Đặt vấn đề Ralstonia solanacearum là tác nhan của bệnh héo xanh trên 250 loài cây thuộc hơn 54 họ thực vật khác nhau, đặc biệt là họ Solanaceae và họ Musaceae trong đó có các cây trồng p
Hạn chế - + 5s csE SE SEEEEEEE5212171212111 1112111111111 EEece 12
Thông tin về trình tự của primer là rất quan trọng để tạo ra các đoạn primer cho phép khuếch đại chọn lọc Người dùng PCR cần nắm rõ trình tự chính xác của vùng đích trên mỗi mẫu của hai khuôn mẫu sợi đơn, nhằm đảm bảo rằng DNA polymerase sẽ liên kết đúng với các mẫu lai với primer.
Giống như tat cả các enzym, DNA polymerase cũng dé bị lỗi, do đó gây ra đột biến trong các đoạn PCR được tạo ra.
Ngay cả lượng DNA tạp nhiễm nhỏ nhất cũng có thể được khuếch đại, dẫn đến kết quả sai lệch hoặc không rõ rang.
Các mẫu môi trường có chứa axit humic có thé ức chế quá trình khuếch đại PCR và dẫn đến kết quả không chính xác.
2.3.4.1 Công nghệ giải trình tự
PCR đã đóng góp đáng kể vào sự phát triển của công nghệ giải trình tự, giúp quá trình này trở nên dễ dàng và thuận tiện hơn Hơn nữa, PCR không chỉ nâng cao khả năng giải trình tự trong nghiên cứu mà còn mở rộng ứng dụng của nó trong chẩn đoán.
Phương pháp này cho phép nhân bản đoạn gen cần giải trình tự thành nhiều bản sao, đồng thời thực hiện giải trình tự trực tiếp mà không cần sử dụng plasmid Nhờ vào chu kỳ nhiệt hiệu quả, phản ứng giải trình tự được cải thiện đáng kể và việc tối ưu hóa các thành phần phản ứng cũng trở nên dễ dàng hơn.
PCR đã giúp tăng tốc kỹ thuật giải trình tự không chỉ trong vấn đề hoàn thiện nó, mà còn cả trong van đê phạm vi áp dụng.
2.3.4.2 Phân lập DNA có chọn lọc
PCR là phương pháp cho phép phân lập và khuếch đại các đoạn DNA cụ thể từ bộ gen, cung cấp lượng DNA tinh khiết cần thiết cho các kỹ thuật như Southern blot và Northern blot Việc sử dụng PCR giúp tạo ra các đầu dò lai và nhân bản DNA, đáp ứng nhu cầu về lượng DNA lớn hơn cho việc phân tích Nhờ khả năng khuếch đại, PCR cho phép nghiên cứu các mẫu DNA ngay cả khi chỉ có một lượng nguyên liệu ban đầu rất nhỏ.
PCR có nhiều ứng dụng quan trọng, bao gồm xác định trình tự DNA và khuếch đại các đoạn chưa biết, với một trong các đoạn primer có thể được sử dụng trong giải trình tự Sanger Ngoài ra, PCR cũng hỗ trợ trong việc phân lập trình tự DNA để thực hiện công nghệ DNA tái tổ hợp, liên quan đến việc chèn trình tự DNA vào plasmid, phage, hoặc cosmid Việc sàng lọc nhanh chóng các khuẩn lạc vi khuẩn bằng PCR giúp xác định các cấu trúc vectơ DNA chính xác.
Phương pháp lấy dấu vân tay PCR có khả năng phân biệt cao, giúp xác định mối quan hệ di truyền giữa các cá nhân Kỹ thuật này mang lại độ chính xác và tin cậy trong việc phân tích gen.
Việc sử dụng đồng hồ phân tử, đặc biệt là gen 16S rRNA và recA, cho phép xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật Những gen này đóng vai trò quan trọng trong việc phân tích và so sánh di truyền, giúp làm sáng tỏ sự phát triển và liên kết giữa các loài vi sinh vật.
2.3.4.3 Khuéch đại và định lượng DNA
PCR là phương pháp phân tích hiệu quả cho các mẫu DNA cực nhỏ, cho phép nghiên cứu di sản sinh học hàng nghìn năm tuổi, từ DNA của voi ma mút 40.000 năm tuổi cho đến việc phân tích xác ướp Ai Cập, xác định danh tính của sa hoàng Nga và thi hài của Vua Anh Richard III.
Phương pháp PCR thời gian thực (realtime PCR) cho phép ước tính số lượng trình tự DNA trong mẫu, thường được sử dụng để xác định mức độ biểu hiện gen Kỹ thuật qPCR có khả năng định lượng và phát hiện chuỗi DNA cụ thể trong thời gian thực bằng cách đo nồng độ trong quá trình tổng hợp Một ứng dụng thú vị là sự kết hợp giữa PCR thời gian thực và phiên mã ngược, được gọi là RT-qPCR, cho phép định lượng RNA với độ chính xác cao Kỹ thuật này giảm thiểu lỗi ở giai đoạn cuối của PCR, nâng cao khả năng phát hiện các gen liên quan đến bệnh di truyền như ung thư Các phòng thí nghiệm áp dụng RT-qPCR để đo lường sự điều hòa gen một cách nhạy cảm.
2.3.4.4 Chan đoán và sàng lọc bệnh hại cây trồng
Xét nghiệm PCR cho thấy độ đặc hiệu cao và tốc độ nhanh hơn so với các phương pháp truyền thống, điều này rất quan trọng trong việc cải thiện quyết định kiểm soát dịch bệnh Ngoài ra, kỹ thuật này còn có thể áp dụng cho các vi sinh vật không thể nuôi cấy, giúp xác định chúng mà không cần phải phân lập.
Việc thiết kế bộ primer PCR dựa trên vùng gen cụ thể cho phép thực hiện các xét nghiệm chẩn đoán với độ chính xác cao, giúp phát hiện các loài và chủng mầm bệnh từ những loài liên quan hoặc cùng một loài Đánh giá đa dạng di truyền thông qua các chỉ thị kết hợp PCR đóng vai trò quan trọng trong việc sử dụng và bảo tồn gen, làm nền tảng cho công tác chọn lọc giống cây trồng hiệu quả.
CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 7 năm 2022 đến tháng 12 năm 2022 tại Phòng thí nghiệm Bệnh học và Chẩn đoán phân tử thuộc Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Mau Ralstonia pickettii (DV026) và Ralstonia solanacearum (DV025) đã được xác định là đối chứng dương, được cung cấp bởi Phòng Thí nghiệm Bệnh học Người và Chẩn đoán Phân tử, thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Mau cây bệnh: dưa leo (Hàm Tân — Bình Thuận); cà chua và ớt chuông (Đà Lạt
— Lâm Đồng); ớt (Di Linh — Lâm Đồng ) được thu thập trong khoảng thời gian từ 09/2022 đến 10/2022.
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Thiết kế primer: Máy tính.
Công cụ thiết kế primer: NCBI, Primer3, Jn silico PCR Amplification.
Phân lập mau: Tủ cay vi sinh, cân điện tử, tủ sấy, lò vi sóng, nồi hap vô trùng.
Ly trích DNA: Máy vortex, máy ly tâm, tủ lạnh. Định danh sinh học phân tử: May PCR, máy điện di gel, máy chụp gel (MultiDoc
Lay mau: Tui zip, dao, kéo.
Phân lập mau: Dia petri, ông nghiệm, cối sứ, chày sứ, bình thuỷ tinh, ống dong, đèn côn, que cấy.
Ly trích DNA: Micropipet, đầu tuýp, cốc thuỷ tinh, eppendorf. Định danh sinh học phân tử: Micropipet, đầu tuýp, eppendorf, tube PCR.
3.2.3 Môi trường nuôi cấy và hoá chất
Môi trường nuôi cấy Casamino acid – Peptone – Glucose (CPG) bao gồm Casamino acid (casein hydrolysate) 1 g/l, Peptone 10 g/l, và Glucose 5 g/l Để tạo môi trường rắn, cần thêm Agar 15 g/l pH của môi trường được điều chỉnh ở mức 6,5 - 7,0 và tiến hành hấp tiệt trùng ở 121°C trong 20 phút.
Môi trường tăng sinh Luria Bertani (LB): Tryptone 10 g/l, Yeast extract 5 g/l,
NaCl 10 g/l Điều chỉnh pH = 6,5 - 7,0 Hap tiệt trùng ở 121°C trong 20 phút.
To extract DNA, use a PCI solution (Phenol:Chloroform:Isomyl alcohol at a ratio of 25:24:1), along with STE buffer, TE buffer, lysis buffer, chloroform, and ethanol For molecular identification, employ GelRed, a 0.5X TBE buffer (composed of Tris HCl, Borate, and EDTA), agarose gel, a 1 kb ladder, a 100 bp ladder, a 5X buffer, Taq polymerase, and the specific primer sets 63F-1489R, RalF-RalR, and RsoF-RsoR.
Thiết kế và kiểm tra độ đặc hiệu primer bằng công cụ tin sinh học a
Gửi mẫu giải trình tự và so sánh trên cơ sở dữ liệu NCBI
Sau khi thực hiện PCR với mẫu phân lập, chọn mẫu có kích thước sản phẩm tương tự như sản phẩm mẫu đối chứng để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại 16S-rRNA Mẫu định danh sẽ được gửi đến công ty GENLAB (Việt Nam) để phân tích Kết quả giải trình tự sẽ được cung cấp sau đó.
BLAST trên hệ thống cơ sở dit liệu NCBI dé so sánh độ tương đồng.
Đánh giá độ nhạy của quy trình - cece cece + S3 SE ng ng nnrưrưy 23
Khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp primer RalF — RalR
Phản ứng khảo sát được thực hiện trên mẫu đối chứng 8 pickettii (DV026) cho việc phát hiện Ralstonia spp.
Hình 4.7 Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp primer RalF — RalR
Kết quả Hình 4.7 cho thấy các giếng đều xuất hiện band có kích thước 108 bp giống với khảo sát ban đầu ở 56°C nhưng band phụ va primer dimer sáng Ở giếng
57,1°C thì band mục tiêu là sáng, rõ rang, band phụ va primer dimer mờ hon Dé đó,
57°C là nhiệt độ tối ưu cho phản ứng PCR phát hiện Ralstonia spp.
4.3.1.2 Khảo sát thời gian bắt cặp tối ưu của cặp primer RalF — RalR
Hình 4.8 Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp primer RalF —RalR.
(M): ladder 100 bp; (-): đối chứng âm; 1: 15 giây; 2: 30 giây; 3: 45 giây
Kết quả Hình 4.8 cho thấy rằng thời gian 15 giây là tối ưu cho quy trình PCR, với sản phẩm PCR sáng và không có band phụ So với 30 giây, thời gian này giảm thiểu sự xuất hiện của primer dimer, trong khi 45 giây dẫn đến nhiều band phụ và primer dimer nhiều hơn.
4.3.1.3 Khảo sát nồng độ primer tối ưu của cặp primer RalF — RalR
Hình 4.9 Kết quả khảo sát nồng độ primer tối ưu của cặp primer RalF — RalR (A⁄): ladder 100 bp; (-): đối chứng âm; 1:
0,2 uM/ul; 2: 0,4 uM/ul; 3: 0,6 uM/ul; 4: 0,8 uM/ul
Kết quả từ Hình 4.9 cho thấy rằng ở nồng độ primer 0,6 M/HI, sản phẩm PCR xuất hiện với band sáng rõ ràng, trong khi primer dimer chỉ hiện lên mờ Do đó, nồng độ 0,6 uM/l được xác định là nồng độ primer tối ưu cho quy trình PCR.
4.3.1.4 Đánh giá độ đặc hiệu quy trình phát hiện Ralstonia spp.
