DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được tiến hành từ tháng 03/2023 — 07/2023.
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Nhân giống cây khoai lang Nhật được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, trường đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh.
Kiểm tra virus SPFMV trên cây khoai lang Nhật bằng kỹ thuật RT-PCR được thực hiện tại Phòng Sinh học phân tử, Công nghệ gen và tế bào của Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, Thanh phô Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu Giống khoai lang Nhật.
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Kiểm tra cây sạch bệnh SPFMV bằng kỹ thuật RT-PCR Củ giống sau khi được tuyển chọn sẽ được xử lý dé thúc bật chồi. Sau ba tuần khi chéi cao khoảng 10 — 20 cm sẽ tiễn hành cat để chuẩn bị cho công đoạn tiếp theo. Nhưng trước đó sẽ được tiến hành lấy mẫu lá dé kiểm tra sàng lọc bệnh virus SPFMV (Sweet Potato Feathery Mottle Virus) bằng kỹ thuật RT-PCR nhằm tạo ra nguồn nguyên liệu sạch bệnh ngay từ ban đầu.
Vật liệu
Mau lá : gồm 10 mẫu tương ứng với mỗi củ giống
Giám định virus bằng kỹ thuật RT-PCR One-step với cặp môi đặc hiệu cho virus SPFMV có thể khuếch đại đặc hiệu một đoạn có kích thước 589 bp. Primer SPFMV-F
có trình tự 5’- GGATTAYGGTGTTGACGACACA-3’ và primer —R có trình tự 5”- TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA-3’ (Li và ctv, 2012).
Bồ trí thi nghiệm
Gồm 10 mẫu lá chia làm 2 mẫu gop, mỗi mau gộp gồm 5 mẫu với 2 lần lặp lại.
Phương pháp tiến hành
Ly trích RNA
16
Các bước thực hiện theo hướng dẫn của bộ Biobasic EZ-10 Spin Column Plant RNA
Miniprep Kit
Bước 1. Cho 50 mg mẫu lá vào eppencedoft có chứa 450 ul Buffer Rlysis- PG into RNase-Free. Nghién nhỏ va ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 2. Ly tâm ở 12.000 x g trong 5 phút. Hút 200 pl địch nổi phía trên vào
eppencedoft mới.
Bước 3. Thêm 100u1 Ethanol 96% vào phan dịch nổi phía trên, trộn nhẹ hỗn hợp rồi chuyền sang Column and Collection tube.
Bước 4. Ly tâm ở 12.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch và đặt lại cột vào tube.
Bước 5. Thêm 500 ul GT Soluion vào cột, ly tâm ở 12.000 x g trong I phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dich, đặt lại cột vào tube.
Bước 6. Thêm 500 NT Soluion vao cột, Ly tâm ở 12.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dich, đặt lại cột vào tube.
Bước 7. Ly tâm cột ở 12.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 8. Đặt cột vào tube 1,5 ml mới, thêm 50 wl RNase-Free Water, giữ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Ly tam ở 12.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
Tạo cDNA
RNA tổng số sau khi tách chiết được tổng hợp cDNA cho phản ứng RT-PCR theo bộ
Kit Bioline SensiFAST cDNA Synthesis . RT-PCR
Tiền biến tinh ở 95°C trong 2 phút. Quá trình khuếch đại diễn ra ở 95°C trong 30 giây,
55°C trong 30 giây va 72°C trong 40 giây với 35 chu kỳ, hậu kéo dài ở 72°C trong 10 phút.
Điện di
Sản phẩm sau khi khuếch đại RT-PCR được điện di trên gel agarose 1,5 % trong dung dịch đệm TBE 0,5X ; 100V trong 30 phút. Sử dụng khoảng Sul sản phẩm RT-PCR
cùng với ul GelRed. Tương tự cũng sử dụng 5 ul Ladder 100bp cùng với 1p] GelRed.
Trộn đều và đưa hỗn hợp cho vào giếng. Sau khi điện di, gel agarose được đưa vào buồng UV và được ghi lai bằng cách chụp ảnh.
Kết quả điện di của hai mẫu gộp sẽ được so sánh với mẫu đối chứng dương ở ladder 589 bp và mẫu đối chứng âm dé xác định mẫu có nhiễm virus SPFMV hay không.
17
3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Tao vật liệu khởi đầu invitro sạch bệnh SPFMV Điều kiện thí nghiệm
Môi trường nền của thí nghiệm đối với mẫu xử lý bằng dung dich NaOCI (Javel) 5% là môi trường MS có bổ sung 20 g saccharose và 7 g agar.
