4.4. Tối ưu và hoàn thiện quy trình Multiplex RT-PCR dé phát hiện ORSV và OFV
4.4.5. Áp dụng quy trình kiểm tra virus trên 30 mẫu lan thu thập
Áp dụng quy trình RT-PCR đã tối ưu được, tiến hành giám định đồng thời ORSV
trên 30 mẫu lá lan, mỗi lá lan được thực hiện phản ứng RT- PCR với 2 primer 18s115
và OR257, đọc kết qua bằng điện di. Dưới đây là kết quả thống kê điện di phản ứng RT-
PCR phát hiện ORSV.
34
257 bp 300 bp 118 bp 100 bp
Hình 4.9. Kết quả điện di của 10 mẫu lan từ mẫu số 1 đến số 10 (trong tổng số 30 mẫu). Sản phẩm PCR mẫu lan 1- 10 (bảng 3.1, hình 3.1) với primer OR257 và primer I8s115; M là Ladder 100bp, (+): đối chứng dương, (-): đối chứng âm (nước cát). Sản phẩm được điện di trên gel 1, 5%, trong dung dịch TAE 0.5X, 30 phút ở hiệu điện thé 100 V.
TỊ 2” 218 “GA “15460137 18 SLỢ 20
Hình 4.10. Kết quả điện di của 10 mẫu lan từ mẫu số 11 đến số 20 (trong tổng số 30 mẫu). Sản phẩm PCR mẫu lan 11- 20 (bảng 3.1, hình 3.1) với primer OR257 và primer I8s115; M là Ladder 100bp, (+): đối chứng dương, (-): đối chứng âm (nước cất). Sản phẩm được điện di trên gel 1,59, trong dung dịch TAE 0.5X, 30 phút ở hiệu điện thé 100 V.
35
300 bp
100 b itD 118 bp
Hình 4.11. Kết qua điện di của 10 mẫu lan từ mau sô 21 dén số 30 (trong tông số 30 mẫu). Sdn phẩm PCR mẫu lan 21- 30 (bảng 3.1, hình 3.1) với primer OR257 và primer 18s115; M là Ladder 100bp, (+): đối chứng dương, (-): đối chứng âm (nước cát). Sản phẩm được điện di trên gel 1,5%, trong dung dịch TAE 0.5X, 30 phút ở hiệu điện thé 100 V.
Trong 30 mẫu thực địa có 26 mẫu dương tính với ORSV gồm các mau 1, 3, 4, 5, 6,
§, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 và có 4 mẫu âm tính gồm các mẫu 2, 7, 10, 17.
Kết quả thực hiện phản ứng RT- PCR với quy trình đã được tối ưu cho thấy sự hiện diện của virus ORSV trên 30 mẫu lan được thu thập ở vườn lan Nhị Binh, Hóc Môn có triệu chứng được thê hiện thông qua Bảng 3.1 và Hình 3.1 là 26/30 (chiếm 86,7%).
Trong đó, giống Cattleya 7/26 mẫu dương tinh là nhiễm ORSV nhiều nhất, giống A.
farmeri 5/26 mẫu dương tính. Qua đó có 26/30 mau cây hoa lan bị nhiễm virus ORSV.
Tỷ lệ nhiễm virus ORSV trong các mẫu lan thu thập cao. Đây chỉ là một đề tài trên quy mô nhỏ, tuy nhiên tỷ lệ nhiễm virus thể hiện mối nguy hiểm tiềm an của virus ORSV đến cây hoa lan ở Việt Nam.
36
CHUONG 5. KET LUẬN VA DE NGHỊ
5.1. Kết luận
Tối ưu và hoàn thiện thành công quy trình RT-PCR phát hiện virus ORSV với nhiệt độ bắt cặp tối ưu là 62 °C và nồng độ primer OR#Sƒ là 0.2 uM trong thời gian bắt cặp là
30 giây.
Các mau lan thu thập âm tính với OFV.
Sau khi tối ưu quy trình RT- PCR, áp dụng lên 30 mẫu thu thập phát hiện 26/30 mau lan dương tính với ORSV chiếm tỉ lệ 86,7%, trong đó giống lan Cattleya bị nhiễm nhiều nhất trong các mẫu thu thập.
5.2. Đề nghị
Áp dụng quy trình đã được tối ưu vào các chân đoán nhanh virus ORSV gây hại
trên cây hoa lan.
37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt:
1. Bùi Trang Việt. (2002). Tai liệu giảng day sinh học phân tử (chương trình cao
học). Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, trang 141.
VÀ Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang. (1999). Di truyén phân tử - Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, trang 195 — 209.
3. Vũ Triệu Man (chủ biên). (2007). Giáo trinh bệnh cây chuyên khoa. Trường Đại hoc Nông nghiệp I — Hà Nội: 175 — 179.
4. Đào Thanh Vân (chủ biên), Đặng Thị Tố Nga. (2008). Giáo trình Hoa Lan. NXB
Nông Nghiệp Hà Nội: 9-50.
5. Pham Đức Toàn, Nguyễn Khanh Ngọc Ha, Bùi Cách Tuyến. (2022). Phát hiện Cymbidium Mosaic Virus (CymMV) và Odontoglossum Ringspot Virus (ORSV) GAY bệnh trên hoa lan bang kỹ thuật PCR, Tap chi Nông nghiệp va Phat triển nông thôn,
1859-4581.
