trường long và đặt trên may lắc có tốc độ điều

chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẻ, được gọi là tế bào đơn Tế bảo

đơn được lọc và nuôi cay trên môi trường đặc biệt dé tang sinh khối Với các cơ chất

thích hợp được bồ sung, từ môi trường tế bào có khả năng sản xuất các hoạt tính sinhhọc Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường lỏng, tế bào đơn được tách ra và trải

trên môi trường thạch Khi môi trường thạch có bé sung auxin, tế bào đơn phát triểnthành từng cum mô sẹo Khi môi trường thạch có tỷ lệ giữa cytokinin va auxin thích

hop, tế bao đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh (Hà Thị Tuyết Phượng,

2010).

2.2.2.4 Nuôi cấy protoplast

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy

đủ các chức năng của tế bảo Protoplast có thể được tách trực tiếp từ các bộ phận của

thực vật bằng cơ học (nghiền mẫu + enzyme) hay từ tế bào sẵn có Trong điều kiệnnuôi cây thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bảo, tiếp tục phân chia vàtái sinh thành cây hoàn chỉnh (Hà Thị Tuyết Phượng, 2010)

2.2.2.5 Nuôi cấy hạt phấn

Hạt phan của thực vật được nuôi cay trên môi trường thích hợp tao thành mô seo Mô

sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh có nhiễm sác thể In gọi là cây đơn bội(Trần Văn Minh, 1997, trích dẫn bởi Hà Thị Tuyết Phượng, 2010)

2.2.3 Lợi ích của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô

Nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô giúp tạo ra các cây con đồngnhất và giống cây mẹ, tạo ra một số lượng cây con lớn từ một nguồn mẫu trong thờigian ngắn Ngoài ra nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô còn giúp tạo

ra các cây con sạch bệnh bằng cách chọn vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm

cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh (Bùi Bá Bồng, 1995)

2.2.4 Các bước nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô

2.2.4.1 Chọn vật liệu và cấy

Về nguyên tắc, trừ những mô đã hóa gỗ, các mô khác trong cơ thé thực vật đều có thé

dùng làm mô dé cấy Các mô dang phát triển mạnh (mô phân sinh ngọn, đầu rễ, phôi

đang phát triển, lá non, cuống hoa và mô phân sinh đốt) khi được cấy và môi trườngthích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Dé bắt đầu nghiên cứu nhân giống invitro, chồi

nách và mô phân sinh ngọn thường được sử dụng (Nguyễn Văn Uyén, 1993)

Các loại củ, căn hành cũng có thé được chọn dé nuôi cấy nhưng cần được xử lý ở nhiệt

độ và chu kỳ sang dé phá mien trạng của củ và căn hành trước khi tách các mầm dé

nuôi cấy (Bùi Bá Bồng, 1995)

2.2.4.2 Nhân choi

Theo Hà Thị Tuyết Phượng (2010), có ba phương pháp nhân chồi thường dùng:

Tạo chéi bat định

Chéi bất định được thành lập từ các bộ phận của cây mà không phải là đỉnh chồi haynách lá Trong nuôi cấy mô, dưới ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng, chồibat định có thé phat sinh từ lá và từ đoạn thân

8

Kích thích sự ra chéi bên

Các mam bên thường hiện điện 6 nách lá, mỗi mầm có khả năng phát triển thành chồi.Trong nhân giống vô tính thông thường, khi các đoạn thân được cat, làm mat anh

hưởng ưu thế ngọn, các mam có thể phát triển thành chổi Trong nuôi cấy mô, khi cây

đỉnh chéi vào môi trường có chứa chất cytokynin ở nồng độ thích hợp, các mầm bêncủa đỉnh chéi sẽ phát triển thành chéi Khi cấy mắt long (đoạn thân có mang mầm)

cũng có kết quả tương tự

Tạo chồi từ mô sẹo

Khi mô thực vật được cay vào môi trường có nhiều chất điều hòa sinh trưởng thuộcnhóm auxin đặc biệt là 2,4D, các tế bao sé phân chia va tạo thành một khối gọi là môsẹo (callus) Khi chuyên sang môi trường có chứa chất điều hòa sinh trưởng thuộc

nhóm cytokinin, không chứa hoặc chứa it auxin, các mô sẹo sẽ biệt hóa tạo thành cây.

Sự biệt hóa này xảy ra bằng sự thành lập chồi trực tiếp hoặc tạo thành phôi vô tinh hay

còn gọi là phôi soma.

