Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa của các vi sinh vật kiểm soát Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây họ cà

TÓM TẮTĐề tài “Hướng tác động của các vi sinh vật đất có khả năng đối kháng với vikhuẩn Ralstonia solanacearum” được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm Bộmôn Bảo vệ Thực vat — kh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

Rew

KHOA LUAN TOT NGHIEP

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC DIEM SINH HOA CUA CÁC VI

SINH VAT KIEM SOÁT Ralstonia solanacearum

gay bénh héo xanh trén cay ho ca

SINH VIEN THUC HIEN : PHAN CHE THÀNH NGHỊNGÀNH : BẢO VỆ THỰC VẬT

KHÓA :2018 - 2022

Thành phó Hồ Chi Minh, tháng 02/2023

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC ĐIÊM SINH HÓA CỦA CÁC VI

SINH VAT KIEM SOAT Ralstonia solanacearum

gay bénh héo xanh trén cay ho ca

Tac gia

PHAN CHE THANH NGHI

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầucấp bằng kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật

Hướng dẫn khoa học

TS VÕ THỊ NGỌC HÀThS PHAM KIM HUYEN

Thanh phé H6 Chi Minh

Thang 2/2023

LỜI CẢM ƠN

Báo cáo tốt nghiệp chuyên ngành Bảo vệ Thực vật với đề tài “Hướng tác độngcủa các vi sinh vật đất có kha năng đối kháng với vi khuan Ralstonia solanacearum” làkết quả của quá trình cô gang không ngừng của bản thân, bên cạnh đó, còn nhờ được sựgiúp đỡ, động viên, khích lệ của các thầy cô, bạn bè và người thân Qua trang viết này,tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người đã giúp đỡ trong thời gian học tập, nghiên cứu

khoa học vừa qua.

Tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS Võ Thị Ngọc Hà đã trựctiếp tận tình hướng dan tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Đồng thời, xin cam ơn ThS Phạm Kim Huyén đã nhiệt tình hỗ trợ va động viên,thúc đây tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo trường Đại học Nông Lâm Thành phố HồChí Minh, khoa Nông học và Bộ môn Bảo vệ Thực vật đã tạo điều kiện để tôi được hoàn

thành tôt công việc nghiên cứu khoa học của mình.

Xin cảm ơn các anh, chi, em, bạn bẻ đã luôn bên cạnh giúp đỡ tôi trong quá trình

học tập và thực hiện Báo cáo tốt nghiệp

Cuôi cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đên gia đình - nguôn động lực to lớn

trong quá trình học tập và nghiên cứu của tôi Cảm ơn bô, mẹ, anh, chị đã luôn bên cạnh

ủng hộ, hỗ trợ và truyền động lực cho tôi trong suốt chặng đường học vấn.

Mặc dù đã cô gang rất nhiều, song do buổi đầu mới làm quen với công tác nghiêncứu khoa học trong phòng thí nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót nhấtđịnh Vì thế, tôi rat trân trọng những đóng góp đáng giá của quý thầy cô dé khóa luận

có thê hoàn thiện hơn nữa Tôi xin chân thành cảm on!

Người thực hiện

Phan Chế Thành Nghị

TÓM TẮT

Đề tài “Hướng tác động của các vi sinh vật đất có khả năng đối kháng với vikhuẩn Ralstonia solanacearum” được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm Bộmôn Bảo vệ Thực vat — khoa Nông học, trường Dai học Nông Lâm thành phố Hồ ChíMinh, nhằm xác định hướng tác động của các vi sinh vật đất đối với vi khuan Ralstoniasolanacearum 09 dong vi sinh vật được xác định có khả năng đối kháng mạnh với vi

khuẩn Ralstonia solanacearum được Bộ môn Bảo vệ Thực vật, trường Đại học Nông

Lâm thành Phố Hồ Chí minh cung cấp Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiênmỗi vi sinh vật là một nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại

Các vị sinh vật được nuôi trên môi trường Burk không đạm, môi trường NBRIP

và môi trường dinh dưỡng và xác định kha năng cé định dam, khả năng phân giải lân vàkhả năng sinh IAA bằng phương pháp so màu Kết quả có 9/9 vi sinh vật có khả năng

cô định dam, trong số đó có 4/9 vi sinh vật có khả năng phân giải lân và 4/9 vi sinh vật

có khả năng sinh IAA.

Khao sát khả năng sinh hợp chat siderophore của 09 vi sinh vật bằng phương

pháp nuôi trên môi trường CAS — blu Agar và phương pháp so màu Trong đó, chủng

CCEN 1.1 có hàm lượng siderophore được sinh ra tại thời điểm 48 giờ đạt 42,357 psu

Những vi sinh vật trên tiếp được được khảo sát khả năng sinh enzyme proteasetrên môi trường bổ sung cơ chất là casein và so màu trên máy quang pho UV Vis Kết

quả khảo sát có 8/9 vi sinh vật có khả năng phân gia protein khó tan và hoạt độ enzyme

được sinh ra cao nhất ở thời điểm 48 giờ là ĐNHI (9,401 U/mL)

Khao sát khả tạo màng sinh học cũng được khảo sát trên 09 vi sinh vật bằngphương pháp nhuộm bằng thuốc tím kết tỉnh 1% và so sánh màu trên máy do quang phô.Kết quả 9/9 chủng vi sinh vật khảo sát đều có khả năng tạo màng sinh học Trong đó,chủng CCFN 1.1 có thi lệ OD600/ODs70 thấp nhất với giá trị là 0,25 thé hiện khả năngtạo mảng sinh học tốt nhất

IMIG TI CU xsnncsncoaneessinansnnsnneianetatiesntaratiansasnsnensiscedanessionedsredateasoencienensedne'ceuseeanesasensasneqatansespannnsassensesaare 12

0 12Giới hạn đỀ tài 222222222222221222211122222211112221111122211111222011111202011122001122220 re 12CHƯƠNG 1 TONG QUAN TÀI LIỆU 2 2 ©2222222S22E2EE2EZ2Ezzzzzzzzzex 13

Ld Vi khuẩn Ralstonia SỌdfIđC€@'HIM 2 ©222222222EEE22222EEEEE2222EE22222222222352222222222-e2 131.1.1 Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia sỌafdC€@fFHHH ©22222222222252zz+EEEESsszrrrrrsee 131.12 Đặc điểm cấu tạo và điều kiện phát triển của vi khuan Ralstonia solanacearum 131.1.3 Hình thức xâm nhập và triệu chứng gây hại của vi khuẩn R solanacearum 131.1.4 Đặc điểm phát sinh phát triển -222222222+2222222EE2E2222222222222rrrrrrrrrrrrre 14

1.2 Biện pháp phịng trừ bệnh do Ralstonia solanacearum gây ra - 15 1⁄21 Bién phap catih 146 scssssssssressnsaremr ES 15

1.2.2 Biện pháp hóa học -55- 52222222222 2221211221 re Lộ

12.3 Biện pháp sử dung giống kháng - 5222222222222 Le 15

N9 0c 16

1.2.5 Phòng trị bệnh bang vi sinh vật đối kháng -222222222+++22222222222zr+ 16 13 Những nghiên cứu về phòng trừ mầm bệnh Ralstonia solanaceum bang vi sinh vật 008417 17277 Ô.ÔỎ.Ỏ 17 1.3.1 Nghiên cứu trong ngước -2-©2++c++c++E2 2 221221211211 re 17 1.3.2 Nghiễn cứu HEOÀLHỮE¿ssesecsrndniodtosisiisERAISEOGSOOSSSOSEEIOHEDGSOSSESSOYSEHSESEAM 18 L4 SinhiônghopÏAAðvisidrvf ì.ì ii 18 15 Khả năng cố định đạm -2222222222222222222222222211111112222 cee 19 1.5.1 Sơ lược về cố định đạm -2222EEE2+++2EEEEEE22222221122227111122711111 2211 eecrrye 19 1.5.2 Một số nghiên cứu về có định đạm 2222222222EEEEEEEE2222222222++rrrrrrrrrrrrr 19 1.6 Khả năng hòa tan lân khó tan -+2+5++2+2c22r2+terrrrrrrr 11 errke 20 1.6.1 Sơ lược về phân giải lân -22222VVVE22222222222+222222222222222211111222 2 E rrrrrrre 20 1.6.2 Một số nghiên cứu về phân giải lân -vvvvvvvvvvvvvvvvvvvvcvvvcve 21 1.7 Kha năng sinh tổng hợp siderphores trong kiểm soát mầm bệnh - 22

L7.1 Sơlưgevễsiđeraphœre ~ 2L 22

1.7.2 Một số nghiên cứu về siderophore 2222222222EEEEEEEE222222222++ztrtrrrrrrrrrr 22 1.8 Khả năng tạo nano bạc trong kiểm so§t mm | ———— 23 1.8.1 So luge vé mano số ớ.-44 23

1.8.2 Các nghiên cứu về vi sinh vật tông hợp nano bạc trên thé giới và tai Việt Nam 23

1.9 Kha năng sinh enzyme protease trong kiểm soát mầm bệnh 24

1.9.1 Vai tro ca enzyme ngoal on 24

1.9.2 So luge vé protease ẽ 24

1.9.3 Một số nghiên cứu về enzyme protease trong nước và trên thé giới 25

1.10 Khả năng tạo màng sinh học - 2-5252 +++2xcrtrxerererrrrrrkerrrrrrrrrrrrrrrrrke 26

1.10.1 Sơ lược về màng sinh học -22£©VVEEE222222+2EEEEEE22222222222222222222222222222222 e2 261.10.2 Các nghiên cứu về khả năng tao màng sinh học của vi sinh vật trên thế giới và Việt

