Phản ứng khảo sát được thực hiện trên mẫu đối chứng 8. pickettii (DV026) cho
việc phát hiện Ralstonia spp.
21
band phu
108 bp
<=——————
primer dimer
Hình 4.7. Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp primer RalF — RalR
Kết quả Hình 4.7 cho thấy các giếng đều xuất hiện band có kích thước 108 bp giống với khảo sát ban đầu ở 56°C nhưng band phụ va primer dimer sáng. Ở giếng
57,1°C thì band mục tiêu là sáng, rõ rang, band phụ va primer dimer mờ hon. Dé đó,
57°C là nhiệt độ tối ưu cho phản ứng PCR phát hiện Ralstonia spp.
4.3.1.2. Khảo sát thời gian bắt cặp tối ưu của cặp primer RalF — RalR
108 bp
Hình 4.8. Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp primer RalF —RalR.
(M): ladder 100 bp; (-): đối chứng âm; 1: 15 giây; 2: 30 giây; 3: 45 giây
28
Kết quả Hình 4.8 cho thay ở 15 giây sản pham PCR sáng, không có band phụ, primer dimer ít hơn so với 30 giây (primer dimer nhiều, band mục tiêu mờ) và 45 giây (nhiều band phụ. nhiều primer dimer). Vậy 15 giây là thời gian bắt cặp tối ưu cho quy
trình.
4.3.1.3. Khảo sát nồng độ primer tối ưu của cặp primer RalF — RalR
108 bp
Hình 4.9. Kết quả khảo sát nồng độ primer tối ưu của cặp primer RalF — RalR. (A⁄): ladder 100 bp; (-): đối chứng âm; 1:
0,2 uM/ul; 2: 0,4 uM/ul; 3: 0,6 uM/ul; 4: 0,8 uM/ul
Kết qua Hình 4.9 cho thấy ở nồng độ primer 0,6 M/HI thì san phẩm PCR có band sáng và primer dimer mờ. Vậy 0,6 uM/l là nồng độ primer tối ưu cho quy trình.
4.3.1.4. Đánh giá độ đặc hiệu quy trình phát hiện Ralstonia spp.
Hình 4.10. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp primer RalF — RalR. (4):
ladder 100 bp; (-): đối chứng âm; 1: R. pickettii (DV026); 2: R. solanacearum
(DV025); 3: R. solanacearum 8; 4: R. solanacearum 513; 5: B. subtillis, 6: B.
lichenifomis; 7: B. megaterium; 8: L. plantarum; 9: E. carotovora
29
Kết quả Hình 4.10 cho thấy ở các giếng không phải thuộc Ralstonia spp. đều xuất hiện band có kích thước chênh lệch ít so với band mục tiêu là 108 bp. Có những giếng (6, 8,9) có sản phâm kích thước gần như bằng với band mục tiêu, khó dé phân biệt
giữa các loài. Vậy nên cặp primer RalF — RalR chưa đặc hiệu cho việc phát hiện sự hiện diện cua Ralstonia spp.
4.3.2. Tối ưu hóa quy trình PCR phat hiện R. solanacearum
4.3.2.1. Khao sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp primer RsoF — RsoR
Phản ứng khảo sát được thực hiện trên mẫu đối chứng R. solanacearum (DV025)
cho viéc phat hién R. solanacearum.
285 bp
Hình 4.11. Kết qua khảo sát nhiệt độ bat cặp tối ưu của cặp primer RsoF — RsoR Kết quả Hình 4.11 cho thay các giếng 54,0; 57,1; 58,2; 59,2°C xuất hiện band có kích thước 285 bp giống với khảo sát ban đầu ở 55°C nhưng chỉ giếng 58,2°C có band mục tiêu sáng, band phụ và primer dimer mờ nhất. Dé đó, 58°C là nhiệt độ tối ưu cho
phan ứng PCR phát hiện R. solanacearum.
30
4.3.2.2. Khao sát thời gian bắt cặp tối ưu của cặp primer RsoF — RsoR
285 bp
Hình 4.12. Kết qua khảo sát nhiệt độ bat cặp tối ưu của cặp primer RsoF — RsoR. (M): ladder 1 kb; (-): đối chứng
âm; 1: 15 giây; 2: 30 giây; 3: 45 giây
Kết quả Hình 4.12 cho thấy ở 45 giây sản phẩm PCR cho band mục tiêu sáng và không có band phụ. Vậy 45 giây là thời gian bắt cặp tối ưu cho quy trình PCR.