đượ cấy trong luống ươm cây có cơ chất thoát nước, tơi xốp và giữ được âm Trong

10-15 ngày đầu cây con nên được duy trì ở âm độ cao bang cách tưới phun sương choluống ươm cây Sau 4-5 tuần cây con có thé đưa ra trồng ở điều kiện thông thường.(Hà Thị Tuyết Phượng, 2010)

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng trong nhân giống bằng cây nuôi cấy mô

2.2.5.1 Lựa chọn mẫu cấy

Các mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chéi bat định có khả năng tái sinh tốt hơn

mô già của cùng một cây Chồi hoa non hay cum hoa non cũng có khả năng tái sinh tốthơn (Dương Công Kiên, 2002) Tình trạng sinh lý của cây có thể ảnh hưởng đến kếtquả nuôi cấy nên việc lấy mẫu thường được tiến hành trong giai đoạn cây đang pháttriển mạnh (Bùi Bá Bồng, 1995)

2.2.5.2 Môi trường nuôi cấy

Các thành phần cơ bản trong môi trường nuôi cấy bao gồm khoáng vô cơ, nguồncarbon, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng Một số chất khác cũng được bồ sungnhư các acid hữu cơ và các dịch chiết

Hiện có nhiều môi trường cơ bản được sử dụng trong nuôi cây mô thực vật Trong đómôi trường MS của Murashige và Skoog (1962) được dùng phô biến nhất vì thích hợpcho phan lớn điều kiện nuôi cấy invitro

Trạng thái môi trường có ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy Do đó, sử lựa chọn môitrường bán rắn hay lỏng là rất cần thiết Môi trường bán rắn giúp đỡ cây, cho phép sự

hoáng khí nhưng có thé làm giảm sự tiếp xúc của cây mầm dé hấp thu dinh dưỡng

(Dương Công Kiên, 2002).

2.2.5.3 Điều kiện nuôi cấy

Ánh sáng

Sự phân phối phô ánh sáng, quang ky và hướng chiếu sáng đóng vai trò quan trong

trong quá trình sinh trưởng ta thewj vật trong nuôi cấy invitro Cương độ ánh sáng bên

canh khả năng điều hòa kích thước lá và thân còn ảnh hưởng đến sự hình thành sắc tố

và hiện tượng thủy tinh thé ở cây con invitro Chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng đến

sự kéo đài đốt thân, sự hình thành chồi bất định trong một số trường hợp nuôi cấy

invitro (Duong Tan Nhựt, 2007)

Ánh sáng được sử dung phổ biến trong nuôi cay mô hiện nay là ánh sáng trang (phổánh sáng khoảng từ 400nm đến 700nm của đèn huỳnh quang Cường độ ánh sángtrong giai đoạn nuôi cay ban dau và nhân chi tiếp theo thích hợp trong khoảng 1000-

5000 lux Thời gian chiếu sáng thường là 16 sáng/ 8 giờ tối Trong giai đoạn tạo rễ,

cường độ ánh sáng có thé lên cao 3000- 10000 lux giúp kích thích cây con invitro

10

chuyên từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng có khả năng quang hợp, qua đó giúp tăng

tỷ lệ sống của cây con invitro khi chuyển ra trồng ngoài đất (Bùi Bá Béng, 1995)

Nhiệt độ

Nhiệt độ có khả năng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây con invitro.Nhiệt độ nuôi cay được xác định dựa vào nguồn gốc của từng loại cây trồng Bên cạnh

đó, trên cùng một loại cây trồng nếu nuôi cấy ở các bộ phận khác nhau thì nhiệt độ yêu

cầu cũng khác nhau Nhiệt độ thích hợp thường được sử dụng trong nuôi cây mô là 20

— 27°C (Tran Văn Minh, 1997)

Theo Reinert và Bajaj (1977) nhiệt độ cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo cây

giống sạch bệnh virus trong nhân giống invitro Xử lý nhiệt ở 35 — 40°C trong vài ngàyhoặc vải tháng có thể loại trừ virus trên nhiều loại cây trồng để thu nhận nguồn vật liệusạch virus Việc xử lý nhiệt thường được thực hiện trước khi tách đỉnh sinh trưởng đểloại trừ virus trong trường hợp không thể loại trừ bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng(trích dẫn bởi Hà Thị Tuyết Phượng, 2010)

2.2.6 Chất điều hòa sinh trưởng thưc vật

2.2.6.1 Auxin

Auxin là một nhóm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Trong cây auxin được tônghợp chủ yếu ở chéi ngọn, lá ngọn và được vận chuyền đến các bộ phận khác nhau dékích thích sự sinh trưởng của tế bảo (Trịnh Xuân Vũ và ctv., 1976)

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tuỳ thuộc vào nồng độ

và sự hỗ trợ qua lại của chúng với cac chất điều hòa khác.Trong trường hợp khảo sáttác động riêng rẽ, auxin có tính chất quan trọng là tác động rõ rang trên sự kéo dài tếbào Hiệu quả này là sự nối tiếp do sự gia tăng đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâmnhập nước , vào trong tế bao, su đề kháng thành tế bao giảm đi và tế bào tự kéo dai ra.Auxin còn có tác dụng kích thích hình thành rễ, kìm hãm sự phát triển chồi bên, kim

hãm sự rụng hoa, rụng quả.