Nam 26

CHƯƠNG 2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 28

21 — NộidunhHgH6lHiEHEÚlssssssssssesnttrslioRODHUOOOHOESOODOOEOEUHIOUSOOHDSEOHSYOHSESERS 28 2.2 Thời gian và phương pháp nghiên cứu -©5+©2<©5++£+rererkerkrrrerrrerkrrree 28 2.3 Vat 1iSu thi 2n 017 29

2.3.1 Đối tượng thí nghiệm 2222222EEEEE22222222222222222222222222211222222222221222 xe 292.3.2 Dụng cụ, thiết bị máy móc -2222EEEE222++2222EEEEE222222222222211222222222221222-cxe 29ĐXN TnhgïÝ tui THỂ NEsssessesssnenamiiotiedinuonottestshuindidosiitodatdØASotôndg0000nxkemig 29

24 Plitene phan RehCt CW accuser ere 31

2.4.1 Khảo sát kha năng đối kháng của dịch nuôi cấy các dòng vi sinh vật đất đối với vi

RU GTR GISTO NIG SOLANA CE GIN SP SP na acc una taoes 31 2.4.2 Khảo sát khả năng sinh LA A -5-5+-5+27+2c+zersrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrerrrree 33

2.4.3 Khảo sát khả năng có định đạm - 222222222EEEEEE2222222222222122222222222212222-xe 34

2.4.4 Khảo sát khả năng phân giải lân - eee 52252252 S++ccrrxerrrrrrrkrrkrrrrrree 35 244.1 Định tính khả năng hỏa tan lẬH::::::.‹-::‹::::::cssc262122012100211111121006100380801861186580443106116 35

2.4.4.2 Định lượng khả năng hòa tan lân - -52- + 252+S+£+EeEtzkererkerrrxerrrrrrrrrerree 36

2.4.5 Khả năng tạo hợp chất Siderophore 2222£2222EEEEEEEE22222222222zrrrttrrrrrrrr 36

2.4.5.1 Thí nghiệm định tính siderophOore -. - - + +55 ++£+£+£+£+£e+zeexexerererrerxerrrrrxrke 37

2.4.5.2 Thí nghiệm định lượng siderophore -+- +5++++z++£++e+zx+rerrrrrxerxerxrrxree 37

24.6 Khdosdt handing tao nate: Dae sessssaoesinpnnigoitiotodoidioeiiigidooidtieoiogtdbogdaDtsgiSbsS2i0s2 008 38 2.4.7 Khảo sat khả năng sinh enzyme ngoại bàO -52-725<2cccrrrrkerrrrrrrree 39

2.4.7.1 Thí nghiệm định tính - -+- 2-2 52+++©2+2E+2E££EE£E++EE+EE£EEEZEEZEEZEEerxerkezkezrerrsrrerree 40

2472) Thímchiệm.ổInh IWHĐsceceseereeoiteiosgittiegagtEGLGG3808041G1014003154130GE1AEDG1ELEDH.H.2.ĐH8 40 DAS Wiig sat Whi varie Hình HưAnh mang STAN H00 eseseisesenererremremnrree 41

| a a 42CHƯƠNG 3 KET QUA VA THẢO LUA spss esssccsrersteoscnacamnrcncemocnicemmnimmnas 433.1 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của dịch chiết các dòng vi sinh vật đất với vi

khudin Ralstonia SOLANACTUIMN N08 nẺaaa 43

3.2 Khao sát khả năng sinh IAA trong điều kiện phòng thí nghiệm - 443.3 Khao sát kha năng cô định dam của các vi sinh vật trong điều kiện phòng thí nghiệm 453.4 Khao sát kha năng hòa tan lân trong điều kiện phòng thí nghiệm - 463.5 Khao sát kha năng sinh tong hợp Siderophore 2EE222222222+++z+++tttrrrrrrr 483.5 Khao sát khả năng tạo nano bạc của các vi sinh vật trong điều kiện phòng thí nghiém 493.6 Khảo sát khả năng sinh enzyme protease của các vi sinh vật trong điều kiện phòng thí

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

Nghia tiéng Viét

Cong tac vién Chrome azurol S Hexadecyltrimeryl ammonium bromide

Môi trường King’ B Agar

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần đường chuẩn NH}Ÿ - 2-2222 52222£22E22E22EE22E+22Ezzxzzzxee 35Bảng 2.2 Thanh phần đường chuẩn khảo sát khả năng phân giải lân 36Bảng 2.3 Thanh phần đường chuẩn Tyrosine 2: 2222s+2x222222E2322212222222cze 40Bảng 3.1 Tổng hợp kết quả khảo sát các chủng vi sinh vật đất 22 5¿ 55

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Bồ trí dịch chiết vi khuân đối kháng vi khuân Ralstonia solanacearum trên đĩapetri theo phương pháp cấy khuếch tán giếng thạch 2- 2252522 222222222z25+2 32Hình 3.1 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của dịch chiết vi sinh vật đất với với vikhuẩn Ralstonia SỌ4I4C€@FHIHI s.-2- 52-52 S2+S22ESE£EE2EEEEEEE2E22E525221212212112121121121 222 e2 43Hình 3.2 Kết quả khảo sát khả năng sinh IAA của các dịng vi sinh vật 44

Hình 3.3 Hàm lượng IAA được tao ra của các vi sinh Vat -c+<<<+s 45

Hình 3.4 Kết qua khảo sát khả năng cĩ định đạm của các vi sinh vật sau khi bồ sung phenol45

Hình 3.5 Hàm lượng NH¡” được sinh ra của các vi sinh vật 2-5-5 5555552 46

Hình 3.6 Kết quả khao sắt khả năng hịa tan lân khĩ tan trên mơi trường NPRIP đặc 47Hình 3.7 Kết quả khảo sát hịa tan lân khĩ tan của các vi sinh vật - 47Hình 3.8 Kết quả khảo sát định tính sinh hơp chất siderophore của các vi sinh vật trên

Tơi trường CAS) sssesscrssescesnosenseserseensennrnneoenenaneace sesame 48

Hình 3.9 Ham lượng siderophore được sinh ra của các vi sinh vật 49

Hình 3.10 Vi sinh vật sau khi bé sung AgNo3 ở ngày thứ Ư7 -2-55255z<: 50Hình 3.11 Kết quả khảo sát nano bạc trên máy quang phơ UV Vis - 50

Hình 3.12 Khao sát kha nang phân giải protein khĩ tan trong mơi trường Winograndsky

I bố sung 1% cơ chất casein 2¿- 222+2222212221221222122122112212211211221211211 21.2 xe 51Hình 3 13 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme protease của các vi sinh vật 52Hình 3.14 Khả năng bám trên thành ống eppendorf của các vi sinh vật - 53Hinh 3.15 Gia tri mat d6 quang cua cac vi sinh vat dat trong khao sat kha nang tao mang

Siitiifi.o.ẺỐẺỐĨỐẺẼỀỐỀỐẺỀẺ.Ẻố.Ẻ.ố.ố.ề.ẻ ẻ.ố.ẻ ẻ.ẽẽ 54

Hình 3.16 Giá trị OD6o/ODz;o của các vi sinh vật cĩ khả năng tạo màng sinh hoc 54

GIỚI THIỆU

Đặt vân đề

Ralstonia solanacearum là mầm bệnh vi khuẩn truyền qua đất quan trọng gây rabệnh héo xanh vi khuẩn, một mầm bệnh thực vật phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới,cận nhiệt và ôn đới trên thế giới (Hayward, 1991) Chúng là một trong những mam bệnh

có sức hủy diệt mạnh nhất được xác định cho đến nay vì nó gây ra các triệu chứng héonhanh chóng và gây chết cây ký chủ Phạm vi vật chủ rộng, hơn 200 loài và mầm bệnhphân bồ trên toàn thế giới (Hayward, 2000) Phổ ký chủ quan trọng của chúng gồm càchua, hạt tiêu, khoai tây, thuốc lá và cà tím (Guo và ctv, 2004) Những thiệt hại về năngsuất thay đổi từ 0 đến 91% ở cà chua, 33 đến 90% ở khoai tây, 10 đến 30% ở thuốc lá

và 20% ở lạc (Elphinstone, 2005) Ở Việt Nam, bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstoniasolanacearum gây ra làm chết hàng loạt cà chua trên đồng ruộng, dẫn đến that thoát lớn

ở các vùng trồng cà chua trong nước, nhất là vùng đồng bằng sông Hồng (Hồ Thanh

Hoàng, 2005).

Trước tình hình đó, việc nghiên cứu quản lý bệnh héo xanh vi khuân được nghiêntrong nhiều thập kỷ qua Các biện pháp chọn lọc giống cây trồng, sử dụng thuốc hóahọc, các biện pháp canh tác và các biện pháp sinh học được khuyến cáo Trong đó, biệnpháp sinh học ngày càng được quan tâm do có những ưu điểm như: không gây ô nhiễmmôi trường, không làm mat cân bằng sinh thái, hạn chế mầm bệnh kháng thuốc, khôngtồn dư chất độc hại và quan trọng nhất là không ảnh hưởng đến người sử dụng và ngườisản xuất Biện pháp sinh học phô biến và đang được nghiên cứu nhiều nhất là các vi sinhvật có khả năng đối kháng với mam bệnh như Bacillus spp., Pseudomonas sp., Rhizibium

sp., Azospirillum sp (Fravel, 2005).

