Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh cây trầu bà thanh xuân in vitro (Philodendron bipinnatifidum)

Nhân giống in vifro còn một số nhược điểm chưa tránh khỏi: trong việc nuôi cay in vitro sử dụng nguồn hydrocacbon nhân tạo nên khả năng tổng hợp các hợp chất hữu cơ thấp, cây nuôi cay in

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

NHÂN NHANH VÀ TẠO CÂY HOÀN CHỈNH CAY TRAU BÀ THANH XUAN IN VITRO

(Philodendron bipinnatifidum)

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : BUI NHƯ NGOC

Mã số sinh viên : 19126113

Niên khóa : 2019 - 2023

Thành phố Thi Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ

MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

NHÂN NHANH VÀ TẠO CÂY HOÀN CHỈNH

CÂY TRAU BÀ THANH XUAN IN VITRO

(Philodendron bipinnatifidum)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiệnThS TÔ THỊ NHA TRAM BUI NHU NGOC

Thanh phố Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Đề hoàn thành được khóa luận này, em xin chân thành cảm ơn Ban GiámHiệu trường Đại học Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh, cảm ơn thầy Đinh XuânPhát Trưởng Khoa Khoa học Sinh học, thầy Toàn cố van học tập lớp DHI9SHAcùng tất cả quý thầy cô giáo đã tận tình dạy bảo, giúp đỡ, truyền đạt kiến thứctrong suốt thời gian em theo học tại trường Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến

cô Tô Thị Nhã Trầm đã luôn nhắc nhở, định hướng, tận tình hướng dẫn và tạomoi điều kiện tốt nhất dé em hoàn thành đề tài tốt nghiệp nay

Cảm ơn chân thành đến anh Huỳnh Tấn Phát, các anh chị và các bạn làm

việc tại Chi nhánh Công ty Cô phần Công nghệ Sinh học TPECO đã hỗ trợ vàgiúp đỡ, động viên, chia sẻ những kinh nghiệm, khó khăn trong suốt quá trình

thực hiện đề tài Đặc biệt hơn cả, con xin cảm ơn công lao to lớn của bố mẹ đã

không ngại cực khổ để nuôi con khôn lớn và luôn động viên tạo mọi điều kiệnthuận lợi nhất để con học tập Chân thành cảm ơn những anh chị và các bạn đã

luôn quan tâm, ủng hộ, giúp đỡ trong quá trình thực hiện khóa luận.

Cuối cùng, em xin kính chúc quý thay cô, gia đình, anh chị và bạn bé luônmạnh khỏe và hạnh phúc trong cuộc sống

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Bùi Như Ngoc, MSSV: 19126113, Lớp: DH19SHA thuộc ngành

Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, xin

cam đoan: Đây là khóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số

liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin

hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đông vê những cam kêt nay.

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 02 năm 2024

Người viet cam đoan

Bùi Như Ngọc

TÓM TẮT

Cây trầu bà thanh xuân (Phildendron bipinnatifidum) là loài cây kiêng lá, thânthảo thuộc họ Araecae, tán lá xẻ, dáng đẹp, phù hợp dé trang trí nội thất Bên cạnh ýnghĩa phong thủy, cây còn được ứng dụng trong y học nhờ các chiết xuất của nó Đáp

ứng các nhu cau trên, nghiên cứu “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây trầu ba

thanh xuân (Phildendron bipinnatifidum)” được thực hiện dé tạo ra số lượng lớn cây

giống đáp ứng nhu cầu thị trường cây cảnh cũng như trong y dược Đối với thí nghiệm

dé phát sinh tạo chéi, chồi được cấy trên môi trường MS có bồ sung KI với nồng độ thayđổi lần lượt từ 0,0 — 0,8 mg/l Kết quả cho thấy sau 30 ngày nuôi cấy, môi trường MS

được bồ sung 0,4 mg/l KI cho tỉ lệ phát sinh chéi tối ưu nhất trong các nghiệm thức với

tỉ lệ phát sinh chồi đạt 50,43 %, số chồi trung bình là 1,59 chồi Chồi được cấy vào môitrường MS có bồ sung cô định 0,2 mg/l KI và 0,0 — 2,0 mg/l BA thay đổi trong từngnghiệm thức Sau 30 ngày nhân nhanh chéi, môi trường MS có bé sung 1,5 mg/I BA và

có định 0,2 mg/1 KI là tối ưu nhất với tỉ lệ tạo chéi là 80,34%, số chéi trung bình đạt3,66 chồi, số lá trung bình là 4,16 lá Chồi được tách và cấy vào môi trường MS thay

đổi nồng độ khoáng đa lượng với bước nhảy 0,5 và so sánh giữa 2 môi trường có và

không có bé sung 0,1 gram than hoạt tính Kết quả cho thấy môi trường 1/2 MS phù hợpcho sự tạo rễ cây trầu bà thanh xuân có bồ sung 0,1 g than hoạt tính sau 30 ngày Trên

môi trường này, cây có số rễ trung bình là 4,82 rễ, chiều dài trung bình rễ dat 12,08 cm

Từ khóa: Phildendron bipinnatifidum, KI, BA, khoáng đa lượng, than hoạt tính

Phildendron bipinnatifidum is a leafy, herbaceous ornamental plant of the Araecae family, with split, beautiful foliage, suitable for interior decoration Besides its feng shui significance, the plant is still used in medicine thanks to its extracts To meet the above needs, the study "Developing an in vitro breeding process for young betel plants (Phildendron bipinnatifidum)" was carried out to create a large number of seedlings to meet the needs of the ornamental market as well as in the domestic market pharmacy For the experiment to generate dew, absorb money in MS medium supplemented with KI with a concentration varying from 0.0 to 0.8 mg/l The results were found that after 30 days of culture, MS medium supplemented with 0.4 mg/l KI gave the most optimal reduction rate in the tests with the rate reaching 50.43%, the number of The average advance is 1.59 depth Shoots were transplanted into MS medium supplemented with fixed 0.2 mg/l KI and 0.0 - 2.0 mg/l BA varied in each treatment After 30 days of rapid shoot multiplication, MS medium supplemented with

1.5 mg/l BA and fixed with 0.2 mg/1 KI is the most optimal with a shoot formation rate

of 80.34%, the average number of shoots reaching 3.66 buds, average number of leaves

is 4.16 leaves Shoots were separated and transplanted into MS medium varying the

concentration of macrominerals with steps of 0.5 and compared between 2 mediums

with and without the addition of 0.1 gram of activated carbon The results show that 1/2 MS medium is suitable for rooting of young betel plants with the addition of 0.1 g

of activated carbon after 30 days On this environment, the plant has an average number of roots of 4.82 roots, and an average root length of 12.08 cm.

Keywords: Philodendron bipinnatifidum, KI, BA, fast multiplication, activated carbon

2.1.2 Nguồn gốc của cây trầu bà thanh xuân 2: 22©-2222+2++EEzzzzzzxzzzzrxez 3

Ø1 tấu im Hinl HT su«=essenankeniiskirininsrdirdididuacthodiidrg.adErdoz.GiCidcg2digGirchuigiG4.14 3 32.1.4 Điều kiện sinh thái ¿+ s5 E£Ex2EE2EEE12112121211211121121 1121121121 3

2.1.5 Các phương pháp nhân giống của cây trầu bà thanh xuân - 4

2.2 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật -2-©2¿22+22+2E2E22E2E22zzzzer 5

2.2.1 Khái niệm và phương pháp nuôi cây mô tế bao thực vật - - 5

2.2.2 Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy mô -2¿2¿22+2z+2E22E+2Ezzzzzzz+2 72.2.3 Các hiện tượng bat thường trong nuôi cấy mô tế bào thực vật - 82.2.4 Su ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng 2: 222255z25z25522 §

225.Cac nehien Cứu HN: Qua ccaseeessabebatoiagS2E0X5GILSGERSEERRLEHL4G.SS883BSL8340E1EĐ08 10 2.2.3.1, Nhiên cứu TONE MUO sáecceseseeesknoiosnoiiEiiniiDAELAS5E0010151016/ 0055115650 841016 138357 10 2.2.5.2 Nghiên cứu ngoai NƯỚC - + + 22 2121221221251 2E E1 ng Hư ưệt 12

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP -2-¿-+2cc++ccccr+rrecee 14

3.2 Vat liu nghién UU 14

3.2.1 Trang thiét bi va dung CU 8n 14

3.2.2 Hóa chất và môi trường -2-22+©2++2E+++2E++2EE+2EEE22EE22EEE2EErrrrrrrrrrrrre 143.2.3 Điều kiện nuôi cấy -2-22¿©222222221222122212211221122112112211 221112121 ee 153.3 Phương PHAP MOMIEM GỮU soneasaesnsseeee nhi g 45 G1 13443844314853838Eha% SSGRSSEL3A84588431083853333856 16

3.3.1 Khảo sat anh hưởng của nồng độ KI đến khả năng phát sinh tao chdi 16

3.3.2 Khảo sat ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chi 17

3.3.3 Khảo sát nồng độ khoáng da lượng và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ 183.3.3.1 Môi trường không bồ sung than hoạt tính -222©5z22++2s+2z+z2sz+2 18

3.3.3.2 Môi trường có bổ sung 0,1 g than hoạt tính - 2 2 2z22++2z+zz+z2+z<- 19

3.4 Phương pháp xữ lý số liệu «_ -c-ceeueEEeELELLEELEEEHEELU00 100002802 66800 00220 2 20

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2 -2255ccccrrrrrrrrrrrrrrree 21

4.1 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng phát sinh tạo chồi 2-22 21

4.2 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi -2- 2222552552 24

4.3 Anh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng đến khả năng tạo rễ 284.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng đến khả năng tạo rễ không bổ

sung than hoat tith 0 28

4.3.2 Anh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng đến khả năng tao rễ có bô sung 0,1

ø than hoạt tinhtecccccsqesse seem 5656225 meen ge een EE OO

A) | Hkossuygusediogre200981456531420901614503480008153.9008423609612:559040504002121049236443/200408936014004500100) 382n 38