Bên cạnh các auxin tự nhiên như indole-3-acetic acid (IAA) va indole-3-butyric acid

(IBA) còn có các auxin nhân tạo do con người tông hợp như I-naphthaleneacetic acid

(NAA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) va 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid

(2,4,5-T).

II

2.2.6.2 Cytokinin

Cytokinin là một nhóm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có tác dụng hoạt hóa sựphân chia tế bao Trong cây cytokinin được tổng hợp chủ yêu ở mô phân sinh đỉnh rễ.Ngoài ra, cytokinin còn có nhiều trong các bộ phận khác của cây như trong hạt đanglớn và quả đang phát triển (Trịnh Xuân Vũ và ctv., 1976)

Ngoài tác dụng hoạt hóa sự phân chia tế bào, cytokinin còn có tác dụng kích thích việt

tạo mầm của mô sẹo, sự sinh trưởng của chỏi bên, phát sinh chéi bat định

Một số cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô như Kinetin (Kin),

6-benzylaminopurine (BA) và thidiazuron (TDZ).

2.2.3 Các phương pháp nhân giống invitro sạch bệnh

2.2.3.1 Phương pháp chan đoán bệnh virus

Không phải tất cả các loài cây sau quá trình xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh phân sinh

trưởng đều sạch virus, vi vậy phải tiến hành xét nghiệm trong quá trình tái sinh chỗồi

của cây Đối với việc làm sạch virus thì độ chính xác của phương pháp thử virus trongmỗi loài xét nghiệm mang ý nghĩa quyết định cho nên mỗi cây cần được xét nghiệm

bằng nhiều phương pháp khác nhau

2.2.3.2 Phương pháp xử lý nhiệt

Theo Quak (1972) xử lý nhiệt là một cách hiệu quả nhằm bắt hoạt một số virus (tríchbởi Nguyễn Văn Khoa, 2010) Đôi khi xử lý nhiệt không hiệu quả do cây mẫn cảm vớinhiệt độ hay virus không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ với lý do chưa được xác định Cầnxét đến nhiệt độ và thời gian xử lý, đảm bảo cây sống sót trong khi virus bị bất hoạt

Phương pháp này đã được áp dụng và mang lại kết quả tốt trong việc chống lại virus

2.2.3.3 Phương pháp nuôi cấy mô phân sinh

Nuôi cấy mô phân sinh là phương pháp phố biến nhất dé loại trừ virus gây bệnh chocây Limmasets và Cornuet (1949) đã phát hiện rằng ở các cây nhiễm bệnh virus, virusphân bố không đồng nhất trên cây, giảm dần khi đến gần chóp lá và thường khôngthấy chúng ở mô phân sinh Như vậy, mô phân sinh tránh được sự lây nhiễm (trích bởi

Nguyễn Văn Khoa, 2010)

2.2.3.4 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý nhiệt

Theo Morel và Martin (1952) khả năng làm sạch virus cao hơn khi được thực hiện

bằng cách nuôi cây mô phân sinh đỉnh kết hợp với xử lý nhiệt Với xử lý nhiệt, các cây

12

được tăng trưởng ở nhiệt độ cao (khoảng 38 -42 °C) trong 4 — 6 tuần Sau khi xử lý

nhiệt chồi đỉnh có kích thước từ 2- 5 mm được cắt ra và nuôi cay trên môi trường dinh

dưỡng thích hợp (Nguyễn Văn Khoa, 2010)

2.3 Giới thiệu về virus SPFMV và bệnh virus SPFMV

2.3.1 Virus Sweet Potato Feathery Mottle Virus

2.3.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tao

Virus SPFMV thuộc chi Potyvirus, có hình sợi mềm, có kích thước khoảng 13- 850

nm Giống như nhiều Potyvirus khác, SPFMV có phạm vi vật chủ hẹp, có thé lâytruyền bởi rệp bao gồm các tế bào chất nội bào ở cây bị nhiễm bệnh, có các phân tuer

dạng sợi linh động, kích thước khoảng 12 x 810 - 865 nm, có chứa RNA sợi đơn khoảng 10 kb va protein vỏ khoảng 36 kDa (CABL 2021).

2.3.1.2 Phwong thire lay truyén

Trong môi trường quan thé gồm cây nhiễm va cây không nhiễm, virus có thé truyềnsang cây khỏe nhờ các vector Ngoài ra virus còn có thé lan truyền trên diện rộng

(không nhờ môi giới) do nguồn giống, nguyên liệu nhân giống ban đầu không sạch

Virus gây bệnh có thê gây hại củ Củ khoai lang nhiễm bệnh thường biến dạng vỏ củ

bị nứt rạn, san sùi, có màu nâu đỏ Vết bệnh có thé bao bọc quanh củ Ruột củ thường

bị xốp và thối Triệu chứng bệnh thẻ hiện rõ ở nhiệt độ 25°C (Vũ Triệu Mân,2007)

2.3.2.2 Nguyên nhân gây bệnh

Bệnh do virus chân chim nhóm Potyvirus - Sweet Potato Feathery Mottle Virus

(SPFMV) gây ra, chúng lây truyền vào khoai lang nhờ rép mudi ho Aphididae hoặc docác vết thương cơ giới (Vũ Triệu Mân, 2007)

13

2.4 Các phương pháp phát hiện va chan đoán virus

2.4.1 Polymerase Chain Reaction (PCR) và Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

PCR va RT-PCR là các kỹ thuật phổ biến dé phát hiện và xác định RNA va DNA củavirus thực vật Phương pháp này cực kỳ nhạy và không quá đắt tiền RT-PCR thường

được sử dụng dé phát hiện sự hiện diện của mRNA, tiền mRNA hoặc các loại RNA

khác như RNA không mã hóa Phương pháp này liên quan đến việc sử dụng một đoạnmôi được ủ vào RNA quan tâm Đối với mRNA, mỗi thường là oligo tổng hợp (DT)15-18, hỗn hợp hexamer ngẫu nhiên (DN) 6 hoặc DNA oligonucleotide tổng hợp bổsung cho một bản phiên mã cụ thể (một đoạn mồi đặc hiệu gen) RNA này đóng vai trò

là một mẫu trong quá trình sao chép ngược, trong đó enzyme phiên mã ngược (RT)

tạo ra một bản sao cDNA sợi don của một phan của phân tử RNA mục tiêu Sử dụng

môi hexamer ngẫu nhiên, có thé có được các bản sao cDNA đại diện của các chuỗi từtoàn bộ chiều dai của mRNA và pre-mRNA trong một quan thé CDNA này sau đó có

thể được sử dụng làm mẫu cho PCR Ngoài các đoạn môi đặc hiệu gen, một đoạn

DNA cụ thé tương ứng với một phan RNA quan tâm được tao ra (Donald, 2014)

Ky thuật RT-PCR có 2 loại:

+One-step RT-PCR: RNA —>cDNA —> DNA —>DNA

+Two-step RT-PCR: RNA —> cDNA->cDNA—> DNA

2.4.2 Phương pháp chan đoán bằng miễn dich gan enzyme (ELISA)

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), còn được gọi là enzyme immunoassay(EIA), là một kỹ thuật sinh hóa sử dung rộng rãi như các công cụ chan đoán trong yhọc cũng như kiểm soát chất lượng trong ngành công nghiệp Chúng cũng được sử

dụng làm công cụ phân tích trong nghiên cứu y sinh để phát hiện và định lượng cáckháng nguyên hoặc kháng thé cu thé trong một mẫu nhất định EIA/ELISA sử dụng

khái niệm miễn dịch cơ ban của một kháng nguyên liên kết với kháng thé cụ thể của

nó, cho phép phát hiện một lượng rất nhỏ các kháng nguyên như protein, peptide,hormone hoặc kháng thé trong một mẫu chất lỏng EIA va ELISA sử dụng các khángnguyên và kháng thé được gắn nhãn enzyme dé phát hiện các phân tử sinh học, các

enzyme được sử dụng phô biến nhất là kiềm phosphatase va glucose oxyase Khang

nguyên được phép liên kết với một kháng thể cụ thể, sau đó được phát hiện bởi một

kháng thê kết hợp enzyme thứ cấp Một chất nền nhiễm sắc thể cho enzyme mang lại

14

sự thay đổi màu sắc hoặc huỳnh quang có thé nhìn thấy, cho thấy sự hiện điện của

kháng nguyên (Stephanie và Kruti, 2013).