Môi trường nền của thí nghiệm đối với mẫu xử lý bang dung dịch HgCla 0,1% là môi trường MS có bổ sung 20 g saccharose và 7 g agar, pH môi trường được điều chỉnh ở
5,8+0,1.
Hệ thống nuôi cấy là chai thủy tinh 250 ml chứa 10 ml môi trường.
Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ 25 + 2°C, thời gian chiếu sáng 12
giờ/ ngày.
Bố trí thí nghiệm
Đối với thí nghiệm xử lý bằng dung dịch HgCl2 0,1%
Thí nghiệm được bồ trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 yếu tố (dung dịch HgCh 0,1% ở các khoảng thời gian: 5 phút; 7 phút; 9 phút; 11 phut), 3 lần lặp lại, 4 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 4 chai (Tổng 12 chai mỗi nghiệm thức). Mỗi chai cấy 1 mẫu.
Đối với thí nghiệm xử lý bằng dung dịch NaOCl (Javel) 5%
Thí nghiệm được bồ trí hoàn toàn ngẫu nhiên, ] yếu tố (dung dịch NaOCl (Javel) 5%
ở các khoảng thời gian: 10 phút; 15 phút; 20 phút; 25 phú), 3 lần lặp lại, 4 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 4 chai (Tổng 12 chai mỗi nghiệm thức). Mỗi chai cấy 1 mẫu.
Phương pháp tiến hành Chuan bị môi trường
Cho 200ml nước cất vào ca có vạch có dung tích 500 ml. Cho các hóa chất từ dung dịch stock theo đúng nồng độ của từng thí nghiệm vào. Khuấy đều dung dịch và điều chỉnh pH đến 5,8 + 0,1. Cân 10 g saccharose và 3,5 g agar cho vao ca theo thứ tự rồi khuấy đều. Dong thêm nước cho đủ 500 ml. Sau đó đun nóng dung dịch nhằm làm tan agar. Khi agar tan hoàn toàn, chuyển 10 ml vào chai thủy tinh có thé tích 250 ml, miệng chai được đậy bằng nút cao su, giấy báo, nylon và dây thun, dùng bút lông không phai viết ký hiệu trên chai môi trường. Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt
độ 121°C trong thời gian 15 phút.
Cay mau
18
Trước khi vào tủ cấy
Sau khi chồi cao khoảng 10 — 20 em sẽ tiến hành cắt mẫu. Mẫu sau khi cắt sẽ được rửa dưới vòi nước chảy dé loại bỏ dich mủ và bụi ban bám trên nách chéi, sau đó được lau lại bằng cồn 70° và rửa lại bằng nước cất. Sau đó được cắt thành từng đoạn khoảng 2 —3 cm và ngâm trong dung dịch xa phòng 30 phút dé loại bỏ bụi ban trên bề mặt của mẫu.
Chuẩn bị tủ cấy
Tủ cấy phải được bật UV trong 30 phút và xả trong 30 phút trước khi tiến hành các thao tác trong tủ cay dé dam bao tủ được vô trùng.
Trong tú cấy
Mẫu được xử lý khuân bề mặt bằng dung dịch cồn 70° trong thời gian 40 giây, tráng lại bằng nước cất đã hấp khử trùng từ 3 — 4 lần. Sau đó, mẫu được chia ra tiếp tục được xử lý bằng dung dịch HgCh 0,1% va NaOCl (Javel) 5% trong các khoảng thời gian khác nhau và được rửa sach lại bằng nước cất sau mỗi lần khừ trùng 3 — 4 lần. Sau đó, mẫu được gap ra đĩa cấy bang pence rồi dùng dao cắt mỗi đoạn dé đạt chiều dải thích hợp và loại bỏ phan bị tồn thương do chất khử trùng gây ra. Dùng pence gap mẫu cấy vào chai môi trường. Cay 1 mẫu/chai môi trường. Mỗi chai được ghi cân thận gồm tên nghiệm thức, số thứ tự của lần lặp lại trên nghiệm thức, số thứ tự của chai/ lần lặp lại và ngày cấy. Sau đó mẫu được chuyên vào phòng nuôi cấy với điều kiện nuôi cấy
tương ứng của thí nghiệm.