Hình 4.10 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp primer RalF — RalR (4): ladder 100 bp; (-): đối chứng âm; 1: R pickettii (DV026); 2: R solanacearum
(DV025); 3: R solanacearum 8; 4: R solanacearum 513; 5: B subtillis, 6: B. lichenifomis; 7: B megaterium; 8: L plantarum; 9: E carotovora
Kết quả từ Hình 4.10 cho thấy các giếng không thuộc Ralstonia spp đều xuất hiện band với kích thước gần giống band mục tiêu 108 bp Một số giếng như 6, 8, và 9 có sản phẩm kích thước gần bằng band mục tiêu, khiến việc phân biệt giữa các loài trở nên khó khăn Do đó, cặp primer RalF — RalR không đặc hiệu cho việc phát hiện sự hiện diện của Ralstonia spp.
4.3.2 Tối ưu hóa quy trình PCR phat hiện R solanacearum
4.3.2.1 Khao sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp primer RsoF — RsoR
Phản ứng khảo sát được thực hiện trên mẫu đối chứng R solanacearum (DV025) cho viéc phat hién R solanacearum.
Hình 4.11 Kết qua khảo sát nhiệt độ bat cặp tối ưu của cặp primer RsoF — RsoR
Kết quả từ hình 4.11 cho thấy các giếng 54,0; 57,1; 58,2; và 59,2°C xuất hiện band kích thước 285 bp tương tự như khảo sát ban đầu ở 55°C Tuy nhiên, chỉ giếng 58,2°C có band mục tiêu sáng nhất, cùng với band phụ và primer dimer mờ nhất Do đó, 58°C được xác định là nhiệt độ tối ưu cho phản ứng PCR phát hiện R solanacearum.
4.3.2.2 Khao sát thời gian bắt cặp tối ưu của cặp primer RsoF — RsoR
Hình 4.12 Kết qua khảo sát nhiệt độ bat cặp tối ưu của cặp primer RsoF — RsoR (M): ladder 1 kb; (-): đối chứng âm; 1: 15 giây; 2: 30 giây; 3: 45 giây
Kết quả từ Hình 4.12 cho thấy rằng ở thời gian 45 giây, sản phẩm PCR tạo ra band mục tiêu rõ ràng mà không có band phụ Do đó, 45 giây được xác định là thời gian tối ưu cho quá trình bắt cặp trong PCR.
4.3.2.3 Khảo sát nồng độ primer tối ưu của cặp primer RsoE — RsoR
Hình 4.13 Kết qua khảo sát nồng độ primer tôi ưu của cặp primer
RsoF — RsoR (M): ladder 1 kb; (-): đối chứng âm; 1: 0,2 uM/ul; 2: 0,4 uM/ul; 3: 0,6 uM/ul; 4: 0,8 uM/ul
Kết quả Hình 4.13 chỉ ra rằng ở nồng độ primer 0,6 uM/ul, sản phẩm PCR tạo ra band sáng rõ ràng, trong khi primer dimer xuất hiện mờ Do đó, nồng độ 0,6 pM/l được xác định là nồng độ primer tối ưu cho quy trình.
4.3.2.4 Đánh giá độ đặc hiệu quy trình phát hiện R solanacearum
Hình 4.14 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp primer RsoF — RsoR (M): ladder
1 kb; (-): doi chứng âm; 1: R solanacearum (DV025); 2: R solanacearum 513 ; 3: R. solanacearum 8; 4: R pickettii (DV026) ; 5: B subtillis, 6: B lichenifomis; 7: B. megaterium; 8: L plantarum; 9: E carotovora
Kết quả phân tích độ đặc hiệu của cặp primer RsoF — RsoR cho thấy sự xuất hiện band sáng, rõ với kích thước 285 bp ở mẫu đối chứng R solanacearum, trong khi các mẫu DNA định danh (4 - 9) và đối chứng âm không có band Điều này chứng tỏ cặp primer RalF — RalR được thiết kế đặc hiệu để phát hiện R solanacearum.
4.4 Kết quả phân lập và chọn lọc R solanacearum
4.4.1 Thu thập mẫu cây bệnh và phân lập R solanacearum
Trong quá trình thu thập, chúng tôi đã ghi nhận 2 cây cà chua (C), 4 cây ớt chuông (OC), 1 cây ớt (O) và 3 cây dưa leo (DL) từ 4 mẫu đất khác nhau Mỗi mẫu cây bệnh được thu thập bao gồm lá (L), thân (T) và rễ (R) Đặc biệt, tại vườn dưa leo, chúng tôi đã tiến hành thu thập các mẫu cây bệnh để phân tích.
Hình 4 15 Thu thập mẫu cây bị bệnh héo xanh 4: Cây 6t; B: Cây ớt chuông;
C: Cây ca chua; D: Cây dưa leo
Hình 4.16 Hình thái khuẩn lạc R solanacearum cấy trên môi trường CPG
Các mẫu vi khuẩn được phân lập trên môi trường CPG, với các khuẩn lạc được chọn tiếp tục cấy ria cho đến khi tạo dòng thuần Khi nuôi cấy trên môi trường CPG, các chủng độc lực xuất hiện với khuẩn lạc màu trắng đến màu kem, hình dạng tròn không đều, lỏng và mờ đục, trong khi các khuẩn lạc không độc có màu trắng hoặc kem, kích thước nhỏ hơn, hình dạng tròn đều và mờ đục (Raymond và ctv, 2019) Kết quả phân lập khuẩn lạc với các đặc điểm nêu trên được tổng hợp trong Bảng 4.2 (Phụ lục 1).
Bang 4.2 Kết qua thu mẫu và phân lập R solanacearum
Nơi lay mẫu Mẫu cây/đất | Số khuẩn lạc phân lập
Di Linh - Lâm Đồng 1 cây ớt 5
3 cay dua leo 19 Hàm Tân - Bình Thuận :
4.4.2 Kết quả kiém nghiệm sinh hóa sàng lọc R solanacearum
Hình 4.17 Kiểm nghiệm sinh hóa với các mau phân lập 4 Nhuộm Gram;
B Thứ nghiện KOH; C Thử nghiệm Catalase oxidase; D Thử nghiệm sản xuất sắc tô huỳnh quang
R solanacearum khi nhuộm Gram tế bào giữ màu hồng, có hình que ngắn, tròn hai đầu (Hình 4.17A); tạo sợi nhay khi hòa với KOH 3% (Hình 4.17B); sinh bọt khí khi trộn với H2O2 3% (Hình 4.17C); không phát quang khi chiếu UV (Hình 4.17D) Tiến hành chọn mẫu phân lập có đặc tính như trên Kết quả kiểm nghiệm đã sàng lọc được 57/60 mẫu phân lập (Phụ lục 2) có thé là R solanacearum (Popoola va ctv, 2015).