4.3.2.3. Khảo sát nồng độ primer tối ưu của cặp primer RsoE — RsoR
285 bp
Hình 4.13. Kết qua khảo sát nồng độ primer tôi ưu của cặp primer RsoF — RsoR. (M): ladder 1 kb; (-): đối chứng âm; 1: 0,2 uM/ul; 2: 0,4
uM/ul; 3: 0,6 uM/ul; 4: 0,8 uM/ul
Kết quả Hình 4.13 cho thấy ở nồng độ primer 0,6 uM/ul thi sản phẩm PCR có band sáng và primer dimer mờ. Vậy 0,6 pM/l là nồng độ primer tối ưu cho quy trình.
31
4.3.2.4. Đánh giá độ đặc hiệu quy trình phát hiện R. solanacearum
285 bp
Hình 4.14. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp primer RsoF — RsoR. (M): ladder
1 kb; (-): doi chứng âm; 1: R. solanacearum (DV025); 2: R. solanacearum 513 ; 3: R.
solanacearum 8; 4: R. pickettii (DV026) ; 5: B. subtillis, 6: B. lichenifomis; 7: B.
megaterium; 8: L. plantarum; 9: E. carotovora
Kết quả phân tích độ đặc hiệu của cặp primer RsoF — RsoR khi kiểm tra với 9 mẫu DNA đã định danh cho thấy xuất hiện band sáng, rõ và có kích thước 285 bp ở giếng có mẫu đối chứng là R. solanacearum (Hình 4.14), ở vị trí các giếng chứa sản phâm PCR mẫu DNA định danh (4 - 9) và đối chứng âm không xuất hiện band. Chứng tỏ cặp primer RalF — RalR được thiết kế đặc hiệu cho việc phát hiện R. solanacearum.
4.4. Kết quả phân lập và chọn lọc R. solanacearum
4.4.1. Thu thập mẫu cây bệnh và phân lập R. solanacearum
Tiến hành thu thập được 2 cây cà chua (kí hiệu: C); 4 cây ớt chuông (kí hiệu:
OC); 1 cây ớt (kí hiệu: O) và 3 cây dưa leo (kí hiệu: DL) ở 4 mẫu đất. Mỗi mẫu cây bệnh được thu lấy lá (kí hiệu: L); thân (kí hiệu: T), rễ (kí hiệu: R). Tại vườn dưa leo thu thập
1 mẫu đất (kí hiệu: Ð).
52
Hình 4. 15. Thu thập mẫu cây bị bệnh héo xanh. 4: Cây 6t; B: Cây ớt chuông;
C: Cây ca chua; D: Cây dưa leo
Hình 4.16. Hình thái khuẩn lạc R. solanacearum cấy trên môi trường CPG
Các mẫu được phân lập trên môi trường CPG. Từ những khuẩn lạc được chọn tiếp tục cấy ria trên môi trường CPG cho đến khi tao dong thuần. Khi được nuôi cấy trên CPG, các chủng độc lực có khuẩn lạc màu trắng đến màu kem, tròn không đều, lỏng và mờ đục; các khuẩn lạc không độc có màu trắng hoặc màu kem, nhỏ hơn, tròn đều và khuẩn lạc mờ đục (Raymond và ctv, 2019). Kết quả phân lập khuẩn lạc (Phụ lục 1) có đặc điểm như mô tả trên được tông hợp trong Bảng 4.2.
Bang 4.2. Kết qua thu mẫu và phân lập R. solanacearum
Nơi lay mẫu Mẫu cây/đất | Số khuẩn lạc phân lập Di Linh - Lâm Đồng 1 cây ớt 5
; 4 cây ớt chuông 22, Da Lat - Lam Dong
2 cay ca chua 11
3 cay dua leo 19 Hàm Tân - Bình Thuận :
1 mẫu đất 3
33
4.4.2. Kết quả kiém nghiệm sinh hóa sàng lọc R. solanacearum
Hình 4.17. Kiểm nghiệm sinh hóa với các mau phân lập. 4. Nhuộm Gram;
B. Thứ nghiện KOH; C. Thử nghiệm Catalase oxidase; D. Thử nghiệm sản xuất sắc
tô huỳnh quang
R. solanacearum khi nhuộm Gram tế bào giữ màu hồng, có hình que ngắn, tròn hai đầu (Hình 4.17A); tạo sợi nhay khi hòa với KOH 3% (Hình 4.17B); sinh bọt khí khi trộn với H2O2 3% (Hình 4.17C); không phát quang khi chiếu UV (Hình 4.17D). Tiến hành chọn mẫu phân lập có đặc tính như trên. Kết quả kiểm nghiệm đã sàng lọc được
57/60 mẫu phân lập (Phụ lục 2) có thé là R. solanacearum (Popoola va ctv, 2015).
