DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 4. KET QUA VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thí nghiệm 1: Kiểm tra cây sạch bệnh virus SPFMV bằng kỹ thuật
RT-PCR
Kết quả điện di virus SPFMV bang kỹ thuật RT — PCR One -step được thé hiện qua Hình 4.1 cho thấy khi so sánh với mẫu đối chứng dương va mẫu đối chứng âm ở hai lần lặp lại thì mẫu vật liệu khởi đầu invitro là mẫu sạch bệnh, không bị nhiễm virus SPFMV. Do đó có thé sử dụng mẫu để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
1000 bp
589 bp 200 bp
Hình 4.1. Kết qua RT-PCR phát hiện SPFMV.
L: Ladder, Giống +: Mẫu đối chứng dương; Giống -: Mẫu đối chứng âm; Giống 1.1-
11.2: Máu thử nghiệm số 1.1-11.2; Giêng 2.1-11.2: Mau thử nghiệm so 2.1-1 1. 2.
4.2. Thí nghiệm 2: Tao vật liệu khởi đầu invitro
4.2.1. Kết quả khi xử lý khử trùng bằng dung dịch HgCh 0,1%
Khử trùng mẫu là một bước rất quan trọng dé tạo nguồn nguyên liệu vô trùng cho nuôi cấy invitro. Các mẫu lay từ bên ngoài thường dé nhiễm nắm và khuẩn. Việc khử trùng mẫu có tác dụng làm sạch bề mặt ngọn chồi, hạn chế tối đa khả năng lây nhiễm.
Tỷ lệ mẫu nhiễm nam, khuẩn và ty lệ mẫu chết phụ thuộc vào thời gian khử trùng.
Thời gian khử trùng càng dai thì tỷ lệ mẫu nhiễm nam, khuẩn càng giảm nhưng đồng thời tỷ lệ gây chết mẫu sẽ càng tăng. Kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy ở nghiệm thức 1 và nghiệm thức 2, tỷ lệ mẫu nhiễm nam, khuẩn ở hai nghiệm thức này là cao nhất lần lượt là 66,67% và 58,33% va không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Ở nghiệm thức 3 và nghiệm thức 4 có tỷ lệ mẫu nhiễm nắm, khuẩn thấp nhất lần lượt là 8,33% và
25
0,00% và không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê ở hai nghiệm thức này. Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu chết ở nghiệm thức 3 là thấp nhất (16,67%) và khác biệt ý nghĩa so với 3 nghiệm thức còn lại. Do vậy, đối với việc khử trùng bằng dung dịch HgCh 0,1%
ở thời gian 9 phút (nghiệm thức 3) là phù hợp nhất, ít tỷ lệ mẫu chết và tỷ lệ mẫu nhiễm. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Lương Thị Ngọc Tú và cộng sự (2019) khi khử trùng bằng dung dich HgCh 0,1% ở khoảng thời gian 10 phút là tốt nhất. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây không khuyến khích sử dụng HgCl;
do độc tính của nó đối với tế bào và động vật có vú (NIH, 2002). Do vậy, NaOCl (Javel) là chất khử trùng thay thé lý tưởng hon.
Bảng 4.1. Kết quả khử trùng chỗi khoai lang sau hai tuần nuôi cấy với nồng độ HgCh
0,1% ở các khoảng thời gian khác nhau
; Thời gian khử Tỷ lệ mẫu +
Nghiệm es Ty lé mau trùng HgCl 0,1% nhiễm nam, :
thức : chêt (%) (phú) khuân (%)
NTI 5 66,672 66,672 N12 7 58,332 66,672
N13 9 8,33° 16,67°
NT4 it 0,00° 41,67
Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái có cùng ký tự biểu hiện sự
khác biệt rat có ý nghĩa về mat thong kê (P<0.05).