Tài liệu tiếng nước ngoài:
6. Sue Bottom. (2014). Orchid Pests and Diseases Diagnosis, Treatment and Prevention. American Orchid Society.
Vs Su Min Kim, Sun Hee Choi. (2015). Simultaneous detection of Cymbidium mosai virus and Odontoglossum ringspot virus in orchids using multiplex RT-PCR.
Virus Genes, 51: 417 — 422.
8. Inouye, Narinobu. (2008). Viruses of Orchids, Symptoms, Diagnosis, Spread, and Control. Blue Bird Publisher. The Netherlands.
9. Raymond, N. Ali., Alison, L. Dann., Peter, A. Cross., Calum, R. Wilson. (2014).
Multiplex RT-PCR detection of three common viruses infecting orchids. Arch Virol, 159: 3095 — 3099.
10. Yamane, K., Oyama, K., Iuchi, E., Ogawa, H., Suzuki, T., and Natsuaki, T., (2008). RT-PCR Detection of Odontoglossum ringspot virus, Cymbidium mosaic virus and Tospoviruses and Association of Infections with Leaf-Yellowing symptoms in Phalaenopsis. Journal of Phytopathology 156: 268 — 273.
11. Engelmann, J., & Hamacher, J. (2008). Plant Virus Diseases: Ornamental Plants.
Encyclopedia of Virology, 207 — 229.
38
12. Peng, D. W., Zheng, G. H., Zheng, Z. Z., Tong, Q. X., & Ming, Y. L. (2012).
Orchid fleck virus: an unclassified bipartite, negative-sense RNA plant virus. Archives of Virology, 158(2), 313 — 323.
13. Kubo,K.S., Freitas-Astúa, J., Machado, M. A., & Kitajima, E. W. (2009). Orchid fleck symptoms may be caused naturally by two different viruses transmitted by Brevipalpus. Journal of General Plant Pathology, 75(3), 250-255.
14. HU, J. S., FERREIRA, S., WANG, M., XU, M. Q. (1993). Detection of Cymbidium mosaic virus, Odontoglossum ringspot virus, tomato spotted wilt virus, and potyviruses infecting orchids in Hawaii. Plant Disease, 77 (5): 464 — 468.
15. Lobato, I. M., & O/’Sullivan, C. K. (2018). Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 98, 19 — 35.
16. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. (2006). DNA Detection Using Recombination Proteins. PLoS Biol. 4, 1115 — 1121.
17. Sushanta Kumar Naik, Sudarshan Maurya, Jaipal Singh Choudhary. (2014).
Growing orchid-An Overview Extension Folder: 11(7), 10 -40.
18. Hideki Kondo, Takanori Maeda, Tetsuo Tamada. (2003). Research Institute for Bioresources, Okayama University, Kurashiki 710-0046, Japan.
19. Kitajima, E. W., Chagas, C. M., & Rodrigues, J. C. V. (2003). Brevipalpus- Transmitted Plant Virus and Virus-Like Diseases: Cytopathology and Some Recent Cases. Experimental and Applied Acarology 30: 135-160.
39
Phụ Lục
Phụ lục số 1: Kiểm tra primer bằng công cụ primer blast của NCBI
Primer pair 1
Sequence (5->3) Length Tm 60% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GCTTGGGCTGACCCCAATTCACT 23 65.42 56.52 9.00 1.00
Reverse primer GGATTCTGCGGATTTTCTACCTCG 24 61.56 50.00 4.00 2.00
Products on target templates
>0P644547.1 Odontoglossum ringspot virus isolate ORV/DH, complete genome
product length = 266
Forward primer 1 GCTTGGGCTGACCCCAATTCACT 23 Template S169: sotiostyu00000/60 du-gg 5791
Reverse primer 1 GGATTCTGCGGATTTTCTACCTCG 24 Template OBA wnisreisisieaoneernarrgaisisiemaneiens 6011
Primer pair 1
Sequence (5->3) Length Tm 60% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GACTGGCAGCGGAGGCAGAC 20 65.55 7000 500 400
Reverse primer CTGGCGGAAGGGGGTGTGAACAG 23 67.50 65.22 4.00 2.00
Products on target templates
>KF246571.1 Orchid fleck virus isolate XM1 nucleocapsid protein gene, partial cds
product length = 160
Forward primer 1 GACTGGCAGCGGAGGCAGAC 20 Template BD: suawenslechsienientensos 58
Reverse primer 1 CTGGCGGAAGGGGGTGTGAACAG 23 Template 198) ;ssgzsiosgaoxaaivseeeslvsu THẾ
Primer pair 1
Sequence (5'->3') Length Tm 60% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCG %5 59.54 4000 700 400
Reverse primer CCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC 24 63.16 50.00 7.00 3.00
Products on target templates
>MN221398.1 Dendrobium moniliforme voucher PDBK2014-0009 external transcribed spacer, partial sequence; small subunit ribosomal RNA gene, internal transcribed spacer 1, 5.85 ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence
product length = 117
Forward primer 1 GAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCG 25
Template 1596 ... 1620
Reverse primer 1 CCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC 24 Template THỂ sconces 4689