4.5 Kết qua thực hiện PCR trên mẫu phân lập phát hiện R solanacearum
4.5.1 Kiểm tra chất lượng DNA ly trích
Hình 4.18 Kết quả khuếch đại cùng 16S —rRNA của các mẫu phân lập (M): ladder 1 kb;
(-): doi chứng âm; 1: OCT4.2; 2: OCR2.1; 3: OCT2.2; 4: OCR3.2; 5: CLI.2; 6: OCL1.1; 7: OCT1.2; 8: OCRI.1; 9: CT2.1
Ly trích DNA từ các mẫu phân lập đã được sang lọc kỹ lưỡng Tiến hành phản ứng PCR 16S — tRNA với cặp primer 63F — 1489R nhằm khẳng định rằng bộ genome của các mẫu ly trích thuộc về vi khuẩn Chọn lựa các mẫu ly trích có chất lượng DNA tinh sạch, với băng sáng rõ và không bị gãy.
Tất cả 57 mẫu DNA đã được kiểm tra và đảm bảo chất lượng phù hợp cho các phản ứng tiếp theo, với kích thước băng sáng rõ ràng khoảng 1200 - 1500 bp, như thể hiện trong Hình 4.18 (Phụ lục 3).
4.5.2 Sản phẩm phản ứng PCR phát hiện Ralstonia spp.
Mặc dù quy trình PCR sử dụng cặp primer RalF — RalR không đặc hiệu cho việc phát hiện Ralstonia spp., nhưng nó vẫn đóng vai trò quan trọng trong việc sàng lọc mẫu phân lập khỏi những loài vi khuẩn chưa được nghiên cứu.
Hình 4.19 Kết qua phản ứng PCR phát hiện Ralstonia spp của mẫu phân lập.
(M): ladder 100 bp; (-): doi chứng âm; (+): doi chứng dương; 1: OCT4.2; 2: OCR2.1; 3: OCT2.2; 4: OCR3.2; 5: CL1.2; 6: OCL1.1; 7: OCT 1.2; 8: OCRI.1; 9: CT2.1
Chín mẫu phân lập trên Hình 4.19 cho thấy sản phẩm khuếch đại có kích thước tương đồng với mẫu đối chứng Những mẫu này có khả năng là Ralstonia spp., do đó, các mẫu có kích thước sản phẩm band không chênh lệch rõ ràng có thể được sử dụng cho phản ứng PCR phát hiện R solanacearum Kết quả cho thấy 57/57 mẫu phân lập đều có khả năng là Ralstonia spp và tất cả đều được thực hiện phản ứng PCR phát hiện.
4.5.3 San phẩm phan ứng PCR phát hiện R solanacearum
Trong quá trình nghiên cứu, 1/9 mẫu phân lập đã cho kết quả xuất hiện band tương đương với đối chứng dương (Hình 4.20), xác định mẫu OCT1.2 là 8 solanacearum Sử dụng phản ứng PCR với cặp primer RsoF — RsoR, chúng tôi đã phát hiện 36/57 mẫu phân lập dương tính.
Hỡnh 4.20 Kết quả phản ứng PCR phỏt hiện ệ solanacearum của mẫu phõn lập.
(M): ladder 1 kb; (-): doi chung âm; (+): doi chứng dương; 1: OCT4.2; 2: OCR2.1; 3: OCT2.2; 4: OCR3.2; 5: CL1.2; 6: OCL1.1; 7: OCT1.2; 8: OCRI.1; 9: CT2.1
4.5.4 Giải trình tự mẫu phân lập
Description Scientific Name bees Ris, ae ee ss Acc.Len Accession
[ (E3 Ralstonia solanacearum partial 165 rRNA gene isolate Rett Ralstonia solanacearum 1528 1528 100% 0.0 97.13% 906
Uncultured Ralstonia sp clone CR3 16S ribosomal RNA gene partial sequence uncultured Ralstonia sp 1519 1519 100% 0.0 96.92% 908
Uncultured Ralstonia sp clone DF4 16S ribosomal RNA gene partial sequence uncultured Ralstonia sp 1430 1430 96% 0.0 96.22% 961
Uncultured Ralstonia sp clone FG7 16S ribosomal RNA gene partial sequence uncultured Ralstonia sp 1413 1413 96% 00 95.88% 964
Ralstonia solanacearum strain APK76 16S ribosomal RNA gene partial sequence Ralstonia solanacearum 1402 1402 94% 00 96.16% 959
Uncultured Ralstonia sp clone HJ6 16S ribosomal RNA gene partial sequence uncultured Ralstonia sp 1402 1402 94% 0.0 96.16% 959
Ralstonia solanacearum strain KAK51 16S ribosomal RNA gene partial sequence Ralstonia solanacearum 1371 1371 96% 00 94.98% 930
Hình 4.21 Kết qua BLAST trình tự vùng 16S —rRNA R solanacearum của mẫu OL1.1
Hinh 4 22 Kết quả giải th tự vùng 16 —rRNA Ä solanacearum của mẫu OL1.1
Khảo sát nồng độ primer tối ưu của cặp primer RalF — RalR
Hình 4.9 Kết quả khảo sát nồng độ primer tối ưu của cặp primer RalF — RalR (A⁄): ladder 100 bp; (-): đối chứng âm; 1:
0,2 uM/ul; 2: 0,4 uM/ul; 3: 0,6 uM/ul; 4: 0,8 uM/ul
Kết quả từ Hình 4.9 cho thấy rằng ở nồng độ primer 0,6 µM/l, sản phẩm PCR tạo ra band sáng rõ ràng, trong khi primer dimer chỉ xuất hiện mờ Do đó, nồng độ 0,6 µM/l được xác định là nồng độ primer tối ưu cho quy trình PCR.
