Cùng với sự phát triển của ngành kinh tế từ lan, việc nuôi trồng lan càng ngày càng trở nên phổbiến, kéo theo các vấn đề về bệnh hại và kiểm soát bệnh hại trên lan ngày càng được quan tâ
Tối ưu và hoàn thiện quy trình Multiplex RT-PCR dé phát hiện ORSV và OFV
Kiểm tra độ đặc hiệu của priimer 2: 2+ 2+S22E+E2E22E£EE2E2212212122122122222 222 32 4.4.2 Kiểm tra primer bằng công cụ primer blast của NCBI 2-5-5522 33 4.4.2.1 Kiểm tra primer ORSV bang công cụ primer blast của NCBI
Bang 4.2 Các đặc tính co bản của cặp primer
Primer Trình tw 5’ — 3’ S6Nu% GC Tm
Nhiét d6 Tm nén chon trong khoang 68 °C dén 72 °C (Su Min Kim va Sun Hee
Các thông số quan trọng cho một cặp primer hiệu quả trong phản ứng RT-PCR bao gồm: nhiệt độ bắt cặp của hai primer không nên chênh lệch quá xa, số nucleotide tối ưu nằm trong khoảng 10 đến 25 nucleotide, và tỷ lệ % GC của mỗi primer khoảng 20%.
Sau đó, các cặp primer được kiểm tra độ đặc hiệu bằng công cụ BLAST của
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) cung cấp chương trình dò tìm trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gene để xác định các gene có trình tự tương đồng với cặp primer đã cho Kết quả từ BLAST sẽ tham khảo các trình tự có độ bao phủ cao nhất để thay thế các primer có độ đặc hiệu cao.
Bảng 4.3 Kết quả phân tích BLAST của 2 primer OR257 và OF 160
Primer Tên trình tự Tỉ lệ bao phủ
Như vậy, về mặt lý thuyết, các primer nảy là hoàn toàn đặc hiệu và phù hợp cho phản ứng RT-PCR phát hiện ORSV và OFV.
4.4.2 Kiểm tra primer bằng công cụ primer blast của NCBI
4.4.2.1 Kiểm tra primer ORSV bằng công cụ primer blast của NCBI
Kết quả kiểm tra được thé hiện ở phụ lục 1 cho thấy primer ORSV phù hợp với
>OP644547.1 bộ gene ORSV isolate ORV/DH.
4.4.2.2 Kiểm tra primer OFV bang công cu primer blast của NCBI
Kết qua kiểm tra được thể hiện ở phụ lục 1 cho thay primer OFV phù hợp với
>KF246571.1 bộ gen OFV XMI.
Xác định chu trình nhiệt tối ưu virus /#ŠƑ -©22©522522+2E22E2E22E2zz22+2 33 4.4.4 Xác định nồng độ primer và thời gian bắt cặp tối ưu @#SE
Ở nội dung 1, đã thực hiện quy trình RT-PCR theo Su Min Kim và Sun Hee Choi
Năm 2015, một quy trình Multiplex đã được xây dựng và khảo sát trên 10 chu kỳ nhiệt từ 56 °C đến 65 °C Tất cả 10 chu trình này được thực hiện với cùng một mẫu RNA được chiết xuất từ cây bệnh, và kết quả thu được đã được ghi nhận.
Kết quả điện di cho thấy, các mẫu ORSV và 18S nằm ở vùng khuếch đại khoảng 257 bp và 118 bp, với nhiệt độ bắt cặp từ 56 °C đến 65 °C Đặc biệt, primer OR257 cho kết quả dương tính với virus ORSV ở tất cả chu kỳ, với band rõ và sáng nhất tại 62 °C Do đó, 62 °C được chọn là nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho virus ORSV.
4.4.4 Xác định nồng độ primer và thời gian bắt cặp tối ưu ORSV
Hình 4.8 trình bày kết quả điện di cho ba thời gian bắt cặp khác nhau và nồng độ primer khác nhau Cụ thể, từ mẫu số 1 đến 4 là thời gian bắt cặp 30 giây với nồng độ từ 0.1 đến 0.4 uM Mẫu số 5 đến 8 thể hiện thời gian bắt cặp 60 giây với cùng nồng độ, và mẫu số 9 đến 12 là thời gian bắt cặp 90 giây cũng với nồng độ từ 0.1 đến 0.4 uM.
Kết quả điện di cho thấy tất cả các mẫu đều nằm trong vùng khuếch đại của ORSV, với 18S có kích thước khoảng 257 bp và 118 bp Các mẫu từ số 2 trở đi cũng nằm trong vùng này.