4.5. Kết qua thực hiện PCR trên mẫu phân lập phát hiện R. solanacearum 4.5.1. Kiểm tra chất lượng DNA ly trích
Hình 4.18. Kết quả khuếch đại cùng 16S —rRNA của các mẫu phân lập. (M): ladder 1 kb;
(-): doi chứng âm; 1: OCT4.2; 2: OCR2.1; 3: OCT2.2; 4: OCR3.2; 5: CLI.2; 6: OCL1.1; 7:
OCT1.2; 8: OCRI.1; 9: CT2.1
Ly trích DNA các mẫu phân lập đã sang lọc. Tiến hành phan ứng PCR 16S — tRNA với cặp primer 63F — 1489R dé khẳng định bộ genome các mẫu ly trích là của vi khuẩn. Chon mẫu ly trích có chất lượng DNA tinh sạch, band sáng rõ, không bi gãy dé
34
thực hiện các phản ứng tiếp theo. Hình 4.18 cho thấy các mẫu đều cho band sáng, rõ ràng có kích thước khoảng 1200 - 1500 bp. Chứng tỏ chất lượng DNA phù hợp cho các phản ứng tiếp theo. Kết quả có 57/57 mẫu DNA đảm bảo chất lượng (Phụ lục 3).
4.5.2. Sản phẩm phản ứng PCR phát hiện Ralstonia spp.
Dù quy trình PCR được xây dựng từ cặp primer RalF — RalR không đặc hiệu
cho việc phát hiện Ralstonia spp. nhưng đây cũng có thé coi là một bước sảng lọc mẫu phân lập khỏi những loài vi khuân mà nghiên cứu chưa khảo sát.
108 bp
Hình 4.19. Kết qua phản ứng PCR phát hiện Ralstonia spp. của mẫu phân lập.
(M): ladder 100 bp; (-): doi chứng âm; (+): doi chứng dương; 1: OCT4.2; 2: OCR2.1;
3: OCT2.2; 4: OCR3.2; 5: CL1.2; 6: OCL1.1; 7: OCT 1.2; 8: OCRI.1; 9: CT2.1
9 mẫu phân lập trên Hình 4.19 đều cho sản phẩm khuếch dai có kích thước tương đồng với mẫu đối chứng. Những mau này cũng có thé là Ralstonia spp., vậy nên những mẫu cho sản phẩm band có kích thước không chênh lệch quá rõ ràng đều có thể sử dụng tiếp cho phản ứng PCR phát hiện R. solanacearum. Kết quả có 57/57 mẫu phân lập có thé là Ralstonia spp. (Phu luc 4) va déu duoc thuc hién phan ứng PCR phát hiện
R. solanacearum.
4.5.3. San phẩm phan ứng PCR phát hiện R. solanacearum
Phát hiện 1/9 mẫu phân lập trên có xuất hiện band tương đương với đối chứng dương (Hình 4.20) do đó mẫu OCT1.2 là 8. solanacearum. Thực hiện phản ứng PCR bằng cặp primer RsoF — RsoR cho các mẫu phân lập phát hiện 36/57 mẫu phân lập là
R.solanacearum (Phu lục 5).
85
285 bp
Hỡnh 4.20. Kết quả phản ứng PCR phỏt hiện ệ. solanacearum của mẫu phõn lập.