Kha nang kiểm soát sinh hoc của các vi sinh vat với mầm bệnh có thé được théhiện qua nhiều khía cạnh khác nhau hoặc theo hướng tăng tính kháng của cây trồngthông qua khả năng cô định đạm, phân giải lân khó tan, sinh hoocmon kích thích sinhtrưởng cây trồng như IAA hoặc theo hướng tác động trực tiếp đến vi sinh vật gây hạinhư tông hợp siderophone dé gây ức chế hóa trình sử dụng sắt của vi khuẩn gây hai,

sinh enzyme protease làm bat hoạt protein tiết ra của các mầm bệnh tan công vào môcây (Van Loon và Van Strien, 1999), hoạt độ protease làm tăng phản ứng của cây trồng

đôi với sự xâm nhiễm của mâm bệnh (Vera và Conejero, 1989).

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa của

các vi sinh vật kiểm soát Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây họ cà”

được thực hiện.

Mục tiêu

Đánh giá được các đặc điêm sinh hóa, khả năng sinh các hoạt chat ức chê vi

khuân Ralstonia solanacearum

Yêu cầu

Đánh giá khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy các dòng vi sinh vật vật đối với

vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Đánh giá khả năng kiểm soát mầm bệnh và khả năng kích thích sinh trưởng cây

trông của các vi sinh vật dat.

Giới han dé tài

- Bước đầu nghiên cứu trên các dòng vi sinh vật đất và vi khuẩn Ralstonia

solanacearum trong điêu kiện phòng thí nghiệm

- Cac dòng vi sinh vat dat va vi khuan Ralstonia solanacearum được cung cap bởi

Bộ môn Bao vệ Thực vật, khoa Nông học, Dai hoc Nông Lam TP HCM.

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Vi khuẩn Ralstonia solanacearum

1.1.1 Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Vi khuan Ralstonia solanacearum gây hại hon 200 loài thực vật Day là loài vi

khuẩn gây bệnh mạch dẫn được nghiện cứu bởi Halted vào năm 1892 Đến năm 1896,tiếp tục được Smith nghiên cứu, mô tả và định tên Ralstonia solanacearum Thời giansau đó, nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu vào nghiên cứu bệnh héo xanh một cáchtoàn điện hơn, phải ké đến như là Kelman (1952; 1954); Hayward (1960; 1964; 1976);Yabuuchi (1992), (Vũ Triệu Man và Lê Lương Tê, 1998)

Theo Caldwell va ctv (2017), Ralstonia solanacearum là tac nhân gây bệnh héo

xanh do vi khuẩn và lây nhiễm trên 200 loài thực vật thuộc 50 họ Vi khuẩn trong đất

có thê gây chét đôi với nhiêu loài solanaceous, bao gôm cả cà chua.

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo và điều kiện phát triển của vi khuẩn Ralstonia

solanacearum

Vi khuan Ralstonia solanacearum là vi khuan hình que, hai dau hoi tròn, có lông

roi ở một dau, kích thước tế bao 0,5 — 1,5 um, nhuộm gram âm

Vi khuẩn tôn tai trong đất, nước tàn dư thực vật, ký chủ phụ hạt giống (đậu

phộng) Vi khuẩn thích hop ở nhiệt độ 25 — 35°C, nhiệt độ tối đa là 41°C, nhiệt độ tốithấp 10°C, nhiệt độ gây chết là 55°C Vi khuẩn phát triển trên phạm vi rộng pH= 6,8 - 7,2.1.1.3 Hình thức xâm nhập và triệu chứng gây hại của vi khuẩn R solanacearum

Vi khuẩn R solanacearum lan truyền theo nước tưới, xâm nhập vào cây qua vếtthương hoặc qua lỗ thở tự nhiên, vết nứt đầu rễ và di chuyển vào trong bó mạch, sau đó

phá bó mạch làm tắc nghẽn sự vận chuyền nước và chất dinh dưỡng gây ra bệnh héoxanh trên các cây họ cà, mạnh nhất khi cây đang trong giai đoạn phát triển.

Bệnh phát sinh từ cây non đến khi thu hoạch Triệu chứng thường biểu hiện ngaysau khi xâm nhập vào cây Ở cây bị bệnh ban ngày lá mat màu nhẫn bóng, tái xanh, héocup xuống Ở giai đoạn cây con thường biểu hiện trên toàn cây, còn ở giai đoạn trưởngthành triệu chứng thường biểu hiện ở lá ngọn trước Ở 1 — 2 ngày đầu cây có thé phụchồi lại được vào lúc trời mát hoặc về đêm, nhưng sau 2 — 3 ngày lá héo không thê hồiphục lại được nữa và toàn cây bị héo rũ rồi chết Vỏ thân gần gốc của cây bị bệnh sansùi, khi cắt ngang thấy bó mạch bị hóa nâu Trong điều kiện âm độ cao, thân cây bị bệnhdan dần thối mềm, ấn mạnh gần miệng cắt có thé thấy dịch nhờn vi khuẩn tiết ra màutrắng sữa, rễ có màu nâu đen và thối (Kucharek, 1998)

1.1.4 Dac điểm phat sinh phát triển

Thời gian vi khuẩn tồn lưu trong đất phụ thuộc vào nhiều yếu tố như âm độ, nhiệt

độ, hóa ly đất Vi khuẩn có thé tồn lưu trong dat từ 5 — 6 năm, trong co thé ký chủ thựcvật hoặc trong hạt giống có thé sống tới 7 tháng, còn nếu bám dính trên bề mặt hat chitồn tại 2 — 7 ngày (Vũ Triệu Man và Lê Luong Té, 1998)

Vi khuẩn lan truyền chủ yếu bằng nguồn nước, đất như bám dính vào giày dép,dụng cụ canh tác (Martin va French, 1997) Bệnh héo xanh vi khuẩn phát sinh phát triểnphụ thuộc vào điều kiện đất đai như trên các chân đất cao bệnh thường nặng hơn cácchân đất thấp, đất được luân canh với lúa nước làm giảm tỉ lệ bệnh đáng ké (Đỗ Tan

Dũng, 2001).

Thời vụ trồng cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển bệnh, thời

vụ trồng có mưa nhiều, âm độ cao làm gia tăng sự phát sinh phát triển bệnh Mật độ

trồng cao tỉ lệ bệnh thường cao do chúng tạo một vùng khí hậu thuận lợi cho sự phátsinh phát triển bệnh

1.2 Biện pháp phòng trừ bệnh do Ralstonia solanacearum gầy ra

1.2.1 Biện pháp canh tác

Luân canh cây trông: đây là biện pháp có hiệu quả cao, có thê luân canh với cây khác họ cà hoặc luân canh với lúa nước Không nên trông cà chua 2 vụ liên tiêp trên một

chân đất

Xử lý hạt giống trong nước nóng 50°C trong 25 phút

Sử dụng cây giống ở vườn ươm không bị bệnh

Vệ sinh đồng ruộng don sạch cỏ dai

Sử dụng phân hữu cơ hoai mục để bón Sử dụng biện pháp ghép dé tăng tinhchống chịu cũng là một trong những biện pháp hiệu quả

1.2.2 Biện pháp hóa học

Bệnh do vi khuẩn gây ra dùng thuốc hóa học hiệu quả không cao Cần phát hiện

sớm dùng các loại thuốc như Kasuran 50 WP, Kanamin 47 WP có thể hạn chế được

bệnh.

Tuy nhiên, biện pháp dùng thuốc bảo vệ thực vật được cho là ít có hiệu quả trongphòng chống vi khuẩn R solanacearum do vi khuẩn này có nguồn gốc từ đất xâm nhiễmgây bệnh và sinh sản trong hệ thống mạch dẫn của cây (Caldwell và ctv, 2017)

1.2.3 Biện pháp sử dụng giống khang

Theo Caldwell và ctv (2017), bệnh được kiểm soát tốt nhất bằng cách sử dụngcác giống cây trồng kháng bệnh, đặc biệt là các gốc ghép kháng bệnh mặc du cây khángbệnh có thé mang mam bệnh cao (từ 10° đến 108 CFU/g trọng lượng tươi) Làm thé nàonhững cây này bị nhiễm khuẩn tiềm an nhưng duy trì sức đề kháng vẫn chưa được rõràng R solanacearum đầu tiên lây nhiễm vào cây thông qua hệ thống rễ và do đó, việcxâm nhiễm rễ sớm có thé là chìa khóa dé hiểu tính kháng Có giả thuyết rằng sự phân

bồ và thời gian xâm nhập của vi khuẩn khác nhau ở rễ của các giống ca chua kháng và

man cảm Sử dụng kết hợp giữa kính hiển vi điện tử quét và kính hiển vi ánh sáng dékhảo sát R solanacearum xâm nhập vào rễ của các giống cà chua kháng và man cảmvới đất trồng ở nhiều thời điểm sau khi cấy Kết quả của nghiên cứu cho thấy rằng sự

xâm nhập của trụ mạch rễ bị trì hoãn trong khả năng kháng “Hawaii 7996” và một khi

vi khuẩn xâm nhập vào các mô mạch sốc, sự xâm nhập của vi khuẩn trong hệ mạch bịhạn chế về mặt không gian Dữ liệu cho thấy tính kháng một phần là do khả năng củagiống cây trồng kháng bệnh trong việc hạn chế sự xâm chiếm của rễ vi khuẩn trong

không gian và thời gian.

1.2.4 Biện pháp sinh hoc

Có thé sử dụng chế phẩm sinh học đối kháng như Pseudomonas fluorescens,

Bacillus subtilis.