Khi chọn vùng khuếch đại sáng với các đoạn khuếch đại có nồng độ khác nhau nhưng cùng một băng sáng, nên ưu tiên nồng độ thấp nhất để tránh hiện tượng dimer Do đó, vùng khuếch đại sáng có nồng độ thấp nhất là số 2, với nồng độ bắt cặp 0.2 uM trong thời gian bắt cặp 30 giây.
Áp dụng quy trình kiểm tra virus trên 30 mẫu lan thu thập
Quy trình RT-PCR đã được tối ưu hóa để giám định đồng thời ORSV trên 30 mẫu lá lan Mỗi mẫu lá lan được thực hiện phản ứng RT-PCR với hai primer 18s115 và OR257, và kết quả được phân tích thông qua điện di Dưới đây là kết quả thống kê từ quá trình điện di phản ứng RT-PCR.
Hình 4.9 trình bày kết quả điện di của 10 mẫu lan, từ mẫu số 1 đến số 10, trong tổng số 30 mẫu Sản phẩm PCR của các mẫu này được tạo ra bằng primer OR257 và primer I8s115 Mẫu đối chứng dương được ký hiệu là (+) và đối chứng âm là (-) với nước cát Quá trình điện di được thực hiện trên gel 1,5% trong dung dịch TAE 0,5X, kéo dài 30 phút với hiệu điện thế 100 V.
Hình 4.10 trình bày kết quả điện di của 10 mẫu lan từ số 11 đến số 20 trong tổng số 30 mẫu Sản phẩm PCR của các mẫu này được tạo ra bằng primer OR257 và primer I8s115, với M là Ladder 100bp, (+) là đối chứng dương, và (-) là đối chứng âm (nước cất) Quá trình điện di diễn ra trên gel 1,59 trong dung dịch TAE 0.5X, kéo dài 30 phút với hiệu điện thế 100 V.
Kết quả điện di của 10 mẫu lan từ mau sô 21 đến số 30 được trình bày trong Hình 4.11, thuộc tổng số 30 mẫu Sản phẩm PCR cho các mẫu lan 21-30 (xem Bảng 3.1, Hình 3.1) được thực hiện với primer OR257 và primer 18s115 Mẫu M là Ladder 100bp, trong đó (+) là đối chứng dương và (-) là đối chứng âm (nước cát) Sản phẩm PCR được điện di trên gel 1,5% trong dung dịch TAE 0.5X, trong thời gian 30 phút với hiệu điện thế 100 V.
Trong 30 mẫu thực địa có 26 mẫu dương tính với ORSV gồm các mau 1, 3, 4, 5, 6, §, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 và có 4 mẫu âm tính gồm các mẫu 2, 7, 10, 17.
Kết quả từ phản ứng RT-PCR cho thấy virus ORSV có mặt trên 26/30 mẫu lan được thu thập tại vườn lan Nhị Binh, Hóc Môn, chiếm tỷ lệ 86,7% Trong số đó, giống Cattleya có 7/26 mẫu dương tính, trong khi giống A farmeri có 5/26 mẫu dương tính Điều này chứng tỏ có 26/30 mẫu cây hoa lan bị nhiễm virus ORSV.
Tỷ lệ nhiễm virus ORSV trong các mẫu hoa lan thu thập được ở Việt Nam rất cao, cho thấy mối nguy hiểm tiềm ẩn mà virus này gây ra cho cây hoa lan Mặc dù đây chỉ là một nghiên cứu quy mô nhỏ, nhưng kết quả này cảnh báo về sự ảnh hưởng nghiêm trọng của ORSV đối với ngành trồng lan tại Việt Nam.
CHUONG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ
Quy trình RT-PCR phát hiện virus ORSV đã được tối ưu hóa thành công, với nhiệt độ bắt cặp tối ưu là 62 °C và nồng độ primer OR#Sƒ là 0.2 uM Thời gian bắt cặp cũng được điều chỉnh để đạt hiệu quả cao nhất trong quá trình phát hiện virus.
Các mau lan thu thập âm tính với OFV.
Sau khi tối ưu quy trình RT-PCR, 30 mẫu thu thập đã được áp dụng, trong đó có 26 mẫu dương tính với ORSV, chiếm tỉ lệ 86,7% Đặc biệt, giống lan Cattleya là loại bị nhiễm nhiều nhất trong số các mẫu này.
5.2 Đề nghị Áp dụng quy trình đã được tối ưu vào các chân đoán nhanh virus ORSV gây hại trên cây hoa lan.
1 Bùi Trang Việt (2002) Tai liệu giảng day sinh học phân tử (chương trình cao học) Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, trang 141.
VÀ Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (1999) Di truyén phân tử - Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng Nhà xuất bản Nông Nghiệp, trang 195 — 209.