DANH SÁCH CÁC CHU VIET TAT

œNAA a-Naphthaleneacetic acid

AC Actived charcoal (than hoạt tính)

IAA Indole-3-acetic acid

IBA Acid indole - 3-butyric

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS 2 22©2222222EE+2E222EE22EEz2Exzzzxrsrxz 15

Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ KI (mg/l) đến quá trình phát sinh tạo chồi 16

Bảng 3.3 Anh hưởng nồng BA (mg/l) đến quá trình nhân nhanh chồi 17

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của khoáng đa lượng đến khả năng tạo rễ trong môi trường không CO than hoat tim ẦŨŨÍỶÝ 18

Bang 3.4 Anh hưởng của nồng độ khoáng da lượng đến kha năng tạo rễ trong môi trường có bô sung 0,1 g than hoạt tính - -¿- ¿2+ *+2*22E£2E*2E2ES Hiệp 20 Bang 4.1 Ảnh hưởng của KI đến kha năng phát sinh chéi sau 10 ngày 21

Bang 4.2 Anh hưởng của KI đến kha năng phat sinh ch6i sau 20 ngày 22

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của KI đến khả năng phát sinh chồi sau 30 ngày 24

Bang 4.4 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chdi sau 10 ngày 25

Bảng 4.5 Anh hưởng của BA đến kha năng nhân nhanh chồi sau 20 ngay 26

Bang 4.6 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi sau 30 ngày 27

Bang 4.7 Anh hưởng của khoáng đa lượng đến khả năng ra rễ sau 10 ngày 29

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của khoáng đa lượng đến khả năng ra rễ sau 20 ngày 30

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của khoáng đa lượng đến khả năng ra rễ sau 30 ngày 31

Bảng 4.10 Anh hưởng của khoáng da lượng sau 30 ngày quan sát . 32 Bảng 4.11 Ảnh hưởng của khoáng đa lượng đến khả năng ra rễ ở môi trường có bồ sung

than: bout: tinhusau LŨ HE inessetsosetiosdotsagsitsdgEsiglkGoSi385i0,SiS4bBELSQAGG-iB832I3980088039103138g088B 34

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng đến khả năng ra rễ ở môi trường

có bô sung than hoạt tính sau 20 ngày - 2-22 2©2222222E22E+2EE22EE2EE22E22EE2EEzrrrrvres 35

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của khoáng đa lượng đến khả năng ra rễ ở môi trường có bé sung

Bang 4.14 Hình thái của chồi và rễ sau 30 ngày nuôi cấy -2-55-552+ 36

Sự ra rễ của chỗồi khi không có than hoạt tính -zz5552 29

Sự ra rễ tối ưu nhất trên môi trường 1/2 MS -z52:55+2 31

Hình thái của chéi va rễ sau 30 ngày nuôi cấy không có than hoạt tinh .32

Sự ra rễ của chỗi khi có than hoạt tính . -22+z+2z+2z+E+zEzzzzzzzzz+ 34

Hình 4.10 Hình thái của chồi và rễ sau 30 ngày nuôi cấy có bổ sung than hoạt tính 36

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, cùng với sự phát triển của kinh tế - xã hội, nhu cầu sử dụng cây cảnhcũng ngày một tăng theo Trong số cây cảnh đó, trầu bà thanh xuân (Philodendronbipinnatifidum) được biết tới là loài cây sở hữu tán lá to bản, xẻ cách điệu độc đáo vớiphiến lá dày và thân mảnh khánh, vẻ ngoài bắt mắt khiến nó trở thành một trong nhữngcây kiếng lá được ưa chuộng trên thị trường cây cảnh Cây chịu nhiệt tốt và dịu mắt

người nhìn, phù hợp với nhiều mục đích như trang trí nội thất, sân vườn hoặc cắm hoa

mang lại cảm giác tươi mát cho không gian Trầu bà thanh xuân có ý nghĩa phong thủymang lại tài lộc, thịnh vượng, thăng tiến cho gia chủ và còn có khả năng hấp thụ mạnh

các tia bức xạ từ các thiết bị điện tử, các loại khí độc hai dễ bay hơi như aldehydes,

hydrocarbon (Chauhan và ctv, 2017) Không chỉ mang ý nghĩa phong thủy, trầu bà thanhxuân còn là nguồn được liệu dùng đề điều trị các bệnh lý, trích xuất của cây còn có tácdụng chống nhiễm trùng và chống viêm, các chiết xuất có trong cây có khả năng chốngoxi hóa, kha năng kháng khuẩn cao và hoạt tính chống đái tháo đường (Scapninello và

ctv, 2019).

Từ những công dụng trên, có thể thấy được giá trị kinh tế của cây trầu bà thanhxuân Tuy nhiên, việc cung ứng cho thị trường cây cảnh còn ít bởi nguồn cung còn hạnchế, do đó, sử dụng phương pháp nhân giống in vitro được coi là phương pháp hiệu qua

để đáp ứng được nhu cầu thị trường bởi những ưu điểm vượt trội so với các phươngpháp truyền thống như gieo hạt, giâm cành chỉ cho hệ số nhân giống thấp và cần nhiềuthời gian Nhân giống in vitro không chỉ giúp tạo ra cây mẹ với đặc tinh chất lượng vahiệu suất sản xuất cao mà còn giúp bảo tồn nguồn gen của loài cây, ôn định về mặt ditruyền

Từ đó, dé tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây trầu bà thanh xuân”

được thực hiện nhằm cải thiện hệ số nhân giống cũng như khắc phục những nhược điểm

và mặt hạn chế của các phương pháp truyền thống dé đem lại nguồn giống dôồi dao vàchất lượng nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường

1.2 Mục tiêu đề tài

Tìm được nồng độ BA, KI phù hợp dé tạo chéi tối ưu về hệ số nhân chồi và cảchat lượng chồi, hàm lượng khoáng đa lượng phù hợp dé tạo rễ được cây hoàn chỉnh

1.3 Nội dung thực hiện

Kế thừa mẫu có sẵn của đề tài “Khảo sát sự phát sinh phôi và tạo cụm chồi câytrầu bà thanh xuân (Philodendron bipinnatifidum)” (Phan Lê Hải Yến, 2023), từ đó hoànthiện quy trình nhân giống in vitro cây trau bà thanh xuân

Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ KI đến kha năng phát sinh chi.Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh

Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng của khoáng đa lượng đến khả năng

tạo rễ Trong đó, so sánh 2 thí nghiệm tạo rễ giữa môi trường có bồ sung than hoạt tính

và môi trường không có than hoạt tính.

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu chung về cây trầu ba thanh xuân

Loai: Philodendron bipinnatifidum Hình 2.1 Cây trau bà thanh xuân

2.1.2 Nguồn gốc của cây trầu bà thanh xuân

Cây trầu bà thanh xuân hay còn có tên gọi khác như trầu bà tay phật, trầu bà lá

xẻ là loài cây có nguồn gốc xuất xứ từ các khu rừng âm ướt ở Nam Mỹ (Argentina,Brazil, Bolivia và Paraguay) Cây được miêu tả khoa học đầu tiên vào năm 1837 bởiSchott ex Endl, có tên tiếng anh là Leaf Philodrendron Tên khoa học của cây là

Philodendron bipinnatifidum hoặc Philodendron selloum Cây thuộc chi Philodendron

là chi lớn thực vật có hoa thuộc ho Araceae.

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Trau bà thanh xuân có chiều cao trung bình từ 70 cm - 1,5 m Cây dạng bụi nhỏ,thân thảo và có nhiều rễ khí sinh, rễ phụ và rễ chính mọc trên thân cây, các rễ mọc ra từcác đốt Rễ có thé dài từ 0,5 đến 3,0 m Rễ khí sinh có vai trò thu nhận nước và các chấtdinh dưỡng cho cây đồng thời giúp cây bám vào giá thé, rễ chính chủ yếu thu nhận chat

dinh dưỡng và nước để nuôi cây Lá có màu xanh lục với cuống dai, mọc thang lên từ

gốc, tán lá to, mép lá xẻ sâu tựa như lá rách, gân nồi giữa phiến lá, be lá lớn ôm lấy thân.Cây cũng có hoa nhưng rất hiếm gặp, hoa của cây to, dạng mo, phía ngoài lá bọc có màuxanh lục đậm bao lấy bên trong có màu trắng ngà

2.1.4 Điều kiện sinh thái

Ánh sáng, đất, nước và độ 4m là những yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng vàphát triển để có được cây trầu bà thanh xuân đẹp nhất.

Trau bà thanh xuân là loài cây ưa bóng, ưa sự mát mẻ và thông thoáng Vì vậy,chỉ can cung cấp cho cây 1 lượng ánh sáng vừa đủ, không nên trồng cây ở nơi có ánh

sáng quá mạnh Tuy nhiên nếu ánh sáng quá yếu sẽ dẫn đến cây phát triển chậm

Trau bà thanh xuân có thé sinh trưởng và phát trién tốt ở nhiều loại đất khác nhau Déđạt chất lượng tốt nhất thì cây nên được trồng trong nền đất thoáng khí, thoát nước tốt

và giàu dinh dưỡng, min như hỗn hop đất gồm xơ dừa, trâu và tro trau theo tỉ lệ 6 : 3 :

1 Nhu cầu nước tưới của trầu bà thanh xuân không cao, tùy theo cây trồng ở vị trí khácnhau mà có chế độ tưới khác nhau Hạn chế lượng nước khi ánh sáng yếu hoặc nhiệt độthấp Vì là loài cây rừng nhiệt đới nên trầu bà thanh xuân yêu thích độ 4m cao và sẽ pháttriển mạnh ở mức độ ẩm cao tới 70% đến 90% Nhiệt độ tối ưu cho cây trong khoảng

18 - 27°C.