Theo “Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Ralstonia solanacearum Smith) hại câykhoai tây vùng Hà Nội - phụ cận và biện pháp phòng trừ” của Nguyễn Tắt Thắng và ctv(2011), đã cho thấy rằng các dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh phân lập trên các giốngkhoai tây khác nhau ở các vùng khác nhau đều có khả năng gây hại trên các giống khoaitây sử dụng chế phẩm vi sinh vật đối kháng Bacillus subtilis kết hợp với thuốc hóa học

dé phòng trừ bệnh héo xanh vi khuan hại khoai tây Chế phẩm dùng xử lý đất trước khitrồng có tác dụng hạn chế khả năng xâm nhiễm, phát sinh phát triển của bệnh héo xanh

vi khuẩn hại khoai tây Các loại thuốc hóa học và kháng sinh có khả năng ức chế sự phátsinh gây hại của bệnh Trong đó, thuốc Lobo 8WP có hiệu lực phòng trừ bệnh héo xanh

vi khuẩn hại khoai tây cao nhất sau 28 ngày đạt 78,8% - 80,2% Tiếp đến là thuốcStreptomycine (hiệu lực phòng trừ đạt 69,4% - 70,9%) Thuốc Validamycin có hiệu lựcthấp nhất (hiệu lực phòng trừ đạt 61,6% - 62,3%)

1.2.5 Phòng trị bệnh bằng vi sinh vật đối kháng

Vi sinh vật đối kháng là những loài vi sinh vật có khả năng kìm hãm sự phát triểnhoặc tiêu diét vi sinh vật khác thông qua các sản phẩm trao đổi chất độc hại của chúngnhư chất kháng sinh, axit hữu cơ, enzyme, các chất ức chế có tác động kìm hãm phảnứng trao đôi chất hoặc sự cạnh tranh về nơi cư trú, về chất dinh dưỡng (Hafeez, 2006);

và sản sinh ra các chât siderophore chủ yêu làm hạn chê lượng sắt sắn có cân thiệt cho

sự sinh tong hợp của các mầm bệnh (Lemanceau, 1992)

Các loại vi sinh vật đối kháng tiêu diệt hoặc ức chế các hoạt động của vi sinh vật gâybệnh cây chủ yếu bằng các chất kháng sinh, là những sản phẩm trao đồi chất trong quátrình sống của chúng (Vũ Triệu Man và Lê Lương Té, 1998), tiết ra các enzyme nhưChitinase, B - 1,3 - Glucanase, Protease phân hủy thành phần vách tế bao vi sinh vật nhưGlucan, Chitin, Protein của vách tế bào nắm và vi khuẩn gây bệnh (Frindlender, 1993)

1.3 Những nghiên cứu về phòng trừ mầm bệnh Ralstonia solanaceum bằng visinh vật đối kháng

1.3.1 Nghiên cứu trong ngước

Lê Lương Té (2002), nghiên cứu “Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn cà chua

có hiệu quả kinh tế cao bằng biện pháp sử dụng rộng rãi các giống cà chua kháng bệnh,

có năng suất CLN - 1462A và P.T4719A ở vùng đồng bằng sông Hồng” Đã được đưa

vào sản xuât rộng rãi ở các tỉnh phía Bac nước ta.

Lê Như Kiểu và ctv (2010), nghiên cứu “Phát hiện biovar 1 và 5 trong quan thé

vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua” Điều này cho thấy rằngquan thể gây bệnh gây bệnh héo xanh cà chua ở nước ta là rất đa dạng

Trong nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn vi khuan Pseudomonas sp cô khảnăng kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh ở cây cà chua” của Lê

Vũ Khánh Trang và Lý Hải Triều (2020), từ các mẫu đất ở rễ cây cà chua được thu thập

ở khu vực hộ dân phường Hòa Quý, quận Ngũ Hành Sơn, Thành phố Đà Nẵng đã phânlập được 5 chủng vi khuẩn kí hiệu là P01, P02, P03, P04, P05 có khả năng đối kháng

với vi khuân R solanacearum.

Nghiên cứu của Pham Thị Kim Loan (2021), về “Phân lập và đánh giá kha năngđối kháng của các vi khuẩn trong đất đối với vi khuan Ralstonia solanacearum gây bệnhhéo rũ trên cây họ cà” Kết quả phân lập được 06 dòng vi khuân gây bệnh héo xanh trên

cây họ cà và 09 dòng vi khuẩn từ đất có khả năng đối kháng với vi khuân Ralstoniasolanacearum trong điều kiện phòng thí nghiệm.

1.3.2 Nghiên cứu ngoài nước

Trong nghiên cứu của J¡ và ctv (2008), đã chọn lọc được 04 chủng vi khuẩn từ ládâu tằm có khả năng ức chết với vi khuan Ralstonia solanacearum Trong đó có chủngLu144 được xác định là Bacillus subtilis có khả năng đôi kháng rõ rệt nhất

Trong nghiên cứu của Ahmed và Zahran (2006), đối tượng là bệnh héo xanh trên

cà chua và đậu phộng gây ra bởi vi khuẩn Ralstonia solanacearum bị ức chế bởi vi

khuân đôi kháng Pseudomonas fluorescens và Bacillus subtilis.

Theo Ling và ctv (2020), trong nghiên cứu “Streptomyces sp NEAU - HV9: Phan

lập, định danh và tiềm năng là tác nhân đối kháng với Ralstonia solanacearum trên càchua”, Ralstonia solanacearum là một vi khuan gây bệnh thực vật quan trọng từ đất.Trong nghiên cứu này, một chủng xạ khuẩn có tên NEAU-HV9 có hoạt tinh kháng khuẩnmạnh đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum đã được phân lập từ đất bằng kỹ thuậtsàng lọc trong ống nghiệm

1.4 Sinh tống hợp IAA ở vi sinh vật

Indole-3-acetic acid (IAA) là dang auxin, là chat điều hòa sinh trưởng của thựcvật IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dải tế bào, phân hóa sinh mô, phát triểntrái và hạt, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng Tác động của IAA phụthuộc vào loại phan sinh mô, IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá mam, ngancản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự bắt đầu của rễ bên và sự hình thành lông

rễ (Theologies và Ray, 1982) Theo Sergeeva, (2002), các nhóm vi khuẩn khác nhau ké

cả vi khuẩn đất, vi khuẩn biểu sinh, vi khuẩn nội sinh và một số khuẩn lam(Cyanobacteraia) đã phát hiện là có khả năng sinh tổng hợp indole-3-acid acetic từ tiềnchat L-tryptophan (Trp) Một số loài của các chi Azospirillum, Gluconacetobacter vàPseudomonas là những vi khuẩn cô định đạm, nhưng nhờ vào khả năng tông hợp IAA

của chúng nên cũng được xem là vi khuẩn vùng ré kích thích sinh trưởng thực vật, gopphần làm tăng sản lượng cây trồng (Kloepper, 1989).

1.5 Khả năng có định đạm

1.5.1 Sơ lược về cố định đạm

Đạm là chất dinh dưỡng rất cần thiết và quang trọng cho sự phát triển của thựcvật Trong không khí có 78% No nhưng cây trồng không thé hap thụ trực tiếp No trongkhông khí Vì vậy, sự cố định đạm sinh học do sự liên kết giữa vi khuẩn với cây trồngthực sự rất có ý nghĩa

Sự cố định đạm sinh học ở vi sinh vật nhân sơ, chủ yếu là ở vi khuẩn và cổ vikhuẩn (Archaea) Nhóm vi sinh vật này có thé sông tự dưỡng hay dị dưỡng và quá trình

cô định đạm của chúng cần nguồn năng lượng, chủ yêu là nguồn carbonhydrate do câychủ cung cấp, do đó nguồn năng lượng càng dồi dào thì sản lượng đạm cố định càngcao Trong quá trình cố định đạm sinh học, khâu then chốt của toàn bộ chu trình nitơ là

sự khử liên kết của N› thành NH: nhờ vào nguồn năng lượng ATP, sự hoạt động của

phức hợp enzyme nitrogenase va enzyme hydrogenase (Văn Thị Phuong Nhu, 2015).

13 — 22%, ngoài ra còn thay thế được 25 — 30 kg/ha phân dam hóa học ở giống lúa(Oryza sativa) trong hai thử nghiệm trong chậu và bốn thử nghiệm ngoài đồng ở các địađiểm khác nhau của Việt Nam (Van và ctv, 2000)

Ở Việt Nam, một số nghiên cứu, đánh giá về vi khuẩn có định đạm đã được thựchiện Phạm Thị Thủy và Ngô Thanh Phong (2018), đã thử nghiệm chế phẩm sinh học từdòng vi khuân Burkholderia vietnamiensis BV3 trên giỗng lúa OM6976 trồng trên đất

phèn ở huyện Hòn Đất tỉnh Kiên Giang trong vụ Hè Thu 2016 cho thấy kết quả chếphẩm sinh học có thê tiết kiệm 50% đạm hóa cho sự sinh trưởng và phát triển của câylúa trồng ngoài đồng.