(M): ladder 1 kb; (-): doi chung âm; (+): doi chứng dương; 1: OCT4.2; 2: OCR2.1; 3:
OCT2.2; 4: OCR3.2; 5: CL1.2; 6: OCL1.1; 7: OCT1.2; 8: OCRI.1; 9: CT2.1
4.5.4. Giải trình tự mẫu phân lập
Description Scientific Name bees Ris, ae ee ss Acc.Len Accession
Sẽ PRS ee es =
[ (E3 Ralstonia solanacearum partial 165 rRNA gene. isolate Rett Ralstonia solanacearum 1528 1528 100% 0.0 97.13% 906
Uncultured Ralstonia sp. clone CR3 16S ribosomal RNA gene. partial sequence uncultured Ralstonia sp. 1519 1519 100% 0.0 96.92% 908 Uncultured Ralstonia sp. clone DF4 16S ribosomal RNA gene. partial sequence uncultured Ralstonia sp. 1430 1430 96% 0.0 96.22% 961 Uncultured Ralstonia sp. clone FG7 16S ribosomal RNA gene. partial sequence uncultured Ralstonia sp 1413 1413 96% 00 95.88% 964 Ralstonia solanacearum strain APK76 16S ribosomal RNA gene. partial sequence Ralstonia solanacearum 1402 1402 94% 00 96.16% 959 Uncultured Ralstonia sp. clone HJ6 16S ribosomal RNA gene. partial sequence uncultured Ralstonia sp. 1402 1402 94% 0.0 96.16% 959 Ralstonia solanacearum strain KAK51 16S ribosomal RNA gene. partial sequence Ralstonia solanacearum 1371 1371 96% 00 94.98% 930
Hình 4.21. Kết qua BLAST trình tự vùng 16S —rRNA R. solanacearum của mẫu OL1.1
50
TCGICGCACGACC
Auld ta
Hinh 4. 22. Kết quả giải th tự vùng 16 —rRNA Ä. solanacearum của mẫu OL1.1
TAA
Dựa và kết quả điện di sản phẩm phan ứng PCR phát hiện R. solanacearum chọn ngẫu nhiên mẫu OL1.1 để gửi đi giải trình tự. Kết quả giải trình tự được đối chiếu với dữ liệu trên GenBank (NCBI) bằng công cụ BLAST xác nhận mẫu OLI.1 tương đồng trình tự với vi khuẩn R. solanacearum với độ tương đồng 97,13% (Trình tự tham chiếu
36
HG425355.1), gia trị E - value = 0,0 và có độ bao phủ là 100% (Hình 4.22). Cho thấy độ tin cậy của kết quả từ quy trình PCR đã xây dựng là tương đối cao.
4.1.4. Kiếm tra độ nhạy quy trình PCR
285 bp
Hình 4.23. Kết quả kiểm tra độ nhạy của quy trình PCR phát hiện R. solanacearum.
(-): đôi chứng âm; 1: Pha loãng 10!; 2: Pha loãng 10°; 3: Pha loãng 10; 4: Pha loãng 101; 5: Pha loãng 10°; 6: Pha loãng 10°; 7: Pha loãng 10”
Kết quả đo OD của mẫu đối chứng R. solanacearum (DV025) có nồng độ DNA là 24,6; A260/280 là 1,882. Kiểm tra độ nhạy với các nồng độ pha loãng khác nhau, kết quả cho thấy phan ứng có thé phát hiện DNA pha loãng ở nồng độ từ 107! đến 10°. Độ pha loãng càng lớn band xuất hiện càng mờ dan, ở nồng độ pha loãng 107 không có band xuất hiện (Hình 4.23). Kết quả độ nhạy của phản ứng PCR có thê phát hiện nồng độ DNA tối thiêu là 24,6 x 105 ng/ụl.
37
CHƯƠNG 5. KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ
5.1. Kết luận
Thiết kế thành công cặp primer RsoF — RsoR đặc hiệu cho việc phát hiện R.
solanacearum. Xây dựng quy trình PCR với các thông số tối ưu cho quy trình bao gồm:
nhiệt độ bat cặp là 58°C; thời gian bắt cặp là 45 giây; nồng độ primer là 0,6 pM/ul.
Phát hiện 36/57 mẫu sang lọc là R. solanacearum bằng quy trình PCR xây dựng với cặp primer RsoF — RsoR. Mẫu nghi ngờ OLI.I có độ tương đồng 97,13% so với trình tự R. solanacearum được công bồ trên GenBank (NCBI).
Quy trình PCR có độ đặc hiệu và độ nhạy cao (nồng độ DNA tối thiểu phát hiện là 24,6 x 10 ng/ul).