4.2.2. Kết quả khi xử lý khử trùng bằng dung dich NaOCl (Javel) 5%
Tương tự với thí nghiệm sử dụng dung dịch HgCh 0,1%, tỷ lệ mẫu nhiễm nắm, khuẩn và tỷ lệ mẫu chết phụ thuộc vào thời gian khử trùng. Thời gian khử trùng càng đài thì tỷ lệ mẫu nhiễm nam, khuẩn càng giảm nhưng cũng gia tăng tỷ lệ chết mau. Theo Bang 4.2 kết qua cho thay ở nghiệm thức 3 tỷ lệ mẫu nhiễm nam, khuẩn và tỷ lệ mẫu chết là thấp nhất tương ứng là 8,33% và 41,67% và khác biệt có ý nghĩa so với ba nghiệm thức còn lại. Do đó, nghiệm thức 3 xử lý khử bằng cồn 70° ở 40 giây và Javel (NaOCl) 5% ở 20 phút được chon là nghiệm thức phù hợp nhất trong thí nghiệm này.
Tuy thời gian khử trùng của Javel dai hơn và ty lệ mẫu chết cũng cao hơn so với khi sử dụng HgCl›a nhưng khả năng mau bật chồi lại cao hơn, chéi phát triển tốt hơn so với
26
khi khử trùng bằng HgCl được thé hiện ở Hình 4.2. Đồng thời việc sử dung NaOCl cũng ít gây độc hại cho con người khi tiếp xúc thường xuyên và giá thành tiết kiệm và dé sử dung hơn khi sản xuất với số lượng lớn mẫu.
Bang 4.2. Kết quả khử trùng chồi khoai lang sau hai tuần nuôi cấy với nồng độ NaOCl
(Javel) 5% ở các khoảng thời gian khác nhau
Nghiệm Thời gian khử trùng Javel Tỷ lệ mẫu nhiễm - ,
, , Tỷ lệ mâu chết (%) thức 5% (phút) nâm, khuân (%)
NTI 10 91,672 91,672
NT2 15 58,53° 58.35%
NT3 20 8,33° 41,67°
NT4 25 0,00° 66,67
Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái có cùng ký tự biểu hiện sự
khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê (P<0.05).
27
4.3. Thí nghiệm 3: Tạo môi trường nhân nhanh chồi thích hợp cho cây khoai lang
Nhật
Sau khi có được vật liệu khởi đầu invitro sạch bệnh thì tiến hành nhân chồi nhằm tao ra số lượng lớn chdi. Kết quả khảo sát nồng độ BA lên khả năng phát sinh chồi của cây
khoai lang Nhật được ghi nhận qua Bảng 4.3.
Bang 4.3. Ảnh hưởng của BA đến hệ số phát sinh chồi, chiều cao trung bình chéi của
cây khoai lang Nhật
: oy. Chiéu cao trung
; Nông độ BA So chối trung bình Ä
Nghiệm thức bình chôi (cm)
(mg/l) (x + SD)
(x + SD)
NT1 0,0 (1,00 + 0,00)° (0,51 + 0,02)°
NT2 0,5 (2,05 + 0,13)” (0,67 + 0,03)*
NT3 1,0 (2,33 + 0,17) (0,71 + 0,03)*
NT4 1,5 (1,91 + 0,22) (0,43 + 0,01)°
NTS5 2,0 (1,77 + 0,25) (0,49 + 0,02)°
Trong cùng mot cội. các giá tri trung bình theo sau bởi các chữ cdi có cùng ky tu biểu
hiện sự khác biệt rat có y nghĩa về mat thông kê (P<0.01).