Bang 3.1. Khao sát ảnh hưởng của nồng độ HgC1› 0,1% đến hiệu quả khử trùng chồi ở các
khoảng thời gian khác nhau
Thời gian khử trùng Nghiệm thức HgC]› 0,1% (phút)
NTI 5 N12 7 NT3 9 NT4 11
19
Bảng 3.2. Khao sát ảnh hưởng của nồng độ NaOCl (Javel) 5% đến hiệu quả khử trùng chéi ở các khoảng thời gian khác nhau
Thời gian khử trùng Nghiệm thức
NaOCl (Javel) 5% (phút) NTI 10
NT2 15 NT3 20 NT4 25
Chi tiêu theo dõi
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = 100 x Số mẫu nhiễm/ Tổng số mẫu
Tỷ lệ mẫu chết (%) = 100 x Số mẫu chét/ Tổng số mẫu. (Số mẫu chết bao gồm số mẫu nhiễm và số mẫu không nảy chéi).
Thời gian theo dõi là 2 tuần.
3.2.2.3. Thí nghiệm 3: Tạo môi trường nhân nhanh chồi thích hợp cho cây khoai
lang Nhật
Sau khi tạo được nguồn nguyên liệu khởi đầu sạch bệnh, mẫu tái sinh từ chồi nách sẽ
được chuyển sang môi trường dinh dưỡng có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin kết hợp với các yếu tô nhiệt độ và ánh sáng phù hợp dé đạt hệ số nhân chéi cao nhất trong thời gian ngắn nhất mà vấn dam bảo sức sống và bản chất di truyền của cây. Thí nghiệm này khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đối với khả năng nhân chồi của cây.
Điều kiện thí nghiệm
Môi trường nền của thí nghiệm là môi trường MS được bé sung 20 g saccharose và 7 g agar cho tat cả các nghiệm thức, pH môi trường được điều chỉnh ở 5,8 + 0,1.
Hệ thống nuôi cấy là chai thủy tinh 250ml chứa 10ml môi trường.
Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ 25 + 29C, thời gian chiếu sáng 12
giờ/ ngày.
20
Bồ trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 yếu tố (BA với 5 mức nồng độ: 0,0 mg/l; 0,5 mg/1 ; 1,0 mg/l; 1,5 mg/1; 2,0 mg/l), 3 lần lặp lại, 5 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 4 chai (tổng 12 chai mỗi nghiệm thức). Mỗi chai cấy 3 mẫu.
Phương pháp tiến hành Chuẩn bị môi trường
Môi trường được chuẩn bị tương tự các bước như ở thí nghiệm 2.
Cay mau
Tiến hành cấy mẫu trong điều kiện vô trùng. Sử dung dao cắt mẫu thành từng chéi riêng lẻ cao khoảng 7 mm. Dùng pence gắp mẫu cấy vào chai chứa môi trường. Mỗi chai được ghi cân thận gồm tên nghiệm thức, số thứ tự của lần lặp lại trên nghiệm thức, số thứ tự của chai/ lần lặp lại và ngày cấy. Sau đó mẫu được chuyên vào phòng nuôi cấy với điều kiện nuôi cấy tương ứng của thí nghiệm.
Bảng 3.3. Các nghiệm thức trong thí nghiệm 3
NT 1 2 3 4 5 BA (mg/l) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Chỉ tiêu theo dõi
Số chi trung bình : Số chồi/mẫu
Chiều cao trung bình chéi (cm): Chiều cao được đo từ phần gốc đến phan cao nhất của chéi bằng thước đo có độ chính xác đến 1 mm.
Thời gian theo dõi là 2 tuần.
3.2.2.4. Thí nghiệm 4: Tạo ra môi trường ra rễ thích hợp cho cây khoai lang Nhật để tạo cây hoàn chỉnh
Sau 3 tuần chéi phát triển số lượng đạt 2 — 3 chồi, chồi riêng rẽ sẽ xuất hiện rễ. Chồi sẽ được tạo rễ sớm dé hình thành cây con hoàn chỉnh trên môi trường bồ sung auxin: IAA, NAA... với nồng độ thích hợp. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đối với sự phát sinh rễ của cây.
Điều kiện thí nghiệm
Môi trường nền của thí nghiệm là môi trường MS được bồ sung 20 g sacchacrose và 7 ứ agar cho tất cả cỏc nghiệm thức, pH mụi trường được điều chỉnh ở 5,Đ + 0,1.
Hệ thống nuôi cấy là chai thủy tinh 250 ml chứa 10ml] môi trường.