Đánh giá độ đặc hiệu quy trình phát hiện Ralstonia Sp - - 5: - 29 4.3.2 Tối ưu húa quy trỡnh PCR phỏt hiện R solanacearum . -.3ệ 4.3.2.1 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp primer RsoF — RsoR
Hình 4.10 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp primer RalF — RalR (4): ladder 100 bp; (-): đối chứng âm; 1: R pickettii (DV026); 2: R solanacearum
(DV025); 3: R solanacearum 8; 4: R solanacearum 513; 5: B subtillis, 6: B. lichenifomis; 7: B megaterium; 8: L plantarum; 9: E carotovora
Kết quả từ Hình 4.10 cho thấy các giếng không thuộc Ralstonia spp xuất hiện band có kích thước gần giống với band mục tiêu 108 bp Một số giếng (6, 8, 9) có sản phẩm kích thước gần như bằng với band mục tiêu, khiến việc phân biệt giữa các loài trở nên khó khăn Do đó, cặp primer RalF — RalR không đặc hiệu cho việc phát hiện sự hiện diện của Ralstonia spp.
4.3.2 Tối ưu hóa quy trình PCR phat hiện R solanacearum
4.3.2.1 Khao sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp primer RsoF — RsoR
Phản ứng khảo sát được thực hiện trên mẫu đối chứng R solanacearum (DV025) cho viéc phat hién R solanacearum.
Hình 4.11 Kết qua khảo sát nhiệt độ bat cặp tối ưu của cặp primer RsoF — RsoR
Kết quả từ Hình 4.11 cho thấy rằng ở các giếng 54,0; 57,1; 58,2; và 59,2°C, xuất hiện band kích thước 285 bp tương tự như khảo sát ban đầu ở 55°C Tuy nhiên, chỉ có giếng 58,2°C cho band mục tiêu sáng nhất, cùng với band phụ và primer dimer mờ nhất Do đó, nhiệt độ tối ưu cho phản ứng PCR phát hiện R solanacearum là 58°C.
4.3.2.2 Khao sát thời gian bắt cặp tối ưu của cặp primer RsoF — RsoR
Hình 4.12 Kết qua khảo sát nhiệt độ bat cặp tối ưu của cặp primer RsoF — RsoR (M): ladder 1 kb; (-): đối chứng âm; 1: 15 giây; 2: 30 giây; 3: 45 giây
Kết quả từ Hình 4.12 chỉ ra rằng sau 45 giây, sản phẩm PCR tạo ra band mục tiêu rõ ràng mà không có band phụ, cho thấy đây là thời gian bắt cặp tối ưu cho quy trình PCR.
4.3.2.3 Khảo sát nồng độ primer tối ưu của cặp primer RsoE — RsoR
Hình 4.13 Kết qua khảo sát nồng độ primer tôi ưu của cặp primer
RsoF — RsoR (M): ladder 1 kb; (-): đối chứng âm; 1: 0,2 uM/ul; 2: 0,4 uM/ul; 3: 0,6 uM/ul; 4: 0,8 uM/ul
Kết quả từ Hình 4.13 chỉ ra rằng ở nồng độ primer 0,6 uM/ul, sản phẩm PCR cho thấy band sáng rõ ràng, trong khi primer dimer xuất hiện mờ Do đó, nồng độ 0,6 pM/l được xác định là nồng độ tối ưu cho quy trình.
4.3.2.4 Đánh giá độ đặc hiệu quy trình phát hiện R solanacearum
Hình 4.14 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp primer RsoF — RsoR (M): ladder
1 kb; (-): doi chứng âm; 1: R solanacearum (DV025); 2: R solanacearum 513 ; 3: R. solanacearum 8; 4: R pickettii (DV026) ; 5: B subtillis, 6: B lichenifomis; 7: B. megaterium; 8: L plantarum; 9: E carotovora
Kết quả phân tích độ đặc hiệu của cặp primer RsoF — RsoR cho thấy sự xuất hiện của band sáng, rõ với kích thước 285 bp ở mẫu đối chứng R solanacearum, trong khi các mẫu DNA định danh và đối chứng âm không có band nào Điều này chứng tỏ cặp primer RalF — RalR được thiết kế đặc hiệu cho việc phát hiện R solanacearum.
4.4 Kết quả phân lập và chọn lọc R solanacearum
4.4.1 Thu thập mẫu cây bệnh và phân lập R solanacearum
Trong quá trình thu thập mẫu cây, chúng tôi đã lấy được 2 cây cà chua (C), 4 cây ớt chuông (OC), 1 cây ớt (O) và 3 cây dưa leo (DL) từ 4 mẫu đất khác nhau Mỗi mẫu cây bị bệnh đều được thu thập các bộ phận như lá (L), thân (T) và rễ (R) để phục vụ cho nghiên cứu Tại vườn dưa leo, việc thu thập mẫu đã được thực hiện một cách cẩn thận.
Hình 4 15 Thu thập mẫu cây bị bệnh héo xanh 4: Cây 6t; B: Cây ớt chuông;
C: Cây ca chua; D: Cây dưa leo
Hình 4.16 Hình thái khuẩn lạc R solanacearum cấy trên môi trường CPG
Các mẫu vi khuẩn được phân lập từ môi trường CPG, với các khuẩn lạc được chọn và cấy ria cho đến khi thuần chủng Khi nuôi cấy trên CPG, các chủng độc lực thể hiện khuẩn lạc màu trắng đến màu kem, có hình dạng tròn không đều, lỏng và mờ đục Ngược lại, các khuẩn lạc không độc có màu trắng hoặc kem, kích thước nhỏ hơn, hình dạng tròn đều và cũng mờ đục (Raymond và ctv, 2019) Kết quả phân lập khuẩn lạc với các đặc điểm trên được tổng hợp trong Bảng 4.2 (Phụ lục 1).