2.1.5 Các phương pháp nhân giống của cây trầu bà thanh xuân

Phương pháp tách cây con: dùng dao cắt từ phía dưới rễ lên, dao phải sạch để

đảm bảo cây được sạch bệnh Sau khi tách cây, chuyên chúng sang môi trường ra rễ vàđến khi chúng phát triển thì chuyển sang các chậu

Phương pháp giâm cành: chọn nhánh cây khỏe, có thân và lá phát triển tốt Tùythuộc vào mỗi loài mà các cảnh được cắt với các đoạn với độ dai khác nhau có chứa cácnốt hoặc lá Chon thân càng dai thì kha năng dự trữ năng lượng dé cung cấp và nuôi

mam lá mới càng lớn Nhung vào các dung dịch có chứa các chất kích thích ra rễ chuyêndùng cho chiết, ghép cành rồi đặt vào giá thé và đặt vào nơi thoáng mát, chú ý giữ ẩm

cho cây Philodendron bipinnatifidum trước đây được nhân giống chủ yêu bằng phươngpháp này, tuy nhiên vì cho số lượng cây nhỏ, số chồi ít do bị hạn chế số cành giâm(Henley và ctv, 2005) do đó hiện nay, người ta thường sử dụng phương pháp nuôi cây

mô để nhân giống

Đối với nhân giống in vitro, phương pháp này vừa có thé chủ động điều chỉnh về

mặt sinh thái, tạo ra môi trường tốt nhất dé cây có thé phát triển một cách tối ưu, vừatạo ra được sé lượng cây lớn, đồng đều và sạch bệnh Cây in vitro khi đã được hoànthiện về mặt hình thái sẽ được đưa ra ngoài tự nhiên dé thích nghi với môi trường tự

nhiên roi đưa vào gia thê.

2.2 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Khái niệm và phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cây mô tế bảo thực vật là một phạm trù chung cho tất cả các loại nuôi cay

mà nguyén liệu là các thực vật hoàn toàn sạch bệnh trên môi trường nhân tao và trong

điều kiện vô trùng (Ngô Xuân Bình, 2009)

Nuôi cay mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cay thuc vat (trong ống nghiệm) đểphân biệt với các quá trình nuôi cấy cây trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm (Ngô

Xuân Bình, 2009).

Ý nghĩa của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dung mô nuôi cấy có kích thước nhỏ,

duy trì và nhân nhanh các nguồn gen hiếm, làm vật liệu cho chọn giống, nhân nhanh với

hiệu quả kinh tế cao

Nuôi cấy mô được xem là một trong những cách nhân giống phổ biến và rộng rãi

được ứng dụng trong sản xuất cây giống hiện nay Đối với các loài thực vật quý hiếm

việc nhân giống với số lượng lớn là việc khó khăn, nhờ áp dụng phương pháp nhân giỗng

vô tính hiện nay mà vấn đề nhân giống cây quý bằng hạt đạt tỉ lệ cao nhưng vẫn áp dụngnhân giống vô tính, là do: các phương pháp cũ nhân giống bằng hạt, mặc dù hệ số giốngcao, dé vận chuyền va bao quản nhưng với một số loài khi nhân giống bằng hạt, các câycon sẽ không giống với đời bố mẹ về đặc điểm hình thái cũng như khác với bố mẹ vềthành phần hoá học Trong sản xuất theo dây chuyền công nghiệp, sự không đồng nhất

về mặt nguyên liệu do đời con khác với bố mẹ của chúng sẽ ảnh hưởng đến chất lượngsản phẩm cũng như giá thành sản phẩm thấp

Đề khắc phục những nhược điểm trên, nhân giống vô tính là một phương pháp tối

ưu đã được áp dụng và mang lại nhiều hiệu quả trong việc nhân giống các loài thực vật

mong muốn Phương pháp này đã khắc phục được nhiều nhược điểm của phương pháp

truyền thống (gieo hạt, giâm, chiết, ghép cành) ưu điểm lớn nhất của phương pháp này

là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ nên

có thé áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng 6n định, rút ngắn thời gian

từ khi trồng đến khi thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với nhữngcây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dai

Ưu điểm của nhân giống in vitro là các hệ số nhân giống cao, sạch bệnh, đồng đều

trong việc phục vụ cho công tác sản xuât cây giông, không phụ thuộc quá nhiêu vào điêu

kiện thời tiết Nhân nhanh cây có nguy cơ tuyệt chủng, bảo tồn đa dạng sinh học, cho ra

cây đồng loạt đồng đều về kiểu hình chất lượng với số lượng lớn so với phương pháp

nuôi trồng thực vật truyền thống (Mousumi và ctv, 2006) Tiết kiệm không gian: Câyngoài tự nhiên cần nhiều không gian để cây sinh trưởng, phát triển Tuy nhiên đối với

phương pháp này được thực hiện hoàn toàn trong phòng thí nghiệm không phụ thuộc

vào thời tiết, không tốn thời gian chăm sóc đồng thời mật độ tạo ra cây nhiều hơn so vớikhi trồng ngoài vườn hoặc trên đồng ruộng Nâng cao chất lượng giống: Với điều kiện

nhân giống trong phòng thí nghiệm nên ta có thé kiểm soát được virus gây bệnh và namgây hại so với điều kiện tự nhiên và tạo ra nhiều giống sạch bệnh có khả năng chịu hạn,

chịu rét, chịu mặn cao Sản xuất quanh năm: Hoàn toàn điều chỉnh các tác nhân dinh

dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ Có thê tiến hành nhân giống quanh năm và bảo quản giống

cây trong thời gian dài Tối đa nguồn giống: Có khả năng tạo ra cây hoàn chỉnh từ một

mô nhỏ kích thước từ 1 10 mm, trong khi phương pháp truyền thống cần ít nhất là 5

-20 cm cơ quan sinh dưỡng của cây.

Nhân giống vô tinh in vitro hay nhân giống cây trồng là một trong những lĩnh vựcứng dụng tính hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô thực vật Bao gồm: nuôi cấyđơn bào; nuôi cấy cây trưởng thành và cây con; nuôi cấy mô sẹo (mô seo); nuôi cay phôi(trưởng thành và phôi non); nuôi cấy cơ quan (lá, rễ, hoa, thân, bao phan, noãn chưa thụtinh, quả); nuôi cay protoplast (nuôi cấy phần bên trong của tế bào thực vat sau khi tách

vỏ được gọi là nuôi cay té bao tran) (Claudia va ctv, 2018) Cong nghé tang sinh nhanh

in vitro có các công dụng sau: duy tri va tăng sinh nhanh các mẫu gen quý hiếm, dùnglàm nguyên liệu cho công tác nhân giống; sinh sản nhanh và duy trì chất lượng tốt, cungcấp hạt giống các loại cây trồng như cây lương thực có củ, rau, hoa, cây cảnh, cây thuốcnam; nhân giống nhanh các loài cây lâm nghiệp quý, kiểu gen gốc ghép; tái nhiễm nhanhchóng và phân lập tái nhiễm kết hợp với sạch vi rút trong điều kiện vô trùng; bảo quảncác bộ hạt giống vô tính và cây lai trong ngân hàng gen

Nhân giống in vifro còn một số nhược điểm chưa tránh khỏi: trong việc nuôi cay

in vitro sử dụng nguồn hydrocacbon nhân tạo nên khả năng tổng hợp các hợp chất hữu

cơ thấp, cây nuôi cay in vitro được cấy trong lọ thủy tinh có nước bão hòa nên khi đượctrồng ngoài môi trường tự nhiên thì cây có hiện tượng bị mat nước và không thé thíchứng được với điều kiện tự nhiên Sản phẩm bị hạn chế về chủng loại

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm: nuôi cấy đỉnh sinh trưởng,

nuôi cây mô sẹo, nuôi cây tê bào đơn, nuôi cây protoplast - chuyên gen (Dương Công

Kiên, 2002).

2.2.2 Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy mô

Theo Nguyễn Đức Lượng và ctv), quá trình nhân giống in vitro được chia thành

các giai đoạn sau:

Giai đoạn chuẩn bị cây mẹ: để tạo ra được cây con sạch bệnh thì phải lựa chọnđược nguồn cây mẹ ban đầu phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kínhhoặc trong phòng tăng trưởng Cây mẹ phải được bón phân và phun thuốc trừ sâu bệnh

chu đáo.

Giai đoạn khử trùng mẫu cấy: khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm rửa mẫu, tiếptheo là khử trùng mẫu cấy Giai đoạn này nhằm mục đích thu được các mẫu vô trùng và

có khả năng sinh trưởng.

Giai đoạn tăng sinh mô: phôi soma thường được sinh ra từ mô sẹo hơn là từ huyềnphù tế bao Các phôi được tạo ra từ tế bào soma nhưng lại phát sinh hình thái như phôi

hữu tính, từ phôi sau đó phát triển thành một cây nguyên vẹn Tăng cường sự phát triển

chồi bên: mẫu cấy có mang một chéi đơn sẽ phát triển thành một chỗồi hay thành mộtcụm chéi tùy thuộc vào loài thực vật và môi trường cấy, chéi bên sẽ được hình thànhtrên chồi ban đầu, các cây con được tạo ra sau nhiều lần cấy chuyền Cytokinin với nồng

độ 1 + 30 mg/1 có thể sử dụng dé kích thích sự tăng sinh chéi bên

Giai đoạn ra rễ in vitro: ở giai đoạn này, tùy thuộc vào từng loài thực vật khácnhau mà bé sung vào môi trường nuôi cấy các chất kích thích ra rễ khác nhau Một sốloài không cần môi trường cảm ứng mà vẫn có thể trực tiếp ra rễ, tuy nhiên, vẫn có

những loài đòi hỏi phải có sự hiện diện của auxin, cytokinin với các nồng độ khác nhau

Đôi khi chính cytokinin còn tôn tại trong môi trường nhân giống đã cản sự ra rễ của choitrong giai đoạn ra rễ

Giai đoạn ra rễ ngoài vườn ươm: cây in vitro được cay vào trong một hỗn hợp cochất 4m dé giúp cho sy ra rễ có thé là than bùn, đất cát, đá nhỏ, vỏ cây, môi trường có

pH trung tính hoặc hơi acid.