Nguyễn Hữu Hiệp va ctv (2012), đã nghiên cứu kha năng cố định đạm của chủngAzospirillum lipoferum có kết hợp liều lượng đạm khác nhau trên cây lúa trong điều kiệnnhà lưới Kết quả cho thấy việc chủng vi khuẩn và bón 50% N cho các chỉ tiêu về thànhphần năng suất khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng và tương đương với nghiệm thứckhông chủng vi khuẩn bón 100% N

1.6 Khả năng hòa tan lân khó tan

1.6.1 Sơ lược về phân giải lân

Vi khuẩn nội sinh thực vật ngoài kha năng cố định đạm sinh học còn có vai tròquan trọng trong việc hòa tan lân khó tan thành dễ tan như orthophosphate cung cấp chothực vật làm tăng san lượng (Rodriguez, 2006) Lân là một trong những chất dinh dưỡngcần thiết cho cây trồng Trong đất, lân tồn tại dưới hai dạng là lân hữu cơ và lân vô cơ.Lân hữu cơ tồn tại trong xác bã động, thực vật và trong vi sinh vật, thường là các hợpchat chủ yếu như phytin, phospholipid, acid nucleic và các hợp chất hữu cơ khác Lân

vô cơ trong đất thường trong các dạng khoáng như apatit, phosphat sắt, phosphat nhôm

và các dạng này khó tan Cây trồng chỉ có thê sử dụng được lân trong đất ở dạng hòatan, lân dạng khó tan cây trồng không hấp thụ được (Nguyễn Xuân Thành và ctv, 2007)

Ở trong dat, lân dễ tan tồn tại với một lượng nhỏ, phần lớn tồn tại dưới dang khó tan.Chính vì vậy, để đạt được năng suất cây trồng, người ta thường dùng các dạng phân bón

dé tan dé bón cho cây Tuy nhiên, các dang có thể hòa tan của phân lân khi bón vào đấtlại dé dàng bị cô định thành các dạng không hòa tan được như là: Cas(PO¿)›, Fea(PO¿)a

và AIPO¿ nên cây khó hap thụ và đã đến việc bón phân vượt quá mức đối với đất trồng.Bón quá nhiều lân sẽ gây ra ô nhiễm môi trường đất (Chen, 2006)

Thực vật sử dụng được lân hữu cơ là nhờ sự thủy phân bởi các enzyme phosphatase

ngoại bao của thực vật hay của vi sinh vật Theo Bumemann (2008) 60% tong lượng lân

hữu cơ có thể bị thủy phân bởi phosphatase Cả hai phosphatases thực vật và vi sinh vật

đều có tác động hiệu quả trong việc tạo orthophosphate từ dạng lân hữu cơ trong đất.Một số bằng chứng cho thấy enzyme vi khuẩn cho hiệu quả cao hơn trong việc hòa tanlân (Tarafdar, 2001) Vi sinh vật có vai trò quan trọng giúp thực vật có thé hap thu được lân.1.6.2 Một số nghiên cứu về phân giải lân

Việc sử dụng PSB trong nông nghiệp có từ những năm 1950 khi một số nhà khoahọc Nga và châu Âu áp dụng Bacillus megaterium var phosphaticum (Menkina, 1963)làm cho năng suất cây trồng tăng lên Kucey và Leggett (1989), đã tìm thấy ở Mollisolscủa Canada, tương ứng 0,5% và 0,1% tổng số vi khuẩn và nam, thé hiện khả năng hòatan hợp chất P không hòa tan Trong một thử nghiệm được tiễn hành trong cả môi trườngtrong chậu và ngoài đồng, sinh khối và tổng P của lúa mì (Triticum aestivum) đã tăngđáng kế sau khi áp dụng duy nhất chủng Phosphobacterium 9320 - SD Tuy nhiên,không có sự khác biệt đáng ké về chiều cao của cây thử nghiệm (Chen và ctv, 2008)

Nguyễn Hữu Hiệp và Hà Danh Đức (2009), đã phân lập được 35 dòng vi khuẩnhòa tan lân cho cây đậu phộng trồng trên đất giồng cát tinh Trà Vinh Từ kết quả thínghiệm cho thấy chủng hỗn hợp vi khuẩn cô định đạm với vi khuẩn hòa tan lân giúp

thay thé 50 kg N/ha và 60 kgP2Os/ha

Nguyễn Thị Ngọc Sương và ctv (2016), đã tuyển chọn được dòng vi khuẩnBacillus B68 và Pseudomonas T15 có khả năng hòa tan lân cao và không gây độc đốivới cây trồng Nghiên cứu của Nguyễn Thị Dơn và Cao Ngọc Điệp (2017), cho thấyhiệu quả hòa tan lân, kali của ba chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 24 CA09,Rhizobium tropici CA29, Azotobacter tropicalis K16B Kết quả là cả ba dong vi khuẩnnày có khả năng hòa tan lân — kali và cung cấp khoảng 25% lượng lân — kali hóa họccho sự sinh trưởng của củ cải trắng, đậu phộng và lúa cao sản trong thí nghiệm ngoàiđồng tại tỉnh An Giang

1.7 Khả năng sinh tổng hợp siderphores trong kiểm soát mầm bệnh

1.7.1 Sơ lược về siderophore

Hau như tat cả vi sinh vật đều cần sử dụng sắt (Fe) dé cấu tạo nên các Cytochrome

và nhiều loại enzyme Sắt rất khó hấp thụ vì ion sắt (Fe?") và các dẫn xuất của chúng rấtkhó hòa tan, trong môi trường thường có rất ít các hợp chat sắt dé hòa tan để có thé vậnchuyên vào tế bào Việc hấp thu sắt của vi sinh vật là hết sức khó khăn Nhiều vi khuẩn

và nắm phải khắc phục khó khăn này bằng cách thông qua thể mang sắt (siderophore)(Nguyễn Lân Dũng, 2013) Siderophores là các hợp chất ngoại bào, có trọng lượng phân

tử thấp (< 1.000 Dalton), liên kết chọn lọc sắt (Fe**) Các siderophores thường được sảnxuất bởi các vi sinh vật hiếu khí, ky khí tùy nghi và ở cây một lá mam trong điều kiện

áp lực nồng độ sắt thấp (Neilands, 1984; Ghosh và ctv, 2015)

Siderophore có thể được tạo ra bởi nam, vi khuẩn, thực vật va động vật có vú.Riêng ở nam và vi khuẩn, siderophore được tạo ra trong điều kiện thiếu sắt, nếu môitrường giàu sắt thì vi sinh vật ít tạo ra siderophore Ở vi khuẩn chỉ tạo ra các dangsiderophore ngoại bao Da số các nghiên cứu về vi khuẩn sản xuất siderophore là vikhuẩn gram âm như vi khuẩn đường ruột ky khí Escherichia coli, vi khuân này chủ yếusản xuất enterobactin — siderophore loại catecholate có ái lực cao nhất với Fe (III) hontat cả các siderophore đã được biết đến — là một dẫn xuất triscatechol của cyclic triserine

lactone (Raymond và ctv, 2003) Ngoài ra vi khuẩn gram dương cũng có khả năng sản

xuất siderophore như vi khuẩn sợi Streptomyces có thê sản xuất desferrioxamine G, B

và E (Challis và Hopwood, 2003).

1.7.2 Một số nghiên cứu về siderophore

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về vi sinh vật có khả năng tổnghợp siderophore và khảo sát các điều kiện nuôi cây dé thu được lượng siderophore cao.Một số nghiên cứu về khả năng tao siderophore của chi Serratia, Devi (2016) đã phân

lập được chủng vi khuẩn nội sinh Serratia marcescens AL2-16 có khả năng tạo được

lượng siderophore cao (83,488%) sau 48 giờ nuôi cấy trong môi trường có bổ sung

1 mM clorua sắt Các loại đường fructose, glucose và sucrose đã được chứng minh là

nguồn carbon tốt nhất dé thu được lượng siderophore đáng kể với giá trị lần lượt là

77,223%, 73,584% và 65,363%.

Chen va ctv (2010), đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn có tên LSE04, LRE17 gan

với chi Enterobacter sp LRE07 được xác định là Serratia nematodiphila và LSE06 cho

thay 100% tương đồng với trình tự Acinetobacter sp Cả 04 chủng vi khuan này đều cókhả năng sinh tong hợp siderophore với giá trị As/Ar là LRE07 (0,433), LRE17 (0,921),

LSE04 (0,377) và LSE06 (0,754).

1.8 Khả năng tạo nano bạc trong kiểm soát mầm bệnh

1.8.1 Sơ lược về nano bạc

Công nghệ nano đã nổi lên như một tiến bộ khoa học và được ứng dụng ở nhiềungành trong vài thập kỷ qua Tiền tố "nano" chỉ đơn vị 1 phan tỷ mét hoặc 10” Hạt nano

có kích thước từ 1 đến 100 nm (Ali, 2019) Trong các kim loại quý được tổng hợp nano,đáng chú ý là bạc nano với tính năng nỗi bật là ức chế và diét khuẩn nên có tiềm năngứng dụng trên nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực nông nghiệp

Mặc dù có nhiều nghiên cứu chứng minh hạt nano bạc chống lại một loạt các visinh vật bao gồm vi khuẩn gram âm, gram dương và nắm, nhưng về cơ chế của hoạtđộng nay vẫn chưa được nghiên cứu nhiều Theo Roy va ctv (2019), tính kháng khuẩncủa các hạt nano bạc có thể giải thích theo một số cơ chế sau: (i) lam ton thuong thanh

và màng tế bao, (ii) xâm nhập và gây ton thương bên trong tế bao, (iii) gây ra stress oxy hóa.1.8.2 Các nghiên cứu về vi sinh vật tổng hợp nano bạc trên thế giới và tại Việt Nam

Các nghiên cứu về vi sinh vật tổng hợp nano bạc chỉ được thực hiện trong 2 thập kygần đây nhưng khả năng ứng dụng nano bạc trong các lĩnh vực trong đó có lĩnh vựcnông nghiệp có nhiều triển vong Đầu tiên, Klaus (1999) nhận thấy vi khuẩn

Pseudomonas stutzeri AG259 phân lập từ mỏ bạc có khả năng khử Ag” trong dung dịch

muối AgNO; thành các hạt nano bạc Các tế bào vi khuẩn tích lũy nano bạc nhiều có

kích thước tới 200 nm.