Bang 4.2 Kết qua thu mẫu và phân lập R solanacearum
Nơi lay mẫu Mẫu cây/đất | Số khuẩn lạc phân lập
Di Linh - Lâm Đồng 1 cây ớt 5
3 cay dua leo 19 Hàm Tân - Bình Thuận :
4.4.2 Kết quả kiém nghiệm sinh hóa sàng lọc R solanacearum
Hình 4.17 Kiểm nghiệm sinh hóa với các mau phân lập 4 Nhuộm Gram;
B Thứ nghiện KOH; C Thử nghiệm Catalase oxidase; D Thử nghiệm sản xuất sắc tô huỳnh quang
R solanacearum khi nhuộm Gram tế bào giữ màu hồng, có hình que ngắn, tròn hai đầu (Hình 4.17A); tạo sợi nhay khi hòa với KOH 3% (Hình 4.17B); sinh bọt khí khi trộn với H2O2 3% (Hình 4.17C); không phát quang khi chiếu UV (Hình 4.17D) Tiến hành chọn mẫu phân lập có đặc tính như trên Kết quả kiểm nghiệm đã sàng lọc được 57/60 mẫu phân lập (Phụ lục 2) có thé là R solanacearum (Popoola va ctv, 2015).
4.5 Kết qua thực hiện PCR trên mẫu phân lập phát hiện R solanacearum
4.5.1 Kiểm tra chất lượng DNA ly trích
Hình 4.18 Kết quả khuếch đại cùng 16S —rRNA của các mẫu phân lập (M): ladder 1 kb;
(-): doi chứng âm; 1: OCT4.2; 2: OCR2.1; 3: OCT2.2; 4: OCR3.2; 5: CLI.2; 6: OCL1.1; 7: OCT1.2; 8: OCRI.1; 9: CT2.1
Ly trích DNA từ các mẫu phân lập đã được sang lọc kỹ lưỡng Tiến hành phản ứng PCR 16S — tRNA với cặp primer 63F — 1489R để xác định bộ genome của các mẫu DNA ly trích là của vi khuẩn Chọn những mẫu ly trích có chất lượng DNA tinh khiết, với band sáng rõ và không bị gãy.
Tất cả 57 mẫu DNA đều đạt chất lượng tốt, với kích thước băng khoảng 1200 - 1500 bp, cho thấy chúng phù hợp cho các phản ứng tiếp theo Kết quả này được minh chứng trong Hình 4.18 và chi tiết hơn có trong Phụ lục 3.
4.5.2 Sản phẩm phản ứng PCR phát hiện Ralstonia spp.
Mặc dù quy trình PCR sử dụng cặp primer RalF — RalR không hoàn toàn đặc hiệu cho việc phát hiện Ralstonia spp., nhưng nó vẫn đóng vai trò quan trọng trong việc sàng lọc mẫu phân lập khỏi các loài vi khuẩn chưa được nghiên cứu.
Hình 4.19 Kết qua phản ứng PCR phát hiện Ralstonia spp của mẫu phân lập.
(M): ladder 100 bp; (-): doi chứng âm; (+): doi chứng dương; 1: OCT4.2; 2: OCR2.1; 3: OCT2.2; 4: OCR3.2; 5: CL1.2; 6: OCL1.1; 7: OCT 1.2; 8: OCRI.1; 9: CT2.1
Các mẫu phân lập trên Hình 4.19 cho thấy sản phẩm khuếch đại có kích thước tương đồng với mẫu đối chứng Những mẫu này có thể là Ralstonia spp., do đó, những mẫu có kích thước sản phẩm band không chênh lệch quá rõ ràng vẫn có thể được sử dụng cho phản ứng PCR phát hiện R solanacearum Kết quả cho thấy 57/57 mẫu phân lập đều có thể là Ralstonia spp và tất cả đều được thực hiện phản ứng PCR phát hiện.
4.5.3 San phẩm phan ứng PCR phát hiện R solanacearum
Trong nghiên cứu, đã phát hiện 1/9 mẫu phân lập có band tương đương với đối chứng dương, xác định mẫu OCT1.2 là 8 solanacearum Sử dụng phản ứng PCR với cặp primer RsoF — RsoR, kết quả cho thấy có 36/57 mẫu phân lập được phát hiện.
Hỡnh 4.20 Kết quả phản ứng PCR phỏt hiện ệ solanacearum của mẫu phõn lập.
(M): ladder 1 kb; (-): doi chung âm; (+): doi chứng dương; 1: OCT4.2; 2: OCR2.1; 3: OCT2.2; 4: OCR3.2; 5: CL1.2; 6: OCL1.1; 7: OCT1.2; 8: OCRI.1; 9: CT2.1
4.5.4 Giải trình tự mẫu phân lập
Description Scientific Name bees Ris, ae ee ss Acc.Len Accession
[ (E3 Ralstonia solanacearum partial 165 rRNA gene isolate Rett Ralstonia solanacearum 1528 1528 100% 0.0 97.13% 906
Uncultured Ralstonia sp clone CR3 16S ribosomal RNA gene partial sequence uncultured Ralstonia sp 1519 1519 100% 0.0 96.92% 908
Uncultured Ralstonia sp clone DF4 16S ribosomal RNA gene partial sequence uncultured Ralstonia sp 1430 1430 96% 0.0 96.22% 961
Uncultured Ralstonia sp clone FG7 16S ribosomal RNA gene partial sequence uncultured Ralstonia sp 1413 1413 96% 00 95.88% 964
Ralstonia solanacearum strain APK76 16S ribosomal RNA gene partial sequence Ralstonia solanacearum 1402 1402 94% 00 96.16% 959
Uncultured Ralstonia sp clone HJ6 16S ribosomal RNA gene partial sequence uncultured Ralstonia sp 1402 1402 94% 0.0 96.16% 959
Ralstonia solanacearum strain KAK51 16S ribosomal RNA gene partial sequence Ralstonia solanacearum 1371 1371 96% 00 94.98% 930
Hình 4.21 Kết qua BLAST trình tự vùng 16S —rRNA R solanacearum của mẫu OL1.1
Hinh 4 22 Kết quả giải th tự vùng 16 —rRNA Ä solanacearum của mẫu OL1.1
Dựa vào kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR, mẫu OL1.1 đã được chọn ngẫu nhiên để gửi đi giải trình tự Kết quả giải trình tự này được đối chiếu với dữ liệu trên GenBank (NCBI) thông qua công cụ BLAST, xác nhận rằng mẫu OL1.1 có độ tương đồng 97,13% với vi khuẩn R solanacearum.