Trồng thành vườn gốc với các cây giống được chăm sóc và theo dõi kĩ đặc điểmhình thái Cây sạch bệnh và đang giai đoạn sinh trưởng khỏe mạnh, đây chính là nguồnnguyên liệu quan trọng cho kỹ thuật nuôi cây mô tế bào thực vật

2.2.3 Các hiện tượng bất thường trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Hiện tượng hóa nâu mẫu: hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa các hợp

chất Tannin và Hydroxyphenol, các hợp chất này có nhiều trong mô già hơn trong mô

non, các phân tử Phenol làm nâu mẫu Cattleya là Eucomic acid và Tyramine chúng làmcho mẫu bị hóa nâu hay hóa đen làm cho mẫu bị hư hỏng hoặc khả năng sinh trưởng củamẫu bị ngăn chặn Đối với cây Philodendron, việc bỗ sung thêm mannitol làm gia tănghàm lượng chlorophyll trong lá nhưng không cải thiện được sự sinh trưởng Đối với câyhạnh nhân và cây 6 liu, rất nhiều loại carbohydrate được thử nghiệm trong đó 4,5%

fructose làm giảm đáng ké hiện tượng thủy tinh thé (Bahmani và ctv, 2009)

Hiện tượng thủy tinh thể: trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủytinh thé mẫu nuôi cấy Khi chuyền ra khỏi bình nuôi cay, cây con dé bị mat nước và tỷ

lệ sống sót thấp Dé hạn chế quá trình thủy tinh thé một phương pháp hiệu quả nhất được

nhiều người ủng hộ là làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôicấy bằng cách tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh sáng,

trao đối khí) thích hợp (Hà Thị Mỹ Ngân và ctv, 2020) Ngoài ra gần đây, các nghiên

cứu đã cho thấy việc sử dụng nano bạc (AgNPs) cũng giúp hạn chế hiện tượng thủy tinhthê trong vi nhân giống một số loại cây trồng AgNPs hạn chế hiện tượng thủy tinh thểtrong vi nhân giống cây dâu tây (Duong Tan Nhựt va ctv, 2014), cây hoa đồng tiền (HàThị Mỹ Ngân và ctv, 2019) Đối với cây Philodendron, việc bỗ sung thêm mannitol làmgia tăng hàm lượng chlorophyll trong lá nhưng không cải thiện được sự sinh trưởng Đốivới cây hạnh nhân và cây ô liu, rất nhiều loại carbohydrate được thử nghiệm trong đó4,5% fructose làm giảm đáng kể hiện tượng thủy tinh thé (Bahmani va ctv, 2009)

2.2.4 Sự ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng là yếu tố quan trọng trong việc quyết định kết quả nuôi

cay mô tế bào thực vật, chúng điều khiển sự phát sinh hình thái và tái sinh cây hoànchỉnh Trong đó, thường được sử dụng là auxin và cytokinin.

Đề nhân nhanh in vitro, trong giai đoạn đầu cần phải điều khiển mô nuôi cay phát

sinh nhiều chồi dé tăng hệ số nhân Vì vậy, người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi

trường nuôi cay Dé tạo cây hoàn chỉnh người ta tách chdi vào cay trong môi trường cóhàm lượng auxin cao dé kích thích ra rễ nhanh Sự cân bằng auxin/cytokinin trong môitrường nuôi cấy quy định sự phát sinh rễ hay chồi Nong độ va tỷ lệ của các chất kích

thích phụ thuộc vào các loài khác nhau, các giai đoạn nuôi cấy khác nhau Tỷ lệauxin/cytokinin cao thì kích thích sự ra rễ, thấp thì kích thích sự ra chồi và trung bình

thì hình thành mô sẹo (callus).

Các chất thuộc nhóm auxin được sử dụng là JAA, a-NAA và các chất thuộc nhómcytokinin là kinetin, axit benzoic hoặc lay từ dung dịch hữu cơ như nước dừa, dịch chiếtnam men Ngoài các chất kích thích sinh trưởng và dịch hữu cơ, còn bổ sung thêm cáchợp chất như đường, axit amin, lipit, một số vitamin, các nguyên tổ da và vi lượng vào

môi trường nuôi cấy

Auxin: auxin được gọi là hormon sinh trưởng do Went và Thimann (1937) phat

hiện Auxin có một số tác dụng sinh lý sau: auxin có tác động kích thích nhiều hoạt động

sinh trưởng, làm giãn tế bào, đặc biệt theo chiều ngang làm tế bao phình ra; hoạt động

của tầng phát sinh; sự hình thành rễ: vai trò của auxin cho sự phân hóa rễ thể hiện rất rõtrong nuôi cay mô, việc sử dụng auxin dé kích thích ra rễ rất quan trọng và bat buộc;hiện tượng ưu thế ngọn: khi chồi ngọn hoặc rễ chính sinh trưởng sẽ ức chế sinh trưởngcủa chéi bên và rễ; tính hướng động của thực vật (hướng sáng và hướng đất), sự sinh

trưởng của quả và tạo ra quả không hạt.

Có 4 loại auxin được sử dụng trong nuôi cay mô la IAA, IBA, NAA va 2,4 - D

Trong đó, IBA là auxin nội sinh có trong nhiéu loài cây cà tím, có vai trò đến tăng trưởng

và phát triển của cây trồng, kích thích sự ra rễ nhanh chóng Quá trình sinh tong hợpIBA trong Ngô (Zea mays L.) liên quan như tiền chất trực tiếp là IAA IAA thành IBAbằng cách sử dung ATP và acetylCoA làm đồng yếu tố Acid indole - 3 -acetic (IAA) làmột phytohormone quan trọng kiểm soát sự phát triển của cây trồng theo mục đích sửdụng Có ba con đường chính tổng hop IAA là con đường indole - 3 - pyruvic acid,indole - 3 - acetamide và indole - 3 - acetonitril Naphthalene Acetic Acid (NAA) là chấtđiều hòa sinh trưởng thực vật tong hợp thuộc nhóm auxin NAA có tác dụng hình thành

rễ đặc biệt là rễ bất định phát sinh từ các cơ quan dinh dưỡng, phát sinh chi, sự già của

lá, rụng lá, quả, ra hoa sự hình thành quả; kéo dải tế bào và phát triển mô IAA, NAA,2,4 — D là các auxin nhân tao thì có hoạt tính mạnh hơn bởi cấu trúc phân tử bền vững

nên ít bị oxy hóa bởi các enzyme.

Nếu auxin tăng ưu thé ngọn thì ngược lai cytokinin lại làm yếu ưu thé ngọn, kíchthích các chồi bên sinh trưởng Do đó, mức độ ưu thé ngọn phụ thuộc vào tỉ lệ

auxin/cytokinin, càng gân chôi ngọn thì tỉ lệ càng lớn và ưu thê ngọn càng mạnh mẽ và

ngược lại Việc sử dụng hàm lượng auxin và tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trường nuôi

cây quyết định sự phân hoá của tế bào theo hưởng tạo mô sẹo, tạo rễ tạo chéi hay tao

phôi soma.

Cytokinin kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ, chúng hoạt hóa mạnh sự tông hợp

axit nucleic và protein Cytokinin có vai trò quan trọng trong phân chia tế bào và kích

thích sự hình thành chồi (Sakakibara, 2006) Dé tăng hệ số nhân giống, người ta tăngnồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro Cytokinin

kìm hãm sự già hóa của cơ quan va của cây nguyên vẹn.

Các cytokinin thường được sử dung là: Kinetin (6 — furfuryl - aminopurin), hình

thành từ chế phẩm DNA ở điều kiện nhiệt độ cao, zeatin tự nhiên cũng là một dẫn xuất

của adenin va BAP (6 — benzin - aminopurin) Tac dụng của chúng tương tự nhau nhưng

hoạt tính của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bền vững hơn zeatin dưới tác độngcủa nhiệt độ cao, zeatin chỉ dùng trong những trường hợp đặc biệt vì quá đắt

Bên cạnh các chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển

của thực vật, trong nuôi cay in vitro con anh hưởng bởi ham lượng khoáng da lượng cótrong môi trường Tùy theo các đối tượng nuôi cấy ma hàm lượng các chất khoángnày cũng khác nhau, do đó việc điều chỉnh môi trường nuôi cây là một trong những

phương pháp đề làm gia tăng hiệu quả của quá trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật Một

số nghiên cứu cho thấy sự ảnh hưởng của thành phần có trong khoáng đa lượng như hàmlượng phosphate trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bàoPanax ginseng và Panax quinquefolium (Liu &Zhong, 1998) hay các chất khoáng ảnhhưởng đến sự hình thành rễ bên của loài Dracaena fragrans trong nuôi cay in vitro vàkhi giảm hàm lượng các chất khoáng đa lượng sẽ kích thích sự hình thành rễ bất định

(Vmterhalter, 1992).

2.2.5 Các nghiên cứu liên quan trong và ngoài nước

2.2.5.1 Nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu nhân giống cây trau bà dé vương đỏ (Philodendron ‘Imperial Red’) từmẫu ch6i nuôi cấy in vitro Kết quả thu được trong nghiên cứu này cho thấy, môi trường

MS (Muraghige và Skoog) được bổ sung 1,5 mg/l benzyl adenine (BA) là môi trườngthích hợp cho giai đoạn nhân nhanh, với sỐ lượng chồi mới tạo thành 6,5 chồi/mẫu sau

6 tuần nuôi cay Sau đó, chồi được chuyên sang môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l

indole — 3 - butyric aicd (IBA) dé tạo rễ Sau 8 tuần nuôi cấy ở điều kiện in vitro, ty lệ

cây con ra rễ 100% với trung bình 14,55 rễ/mẫu, chiều dài đạt 4,38 cm và số lá dat 6,83

Các cây con sau đó thích nghỉ tốt khi được đưa ra trồng ở điều kiện vườn ươm, với tỷ lệsong 100%, trung bình chiều cao cây 6,80 cm, chiều dai lá 5,27 cm, chiều rộng lá 2,90

cm, khí không và chỉ số SPAD của cây ở các giai đoạn nuôi trồng khác nhau cũng được

quan sát ở nghiên cứu này (Trịnh Thị Hương và ctv, 2023).