5.2. Kién nghi
Ung dung quy trình PCR này cho các nghiên cứu trên vi khuẩn R. solanacearum Nghiên cứu chuyên sâu hơn về các chủng R. solanacearum được phát hiện trong
nghiên cứu này
Khao sát và xây dựng quy trình PCR phát hiện sự hiện diện của Ralstonia spp.
38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Le Lé Thanh Toan va Nguyễn Quốc Thư. (2019). Hiệu qua dich chiết dừa cạn —
hung qué - tỏi đối với bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây ớt. Tap chi Khoa học Dai học Can Thơ: Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 366, 52-58.
Lê Thanh Toàn và Trần Anh Vũ. (2019). Hiệu quả của dịch chiết bạc hà, sả và bach đàn đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên trên cây ớt. Tap chí Khoa học Đại học Huế: Nông nghiệp và Phat triển Nông thôn
128G@C).
Nguyễn Phạm Anh Thi, Tran Thị Ngọc Châu, Trương Thị Tuyết Ngân và
Nguyễn Tấn Tài. (2021). Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Ralstonia sdlanacearum gây bệnh héo xanh ở thực vật bằng nano bạc. Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn, kỳ 2 - tháng 5/2021.
Nguyễn Tat Thắng, Đỗ Tan Dũng và Nguyễn Văn Tuất. (2011). Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Raltonia solanacearum Smith) hại cây khoai tây vùng Hà Nội - phụ cận và biện pháp phòng trừ. Tap chi Khoa học và Phat triển Tập 9, số 5: 725 - 734
Trương Thị Hồng Hải, Trần Thị Thanh và Hatsadong Chanthanousone. (2016).
Nghiên cứu da dang di truyền của các chủng vi khuân Ralstonia solanacearum Smith ở một số tỉnh miền Bắc bằng chỉ thị RAPD. Tap chi Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 297, 71-75.
Võ Thị Bích Thủy, Nguyễn Thị Vẽ, Đoàn Thị Kiều Tiên, Nguyễn Thị Thu Nga
và Trần Thị Ba. (2016). Đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum và bước đầu khảo sát ảnh hưởng của các gốc ghép ớt đến khả năng chống chịu bệnh héo vi khuẩn trên ớt sừng trong điều kiện nha
lưới. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Can Thơ. Số chuyên đề: Nông nghiệp
(Tập 3): 241-248.
Tiêng nước ngoài
1;
10.
Ahmed M. Khairy, Mohamed R.A. Tohamy, Mohamed A. Zayed, Samy F.
Mahmoud, Amira M. El-Tahan, Mohamed T. El-Saadony and Phelimon K.
Mestha. (2022). Eco-friendly application of nano-chitosan for controlling potato and tomato bacterial wilt. Saudi Journal of Biological Sciences 29, 2199-2209.
Amy Charkowski, Kalpana Sharma, Monica L. Parker, Gary A. Secor and John Elphinstone. (2020). Bacterial Diseases of Potato. The Potato Crop. Hugo Campos and Oscar Ortiz (Ed), pp: 351-388.
Denise Caldwell, Bong-Suk Kim and Anjali S. Iyer-Pascuzzi. (2017). Ralstonia solanacearum Differentially Colonizes Roots of Resistant and Susceptible Tomato Plants. Phytopathology, 107(5), 528-536.
Jacquiod Samuel, Tarek E] Sayed, Eman Nour, Seren J. Sorensen and Kornelia Smalla. (2020). Biocontrol of bacterial wilt disease through complex interaction between tomato plant, antagonists, the indigenous rhizosphere microbiota and Ralstonia solanacearum. Frontiers in Microbiology 10.
39
ine
12.
13,
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Liang Yang, Yao Wang, Xiaobin He, Qingli Xiao, Songting Han, Zhou Jia, Shili Li and Wei Ding. (2021). Discovery of a novel plant-derived agent against Ralstonia solanacearum by targeting the bacterial division protein FtsZ.
Pesticide Biochemistry and Physiology, 177, 104892.
Narumol Thongwai and Jirapa Kunopakarn. (2007). Growth Inhibition of Ralstonia solanacearum PT1J by Antagonistic Bacteria Isolated from Soils in the Northern Part of Thailand. Chiang Mai Journal Science 34(3): 345-354.
