Phân lập, tuyển chọn và khảo sát đặc điểm sinh hóa, điều kiện nuôi cấy của một số chủng vi khuẩn sinh protease kiềm

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: Phân lập, tuyển chọn khảo sát đặc điểm sinh hóa, điều kiện ni cấy số chủng vi khuẩn sinh protease kiềm HÀ NỘI - 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: Phân lập, tuyển chọn khảo sát đặc điểm sinh hóa, điều kiện ni cấy số chủng vi khuẩn sinh protease kiềm Sinh viên thực : ĐÀM VĂN DUY Lớp : K64CNSHA MSV : 645730 Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS NGUYỄN VĂN GIANG Bộ môn : CÔNG NGHỆ VI SINH Hà Nội - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học thực thời gian từ 09/2022 – 02/2023 hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Văn Giang – giảng viên Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tất số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu nước Các tài liệu trích dẫn nêu mục tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày 03 tháng 03 năm 2023 Sinh viên ĐÀM VĂN DUY i LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đội ngũ giảng viên, cán giảng dạy công tác Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Tôi vô biết ơn thầy, cô khoa Công nghệ sinh học giảng dạy, hướng dẫn tạo điều kiện để tơi hồn thành chương trình học, thực tập nghề nghiệp khố luận tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ kính trọng biết ơn đến PGS.TS Nguyễn Văn Giang định hướng nghiên cứu, tận tình dạy, giúp đỡ, hỗ trợ suốt trình thực khóa luận Tơi xin cảm ơn đến thầy PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh, cô Th.S Trần Thị Đào, cô Th.S Nguyễn Thanh Huyền, cô Th.S Trần Thị Hồng Hạnh, nghiên cứu viên Dương Văn Hoàn, Nguyễn Thị Thu giúp đỡ tơi thời gian thực khố luận Cuối muốn gửi lời cảm ơn đến Bố, Mẹ, gia đình bạn bè thực khố luận mơn Cơng nghệ vi sinh khuyến khích, động viên, hỗ trợ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành tốt khố luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 03 tháng 03 năm 2023 Sinh viên ĐÀM VĂN DUY ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Danh mục từ viết tắt viii Tóm tắt ix PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, đối tượng nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1.2.2 Đối tượng nghiên cứu 1.2.3 Nội dung nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương enzyme 2.1.1 Đặc điểm chung 2.1.2 Lịch sử nghiên cứu enzyme 2.1.3 Cấu trúc chung enzyme 2.1.4 Chức enzyme 2.1.5 Các yếu tố ức chế enzyme 2.1.6 Quy ước đặt tên enzyme 2.2 Enzyme protease 10 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu 10 2.2.2 Sự phân giải protein (quá trình thối rữa) 12 iii 2.2.3 Các phâm nhóm protease 13 2.2.4 Các nguồn cung cấp protease 14 2.3 Protease kiềm 15 2.3.1 Khái quát 15 2.3.2 Ứng dụng protease kiềm 16 2.3.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng protease kiềm Việt Nam giới 19 PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 21 3.1.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 21 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 21 3.1.3 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 21 3.1.4 Hóa chất 21 3.2 Phương pháp nghiên cứu 22 3.2.1 Phân lập vi khuẩn từ nước thải lò mổ 22 3.2.2 Phương pháp nhuộm gram 22 3.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính protease 23 3.2.4 Phương pháp dựng đồ thị đường chuẩn tyrosine 24 3.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ protease từ dịch nuôi vi khuẩn 24 3.2.6 Khảo sát đặc điểm sinh học phản ứng hóa sinh chủng vi khuẩn sinh protease kiềm 25 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Phân lập vi khuẩn sinh protease kiềm 30 4.2 Hoạt tính phân giải protein chủng vi khuẩn sinh protease kiềm 31 4.3 Đồ thị đường chuẩn L-Tyrosine 32 4.4 Khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn sinh 33 4.4.1 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease kiềm 33 iv 4.4.