Quy trình nhân nhanh in vitro cây trầu bà cánh phượng (Philodendrom xanadu)

được xây dựng dựa trên các thí nghiệm nuôi cây khởi động, nhân nhanh và tạo rễ cho

chỗi in vitro Trong giai đoạn nuôi cấy khởi động, nghiên cứu đã tiễn hành nuôi cấy chdiđỉnh trên các môi trường MS có bồ sung benzyl adenine (BA) hay kinetin (KI) Kết quacho thấy, môi trường MS bổ sung 4,0 mg/I BA là môi trường tối ưu, với 5,01 chồi/mẫusau 4 tuần nuôi cấy Nghiên cứu cũng đã tiến hành thí nghiệm sự ảnh hưởng phối hopcủa cytokinin (BA) với auxin (IAA, IBA) dé xác định môi trường nhân nhanh thích hợp.Trên môi trường nền MS có chứa 4,0 mg/1 BA thì việc bổ sung thêm IAA hay IBAkhông làm tăng hệ số nhân nhanh, a - NAA hay than hoạt tính đều có ảnh hưởng tích

cực đến sự hình thành rễ của chéi in vitro Môi trường MS có bồ sung 1 g/l than hoạt

tính là môi trường ra rễ thích hợp nhất sau 4 tuần nuôi cấy Sau giai đoạn nhân in vitro,các cây con được chuyền sang điều kiện vườn ươm trên bốn loại giá thê Tỉ lệ sống củacây con trên các giá thé khác nhau đạt 100% sau bốn tuần ra cây, trong đó, giá thé xơ

dừa:trâu hun (tỉ lệ 1 : 1) cho chất lượng cây tốt nhất (Pham Thị Thu Hang va ctv, 2013)

Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Đề vương lá xanh (Philodendron erubescens

‘Imperial Green’) sử dụng phương pháp nuôi cây mô tế bào thực vật dé xác định thànhphan chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho việc nhân giống in vitro và chuyên cây Dé

vương lá xanh ra vườn ươm Kết quả nghiên cứu cho thấy: môi trường MS có bồ sung

BA (0,1 mg/l) thích hợp cho quá trình nuôi cấy tạo chéi in vitro Giai đoạn ra rễ và tạocây hoàn chỉnh cần IAA (1,0 mg/l), nước dừa 20 % Thanh phần giá thé gồm mụn dừa

90 %, phân bò 5 %, tro trâu 5 % thích hợp dé chuyền cây Dé vương lá xanh ra vườn

ươm (Mai Thị Phương Hoa và Đỗ Tiến Vinh, 2023)

Nghiên cứu “Khảo sát sự phát sinh phôi và tạo cụm chỗi cây trau bà thanh xuân(Philodendron bipinnatifidum)” xác định môi trường thích hợp dé tao mô seo, phát sinhphôi và tái sinh chdi, xác định ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến

khả năng tạo cụm chồi và tạo rễ của cây trầu bà thanh xuân Kết quả cho thấy sau 6 tuần

nuôi cấy, môi trường MS có bô sung 1,0 mg/l BA và 1,0 mg/1 2,4-D cho sự tạo mô sẹo

tốt nhất với tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 96,67% Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS bổ

sung 0,3 mg/l NAA kết hợp với 1,5 mg/I BA cho sự phát triển phôi tốt nhất, sau 6 tuầnnuôi cấy cho tỷ lệ phôi tái sinh chồi cao nhất 80,95%, với số chổi trung bình đạt 10,76

Môi trường MS có bé sung 2,0 mg/I BA thích hợp cho sự tạo cụm chồi với số chồi trung

bình là 10,00, số lá trung bình là 13,71 lá và chiều cao trung bình của cây đạt 2,69 cm.Môi trường MS có bồ sung 0,1 mg/l NAA phù hợp cho sự tạo rễ, trên môi trường nay,cây in vitro có chiều cao trung bình là 2,43 cm với trung bình 5,43 rễ, chiều dài rễ trungbình đạt 5,18 em sau 30 ngày nuôi cấy (Phan Lê Hải Yến, 2023)

Nghiên cứu quy trình nhân nhanh in vitro cây trầu bà cánh phượng(Philodendrom xanadu) được xây dựng dựa trên các thí nghiệm nuôi cấy khởi động,nhân nhanh và tạo rễ cho chồi in vitro Nuôi cấy chồi đỉnh trên các môi trường MS có

bồ sung benzyl adenine (BA) hay kinetin (KI) Kết quả cho thấy, môi trường MS bổ

sung 4,0 mg/l BA là môi trường tối ưu, với 5,01 chồi/mẫu sau 4 tuần nuôi cấy Nghiên

cứu tiến hành thí nghiệm sự ảnh hưởng phối hợp cua cytokinin (BA) với auxin (IAA,IBA) để xác định môi trường nhân nhanh thích hợp Trên môi trường nền MS có chứa4,0 mg/l BA thì việc bổ sung thêm IAA hay IBA không làm tăng hệ số nhân nhanh vaơ- NAA hay than hoạt tính đều có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành rễ của chồi in

vitro Môi trường MS có bồ sung 1 g/l than hoạt tinh là môi trường ra rễ thích hợp nhất

sau 4 tuần nuôi cấy Sau giai đoạn nhân in vitro, các cây con được chuyền sang điềukiện vườn ươm trên bốn loại giá thể Tỉ lệ sống của cây con trên các giá thể khác nhau

đạt 100% sau bốn tuần ra cây, trong đó, giá thé xơ dita:trau hun (tỉ lệ 1 : 1) cho chat

lượng cây tốt nhất (Phạm Thị Thu Hằng và ctv, 2013)

2.2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước

Nghiên cứu mô tả quá trình nhân giống in vitro và thích nghi in vitro củaPhilodendron erubescens công chúa hồng Dé tăng sinh chồi, thé giống protocorm củaPhilodendron công chúa hồng được nuôi cấy trên môi trường Murashige và Skoog (MS)rắn có bố sung 6-benzylaminopurine (BAP) và axit 1-naphthaleneacetic (NAA) ở cácnồng độ khác nhau Kết quả cho thay rang chỉ bổ sung BAP ở nồng độ 1,0 mg/ mang lại

số lượng chồi và lá tối đa Việc áp dung BAP ở mức 1,0 mg/l đã tăng cường đáng kékhả năng nhân ch6i của Philodendron công chúa hồng khi được trồng trong môi trường

MS lỏng, mang lại 11,2 chồi/mẫu và 4,7 lá/mẫu Khi các chồi non đã hình thành được

tạo rễ bang cách sử dụng môi trường MS rắn có bồ sung các loại và nồng độ auxin khác

nhau, axit indole-3-butyric (IBA) ở mức 3 mg/l mang lại số lượng rễ cao nhất (3,2ré/mau) và chiều dài rễ dài nhất (1,9 cm) Ba vật liệu bố sung bao gồm rêu than bùn,

vermiculite và đá trân châu, được sử dụng làm giá thé trồng cây dé thích nghi với điều

kiện in vitro của cây con Philodendron công chúa hồng Kết quả chứng minh rằng câycon in vitro thích nghỉ với điều kiện và có tỉ lệ sống sót tương đối cao trong tất cả các

môi trường trồng mà không có bất thường về hình thái Rêu than bùn vượt trội hơn tất

cả các loại giá thé trồng khác về mặt duy trì sự phát triển sinh dưỡng của cây con Trongtương lai, phương pháp được thiết lập trong nghiên cứu này có thé được sử dụng dé sảnxuất rộng rãi Philodendron công chúa hồng (Klanrit và ctv, 2023)

Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình vi nhân giống Philodendron cây ren bằng cách sửdụng mẫu chồi.mSự tái sinh chồi nách đã được nghiên cứu trên môi trường Murashige

và Skoog (MS) với các loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau,

nồng độ muối trung bình MS, nồng độ sucrose, cường độ ánh sáng và kiểu nuôi cấykhác nhau Bồ sung 6 - benzylaminopurine (BAP; 1 mg/l) làm tăng đáng ké khả năngnhân chổi so với các cytokinin khác và sự kết hợp giữa cytokinin va auxin axit indole -

3 - butyric (IBA) và axit axetic naphthalene (NAA), mang lại kết quả nhiều chồi hơn sovới chỉ cytokinin, với số lượng chổi nách lớn nhất (11,4 trên mỗi mẫu) thu được bằng

cách sử dụng cả BAP (1 mg/l) và IBA (0,5 mg/1) Việc sử dụng nồng độ muối nửa nồng

độ làm giảm đáng ké sự nhân chồi và nồng độ sucrose cao (> 30 g/l) làm giảm sự pháttriển của mẫu Cường độ ánh sáng cao cũng làm giảm sự nhân lên và phát triển của chỗi,

do ức chế quang học và sự nhân lên của chéi hiệu qua hơn trong nuôi cấy gel, trong khi

sự phát triển của chồi cao hơn trong nuôi cấy chất lỏng/lò phản ứng sinh học Ra rễ thành

công tốt nhất (100%) và số lượng rễ cũng như trọng lượng tươi lớn nhất thu được khi sửdụng môi trường MS bổ sung NAA (1 — 2 mg/l) Các cây con thu được đã thích nghỉthành công với tỷ lệ sống sót là 100% và có hình thái tương tự như cây mẹ (Asma và

ctv, 2020).

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 7 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023 tại chi nhánh

Công ty Cé phần Công nghệ Sinh học TPECO, số 178A đường Nguyễn Ai Quốc, thànhphố Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây trầu bà thanh xuân (Philodendron bipinnatifidum)mẫu nuôi cấy ban đầu sử dung là mẫu chdi in vitro tại Công ty Cổ phần Công nghệ Sinhhọc TPECO Chọn các chồi sinh trưởng khỏe mạnh, không nhiễm nam, khuẩn, có hìnhthái rõ ràng, không biến dị trên các bộ phận của chồi, tương đồng về chiều cao và kích

thước giữa các chôi.