3 Vũ Triệu Man (chủ biên) (2007) Giáo trinh bệnh cây chuyên khoa Trường Đại hoc Nông nghiệp I — Hà Nội: 175 — 179.
4 Đào Thanh Vân (chủ biên), Đặng Thị Tố Nga (2008) Giáo trình Hoa Lan NXB
5 Pham Đức Toàn, Nguyễn Khanh Ngọc Ha, Bùi Cách Tuyến (2022) Phát hiện Cymbidium Mosaic Virus (CymMV) và Odontoglossum Ringspot Virus (ORSV) GAY bệnh trên hoa lan bang kỹ thuật PCR, Tap chi Nông nghiệp va Phat triển nông thôn,
Tài liệu tiếng nước ngoài:
6 Sue Bottom (2014) Orchid Pests and Diseases Diagnosis, Treatment and Prevention American Orchid Society.
Vs Su Min Kim, Sun Hee Choi (2015) Simultaneous detection of Cymbidium mosai virus and Odontoglossum ringspot virus in orchids using multiplex RT-PCR. Virus Genes, 51: 417 — 422.
8 Inouye, Narinobu (2008) Viruses of Orchids, Symptoms, Diagnosis, Spread, and Control Blue Bird Publisher The Netherlands.
9 Raymond, N Ali., Alison, L Dann., Peter, A Cross., Calum, R Wilson (2014). Multiplex RT-PCR detection of three common viruses infecting orchids Arch Virol, 159: 3095 — 3099.
10 Yamane, K., Oyama, K., Iuchi, E., Ogawa, H., Suzuki, T., and Natsuaki, T.,
(2008) RT-PCR Detection of Odontoglossum ringspot virus, Cymbidium mosaic virus and Tospoviruses and Association of Infections with Leaf-Yellowing symptoms in Phalaenopsis Journal of Phytopathology 156: 268 — 273.
11 Engelmann, J., & Hamacher, J (2008) Plant Virus Diseases: Ornamental Plants. Encyclopedia of Virology, 207 — 229.
12 Peng, D W., Zheng, G H., Zheng, Z Z., Tong, Q X., & Ming, Y L (2012). Orchid fleck virus: an unclassified bipartite, negative-sense RNA plant virus Archives of Virology, 158(2), 313 — 323.
13 Kubo,K.S., Freitas-Astúa, J., Machado, M A., & Kitajima, E W (2009) Orchid fleck symptoms may be caused naturally by two different viruses transmitted by Brevipalpus Journal of General Plant Pathology, 75(3), 250-255.
14 HU, J S., FERREIRA, S., WANG, M., XU, M Q (1993) Detection of Cymbidium mosaic virus, Odontoglossum ringspot virus, tomato spotted wilt virus, and potyviruses infecting orchids in Hawaii Plant Disease, 77 (5): 464 — 468.
15 Lobato, I M., & O/’Sullivan, C K (2018) Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances TrAC Trends in Analytical Chemistry, 98, 19 — 35.
16 Piepenburg, O., Williams, C H., Stemple, D L., Armes, N A (2006) DNA Detection Using Recombination Proteins PLoS Biol 4, 1115 — 1121.
17 Sushanta Kumar Naik, Sudarshan Maurya, Jaipal Singh Choudhary (2014). Growing orchid-An Overview Extension Folder: 11(7), 10 -40.
18 Hideki Kondo, Takanori Maeda, Tetsuo Tamada (2003) Research Institute for Bioresources, Okayama University, Kurashiki 710-0046, Japan.
19 Kitajima, E W., Chagas, C M., & Rodrigues, J C V (2003) Brevipalpus- Transmitted Plant Virus and Virus-Like Diseases: Cytopathology and Some Recent Cases Experimental and Applied Acarology 30: 135-160.
Phụ Lục Phụ lục số 1: Kiểm tra primer bằng công cụ primer blast của NCBI
Sequence (5->3) Length Tm 60% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GCTTGGGCTGACCCCAATTCACT 23 65.42 56.52 9.00 1.00
>0P644547.1 Odontoglossum ringspot virus isolate ORV/DH, complete genome product length = 266
Sequence (5->3) Length Tm 60% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GACTGGCAGCGGAGGCAGAC 20 65.55 7000 500 400
>KF246571.1 Orchid fleck virus isolate XM1 nucleocapsid protein gene, partial cds product length = 160
Sequence (5'->3') Length Tm 60% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCG %5 59.54 4000 700 400
The MN221398.1 Dendrobium moniliforme voucher PDBK2014-0009 includes a partial sequence of the external transcribed spacer and the small subunit ribosomal RNA gene It features the complete sequences of internal transcribed spacer 1, the 5.85 ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, along with a partial sequence of the large subunit ribosomal RNA gene, resulting in a total product length of 117.