Popoola, A. R., Ganiyu, S. A., Enikuomehin, O. A., Bodunde, J. G., Adedibu, O. B., Durosomo, H. A. and Karunwi, O. A. (2015). Isolation and characterization of Ralstonia solanacearum causing bacterial wilt of tomato in Nigeria. Nigeria Journal of Biotechnology 29, 1-10.
Raymond O. Gacia, Jim P. Kerns and Lindsey Thiessen. (2019). Ralstonia solanacearum Species Complex: A Quick Diagnostic Guide. Plant Health Progress, 7-13.
Rudrappa K.B., Suryawanshi A.P., Punitkumar N.D., Ganesh J.K., Kumar Lambani and Roop Singh. (2016). Cultural and biochemical characterization of Ralstonia solanacearum causing bacterial wilt in tomato. Journal of Pure and Applied Microbiology 10(4): 3111-3115.
Sambrook J. and Russell D.W. (2001). Molecular cloning: A laboratory manual.
third. Cold pring Harbor Laboratory Press, New York, USA.
Soguilon C. E., Magnaye L. V. and Natural M. P. (1995). Bugtok disease of banana. Musa Disease Fact, 6.
Wan-Wan Fan, Gao-Qing Yuan, Qi-Qin Li and Wei Lin. (2013). Antibacterial mechanisms of methyl gallate against Ra/stonia solanacearum. Australasian Plant Pathology, 43(1), 1-7.
Xuehui Tian, Zichen Zhao, Huimeng Wang, Yuling Qin, Dongkun Wang, Yichi Li, Xiaoqiang Wang, and Limin Wang. (2022). An immunochromatographic test strip for on-site detection of Ralstonia solanacearum in tobacco leaves and soil. Analytical Biochemistry, 641, 114561.
Ziyan Fan, Liwei Hu, Yuan Ji, Shanshan Liu, Ying Wang, Xianjie Cai, Mowen Shi, Huimin Deng, Gangling Tang, Ding Yan, Xingfeng Chen, Zubin Lin, Shili Liu and Fei Yang. (2022). Construction of a TRFIC strip for rapid and sensitive detection of Ralstonia solanacearum. Talanta, 239, 123139.
Zubeda Chaudhry and Hamid Rashid. (2011). Isolation and characterization of Ralstonia solanacearum from infected tomato plants of Soan Skesar valley of Punjab. Pakistan Journal of Botany 43(6):2979-2985.
Nguồn Internet
2725 23.
https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase chain reaction
https://www.researchgate.net/publication/3 15582478 Ralstonia solanacearum Differentially Colonizes Roots of Resistant and Susceptible Tomato Pla
nts
40
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Kết quả phân lập 8. solanacearum
31: DLRI.3; 32: DLT2.2; 33: DLR1.1; 34: DLR2.1; 35: DLL]I.I; 36: DLT1.2; 37: DLĐI.2;
36: DLD1.1; 39: DLT1.1; 40: DLT3.2; 41: DLL2.2; 42: DLT2.1; 43: DLĐI.4; 44: DLL3.2;
45: DLR3.1; 46:DLT2.3; 47: DLD1.3; 48: DLL2.1; 49: CT2.1; 50: CR2.3; 51: OCT4.2; 52:
OCR2.1; 53: OCT2.2; 54: OCR3.2; 55: CLI.2; 56: OCL1.1; 57: OCTI.2; 58: OCR1.1; 59.