21
Bồ trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 yếu tố (NAA với 5 mức nồng độ: 0,0 mg/l; 0,1 mg/l; 0,3 mg/l; 0,5 mg/l; 0,7 mg/1), 3 lần lặp lại, 5 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 5 chai (Tổng 15 chai mỗi nghiệm thức). Mỗi chai cấy 3 mẫu.
Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ 25 + 2°C, thời gian chiếu sáng 12
giờ/ ngày.
Phương pháp tiến hành Chuẩn bị môi trường:
Môi trường được chuẩn bị tương tự như ở thí nghiệm 2.
Cay mau
Được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Sử dung dao cắt mẫu thành từng chồi riêng lẻ cao khoảng 7 mm. Dùng pence gap mẫu cấy vao chai chứa môi trường. Mỗi chai được ghi cần thận gồm tên nghiệm thức, số thứ tự của lần lặp lại trên nghiệm thức, số thứ tự của chai/ lần lặp lại và ngày cấy. Sau đó mẫu được chuyển vào phòng nuôi cấy với điều kiện nuôi cấy tương ứng của thí nghiệm.
Bảng 3.4 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 4.
NT 1 2 3 4 5 NAA
0,0 0,1 0,3 0,5 0,7 (mg/l)
Chi tiêu theo dõi
Số rễ trung bình: số rễ/cây
Chiều dai trung bình rễ (cm): chiều dài được đo từ phần gốc đến phan dài nhất của rễ bằng thước đo chính xác đến 1 mm.
Chiều cao trung bình thân (cm): chiều cao được đo từ phần gốc đến phần cao nhất của thân bằng thước đo chính xác đến mm.
Thời gian theo dõi là 3 tuần.
3.2.2.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của môi trường có b6 sung 0,3 mg/I NAA và
GA3 đối với sự phát triển rễ của cây khoai lang Nhật
Sau 3 tuần nuôi cấy nhận thấy môi trường MS có bổ sung NAA sẽ cho hệ rễ tốt nhất nhưng chiều cao cây phát triển không tốt. Tiến hành bồ sung nồng độ GA3 kết hợp với 0,3 mg/l NAA trên môi trường nền MS.
22.
Điều kiện thí nghiệm
Môi trường nền của thí nghiệm là môi trường MS được bé sung 0,3 mg/I NAA, 20 g sacchacrose và 7 g agar cho tất cả các nghiệm thức, pH môi trường được điều chỉnh ở
5,8 + 0,1.
Hệ thống nuôi cấy là chai thủy tinh 250 ml chứa 10 ml môi trường.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 yếu tổ (GA3 với 4 mức nồng độ: 0,0 mg/l; 0,1 mg/l; 0.3 mg/l; 0,5 mg/l), 3 lần lặp lại, 4 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 5 chai (Tổng 15 chai mỗi nghiệm thức). Mỗi chai cấy 3 mẫu.
Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ 25 + 29C, thời gian chiếu sáng 12
giờ/ ngày.
Phương pháp tiến hành Chuẩn bị môi trường:
Môi trường được chuẩn bị tương tự như ở thí nghiệm 2.
Cay mau
Được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Sử dụng dao cắt mẫu thành từng chồi riêng lẻ cao khoảng 7 mm. Dùng pence gắp mẫu cấy vào chai chứa môi trường. Mỗi chai được ghi cân thận gồm tên nghiệm thức, số thứ tự của lần lặp lại trên nghiệm thức, số thứ tự của chai/ lần lặp lại và ngày cấy. Sau đó mẫu được chuyên vào phòng nuôi cấy với điều kiện nuôi cấy tương ứng của thí nghiệm.
Bảng 3.5. Các nghiệm thức trong thí nghiệm 5
NT 1 2 3 4 GA3 (mg/l) 0,0 0,1 0,3 0,5 NAA (mg/)) 0,3
Chi tiéu theo doi
Số rễ trung bình: số rễ/cây
Chiều dài trung bình rễ (cm): chiều dài được đo từ phần gốc đến phan dài nhất của rễ bằng thước đo chính xác đến 1 mm.
Chiều cao trung bình thân (cm): Chiều cao được đo từ phần gốc đến phần cao nhất của thân bằng thước đo có độ chính xác đến 1 mm.
Thời gian theo dõi là 3 tuần.
23
3.3. Xử lý số liệu
Số liệu ở các thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Minitab 16 với sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê của các giá trị trung bình được so sánh bằng cách phân tích ANOVA đơn yếu tố.
24