3.2.1 Trang thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị bao gồm: Nồi hấp khử trùng với nhiệt độ 121°C, áp suất 1,2 atm dùng

dé hấp môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy và các thiết dụng cụ thí nghiệm; tủ cay vôtrùng dé thực hiện thao tác cấy, hộp gia nhiệt để khử trùng dụng cụ cấy Bên cạnh đócòn sử dụng thêm các thiết bị khác như tủ lạnh, cân kỹ thuật, máy đo pH

Các dung cụ được sử dụng dé pha môi trường bên ngoài bao gồm: pipette, ống

đong, bình định mức, phéu; dung trong tu cay: đèn cồn, bình xịt cồn, đĩa cay, dao cay,

pence, giấy cấy, hũ nhựa đã được hap khử trùng trước khi sử dung

3.2.2 Hóa chất và môi trường

Sử dụng than hoạt tính (Actived charcoal - AC) và các chất điều hòa sinh trưởng

thực vật gồm: BA (6 - Benzyladenine), Kinetin (6 - Furfurylaminopurine) được bốsung các nồng độ khác nhau tùy theo từng nghiệm thức

Môi trường được sử dụng trong đề tài là MS - môi trường cơ bản trong nuôi cay

mô tế bao thực vật (Muraskige và Skoog, 1962) trong đó có bổ sung 30 g/l đường, 5,2ø/1 agar Tùy thuộc vào từng thí nghiệm sẽ bé sung các chất điều hòa sinh trưởng thực

vật khác nhau Giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng là 5,8 - 5,9 Môi

trường nuôi cay được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,2 atm trong 18 phút.Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS

Vi luong KI 0,83

MnSO4.4H2O 22,3 Na2Mo04.2H20 0,25 ZnSO4.7H20 8,6 Fe- EDTA Na2EDTA.2H2O 37,3

FeSO4.7H2O 27,8 Glycine 2,00

es Myo-Inositol 100

Nicotinic acid 0,50 Pyridoxine HCl 0,50 Thiamine-HCl 0,10

(Theo Murashige va Skoog, 1962)

3.2.3 Điều kiện nuôi cấy

Mau cấy của các nghiệm thức sau khi cay phải được dé trong điều kiện nuôi cấythích hợp Nhiệt độ nuôi cay thường dao động từ 25 - 28°C dé tốt cho sự phát triển của

lá in vitro Thời gian chiếu sáng trung bình từ 16 - 18 giờ với cường độ chiếu sáng thíchhợp là 15 W/m? /s là hai yếu tố quan trọng đối với sự tăng trưởng và tích lũy các hợp

chat thứ cấp của thực vật nuôi cấy in vitro Độ âm trung bình từ 60 - 80% sẽ phù hợpnhất dé mẫu không bị mat nước trong quá trình nuôi cấy.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ KI đến khả năng phat sinh tạo chỗồi

Mục tiêu thí nghiệm: xác định được nồng độ Kinetin thích hợp dé phat sinh tao

chéi cho cây trau bà thanh xuân

Cách tiến hành: mẫu chồi sau khi được nuôi cay in vitro sach khuan va nam sé

được dem tach ra thành chồi lẻ, sử dụng các chồi có chiều cao tương đồng từ 2,5 - 3 cm

sau đó cắt bỏ phan rễ, những lá già và úa sau đó cây vào môi trường nuôi cay MS có bésung chất điều hòa sinh trưởng KI có nồng độ thay đồi từ 0,0 - 0,8 mg/1 Mẫu sau khi

cay sẽ được nuôi dưỡng và bảo quản trong điều kiện ánh sáng thích hợp dé phát sinh tạo

chôi

Bồ trí thí nghiệm đơn yếu tố bao gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 3lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 9 mẫu Tổng số mẫu thí nghiệm là 135 mẫu Theo dõi và ghinhận chỉ tiêu sau 10, 20, 30 ngày nuôi cấy

Bang 3.2 Ảnh hưởng nồng độ KI (mg/l) đến quá trình phát sinh tạo chéi

Nghiệm thức Môi trường Nông độ SO mau

Chỉ tiêu theo dõi:

» Tổng số mẫu tạo choi

¥ Tổng số mẫu của nghiệm thức

Ty lệ mẫu tạo chỗi (%) = x 100

¥ Tổng số choi

SỐ Shot ining bink fehor)— ¥ Tổng số mẫu của nghiệm thức

(Chi tính những chéi có kích thước từ 0,2 em trở lên)

» Tổng chiều cao chồi

¥ Tổng số chồi của nghiệm thức

Chiều cao trung bình của chéi (cm) =

(Đo các mâu chôi có kích thước từ 0,2 cm trở lên, chiêu cao được tính từ gôc của chôi cho dén phân ngọn cao nhat của lá)

¥ Tổng số lá

SỐ lá trung bình (lá) = ¥ Tổng số chồi của nghiệm thức

(Chi tính những lá đã mở hoàn chỉnh, tính ca trên và dưới bề mặt thạch)

Tình trạng mẫu (màu sắc, hình dạng chéi, lá)

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi

Mục tiêu thí nghiệm: xác định được nồng độ BA thích hợp dé nhân nhanh chéivới hệ số nảy chỗồi cao nhất và chat lượng chỗi tốt nhất

Cách tiến hành: mẫu chồi sau khi được nuôi cay in vitro sach khuan va nam séđược đem tach ra thành chồi lẻ, sử dụng các chồi có chiều cao tương đồng từ 2,5 - 3 cm

sau đó cắt bỏ rễ, lá già, úa và cây vào môi trường nuôi cây MS có bồ sung chất điều hòa

sinh trưởng BA có nồng độ thay đổi từ 0,0 - 2,0 mg/1 kèm với 0,2 mg/l KI trong mỗinghiệm thức Mẫu sau khi cấy sẽ được nuôi dưỡng và bảo quản trong điều kiện ánh sángthích hợp dé phát sinh tạo chôi

Bồ trí thí nghiệm đơn yếu tố bao gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 3lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 9 mẫu Tổng số mẫu thí nghiệm là 135 mẫu Theo dõi và ghinhận chỉ tiêu sau 10, 20, 30 ngày nuôi cấy

Bảng 3.3 Anh hưởng nồng BA (mg/l) đến quá trình nhân nhanh chồi

Nghiệm Môi BA (mg/l) KI Số mau

Ð% Tổng số mẫu tạo chồi

¥ Tổng số mẫu của nghiệm thức x 100

Ty lệ mẫu tạo chồi (%) =

% Tổng số chồi

BO CHÔI thang, binh (ener) ¥ Tổng số mẫu của nghiệm thức

(Chỉ tính những chỗồi có kích thước từ 0,2 em trở lên)

3 Tổng chiều cao chồi

¥ Tổng số chéi của nghiệm thức

Chiều cao trung bình của chéi (cm) =

(Đo các mẫu chỗi có kích thước từ 0,2 em trở lên, chiều cao được tính từ gôc của chôi

cho đên phân ngọn cao nhât của lá)

3 Tổng chiều cao

3 Tổng số chồi của nghiệm thức

Chiều cao trung bình (cm) =

¥ Tổng số lá

¥ Tổng số choi của thí nghiệm

Số lá trung bình (lá) =

(Chi tính những lá đã mở hoàn chỉnh, tinh cả trên và dưới bề mặt thạch)

Tình trạng mẫu (màu sắc, hình dạng chi, lá)

3.3.3 Khảo sát hàm lượng khoáng đa lượng và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ

Mục tiêu thí nghiệm: tìm được môi trường tối ưu nhất đề tiết kiệm chỉ phí và phùhợp sản xuất qua thực hiện khảo sát so sánh 2 thí nghiệm giữa môi trường có than hoạt

tính và môi trường không có than hoạt tính.

3.3.3.1 Môi trường không bỗ sung than hoạt tính

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của khoáng đa lượng đến sự tạo rễ

Nghiệm thức Môi trường Số mẫu (mẫu/LLL)

Cl MS 9

C2 MS 1/2 9 C3 MS 1/3 9 C4 MS 1/4 9

C5 MS 1/5 9

Cách tiến hành: mẫu trau bà thanh xuân sau khi được nhân chéi in vitro sạch

khuẩn và nắm từ thí nghiệm I sẽ được đem tách ra thành chéi lẻ, sử dụng các chồi có

chiều cao tương đồng từ 3,0 - 3,5 cm sau đó cắt bỏ rễ, lá già và ta dé cay vào môi trườngnuôi cây MS có nồng độ khoáng đa lượng giảm dan MS, 1/2 MS, 1/3 MS, 1/4 MS, 1/5

MS Mẫu sau khi cấy vào môi trường sẽ được nuôi dưỡng và bảo quản trong điều kiệnánh sáng thích hợp dé tạo rễ

Bồ trí thí nghiệm đơn yếu tố bao gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 3lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 9 mẫu Tổng số mẫu thí nghiệm là 135 mẫu Theo dõi và ghi

nhận chỉ tiêu sau 10, 20, 30 ngày nuôi cấy

Chỉ tiêu theo dõi

»% Tổng số mẫu của nghiệm thức

Chiều dài trung bình của rễ (cm) =

¥ Tổng số lá

¥ Tổng số mẫu của nghiệm thức

Số lá trung bình (lá) =

(Chỉ tính những lá đã mở hoàn chỉnh, tính cả trên và đưới bề mặt thạch)

Tình trạng mẫu (màu sắc, hình dạng chéi, la)

3.3.3.2 Môi trường có bo sung 0,1 g than hoạt tinh

Cách tiễn hành: mẫu trau bà thanh xuân sau khi được nhân chỗi in vitro sạch khuẩn

và nam từ thí nghiệm 1 sẽ được đem tách ra thành chồi lẻ, sử dụng các chồi có chiều cao

tương đồng từ 3,0 - 3,5 cm sau đó cắt bỏ rễ, lá già và úa dé cấy vào môi trường nuôi cay

MS được bồ sung 0,1 g/l than hoạt tính và có nồng độ khoáng đa lượng giảm dan MS,1/2 MS, 1/3 MS, 1/4 MS, 1/5 MS Mẫu sau khi cay vào môi trường sé được nuôi đưỡng

và bảo quản trong điều kiện ánh sáng thích hợp dé tạo rễ

Bồ trí thí nghiệm đơn yếu tố bao gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 3 lần

lặp lại, mỗi lần lặp lại 9 mẫu Tổng số mẫu thí nghiệm là 135 mẫu Theo dõi và ghi nhận

chỉ tiêu sau 10, 20, 30 ngày nuôi cấy

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng đến sự tạo rễ

Nghiệm Môi Than hoạt tính Số mẫu

¥ Tổng số chồi của nghiệm thức

Chiều dài trung bình của rễ (cm) =

® Tổng số lá

¥ Tổng số mẫu của nghiệm thức

Số lá trung bình (lá) =

(Chỉ tính những lá đã mở hoàn chỉnh, tính cả trên và dưới bề mặt thạch)

Tình trạng mẫu (màu sắc, hình dạng chéi, 1a)

3.4 Phuong pháp xử ly số liệu

Số liệu thu thập được xử lý trên máy tính bằng phần mềm Excel sau đó được phân

tích ANOVA đơn yếu tố bằng phần mềm MINITAB 16.2.4 Đọc kết qua dựa vào bang

ANOVA, phương pháp Turkey multiple range test, bảng trung bình và bảng so sánh khác biệt giữa các nghiệm thức.