Kết quả từ quy trình PCR được xây dựng có độ tin cậy tương đối cao, với giá trị E - value = 0,0 và độ bao phủ đạt 100% (Hình 4.22).
4.1.4 Kiếm tra độ nhạy quy trình PCR
Đánh giá độ đặc hiệu quy trình phát hiện R solanacearum
Hình 4.14 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp primer RsoF — RsoR (M): ladder
1 kb; (-): doi chứng âm; 1: R solanacearum (DV025); 2: R solanacearum 513 ; 3: R. solanacearum 8; 4: R pickettii (DV026) ; 5: B subtillis, 6: B lichenifomis; 7: B. megaterium; 8: L plantarum; 9: E carotovora
Kết quả phân tích cho thấy cặp primer RsoF — RsoR có độ đặc hiệu cao khi kiểm tra với 9 mẫu DNA đã định danh, với sự xuất hiện của band sáng, rõ và kích thước 285 bp ở mẫu đối chứng R solanacearum Các giếng chứa sản phẩm PCR từ mẫu DNA định danh (4 - 9) và đối chứng âm không có band xuất hiện, khẳng định rằng cặp primer RalF — RalR được thiết kế đặc hiệu cho việc phát hiện R solanacearum.
4.4 Kết quả phân lập và chọn lọc R solanacearum
4.4.1 Thu thập mẫu cây bệnh và phân lập R solanacearum
Trong quá trình thu thập mẫu cây, chúng tôi đã thu được 2 cây cà chua (C), 4 cây ớt chuông (OC), 1 cây ớt (O) và 3 cây dưa leo (DL) từ 4 mẫu đất khác nhau Mỗi mẫu cây bệnh đều được thu thập các bộ phận như lá (L), thân (T) và rễ (R) Đặc biệt, tại vườn dưa leo, chúng tôi đã tiến hành thu thập các mẫu cần thiết để phân tích.
Hình 4 15 Thu thập mẫu cây bị bệnh héo xanh 4: Cây 6t; B: Cây ớt chuông;
C: Cây ca chua; D: Cây dưa leo
Hình 4.16 Hình thái khuẩn lạc R solanacearum cấy trên môi trường CPG
Các mẫu được phân lập trên môi trường CPG và cấy ria liên tục cho đến khi tạo dòng thuần Khi nuôi cấy trên môi trường CPG, các chủng độc lực thường có khuẩn lạc màu trắng đến màu kem, tròn không đều, lỏng và mờ đục, trong khi các khuẩn lạc không độc có màu trắng hoặc màu kem, nhỏ hơn, tròn đều và mờ đục Kết quả phân lập khuẩn lạc được tổng hợp trong Bảng 4.2, cho thấy các đặc điểm của khuẩn lạc phù hợp với mô tả của Raymond và cộng sự (2019).
Bang 4.2 Kết qua thu mẫu và phân lập R solanacearum
Nơi lay mẫu Mẫu cây/đất | Số khuẩn lạc phân lập
Di Linh - Lâm Đồng 1 cây ớt 5
3 cay dua leo 19 Hàm Tân - Bình Thuận :
4.4.2 Kết quả kiém nghiệm sinh hóa sàng lọc R solanacearum
Hình 4.17 Kiểm nghiệm sinh hóa với các mau phân lập 4 Nhuộm Gram;
B Thứ nghiện KOH; C Thử nghiệm Catalase oxidase; D Thử nghiệm sản xuất sắc tô huỳnh quang
R solanacearum khi nhuộm Gram tế bào giữ màu hồng, có hình que ngắn, tròn hai đầu (Hình 4.17A); tạo sợi nhay khi hòa với KOH 3% (Hình 4.17B); sinh bọt khí khi trộn với H2O2 3% (Hình 4.17C); không phát quang khi chiếu UV (Hình 4.17D) Tiến hành chọn mẫu phân lập có đặc tính như trên Kết quả kiểm nghiệm đã sàng lọc được 57/60 mẫu phân lập (Phụ lục 2) có thé là R solanacearum (Popoola va ctv, 2015).
4.5 Kết qua thực hiện PCR trên mẫu phân lập phát hiện R solanacearum
4.5.1 Kiểm tra chất lượng DNA ly trích
Hình 4.18 Kết quả khuếch đại cùng 16S —rRNA của các mẫu phân lập (M): ladder 1 kb;
(-): doi chứng âm; 1: OCT4.2; 2: OCR2.1; 3: OCT2.2; 4: OCR3.2; 5: CLI.2; 6: OCL1.1; 7: OCT1.2; 8: OCRI.1; 9: CT2.1
Ly trích DNA từ các mẫu phân lập đã được sang lọc và tiến hành phản ứng PCR 16S — tRNA với cặp primer 63F — 1489R để xác định bộ genome của các mẫu ly trích là vi khuẩn Chọn mẫu ly trích có chất lượng DNA tinh sạch, với band sáng rõ và không bị gãy.
Tất cả 57 mẫu DNA đều đạt chất lượng tối ưu cho các phản ứng tiếp theo, với kích thước band khoảng 1200 - 1500 bp, như thể hiện trong Hình 4.18 Điều này chứng tỏ rằng chất lượng DNA phù hợp để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo (Phụ lục 3).
4.5.2 Sản phẩm phản ứng PCR phát hiện Ralstonia spp.
Quy trình PCR sử dụng cặp primer RalF — RalR không hoàn toàn đặc hiệu cho việc phát hiện Ralstonia spp., nhưng vẫn đóng vai trò quan trọng trong việc sàng lọc mẫu phân lập khỏi các loài vi khuẩn chưa được nghiên cứu.
Hình 4.19 Kết qua phản ứng PCR phát hiện Ralstonia spp của mẫu phân lập.