OCT4.3; 60: OT1.3
Mô tả hình thái mẫu phân lập
Kí hiệu Mô tả
2; 5; 6; 14; 15; 23; 29; 37; 38; 41; 46; 47;
51:52: 53: 358
Khuan lac mau trang, tròn không déu, long, mo duc
8; 9; 18; 19; 21; 24; 30; 36; 49; 59; 60 Khuan lac màu trang, tròn đều, mờ đục
1; 3; 26; 27; 31; 32; 35 Khuẩn lạc màu kem, nhỏ, tròn đêu
7; 10; 11; 12; 13; 16; 20; 22; 34; 39; 40;
42: 43: 44; 45; 48; 54; 55; 56; 57
Khuan lac màu kem, tron không déu,
long, duc
4; 17; 25; 28: 33; 50 Khuan lac mau trang, tron déu
Phụ lục 2: Bảng kết quả kiểm nghiệm sinh hoá sàng lọc mẫu phân lập
Tên Cata - Cata
-- . Gr | KOH Flu| -- | Tên mẫu | Gr | KOH Flu mau lase lase
i | ocr2 | - + E1 - | Zi | B5 | - m + -
2 | OCT4.2 | - + + - |## | oer | + + z `
3 | CR2. 8 ® + = | 23 | Q2 | = + # a
4 | CR22 | - + + - | 4 | ĐŒU41 | + + $Š :
3 | OTL1 - + a - | 25 | OCL2.1 | - + + l
6 | OLI.] “ 2 + s | a | OCT4i | ô 4: + - 7 | ORL | ô Ẵ Hs ô | 27 | UƠDEĐ | - a $ P
8 CRI.I - + + - 28 | OCR2.1 - + + =
9 | CLI.I P a Es ô | 20 | OCT22 | ô + + P 10 | CRI.2 - + + - | 30 | OCR3.2 | - + rm -
11 | CTI.I . + + , IĐ1l | CHi2 - + + -
12 CL2.1 - + + - | 32 | OCLI.] - + + =
13 | OCRI2 | - + + - | 38] Gere || + + + :
14 | o7T12 | - + + ô |34 | ĐCRIl | = + + -
15 | OCT3.1 | - nh + - | 35 | CT2.1 2 + + -
16 | OCR4.1 | - + + s | 36 | DLRSW | = # + P
17 | OCT3.3 - a + - 37 | DLT1.3 - + + 7
18 | OCL4.2 - th + ô 38 | DLL1.2 F fe + R
19 | OCL2.2 - + + - 39 | DLT3.1 - + + Z
20 | OCL3.2 | - + + - | 40 | DLRI.3 | - + a -
Gr: nhuộm Gram; Flu: thử nghiệm sản xuất sắc tô huỳnh quang;
(-): âm tính; (+): dương tính
. Cata Cata
-- | Tên mẫu | Gr | KOH _ Flu| -- | Tén mau | Gr | KOH " Flu
41 | DLT2.2 | - + Š - | 51 | DIỉ33 | - # + -
42 | DLRLI | s + + ằ |5? | DEI3ỉ | = + 4 -
43 | DLR2.I - + + E 53 | DLR3.1 = + ‡# -
44 | DLLI.I | - + + - | 5# | Dime | - + ra -
45 | DLTI.2 - + + Bí 55 | DLĐI.3 = + + =
46 | DLD3.1 - + + - 56 | DLL2.1 - + + =
47 | DLĐI.I = Mộ a - 57 | DLT3.2 - + + -
48 | DLT1.1 - + + - | 58 | OCT4.3 # rn 2 49 | DLL2.2 - + + $ 59 CR2.3 E Ea =
50 | DLT2.1 - + + - 60 OT1.3 - + bạ
Gr: nhuộm Gram;
(-): âm tính; (+): dương tinh
Flu: thử nghiệm sản xuất sac tô huỳnh quang;
Phu lục 3: Kết quả khuếch đại vùng 16S — rRNA của mẫu phân lập
1,5 kb
(M): ladder 1 kb; (-): đối chứng âm; 1: OCL1.2; 2: OCL3.1; 3: OCL2.1; 4: OCL2.2; 5:
OCT2.3; 6 : OL1.1; 7: ORI.2; 8: CR1.1; 9: CL1.1; 10: CR1.2; 11: CTI.1; 12: CL2.1
M()I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1, 5 kb
(M): ladder 1 kb; (-): đối chứng âm; 1: OCR1.2; 2: OT1.2; 3: OCT3.1; 4: OCR4.1;
5: OCT3.3; 6: OCL4.2; 7: CR2.2; 8: OCL3.2; 9: OCR2.2; 10: OTI.1; 11:
OCT3.2; 12: OCT4.2; 13: CR2.1
M()I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
(M): ladder 1 kb; (-): đối chứng âm; 1: OCT4.1; 2: DLR3.2; 3: DLT1.3; 4: DLL1.2; 5:
DLT3.1; 6: DLR1.3; 7: DLT2.2; 8: DER1.1; 9: DER2.1; 10: DELIA; 11: DLTI.2; 12:
DLD1.2; 13: DLD1.1; 14: DLT1.1