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Ánh hưởng của Kinetin đến khả năng phát sinh chồi

Mẫu chỗi sau khi được nuôi cấy vào môi trường có bố sung KI với các nồng độkhác nhau phát triển sau 10 ngày nuôi cấy được thé hiện như bảng sau

Bảng 4.1 Chỉ tiêu quan sát của chỗồi sau 10 ngày nuôi cấy

Nghiệm KI bả: : sone hình Chiều cao chéi Sốlá trung bìthức (mg/l) : (%) Cals ầ 5 trung binh (cm) nh (14)

Al 0,0 19,47° 1,15°+0,06 2,537+ 0,13 2,86°+ 0,31

A2 0,2 25,246 = 1,267 +.0,06 = 2,74 + 0,14 ~—- 3,63 + 0,05A3 04 30,05% 13341011 2/78 + 0,04 3,75” + 0,15A4 0,6 35,067 137P1011 2,887+0,07 4,407+0,11

AS 0.8 37,442 14422006 2,917+0,09 4,637 + 0,33

CV (%) 13,36 6,11 3,39 4,93

Các giá trị trung bình trong cùng một cột có các ky tu khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về

thong kê p< 0,05 Các số liệu % đã được chuyển đổi theo công thức aresin(x)!2 ˆ trước khi xử

lý thống kê.

Kết quả quan sát sau 10 ngày nuôi cấy các nghiệm thức đều tăng dần về các chỉtiêu với số chồi dao động từ 1,15 - 1,44 chồi và tỉ lệ tạo phát sinh chồi lên tới 37,44%,

chiều cao chồi trong khoảng dao động từ 2,02 - 2,49 cm và số lá từ 2,86 - 4,63 lá Trong

đó, ở nghiệm thức đối chứng AI (0,0 mg/1 KI) là thấp nhất, chỉ đạt 19,47% tỉ lệ tạo chéi

và 1,15 chồi với chiều cao chdi là 2,53 cm và 2,86 lá Nghiệm thức A5 (0,8 mg/1 KI) là

cho kết quả tối ưu nhất với 37,44% ti lệ tạo chồi, 1,44 chồi, 2,91 cm và 4,63 lá, tương

tự với các nghiệm thức còn lại các chỉ tiêu theo dõi cũng tăng lần lượt Qua đó thấy được

khi b6 sung KI vào trong môi trường nuôi cấy thì có ảnh hưởng đến quá trình tạo chdi,

nồng độ càng nhiều thì sẽ càng kích thích sự phát triển chdi cao hơn Tuy nhiên, các

nghiệm thức có sự thay đổi rõ rệt hơn trong 20 ngày quan sát như bảng 4.2 dưới đây

Bang 4.2 Chỉ tiêu quan sát của chỗồi sau 20 ngày nuôi cấy

Nghiệm XI Bì Số chồi trung Chiềucaochồi $614 trung bi

thúc (mg/) : (%) bình (choi) trung binh (cm) nh (lá)

Al 0,0 28,12" 1,30°+0,06 2,85°>+0,18 3,15 + 0,40

A2 02 33/089 133°P+011 2,91°+4016 4,457+0,11

A3 0.4 39,632 12011 3,267 + 0,13 5,063 + 0,20A4 0,6 37.442 144°+011 3,16” +0.11 4,857 + 0,21

A5 0,8 37,442 1,37%+0,06 3/012P+008 4,492 + 0/10

CV (%) 8,81 6,44 4,34 4,60

Các giá trị trung bình trong cùng một cột có các ky tu khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về

thong kê p < 0,05 Các số liệu % đã được chuyển doi theo công thức aresin(x)'` trước khi xử

lý thông tb.

Hình 4.2 Hình thái chồi ở nồng độ 0,8 mg/1 KI

Kết qua theo dõi cho thấy sau 20 ngày nồng độ KI vượt quá 0,4 mg/I thì chồi phát

triển chậm lại, thể hiện rõ nét ở nồng độ KI 0,8 mg/1 chéi còn xuất hiện lá vàng (hình4.2), it phát triển hơn so với các nghiệm thức còn lại, tỉ lệ tao chồi cũng không tiếp tục

tăng (37,44%) Cụ thé với số chồi là 1,37 chồi và chiều cao trung bình 3,01 cm là tương

đối thấp so với nghiệm thức A3 (0,4 mg/1 KI) Điều này thé hiện rằng khi tăng nồng độKinetin vượt quá khả năng hấp thu của cây trầu bà thanh xuân in vitro sẽ ức chế làm

giảm sự phát triển của chồi Ở nghiệm thức A3 (0,4 mg/1 KI) cho chiều cao chồi và số

lá cao nhất với 3,26 cm và 5,06 lá và số choi trung bình đạt 1,55 chồi Đây là nghiệm

thức cho kết quả tôi ưu nhất sau 20 ngày nuôi cấy Bên cạnh đó ở nghiệm thức đối chứngvẫn cho các chỉ tiêu theo dõi thấp nhất với 28,12% tỉ lệ mẫu tạo chdi, số chồi trung bình

đạt 1,30 chồi, chiều cao chdi là 2,85 em và 3,15 lá/chồi và không có quá nhiều khác biệt

so với thời gian sau 10 ngay quan sắt.

Dé đánh giá rõ hơn về khả năng cảm ứng chổi của KI trong quá trình nuôi cấy,

tiếp tục quan sát các chỉ tiêu theo dõi chồi sau 30 ngày nuôi cấy Kết quả được ghi nhậnthé hiện rõ hơn qua bảng 4.3 và hình 4.4 như sau

Bảng 4.3 Chỉ tiêu quan sát của chỗi sau 30 ngày nuôi cấy

Nghiệm KI paki Số chồitrung Chiềucaochồi Sốlá trung bi

Các giá trị trung bình trong cùng một cột có các ký tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về

thống kê p< 0,05 Các số liệu % đã được chuyển đổi theo công thức arcsin(x)!7 trước khi xử

lý thông kê.

Sau 30 ngày nuôi cấy, xét thay ở nghiệm thức A3 với nồng độ 0,4 mg/l KI thuđược kết quả tối ưu nhất với tỉ lệ tạo chồi, số chỗồi trung bình, chiều cao và số lá trung

bình lần lượt là 50,43%, 1,59 chdi, 3,66 cm và 5,45 lá Nghiên cứu này tương đồng với

nghiên cứu tạo chéi in vitro của cây hoa hong tỷ muội của Nguyễn Ngọc Quỳnh Thơ vàctv (2018) khi b6 sung KI vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ lớn hơn 0,50 mg/lKinetin (cụ thé là 0,75 - 1,0 mg/l), số chồi và chiều cao chéi thu được có khuynh hướnggiảm dần (từ 3,60 - 2,22 chéi, 2,20cm - 2,04 cm) hay nghiên cứu cua Hameed va ctvnăm 2006 trên đối tượng Rosa indica L., nhóm tác giả nay cũng dé cập đến ảnh hưởng

của KI lên hệ số nhân chdi, sự sinh trưởng, phát triển của chôi, cụ thé là với nồng độ 0,5

mg/1 KI thì chéi phát triển tốt nhất

Qua đó thay rằng nồng độ Kinetin có ảnh hưởng đến quá trình phát sinh chdi của

cây trầu bà thanh xuân in vitro, kích thích sự phân hóa chổi ngọn và ở nồng độ cao sẽ

ức chê chôi, làm giảm các hệ sô chỉ tiêu chôi.

4.2 Ánh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi

Nhân nhanh chdi là giai đoạn tao ra sé lượng lớn chéi, việc lựa chọn môi trườngnuôi cấy phù hợp là rat cần thiết bởi nó sẽ là yếu tố quyết định số lượng và chất lượngchỗồi Theo Sakakibara (2010), cytokinin có vai trò quan trọng trong phân chia tế bào vàkích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi nên thường được bồ sung vào môi trường

nuôi cấy Một trong số đó, Benzyl adenine (BA) là loại cytokinin có hiệu quả cao trong

sự cam ứng kích thích tạo chồi ở nhiều loài thực vật (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị

Thủy Tiên, 2002) Khi thêm vào môi trường hợp chat này sẽ kích thích tạo chdi bên.Theo nghiên cứu của Han và Park (2008) nhóm tác giả kết luận BA cho hiệu quả nhân

nhanh chồi cây Trau bà tay phật cao hơn so với TDZ cùng với kết quả nghiên cứu cho

thấy BA cho hiệu quả nhân nhanh và chất lượng chỗi Trầu bà vàng chanh cao hơn so

với TDZ (Ninh Thị Thảo và ctv, 2022) Tác động khác nhau của các cytokinin trongnuôi cấy in vitro có thé liên quan đến sự khác biệt về khả năng hap thu của tế bào thực

vat theo Sakakibara (2010) Dưới đây là kết quả quan sát sự phát triển của mẫu chỗi câytrầu bà thanh xuân được nuôi cấy trong môi trường MS được bồ sung BA

Bang 4.4 Chỉ tiêu quan sát của chéi sau 10 ngày nuôi cay

Nghiệm BA Tiiệmãutạo Sốchồitung Chiềucaochồi Sốlá trung bìthức (mg/l) chổi (%) bình (chéi) trung bình (cm) nh (1á)

Bl 0,0 29.12" 1,19°+0,06 2,57°+0,1 3,12°+0,14B2 0,5 30,50° 1,37°+0,06 2,74+0,11 3,12°+0,12

B3 1,0 35,06 1,67°+0,11 2,757 + 0,06 3,30% + 0,01

B4 1,5 ST 410 1,857°+0,06 2,857+0,07 3,412? + 0,15

B5 2,0 43,942 193242006 2,88°+0,10 3,493+ 0,11

CV (%) 10,53 4,37 3,19 373

Các giá trị trung bình trong cùng một cột có các ky tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa vê

thông kê p < 0,05 Các số liệu % đã được chuyển đổi theo công thức arcsin(x)1⁄2 trước khi xử

lý thông kê.