(M): ladder 100 bp; (-): doi chứng âm; (+): doi chứng dương; 1: OCT4.2; 2: OCR2.1; 3: OCT2.2; 4: OCR3.2; 5: CL1.2; 6: OCL1.1; 7: OCT 1.2; 8: OCRI.1; 9: CT2.1
Tất cả 9 mẫu phân lập trên Hình 4.19 đều cho sản phẩm khuếch đại có kích thước tương đồng với mẫu đối chứng, cho thấy khả năng chúng là Ralstonia spp Những mẫu có kích thước sản phẩm band không chênh lệch rõ ràng có thể tiếp tục được sử dụng cho phản ứng PCR phát hiện R solanacearum Kết quả cho thấy 57/57 mẫu phân lập đều có thể là Ralstonia spp và tất cả đều đã được thực hiện phản ứng PCR phát hiện.
4.5.3 San phẩm phan ứng PCR phát hiện R solanacearum
Mẫu OCT1.2 được xác định là 8 solanacearum khi phát hiện 1/9 mẫu phân lập có band tương đương với đối chứng dương (Hình 4.20) Qua phản ứng PCR với cặp primer RsoF — RsoR, đã phát hiện 36/57 mẫu phân lập.
Hỡnh 4.20 Kết quả phản ứng PCR phỏt hiện ệ solanacearum của mẫu phõn lập.
(M): ladder 1 kb; (-): doi chung âm; (+): doi chứng dương; 1: OCT4.2; 2: OCR2.1; 3: OCT2.2; 4: OCR3.2; 5: CL1.2; 6: OCL1.1; 7: OCT1.2; 8: OCRI.1; 9: CT2.1
4.5.4 Giải trình tự mẫu phân lập
Description Scientific Name bees Ris, ae ee ss Acc.Len Accession
[ (E3 Ralstonia solanacearum partial 165 rRNA gene isolate Rett Ralstonia solanacearum 1528 1528 100% 0.0 97.13% 906
Uncultured Ralstonia sp clone CR3 16S ribosomal RNA gene partial sequence uncultured Ralstonia sp 1519 1519 100% 0.0 96.92% 908
Uncultured Ralstonia sp clone DF4 16S ribosomal RNA gene partial sequence uncultured Ralstonia sp 1430 1430 96% 0.0 96.22% 961
Uncultured Ralstonia sp clone FG7 16S ribosomal RNA gene partial sequence uncultured Ralstonia sp 1413 1413 96% 00 95.88% 964
Ralstonia solanacearum strain APK76 16S ribosomal RNA gene partial sequence Ralstonia solanacearum 1402 1402 94% 00 96.16% 959
Uncultured Ralstonia sp clone HJ6 16S ribosomal RNA gene partial sequence uncultured Ralstonia sp 1402 1402 94% 0.0 96.16% 959
Ralstonia solanacearum strain KAK51 16S ribosomal RNA gene partial sequence Ralstonia solanacearum 1371 1371 96% 00 94.98% 930
Hình 4.21 Kết qua BLAST trình tự vùng 16S —rRNA R solanacearum của mẫu OL1.1
Hinh 4 22 Kết quả giải th tự vùng 16 —rRNA Ä solanacearum của mẫu OL1.1
Dựa trên kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR, mẫu OL1.1 đã được chọn ngẫu nhiên để gửi đi giải trình tự Kết quả giải trình tự này đã được đối chiếu với dữ liệu trên GenBank (NCBI) thông qua công cụ BLAST, xác nhận rằng mẫu OL1.1 có độ tương đồng 97,13% với vi khuẩn R solanacearum.
Kết quả từ quy trình PCR được xây dựng cho HG425355.1 cho thấy giá trị E - value là 0,0 và độ bao phủ đạt 100% (Hình 4.22), điều này chứng tỏ độ tin cậy của kết quả là tương đối cao.
4.1.4 Kiếm tra độ nhạy quy trình PCR
Hình 4.23 trình bày kết quả kiểm tra độ nhạy của quy trình PCR trong việc phát hiện vi khuẩn R solanacearum Các mẫu thử được phân loại như sau: (-) là đôi chứng âm, 1 là mẫu pha loãng 10!, 2 là mẫu pha loãng 10°, 3 là mẫu pha loãng 10, 4 là mẫu pha loãng 101, 5 là mẫu pha loãng 10°, 6 là mẫu pha loãng 10° và 7 là mẫu pha loãng 10”.
Kết quả đo OD của mẫu đối chứng R solanacearum (DV025) cho thấy nồng độ DNA là 24,6 và A260/280 là 1,882 Kiểm tra độ nhạy với các nồng độ pha loãng khác nhau cho thấy phản ứng có thể phát hiện DNA ở nồng độ từ 10^7 đến 10^0 Độ pha loãng càng lớn, băng xuất hiện càng mờ, và ở nồng độ pha loãng 10^7 không có băng xuất hiện (Hình 4.23) Kết quả cho thấy độ nhạy của phản ứng PCR có thể phát hiện nồng độ DNA tối thiểu là 24,6 x 10^5 ng/µl.
CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ
Cặp primer RsoF và RsoR đã được thiết kế thành công để phát hiện R solanacearum Quy trình PCR được xây dựng với các thông số tối ưu, bao gồm nhiệt độ bắt cặp 58°C, thời gian bắt cặp 45 giây và nồng độ primer 0,6 pM/µl.
Quá trình PCR với cặp primer RsoF — RsoR đã phát hiện 36 trong số 57 mẫu sang lọc là R solanacearum Đặc biệt, mẫu nghi ngờ OLI.I cho thấy độ tương đồng 97,13% với trình tự R solanacearum đã được công bố trên GenBank (NCBI).
Quy trình PCR có độ đặc hiệu và độ nhạy cao (nồng độ DNA tối thiểu phát hiện là 24,6 x 10 ng/ul).
Ung dung quy trình PCR này cho các nghiên cứu trên vi khuẩn R solanacearum
Nghiên cứu chuyên sâu hơn về các chủng R solanacearum được phát hiện trong nghiên cứu này
Khao sát và xây dựng quy trình PCR phát hiện sự hiện diện của Ralstonia spp.