Ở Việt Nam, hiện nay có rất ít công trình khoa học liên quan đến hướng sinh tônghợp nano bạc từ vi sinh vật Hoàng Ngọc Phương (2009) đã chứng minh khả năng tổng

hợp nano bạc của nam Fusarium oxysporum Phan Huệ Phương (2010) đã nghiên cứusinh tổng hợp nano bạc bang sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis và B licheniformis.Nguyễn Đắc Khoa (2022) cũng đã nghiên cứu khả năng tạo nano bạc của vi khuẩn

Serriatia nematodiphlia CT-78.

1.9 Kha năng sinh enzyme protease trong kiểm soát mầm bệnh

1.9.1 Vai trò của enzyme ngoại bào

Một số vi sinh vật tiết ra enzyme phân giải, có thể làm suy giảm tế bào của sinhvật khác (Gomes, 2001) Việc tiết ra enzyme phân giải bởi nam hay vi khuẩn đã đượcchứng minh là một trong những cơ chế kiểm soát sinh học bệnh hại cây trồng (Kaur,2005) Enzyme lipase và protease là enzyme thủy phân có khả năng ức chế mầm bệnh

từ đó làm giảm thiệt hai cho cây trồng và được tìm thấy trong hon 10 chủng vi khuẩn(Bootkotr và Mongkolthanaruk, 2012) Theo Bashan (2005), các chất được vi sinh vậttiết ra có khả năng làm giảm bệnh như: 2,4-diacetylphloroglucinol, herbicolin,

phenazine, pyoluteorin, siderophores, HCN va hydrolytic enzymes như chitinase,

1,3-glucanase, protease va lipase Trong các nghiên cứu trước đây về các chất điều hòa sinh

trưởng thực vật, các hoạt động từ enzyme thủy phân như protease, lipase, pectinase,

amylase (Nielsen va Sorensen, 1997) của vi khuẩn vùng rễ sản xuất cytokinin, làm tăng

sự hấp thu N, P và K của thực vật

1.9.2 Sơ lược về protease

Enzyme protease là enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide trong phân tử

protein và các peptide giải phóng các acid amin hoặc pepton Ngoài ra, enzyme này còn

có khả năng thủy phân liên kết ester, tham gia chuyền vị các gốc amino acid Proteaserất cần thiết cho các sinh vật sống và phân bồ rất rộng rãi trên nhiều đối tượng thực vật,động vật và vi sinh vật (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Enzyme protease của động vật hay thực vật thường chỉ chứa một trong hai loại

endopeptidase hoặc exopeptidase Riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên,chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein

Protease có liên quan với sự bảo vệ chống côn trùng, vi sinh vật và tuyến trùng,làm bất hoạt protein tiết ra của các mầm bệnh tân công vào mô cây (Van Loon và VanStrien, 1999) Suy thoái các yếu tô gây bệnh của mầm bệnh như độc té, ký sinh trùng cóthể liên quan đến việc sản xuất các enzyme phân hủy thành tế bào ngoại bào Hoạt độcủa protease làm gia tăng phản ứng của cây trồng đối với sự xâm nhiễm của mầm bệnh

(Vera và Conejero, 1989).

Mam bệnh sản xuất enzyme thủy phân ngoại bao, làm suy giảm các polymer cótrong thành tế bào thực vật làm tan rã thành tế bào và tạo điều kiện cho nắm xâm nhậpvào mô cây Các enzyme thủy phân này bao gồm enzyme pectolytic, pectin lyase,

cellulase và cutinase Giảm hoạt động của các enzyme này tương quan với giảm độc lực

(Beraha, 1983) Bacillus megaterium B 153-2-2 đã ức chế hoạt động của các enzymengoại bào như cellulase, pectin lyase và pectinase được sản xuất bởi mầm bệnh, bằngcách sản xuất một endoprotease ngoại bào (Bertagnolli, 1996) Bản thân protease cũng

là protein, do đó có thé bị phân cắt bởi các phân tử protease khác, đôi khi cùng loại.Điều này như một phương pháp điều chỉnh hoạt động protease Một số protease ít hoạtđộng hơn sau khi tự phân giải Một protease v1 khuẩn được tiết ra cũng có thé hoạt độngnhư một exotoxin, và là một ví dụ về yếu t6 độc lực trong sinh bệnh học của vi khuẩn.Vùng ré cây rất giàu chất nền carbon cho các vi sinh vật Các chat tiết ra rễ có thé là mộtnguồn của các hợp chat N dé phân hủy, chang hạn như acid amin và các peptide nhỏ, có

thé là các tín hiệu gây ra sự tong hop protease (Garcia-Gil, 2004)

1.9.3 Một số nghiên cứu về enzyme protease trong nước và trên thé giới

Nguyễn Thị Kim Cơ và Trần Quốc Dung (2019), đã phân lập từ các mẫu nước

thải được 04 chung Bacillus sp được đặt tên là Bó, B8, B9 và B14 có đường kính vòng

thủy phân cao Bốn chủng này được xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp củaSigma Ở mức pH = 7,9, với co chất cảm ứng là gelatin 1%, sau 24 giờ lên men ở 30°Cđạt hoạt độ cao nhất (175,2 U/mL) ở chủng B14

Palsaniya và ctv (2012) đã phân lập được 04 chủng vi khuẩn từ đất được xác định

là Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilus, E Coli và Sarratia marcens Và diéukiện tối ưu dé sản xuất protease được tim thay là 37°C ở pH = 10 với glucose là nguồncarbon, pepton là nguồn nitrogen Trong tat cả các chủng được nghiên cứu, hoạt tính

ezyme cao nhất được quan sát that ở Bacillus Subtilis

1.10 Khả năng tạo màng sinh học

1.10.1 Sơ lược về màng sinh học

Màng sinh học (biofilm) là một cấu trúc phức tạp, được tạo ra bởi các vi sinh vậtsinh trưởng và bám dính trên bề mặt chất nền (Dunne, 2002) Màng sinh học có thể đượctạo ra từ các nhóm vi sinh vật khác nhau bao gồm vi khuẩn, nam mốc, nam men

Nhưng phô biến nhất van là vi khuẩn, các nghiên cứu đã xác định hau hết các loài vikhuẩn đều có khả năng tạo mang sinh học Vi khuẩn có thể hình thành màng sinh học

trên các loại bê mặt môi trường răn, lỏng hoặc trên bê mặt môi trường bán lỏng.

Quá trình hình thành màng sinh học xảy ra theo một trật tự: bắt đầu bằng su hapthụ các hat dinh dưỡng hữu cơ và vô cơ trên bề mặt môi trường, tiếp đó là sự bám dínhcủa những vi sinh vật đầu tiên vào các hạt đinh dưỡng hữu cơ và vô cơ đó, những visinh vật này sinh trưởng và sinh sản tạo thành những khuẩn lạc đầu tiên; sau cùng là sự

hình thành phức hệ màng sinh học (Dang va Lovell, 2000).

Sự hình thành mang sinh học được xem như là một xu hướng chung của v1 khuẩn

dé sống sót trong tự nhiên (O’Toole và ctv., 2000), bởi màng sinh học giúp chúng chốnglại các chất kháng sinh, sát trùng, chống lại tác động của một số kim loại nặng, các cation

và chất độc, đồng thời bảo vệ tế bào tránh khỏi nhiều yếu tố bat lợi từ môi trường như

sự thay đổi độ pH, bức xa tia cực tím, áp suất thâm thấu và sự khô hạn (Kokare, 2009).1.10.2 Các nghiên cứu về khả năng tao mang sinh học của vi sinh vật trên thé giới

và Việt Nam

Theo Trần Thị Đào và ctv (2021), trong nghiên cứu “Phân lập và đánh giá đặctính của chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng sinh học định hướng ứng dung trong xử

lý nước thải” cho thay đã phân lập được 07 chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng sinhhọc tốt đã được phân lập từ 15 mẫu nước thải thu thập ở làng bún Khắc Niệm — Bắc Ninh.

Nhóm nghiên cứu của Lê Thị Nhi Công và ctv 2016 đã phân lập từ mẫu nước

thải khu công nghiệp Từ Liêm, Hà Nội thu được chủng Bacillus sp B8 vừa có khả nang

tạo màng sinh học cao vừa có khả năng phân hủy dầu diesel tốt Phân tích trình tự gen

mã hóa 16S rRNA, chủng B8 đã được định tên là Bacillus sp B8 với mã số đăng ký trênGenBank là JQ764732 Bằng thực nghiệm đã xác định được một số điều kiện sinh lýsinh hóa tối ưu cho sự hình thành màng và khả năng hoạt động bề mặt của chủng là:nhiệt độ 30°C, pH=7, nồng độ NaCl 0,5% Dưới các điều kiện tối ưu này, mật độ quanghọc ở bước sóng 570 nm của mang sinh học do chủng B8 tạo thành đạt gần 27,89 vàkhả năng đánh tan dau đạt 68%

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Khao sát khả năng đôi kháng của dịch nuôi cây các dòng vi sinh vat dat với với

vi khuan Ralstonia solanacearum.