Sau 10 ngày nuôi cấy, quan sát được 100% các nghiệm thức đều xuất hiện chdi

mới Kết quả này thé hiện rằng khi cho BA vào môi trường MS có bé sung Kinetin sẽ

làm kích thích sự nảy chéi Vượt trội hơn là nghiệm thức B5 (1,5 mg/l BA + 0,2 mg/lKI) có dau hiệu xuất hiện nhiều chéi mới nhất, trong đó ti lệ mẫu tạo chồi đạt 43,94%

cao hơn hết so với các nghiệm thức còn lại Song song đó, số chồi, chiều cao chéi và số

lá ở nghiệm thức này cũng dat giá trị cao nhất lần lượt là 1,93 chồi, 2,88 cm và 3,49 lá

Ở nghiệm thức B1 (0 mg/l BA + 0,2 mg/l KI) các chỉ tiêu thấp hơn so với các nghiệm

thức còn lại với 28,12 % tỉ lệ mẫu tạo chồi, số chỗồi trung bình chỉ đạt 1,19 chổi, chiềucao và số lá cũng thấp nhất lần lượt là 2,57cm va 3,12 lá

Việc bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy sẽ kích thích sự gia tăng hoạt

tính của auxin nội sinh trong mô tế bào thực vật (Syono và Furuya, 1972) Cytokinin nộisinh được vận chuyền về phía đỉnh chỗi trong mạch mộc và thúc day phát triển tự nhiêncủa chỗồi (Wickson và Thimann, 1958; Faiss va ctv, 1997) Khi bổ sung cytokinin ngoạisinh vào môi trường nuôi cấy sẽ làm thay đổi gradient nồng độ chất điều hòa sinh trưởngnội sinh, đồng thời thiết lập một gradient chất điều hòa sinh trưởng mới Điều này giúppha vỡ trạng thái ngủ và kích thích sự phát triển của chdi Thật vậy, bởi ở tất cả các

nghiệm thức có bồ sung BA đều kích thích mọc chồi, trong đó nghiệm thức BI (0,0 mg/I

BA + 0,2 mg/l KI) cũng có sự xuất hiện chồi mới chứng tỏ rằng Philodendronbipinnatifidum có hàm lượng auxin nội sinh cao cộng với tác dụng của Kinetin dẫn đến

sự xuất hiện chồi mới Sự ảnh hưởng của BA kết hợp Kinetin được theo dõi tiếp tục sau

20 ngày bằng các chỉ tiêu thu được ở bảng dưới đây

Bang 4.5 Chỉ tiêu quan sát của chi sau 20 ngày nuôi cấy

Nghiệm BA Tleman SỦ EHÙI Chiều cao chỗi Sốlá

thức (mg/l) lạn chối trung bình trung bình (cm) - trung bình (14)

(%) (chồi) 8

Bl 0,0 30,50° 1412006 2,74°40,12 3,39°40,15 B2 0,5 49.63" 18941011 2,85°40,11 3,453 + 0,07

B3 1,0 43,94" 2043036 3202+011 3,837°+0,15

B4 1,5 64,762 28122017 3,159 + 0,09 3,854 + 0,08

B5 2,0 54,942 24421011 29IP°+00§ 3,42 + 030

CV (%) 12,35 7,68 3,50 4,18

Các giá trị trung bình trong cùng một cội có các ky tự khác nhau thi khác biệt có ý nghĩa về

thống kê p < 0,05 Các số liệu % đã được chuyển đổi theo công thức aresin(x)!? trước khi xử

lý thông kê.

Sau 20 ngày nuôi cấy, ở các nghiệm thức tiếp tục tăng dần về các chỉ tiêu theodõi Vượt trội nhất là nghiệm thức B4 (1,5 mg/l BA + 0,2 mg/1 KI) số chồi tiếp tục tăng

từ 1,85 chồi lên 2,81 chồi Chiều cao chdi đạt 3,15 cm va 3,85 lá Mặc dù vậy, các chỉ

tiêu có xu hướng giảm khi kết hợp 2,0 mg/l BA với 0,2 mg/l Kinetin Điều này thể hiệnkhi nồng độ cytokinin quá nhiều sẽ làm bat lợi đến khả năng cảm ứng tạo chéi của câytrầu bà thanh xuân in vitro thé hiện ở nghiệm thức BS (2,0 mg/l BA + 0,2 mg/l KI) xuathiện chồi có hình dạng không bình thường, lá cứng và không mở rộng Theo Ngô Xuân

Bình (2009), chất điều hòa sinh trưởng cytokinin là hợp chất hoạt hóa mạnh mẽ tổnghợp acid nucleic và protein Vì vậy có thê giải thích rằng, hiện tượng bat thường trên do

nồng độ cytokinin trong môi trường qua cao dan tới chéi phát sinh quá nhanh làm cho

choi bị biến đổi về mặt hình thái cũng như ức chế sự phát triển chồi về chiều cao, sốchối và sô lá.

Bảng 4.6 Chỉ tiêu quan sát của chỗồi sau 30 ngay nuôi cấy

Nghiệm BA Tilệmẫu Sốchồi — Chiệucqo môi "—~ :

thức (mg) tạo chôi(%) trung bình (choi) ( em) 8 4)

Bl 0,0 37,44° 1,67°+0,00 3,16°+0,10 3,66°+0,11

B2 0,5 50,43 °° 2,63°40,39 3,26>+0,22 3,68° + 0,12B3 1,0 64,76 3,07°+0,23 3,66* + 0,08 4,147 + 0,08B4 1,5 80,342 3,852+0/17 3,417° + 0,08 4,163 + 0,13

BS 2,0 59 5i» 293°+017 3/20°+0/10 3,69° + 0,29

CV (%) 137 6,78 3,47 3,78

Các giá trị trung bình trong cùng một cột có các ký tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về

thống kê p < 0,05 Các số liệu % đã được chuyển đổi theo công thức aresin(x)!2 trước khi xử

lý thong kê

Sau 30 ngày nuôi cấy, nghiệm thức B1 vẫn cho tỉ lệ mẫu tạo chồi thấp nhất với37,44%, 1,67 chồi/mẫu, chiều cao trung bình chéi chi đạt 3,16 cm và số lá là 3,66 lá.

Trong khi đó, nghiệm thức B4 (1,5 mg/1 BA + 0,2 mg/I KI) vẫn là nghiệm thức cho các

chỉ tiêu tối ưu nhất, trên môi trường này tỉ lệ tạo chồi là 80,34%, với 3,85 chồi, chiềucao trung bình chi đạt 3,41 cm và 4,16 lá So sánh với kết quả nghiên cứu nhân nhanh

in vitro cây trầu bà cánh phượng (Philodendrom xanadu) của Phạm Thị Thu Hang vàctv (2013) hệ số nhân chồi tăng khi tăng nồng độ BA và đạt cao nhất tại nồng độ 4,0mg/l và 5,0 mg/l với 5,01 và 4,97 lần sau 4 tuần nuôi cấy Còn ở thí nghiệm này mặc dù

nông độ BA thấp hơn (1,5 mg/1 BA) và hệ số nhân chồi đạt 3,85 chồi sau 30 ngày nuôicay Như vậy, sự kết hợp giữa BA tăng ưu thé chồi bên và Kinetin tăng ưu thé chdi đỉnh

làm cho chất lượng và số lượng chéi được cải thiện hơn, điều nay đúng với phát biểucủa nhóm tác giả Nguyễn Ngọc Quỳnh Thơ năm 2018, việc bổ sung KI vào môi trường

nuôi cay đã kích thích gia tăng số lượng chi tạo thành, từ đó có thé giúp gia tăng hệ số

nhân chồi so với môi trường không được bỏ sung chất điều hòa sinh trưởng thích hop

để nhân nhanh cây trầu bà thanh xuân, tạo nguồn nguyên liệu tốt nhất đề tiếp tục ra rễ

tạo cây hoàn chỉnh trước khi được đưa vào vườn ươm.

4.3 Ánh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng đến khả năng tạo rễ

4.3.1 Ảnh hưởng của khoáng đa lượng đến sự tạo rễ khi không có than hoạt tính

Thành phần của khoáng đa lượng có trong môi trường nuôi cấy đóng vai trò quyết

định đối với sự tăng trưởng và khả năng tạo rễ của cây trầu bà thanh xuân in vitro thé

hiện qua bảng dưới đây.

Bang 4.7 Chỉ tiêu quan sát của chỗi sau 10 ngày nuôi cay

a: Số rễ Chiều dài Ba Chiéu cao

Nghiệm kêu trung bình trung bình rễ eal trung binh

thức trường (trễ) (m0 trung bình (lá) fet)

Hình 4.6 Sự ra rễ của chỗồi khi không có than hoạt tính

Sau 10 ngày nuôi cây, vê hình thái các mâu cây hau hét cho sô re rat ít và chiêu

dài rễ ngăn, các mẫu cay đều khỏe Bên cạnh đó, theo dõi được ở nồng độ MS tỉ lệ thuậnvới chiều dài của rễ và tỉ lệ nghịch với các chỉ tiêu theo dõi còn lại Cụ thê, cây trầu bàthanh xuân in vitro bị ảnh hưởng nhiều nhất ở môi trường MS với 1,93 rễ là số rễ trung

bình cao nhất, số lá trung bình 4,20 lá và chiều cao trung bình dat 4,54 cm là tối ưu nhất,