Kêt quả Bảng 4.3 và Hình 4.3 cho thay, sau 2 tuân nuôi cây choi phat triên trên môi
trường bố sung BA ở những nồng độ khác nhau. Số chéi trung bình và chiều cao chỗồi tăng khi nồng độ tăng từ 0,5 mg/1 đến 1,0 mg/l và khi nồng độ tăng cao (1,5 mg/l ) thì số chồi giảm. Ở nghiệm thức 2, nghiệm thức 3 và nghiệm thức 4, số chéi trung bình không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên , kết quả số chồi trung bình ở nghiệm thức 3 là cao nhất (2,33 chéi) so với hai nghiệm thức còn lại. Chiều cao trung bình chồi ở nghiệm thức 2 và nghiệm thức 3 khác biệt có ý nghĩa so với 3 nghiệm thức còn lại nhưng kết quả chiều cao trung bình chéi của nghiệm thức 3 cao
hơn so với nghiệm thức 2. Do đó, nghiệm thức 3 được xem là nghiệm thức phù hợp
nhất cho thí nghiệm này. Kết quả này cũng tương tự với kết quả nghiên cứu của Lương Ngọc Tú và ctv (2019) khi nuôi cấy mô phân sinh đỉnh trên cây khoai lang Nhật. BA là một cytokinin tong hợp có tác động khắc phục trạng thái ngủ và hiện tượng ưu thé ngọn ở thực vật trong điều kiện in vitro (George va ctv, 2008). Do đó, BA thường
được dùng đê tạo chối từ mâm ngủ của nhiêu đôi tượng nuôi cây. Khi nông độ BA
28
thích hợp sẽ kích thích sự kéo dài chồi nhưng nếu tăng quá mức sẽ ức chế sự phát sinh
chôi.
4.4. Thí nghiệm 4: Anh hưởng của nồng độ NAA đến sự phát triển rễ của cây
khoai lang Nhật
Rễ là một bộ phận quan trọng cho sự sinh trưởng của cây. Rễ không chỉ giúp cây đứng vững, hút nước, để cung cấp cho hoạt động quang hợp ở lá, hấp thu các nguyên tố đa lượng, vi lượng cần thiết cho cây. Do đó, trước khi đưa cây ra vườn ươm thì cây cần có một bộ rễ phát triển tốt.
Kết quả ghi nhận ở Bảng 4.4 cho thấy rằng nồng độ NAA có anh hưởng đáng ké đến sự phát sinh rễ, chiều đài rễ và chiều cao của cây. Chiều dài rễ, số rễ tăng dần theo nồng độ NAA từ 0,1 mg/l dén 0,3 mg/I, sau đó bắt đầu giảm dan ở nồng độ 0,5 mg/1. Ở nghiệm thức 3, nồng độ NAA 0,3 mg/l cho kết quả cao nhất lần lượt là số rễ nhiều nhất (4,7 rễ), chiều dài rễ (3,97 cm) va chiều cao cây tốt nhất (1,83 cm) có sự khác biệt
có ý nghĩa so với 3 nghiệm thức còn lại. Do đó, nghiệm thức 3 được chọn là nghiệm
thức phù hợp nhất dé tạo rễ cây khoai lang Nhật. Tuy nhiên, ở thí nghiệm này chiều cao cây không đạt hiệu quả đáng kể. Theo Nguyễn Minh Chơn (2004), auxin ngoại sinh có thé kích thích hình thành rễ sớm, nhưng ở nồng độ cao có thé ức chế sự vươn dài của rễ. Nghiên cứu của Nguyễn Thế Nhuận và cộng sự (2015) cũng chứng minh
29
điều tương tự khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ của cây ca chua, việc tăng nồng độ auxin khiến chiều dài rễ của cây cà chua
giảm rõ rét.
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến số rễ, chiều dai rễ và chiều cao của cây
khoai lang Nhật
, " Chiều dairé Chiều cao trung
Nghiệm Nông độ Sô re
(cm) bình của cây (cm) thức NAA (mg/l) (Z+SD)
(x + SD) (+ SD)
NTI 0,0 (1,93 40,70) (1,60+0,40) (0,73 + 0,25)?
NT2 0,1 (3,87+0,41)" (2,53 £ 0,15)” (1,23 + 0,45)"
NT3 0,3 (4,70+0,10) (397#0/20) (1,83 0,15)"
NT4 0,5 (3,40 +0,35) (2,33 0,15)" (0,63 + 0,05)”
NTS 0,7 (3,30 40,56) (2,17£0,45)° (097+0/15
Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái có cùng ký tự biéu hiện sự
khác biệt rat có ÿ nghĩa về mat thông kê (P<0.01).