Khao sat khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng của các dòng vi sinh vat đấttrong điều kiện phòng thí nghiệm

Khảo sát khả năng kiêm soát mâm bệnh của các dòng vi sinh vật đât trong điêu

kiện phòng thí nghiệm

Khao sát khả năng tạo màng sinh học của các vi sinh vật đất trong điêu kiện

phòng thí nghiệm.

2.2 Thời gian và phương pháp nghiên cứu

Đề tài được thực hiện: Từ tháng 08 năm 2022 đến tháng 02 năm 2023

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, Đại học Nông Lâm TP.HCM.

2.3 Vật liệu thí nghiệm

2.3.1 Đối tượng thí nghiệm

Bảng 2.1: Các vi sinh vật đất được thực hiện trong thí nghiệm

đo, que cấy, ống đong,

Thiết bị nghiên cứu: Tủ cấy khử trùng (2AC2 — 6E8, Esco, Singapore), lòMicroweve, máy đo pH (SI Analytics, Germany), máy do EC (SI Analytics, Germany), nồihap vô trùng autoclave, kính hiển vi (CX23, Olympus, Japan), tủ sấy khử trùng (MC40L,ALP, Japan), may lac (Stuart) va mot số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm

2.3.3 Thành phan môi trường

Môi trường LB - Luria Broth: thành phan 1 lít peptone 10 g, cao nấm men 5 g,

NaCl 10 g, agar 20 g, nước | lít, pH 7,0 Hap khử trùng ở 121°C trong 20 phút

Môi trường KBA (King'B Agar): Thành phần: Peptone 20 g, Glycerol 10 g,K2HPOs, khan 1,5 g, MgSO¿ 7H2O 1,5 g, Agar 15 g, nước cất 1000 ml Trộn chung tat

cả các thành phần ngoại trừ MgSO¿ Điều chỉnh pH đến 7.2 Từ từ thêm MgSO và lắpđều Hấp khử trùng ở 121°C trong 25 phút

Môi trường LB (Luria Broth) bồ sung L — Trytophan: Bacto — Trytophan 10 g,NaCl 5 g, cao nam men 5 g, L — Trytophan 1 g, nước cất 1000 ml

Môi trường Cas-Blu Agar: Hòa tan 60,5 mg CAS vào 50 ml nước cat, sau đóthêm 10 ml dung dich sắt (ID, khuấy đều và thêm 40 ml HDTMA (72,9 mg HDTMA

và 40 ml nước cat) Khi dùng đem pha loãng dung dịch 10 lần sau đó bổ sung 2% agarrồi đem hấp khử trùng

Thuốc thử Salkowski R2 (Glickmann và Dessaux, 1995): cân 0,45 g FeCl: chovào 100 mL acid HaSOx 10,8 M khuấy đều và bảo quản trong chai sậm màu, đặttrong tối

Đệm phosphate: dung dich A (0,136 g KHzPO¿ trong 100 mL nước cat), dungdịch B (0,174 g K2HPOs trong 100 mL nước cat) Pha dung dich A và B theo tỷ lệ 39

mL A + 61 mL B, thêm nước cất vừa đủ 200 mL, pH =7

Môi trường NBRIP: 10 g succrose; 0,1 g (NHa4)2SOa; 0,25 g MgSO4.7H20; 0,2 g

KCl; 5 g MgCh.6H20; 5 g Cas(PO¿)s; nước cất vừa đủ 1 lít

Môi trường Winograndsy I: 2 g (NH4)2SOu; 0,5 g MgSOu; 2 g NaCl; 1 g KzHPOau;

0,001 g CaCOs; 0,4 g FeSOu; Agar 15 g; 1 lit nước cất

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Mục Tên thí nghiệm

1 Khả sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy các dòng vi sinh vật đất đối với vi

khuân Ralstonia solanacearum trong phòng thí nghiệm

2 Khảo sát khả năng sinh IAA của các dòng vi sinh vật

3 Khao sát khả năng có định đạm của các dong vi sinh vật

4 Khao sát khả năng phân giải lân của các vi sinh vật

5 Khap sát khả năng sinh hợp chất siderophore của các vi sinh vật

6 Khao sát kha năng tạo nano bạc của các vi sinh vật

7 Khao sát khả năng sinh enzyme protease của các vi sinh vật.

8 Khao sat kha nang tao mang sinh hoc cua cac vi sinh vat.

2.4.1 Khảo sát kha năng đối kháng của dịch nuôi cấy các dòng vi sinh vat dat đối

với vi khuân Ralstonia solanacearum.

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum CXT3 từ nguồn vi khuẩn phòng thí nghiệm bộmôn được chọn đề đánh giá tính đối kháng Tính đối kháng của các dòng vi sinh vật đấtđược đánh giá bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy visinh vật đất với vi khuẩn bệnh Dịch nuôi cấy vi sinh vật đối kháng có khả năng khuếchtán trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn bệnh Dịch nuôi cấy vi sinh vật đốikháng được vi khuẩn bệnh sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với mỗi dòng vi sinh vật là một

nghiệm thức và mỗi NT là | đĩa petri, mỗi NT với 3 LLL.

Cách tiến hành

quanh lỗ đục.

Dùng pipet vô trùng hút 6 wl nước cất vào lỗ khoan ở trung tâm dé đối chứng, 3

lỗ khoan còn lại hút 6 ul dịch vi sinh vật đối kháng đã được ly tâm tốc độ 14.000vòng/phút trong 15 phút đưa vào mỗi lỗ khoan, giữ ở điều kiện nhiệt phòng trong thờigian 24 giờ Sau khi cấy tránh di chuyên đĩa petri Khi dịch khuẩn khô lại có thé dichuyên nhưng cần nhẹ nhàng

Nước cât

Dịch nuôi cấy

VSV

R solanacearum

Hình 2.1 Bồ trí dich chiết vi khuẩn đối kháng vi khuan Ralstonia solanacearum trên

đĩa petri theo phương pháp cây khuêch tán giêng thạch

Theo dỗi chỉ tiêu:

Hoạt tính đối kháng của dịch nuôi cấy vi sinh vật đối kháng được thé hiện thôngqua vòng vô khuẩn sau 1, 2 ngày sau cấy được biểu thị bằng công thức:

Kích thước vòng vô khuẩn (mm) = (D1+D2+D3)/3-d

Trong đó:

DI, D2, D3 là đường kính tương ứng của 3 vòng vô khuan trên 1 dia petri (mm)

d là đường kính vòng cấy vi sinh vật có ích (mm)

» Tính kháng khuan được biéu hiện khi vòng vô khuẩn > 2 mm

+ Kích thước vòng vô khuân < 5 mm: tính kháng yếu

+ Kích thước vòng vô khuẩn từ 5 đến 10 mm: tính kháng trung bình

+ Kích thước vòng vô khuẩn > 10 mm: tính kháng mạnh

2.4.2 Khao sat khả năng sinh IAA

Phuong phap thi nghiém

Thi nghiệm được bô trí theo kiêu hoàn toàn ngau nhiên với môi vi sinh vật là một

nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 LLL

Đánh giá định lượng khả năng sinh LAA

Khả năng tổng hop IAA của vi sinh vật được xác định bằng thuốc thử Salkowski,

sự kết hợp của IAA với Fe** và H' trong thuốc thử sẽ tạo thành phức tris (indole — 3 aceto) iron (III) Fe[(CsHøN)CHaCOO]› có màu hồng hoặc đỏ Nồng độ IAA được ghinhận khi đo độ hấp thu quang phô của dung dich ở bước sóng 530 nm (Gordon và Weber,

-1951; Kamnev và ctv, 2001).

Dựng đường chuẩn IAA

Cân 0,001 g IAA tinh khiết hòa tan 10 ml dung dịch đệm phosphate được nồng

độ là 100 pg/ml Pha loãng ra các nồng độ 0; 2,5; 5; 10; 15; 20; 30; 40 pg/ml Lay 1,5

ml thuốc thử salkowski R2 cho vào 8 ống nghiệm chứa 1,5 ml dung dich IAA ở cácnồng độ pha loãng trên Tiến hành vortex các ống nghiệm va để trong tối khoảng 25phút để phan ứng màu xảy ra, nồng độ [AA càng cao thì màu hồng càng đậm, sau đó

Cách thực hiện:

Vi khuẩn ở mật số 105 CFU/ml được nuôi trong môi trường LB lỏng có bé sungthêm trytophan ở nồng độ 0,1 g/l, đặt trên máy lắc ở nhiệt độ phòng và dé ở điều kiệntối dé IAA sinh ra không bị phân hủy Khảo sát khả năng sinh IAA của vi khuẩn ở thờiđiểm 02 ngày sau khi chủng Hút 2 ml dịch nuôi vi khuẩn ở mỗi thời điểm ly tâm ở tốc

độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút dé loại bỏ tế bào Hút 1,5 ml phan dịch trong phíatrên cho vào các ống nghiệm, sau đó bé sung thêm 1,5 ml thuốc thử Salkowski R2, trộnđều dung dịch Hỗn hợp dé 6n định ở nhiệt độ phòng trong 25 phút trong điều kiện tối

dé phản ứng tạo màu xảy ra Mẫu đối chứng là môi trường LB có bổ sung trytophan ởnồng độ 0,1 g/l và thuốc thử Salkowski R2

Đọc kết quả: Hàm lượng IAA được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang ở

Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với mỗi vi sinh vật là một

nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 LLL.