2.4.3 Phương pha đa hình các đoạn giới han —Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

Theo Susha (2019), RFLP là kỹ thuật được phat minh vào năm 1948 bởi nhà khoa họcngười Anh Alec Jeffrey trong khi nghiên cứu bệnh di truyền Nó được sử dụng để

phân tích các mẫu độc nhất ở các đoạn DNA nhằm phân biệt di truyền giữa các sinhvật- nhằm khuôn mẫu này được gọi la Variable Number of Tandem Repeat (VNTR)

Đa hình di truyền được định nghĩa như sự khác biệt di truyền gen giữa các cá thé tronghơn 1% dân số thông thường Kỹ thuật RFLP lợi dụng những sự khác nhau này ở trình

tự DNA đề nhận ra và nghiên cứu sự đa dạng trong loài và giữa các loài RFLP được

sử dụng kết hợp với PCR dé xác định sự khác nhau của các virus dựa trên sự hiện diệncủa các vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn Sau khi khuếch đại bằng PCR, cácmẫu được phân cắt bởi enzyme cắt giới hạn và các kích thước của các đoạn phân cắtđược phân tích bằng điện di Hiệu qua của phương pháp này phụ thuộc vào sự đa hình

trong phạm vi vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn

15

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ tháng 03/2023 — 07/2023

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Nhân giống cây khoai lang Nhật được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh

học và Môi trường, trường đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

Kiểm tra virus SPFMV trên cây khoai lang Nhật bằng kỹ thuật RT-PCR được thựchiện tại Phòng Sinh học phân tử, Công nghệ gen và tế bào của Viện Nghiên cứu Côngnghệ sinh học và Môi trường, Thanh phô Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Giống khoai lang Nhật

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Kiểm tra cây sạch bệnh SPFMV bằng kỹ thuật RT-PCR

Củ giống sau khi được tuyển chọn sẽ được xử lý dé thúc bật chồi Sau ba tuần khi chéicao khoảng 10 — 20 cm sẽ tiễn hành cat để chuẩn bị cho công đoạn tiếp theo Nhưng

trước đó sẽ được tiến hành lấy mẫu lá dé kiểm tra sàng lọc bệnh virus SPFMV (Sweet

Potato Feathery Mottle Virus) bằng kỹ thuật RT-PCR nhằm tạo ra nguồn nguyên liệusạch bệnh ngay từ ban đầu

Vật liệu

Mau lá : gồm 10 mẫu tương ứng với mỗi củ giống

Giám định virus bằng kỹ thuật RT-PCR One-step với cặp môi đặc hiệu cho virusSPFMV có thể khuếch đại đặc hiệu một đoạn có kích thước 589 bp Primer SPFMV-F

có trình tự 5’- GGATTAYGGTGTTGACGACACA-3’ và primer —R có trình tự TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA-3’ (Li và ctv, 2012).

Các bước thực hiện theo hướng dẫn của bộ Biobasic EZ-10 Spin Column Plant RNA

Bước 5 Thêm 500 ul GT Soluion vào cột, ly tâm ở 12.000 x g trong I phút ở nhiệt độ

phòng, loại bỏ dich, đặt lại cột vào tube.

Bước 6 Thêm 500 NT Soluion vao cột, Ly tâm ở 12.000 x g trong 1 phút ở nhiệt

độ phòng, loại bỏ dich, đặt lại cột vào tube.

Bước 7 Ly tâm cột ở 12.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

Bước 8 Đặt cột vào tube 1,5 ml mới, thêm 50 wl RNase-Free Water, giữ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút Ly tam ở 12.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

Tạo cDNA

RNA tổng số sau khi tách chiết được tổng hợp cDNA cho phản ứng RT-PCR theo bộ

Kit Bioline SensiFAST cDNA Synthesis

RT-PCR

Tiền biến tinh ở 95°C trong 2 phút Quá trình khuếch đại diễn ra ở 95°C trong 30 giây,

55°C trong 30 giây va 72°C trong 40 giây với 35 chu kỳ, hậu kéo dài ở 72°C trong 10

phút.

Điện di

Sản phẩm sau khi khuếch đại RT-PCR được điện di trên gel agarose 1,5 % trong dung

dịch đệm TBE 0,5X ; 100V trong 30 phút Sử dụng khoảng Sul sản phẩm RT-PCR

cùng với ul GelRed Tương tự cũng sử dụng 5 ul Ladder 100bp cùng với 1p] GelRed.

Trộn đều và đưa hỗn hợp cho vào giếng Sau khi điện di, gel agarose được đưa vào

buồng UV và được ghi lai bằng cách chụp ảnh

Kết quả điện di của hai mẫu gộp sẽ được so sánh với mẫu đối chứng dương ở ladder

589 bp và mẫu đối chứng âm dé xác định mẫu có nhiễm virus SPFMV hay không

17