INTI NT2 NT3 NT4 NT5 Hình 4.4. Rễ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy ở thí nghiệm 4.
30
4.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của môi trường có bồ sung 0,3 mg/l NAA và GA3
đối với sự phát triển rễ của cây khoai lang Nhật
Kết quả ghi nhận ở thí nghiệm 4 cho thấy khi chỉ bố sung NAA cây chi phát triển rễ tốt nhưng chiều cao vẫn thấp, cây chưa đủ khỏe mạnh dé đưa ra vườn ươm. Do đó, thi nghiệm 5 được tiến hành bổ sung thêm GA3 ở các nồng độ khác nhau trên môi trường nền MS có bồ sung 0,3 mg/l NAA dé tạo được cây hoàn chỉnh phát triển tốt về chiều cao va rễ.
Bang 4.5. Ảnh hưởng của môi trường có bổ sung 0,3 mg/I NAA va nồng độ GA3 đến số rễ, chiều dài rễ và chiều cao của cây khoai lang Nhật.
Nông Số rễ Chiêu dài rễ Chiều cao trung
ô rễ
Nghiệm thức độ GA3 (cm) bình của cây (em) (x+SD)
(mg/l) (x + SD) (x+ SD) NT1 0,0 (4,70 +0,10) (3,97 + 0,21) (1,83 + 0,15)°
NT2 0,1 (4,23 + 0,15) (3,80 + 0,20)° (2,20 + 0,10)°
NT3 0,3 (5,00 + 0,15) (4,37+40,06) (2,90+0,10)
NT4 0,5 (5,73 + 0,55)* (4,80 + 0,17)* (3,20 + 0,15)*
Trong cùng mot cot, các giá Irị trung bình theo san bởi các chữ cái có cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê (P<0.01).
Kết quả Bảng 4.5 sau 3 tuần nuôi cấy, cây phát triển ở môi trường có bồ sung 0,3 mg/l NAA kết hợp với nồng độ GA3 khác nhau. Số rễ, chiều dài rễ và chiều cao cây tăng
dan khi nồng độ GA3 tăng dan từ 0,1 mg/1 đến 0,5 mg/l. Khi kết hop NAA với GA3 trong môi trường nền cây phát triển về bộ rễ và chiều cao tăng dần khi nồng độ GA3 tăng dan chứng tỏ sự có mặt GA3 có ảnh hưởng đáng kể đến việc kéo dài thân cây .Ở nghiệm thức 1 và nghiệm thức 2 khi so sánh với số rễ thì có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Ở nghiệm thức 4 (NAA 0,3 mg/l, GA3 0,5 mg/1 ) cây cho số rễ nhiều nhất (5,73 rễ), chiều dài rễ đài nhất (4,8 cm) và chiều cao cây cao nhất (3,2 em) kết quả này khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại khi so sánh về cả số rễ, chiều dai rễ và chiều cao cây. Do đó, nghiệm thức 4 được chon là nghiệm thức tối ưu nhất đề cây phát triển tốt nhất (Hình 4.5).
31
Theo Fu và Harberd (2003) auxin kiểm soát sự tăng trưởng của rễ bằng cách hoạt hóa khả năng đáp ứng của tế bao với gibberellin. Ngoài ra, auxin rất cần thiết cho sự điều hòa kiểm soát của gibberellin trong sự tăng trưởng rễ (trích dẫn bởi Nguyễn Thi Ngọc Hường và ctv,2009) .Vì vậy, khi so sánh với thí nghiệm chỉ sử dụng môi trường có bé sung NAA thi môi trường có sự kết hợp giữa NAA và GA3 sẽ cho hiệu quả tốt hơn, cây phát triển tốt cả về chiều cao cây, số rễ và chiều đài rễ.
32