Xây dựng đường chuẩn NH+*

Sáu ống nghiệm được đánh số theo thứ tự từ 0 đến 5 với ống 0 là đối chứng âm,lần lược thêm các thành phan trong Bảng 2.1 vào ống nghiệm:

Bang 2.1 Thanh phần đường chuan NH¿”

Cho 2 ml huyền phù vi khuẩn vào ống eppendorf, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút

trong 5 phút Hút 1 ml dịch vi khuẩn đã được ly tâm cho vào ống nghiệm và lần lượccho vào các thành phần sau: 4 ml nước cất, 2 ml dung dich phenol — sodiumnitroprusside, 1 ml EDTA, 4 ml dung dich sodium hypochlorite Tiến hành khuấy cácống nghiệm trên máy khuấy va dé ổn định khoảng 15 — 20 phút trong điều kiện tối ở

nhiệt độ 30°C cho phản ứng màu xảy ra.

Đọc kết quả: Hàm lượng NH," được xác định bằng phương pháp so sánh màu ởbước sóng 636 nm trên quang phổ kế (Page, 1982)

2.4.4 Khảo sát khả năng phân giải lan

Phương pháp thí nghiệm

Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi vi sinh vật

là một nghiệm thức, mõi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

2.4.4.1 Dinh tính khả năng hòa tan lân

Vi sinh vật được cay trên môi trường chứa lân khó tan (NBRIP) (Nautiyal, 1999)

đặc và được ủ ở 30°C Quan sát khả năng tạo vùng sáng màu quanh khuẩn lạc trên môitrường NBRIP do vi sinh vật sử dung nguồn lân khó tan (Cas(PO¿)a) Sau đó tiến hành

xác định khả năng hòa tan lân khó tan trên môi trường NBRIP lỏng.

2.4.4.2 Định lượng khả năng hòa tan lân

Xây dựng đường chuẩn lân

Dung dịch lân chuẩn được chuẩn bị bằng cách cho 1,757 g KH¿PO¿ vào 1 lít nướccất và khuấy bang bằng đũa thủy tinh cho tan hết đề tao dung địch có nồng độ 400 pg/ml.pha loãng dung dịch trên dé tao dung dich lân chuẩn có nồng độ 4 ug/ml chuẩn bị 6 ốngnghiệm được bé sung các thành phan sau:

Bảng 2.2 Thành phần đường chuẩn khảo sát khả năng phân giải lân

: Ậ Ong nghiệm

Hóa chât 0 i 2 3 Ầ 5

Nước khử ion (ml) 5 4 3 2 1 0

Dung dịch lân (ml) 0 1 2 3 4 5 Dung dich B (ml) 1 1 1 1 1 1 Hàm lượng P (ug/ml) 0 0,8 1,6 2,4 3,2 4

dé ôn định khoảng 15 - 20 phút ở nhiệt độ 30°C Tiến hành đo hàm lượng lân bằng

phương pháp so màu ở 882 nm.

2.4.5 Khả năng tạo hợp chất Siderophore

Kha năng sinh siderophore của vi khuẩn được xác định bang cách sử dụng phứchợp thuốc nhuộm sắt - chrome azurol S (CAS) có màu xanh Do siderophore có ái lựcvới sắt cao hơn thuốc nhuộm nên siderophore lấy sắt trong phức hợp thuốc nhuộm dẫnđến sự thay đổi màu của thuốc nhuộm từ màu xanh sang màu cam, tím (Schwyn và

Neilands, 1987).

Phương pháp thí nghiệm:

Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với mỗi vi sinh vật là một

nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 LLL.

Tiến hành thí nghiệm:

2.4.5.1 Thí nghiệm định tính siderophore

Siderophore được tạo ra bởi các vi sinh vật được xác định theo phương pháp

SD-CASA (A Simple double-playerd Chrome Azurol S Agar) của Hu và Xu (2011) Chuan

bị môi trường CAS-blue agar [60,5 mg CAS hòa tan trong 50 ml nước, sau đó thêm 10

mL dung dich sat (II) (1 mM FeCl:.6H2O, 10 mM HCI)] Khuấy đều và thêm 40 mlHDTMA (72,9 mg HDTMA + 40 ml H20) Khi dùng thi dem hỗn hợp pha loãng 10 lầnsau đó bổ sung thêm 2% agar rồi dem khử trùng ở 121°C, 1 atm trong 20 phút

Môi trường CAS-blue agar được đồ vào dia petri một lớp mỏng (khoảng 10 mL)trước, sau 10 phút cho agar đông lại, đồ thêm một lớp thật mỏng môi trường LB (khoảng

6 mL) Vi sinh vật được nuôi tăng sinh trong môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở

30°C trong 24 giờ Dùng micropipette hút 3 yl dịch vi sinh vật trên nhỏ lên đĩa petri đã

chuẩn bị như trên (3 giot/dia) và ủ trong điều kiện tối

Chỉ tiêu theo dõi:

Quan sát vòng halo màu vàng quanh khuẩn lạc của vi sinh vật từ ngày thứ nhấtđến ngày thứ 4 sau khi nhỏ dịch vi sinh vật vào đĩa petri Vi sinh vật có khả năng tạovòng halo vàng chứng tỏ có khả năng sinh hợp chất siderophore, những vi sinh vật cókhả năng tạo siderophore sẽ tiếp tục thực hiện định lượng Đối chứng thực hiện với điềukiện tương tự nhưng không nhỏ vi khuẩn vào dia petri

2.4.5.2 Thí nghiệm định lượng siderophore

Siderophore do các vi sinh vật sinh ra được định lượng theo theo phương pháp

của Ghosh va ctv (2015) Chuẩn bị dung dich CAS: 9,1 mg CAS (chrome Azurol S) hòatan trong 7,5 ml nước, sau đó thêm 1,5 mL dung dịch sắt (IID (1 mM FeCls.6H20, 10

mM HCl) Khuấy đều và thêm 6 ml HDTMA 10 mM (21,9 mg HDTMA + 6 ml H20).Hỗn hợp trên được bổ sung nước cho đủ 100 mL và chỉnh pH = 5,6 Trước khi thực hiệnthí nghiệm thì bổ sung 87,3 mg sulfosalicylic acid vào dung dịch trên và chỉnh pH = 5,6.

Vi sinh vật đã được nuôi cấy trên môi trường LB trong 48 giờ được chủng vào môitrường LB lỏng với mật số 107 CFU/mL va ủ trong điều kiện lắc với tốc độ 120vòng/phút ở 30°C trong 60 giờ Sau 48 giờ, dịch nuôi cấy vi sinh vật được được ly tâmvới tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch nỗi Sau đó, 1,5 mL dịch nỗi đượctrộn với 1,5 mL dung dich CAS và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 630 nm so với đốichứng bao gồm 0,5 mL môi trường LB nhưng không chủng vi sinh vật và 0,5 mL dungdịch CAS Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và hàm lượng siderophore trong dịch nỗi đượctính bằng cách sử dụng công thức sau:

% Don vị Siderophore (psu)=(Az- As) / Ar x 100

Trong đó:

A:: Độ hap thụ của đối chứng ở bước sóng 630 nm (thuốc thử CAS)

As: Độ hap thụ của mẫu ở bước sóng 630 nm

2.4.6 Khảo sát khả năng tao nano bac

Sinh tông hợp nano bạc được thực hiện thông qua các phản ứng oxy hóa — khửbởi các enzym của vi sinh vật Nếu vi sinh vật có khả năng tổng hợp nano bạc thì dịchlọc sau nuôi cấy vi sinh vật được bố sung dung dịch AgNO; sẽ chuyên từ không mausang màu nâu Sự khử ion bạc thành nano bạc được xác định bằng phương pháp quangphổ với máy quang phố UV Vis chùm tia kép với dai phổ từ 400 nm đến 600 nm và

quan sát các peak đặc trưng cho nano bạc ở bước sóng từ 410 - 440 nm Đặc tính của

nano bạc được xác định thông qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TransmissionElectron Microscopy TEM) hay kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron

Microscopy SEM) (Malarkodi, 2013; Adan, 2018; Barkhade, 2018).

Phương pháp thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi vi sinh vat

là một nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

Cách thực hiện

Khả năng tạo nano bạc các vi sinh vật được xác định theo phương pháp của

Malarkodi (2013) Vi sinh vật được nuôi trên môi trường LB được chủng vào bình tam

giác 100 mL chứa 50 mL môi trường LB lỏng ủ ở 35°C trong 24 giờ Sau đó lay 5 mLdịch nuôi cấy vi sinh vật chủng sang bình tam giác chứa 45 mL môi trường LB lỏng tiếptục ủ ở 35°C trong 24 giờ Dịch vi khuẩn được ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong

10 phút thu dịch nổi Dịch nổi được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ là 0,22 pm

Bồ sung 5 mL dung địch AgNO3 10 mM vào 45 mL dịch nổi sau lọc dé đạt nồng

độ AgNO; trong hỗn hợp là 1 mM Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phúttrong 7 ngày trong điều kiện tối Quan sát sự thay đổi màu sắc của dung dịch sau 1 — 7ngày b6 sung AgNO; so với mẫu đối chứng Nếu vi khuẩn có khả năng tạo nano bạc thì

màu dung dịch sẽ chuyên sang màu nâu sâm hay màu nâu cam.

Sự khử ion bạc thành nano bạc ở thời điểm 7 ngày sau khi bé sung AgNO: đượcxác định bằng phương pháp quang phổ với máy quang phô UV Vis chùm tia kép với daiphổ từ 300 nm đến 700 nm và quan sát các speak đặc trưng cho nano bạc ở bước sóng

từ 400 — 430 nm.

2.4.7 Khảo sat khả nang sinh enzyme protease

Phương pháp thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi vi sinh vật

là một nghiệm thức, mõi nghiệm thức được lặp lại 3 lần