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ protease kiềm 34 4.4.3 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt độ protease kiềm 36 4.4.4 Ảnh hưởng nguyên tố kim loại đến hoạt độ protease 37 4.4.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease kiềm 38 4.5 Khảo sát đặc điểm hình thái đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn sinh protease kiềm 40 4.5.1 Đặc điểm hình thái 40 4.5.2 Khả di động 41 4.5.3 Phản ứng catalase 42 4.5.4 Phản ứng MR (Methyl Red) 42 4.5.5 Phản ứng VP (Voges-Proskauer) 43 4.5.6 Khả biến dưỡng citrate 44 4.5.7 Khả thủy phân tinh bột 44 4.5.8 Khả thủy phân Urê 45 4.5.9 Khả thủy phân gelatin 46 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 5.2 Kết luận 47 5.3 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 59 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số cơng trình thu protease từ vi sinh vật 11 Bảng 3.1 Thành phần dung lượng chất dung dịch gốc Tyrosine 24 Bảng 4.1 Đường kính vòng phân giải protein 31 Bảng 4.2 Số đo OD660 đường chuẩn Tyrosine 32 Bảng 4.3 Hoạt độ protease ảnh hưởng pH 34 Bảng 4.4 Hoạt độ protease ảnh hưởng nguồn cacbon 35 Bảng 4.5 Hoạt độ protease ảnh hưởng nguồn nitơ 36 Bảng 4.6 Hoạt độ protease ảnh hưởng nguyên tố kim loại 37 Bảng 4.7 Hoạt độ protease ảnh hường thời gian nuôi cấy 39 Bảng 4.8 Đặc điểm hình dạng tế bào, khuẩn lạc chủng vi khuẩn tuyển chọn 41 vi DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Quá trình thủy phân ure 28 Hình 4.1 Phân lập vi khuẩn sinh protease kiềm môi trường skim milk agar 30 Hình 4.2 Năm chủng vi khuẩn tuyển chọn sinh protease kiềm 31 Hình 4.3 Hoạt tính chủng vi khuẩn sinh protease kiềm 32 Hình 4.4 Đồ thị đường chuẩn Tyrosine 32 Hình 4.5 Biểu đồ hoạt độ protease theo pH 34 Hình 4.6 Biểu đồ hoạt độ protease theo nguồn cacbon 35 Hình 4.7 Biểu đồ hoạt độ protease theo nguồn nitơ 36 Hình 4.8 Biểu đồ hoạt độ protease theo nguyên tố vi lượng kim loại 38 Hình 4.9 Đồ thị hoạt độ protease theo thời gian 39 Hình 4.10 Khả di động chủng vi khuẩn tuyển chọn 41 Hình 4.11 Phản ứng catalase chủng vi khuẩn tuyển chọn 42 Hình 4.12 Phản ứng MR chủng vị khuẩn tuyển chọn 43 Hình 4.13 Phản ứng VP chủng vi khuẩn tuyển chọn 43 Hình 4.14 Khả biễn dướng citrate chủng vi khuẩn tuyển chọn 44 Hình 4.15 Khả thủy phân tinh bột chủng vi khuẩn tuyển chọn 45 Hình 4.16 Khả thủy phân ure chủng vi khuẩn tuyển chọn 45 Hình 4.17 Khả thủy phân gelatine 46 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Giải nghĩa ml Milliter MR Methyl Red RNA Acid ribonucleic pH Power of hydrogen/potential of hydrogen ATP Adenosine triphosphate P Proteolysis viii TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Hoàng Anh Nguyễn Văn Giang, 2017 “Tuyển chọn định danh vi khuẩn bacillus sinh enzyme protease kiềm xác định đặc tính chịu nhiệt enzyme” Nguyễn Thành Đạt, thực hành vi sinh, 1990, NXB Nông Nghiệp Lương Đức Phẩm Chế phẩm sinh học dung chăn nuôi nuôi trồng thủy sản, 2007 NXB Nông nghiệp Lương Đức Phẩm, Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp Nguyễn Lân Dũng (Dịch) Thực hành vi sinh vật học, 1983 NXB Đại Học trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Mùi, Thực hành hóa sinh học, NXB Khoa học kỹ thuật, 2001 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục, 2000 Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Phạm Trân Châu Châu, Nguyễn Lân Dũng, enzyme vi sinh vật, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, Công nghệ enzyme, NXB Nông nghiệp – Thành phố Hồ Chí Minh, 1998 10 Lê Ngọc Tú (chủ biên), Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Diên, Hóa sinh cơng nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 2002 11 Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngơ Đại Nghiệp (2004), Thực tập lớn sinh hóa, NXB Đại Học Quốc Gia Tp Hổ Chí Minh 12 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi Sinh vật học NXB Giáo dục 48 13 Cao Thị Hạnh (2007), Nghiên cứu nuôi vi khuẩn Bacillus thu sinh khối để sản xuất chế phẩm EMINA dùng chăn ni bảo vệ mơi trường, Khố luận tốt nghiệp, Học viện Nông nghiện Việt Nam 14 Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên) Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền (2004), Công Nghệ Enzyme, NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 15 Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên) Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 16 Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Hữu Phúc (1996), Công Nghệ Vi sinh vật (tập 2) Vi Sinh Vật Học Công Nghiệp, NXB Trường Đại Học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh 17 Đặng Lê Minh (2006), Khảo sát khả tổng hợp đặc tính protease số giống Bacillus Sp phân lập từ sản phẩm thuốc thú y thủy sản, Báo cáo thực tập tốt nghiệp, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tài liệu tiếng Anh Masi at el., (2021), Isolation, screening, characterization, and identification of alkaline protease-producing bacteria from leather industry effluent Balasubramanyam et al., (1996), Foreign Direct Investment and Growth in EP and IS Countries Masi et al., (2014), A comparative study on the protease producing bacteria isolated from dairy effluents of Chennai region, identification, characterization and application of enzyme in detergent formulation Briggs, G E & J B S Haldane (1925), A note on the kinetics of enzyme action, Biochem J 19:339-339 B Asha et M Palaniswamy 2/2018, Optimization of alkaline protease production by Bacillus cereus FT isolated from soil 49 Kumar, C.G and Takagi, H (1999) Microbial alkaline proteases: From a bioindustrial viewpoint Biotechnology Advances, 17, 561-594 Cha, Y., C J Murray, & J P Klinman (1989), Science 243: 1325-1330 Koshland, D (1959), The Enzymes New York: Academic Press Lewis, R L (2005), Do Proteins Teleport in an RNA World New York: International Conference on the Unity of the Sciences 10 Michaelis, L and M Menten (1913), Die Kinetik der Invertinwirkung, Biochem Z 49:333-369 11 Perutz, M (1967), Proc Roy Soc 167: 448 12 Volkenshtein, M.V., R.R Dogonadze, A.K Madumarov, Z.D Urushadze, & Yu.I Kharkats (1972), Theory of Enzyme Catalysis, Molekuliarnaya Biologia 431-439 (In Russian, English summary) 13 A.M Mazotto et al., (2010), Keratinolytic activity of Bacillus subtilis AMR using human hair 14 Thomas E Creighton (1993 Proteins: Structures and Molecular Properties) 15 Mushtaq H, Jehangir A, Ganai SA, Farooq S, Ganai BA, Nazir R.Biomolecules (2021 Jan 18), Biochemical Characterization and Functional Analysis of Heat Stable High Potential Protease of Bacillus amyloliquefaciens Strain HM48 from Soils of Dachigam National Park in Kashmir Himalaya 16 Tung et al., (2003), Investigations on the biology, epidemiology, pathology and control of Tunga penetrans in Brazil: I Natural history of tungiasis in man 17 Wang et al., (2003), Comment on "Wang et al (2005), Robust estimating functions and bias correction for longitudinal data analysis" 18 Srinu babu et al, 2007, Optimization of Protease Production from Aspergillus Oryzae Sp Using Box-Behnken Experimental Design 50 19 Bugg TD (2004) Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry) 20.Zaks et al Enzymatic catalysis in non aqueous solvents 21 Ahern, T J., and Klibanov, A M (1985), Science 228, 1280-1284 22.Manzoor Ahmad Shah et al, 2013, Plant proteases as milk-clotting enzymes in cheesemaking: a review 23.Dagmar R, Gregory A (2008 "How Enzyme Work" Science 320 (5882): 1428–1429.) 24.Axbn, R., and Ernback, (1971), Eur J Biochem 18, 351-360 25.Ahamed M, Rehman R, Siddique A, Hasan F, Ali N, Hameed A Production, purification and characterization of detergent-stable, halotolerant alkaline protease for eco-friendly application in detergents’ industry Int J Biosci, 2016; 8: 47-65 26.Amira Al-Abdalall et al, 2016 Recovery of silver from used X-ray film using alkaline protease from Bacillus subtilis sub sp Subtilis 27.Ananthan G Optimization of novel protease production through submerged fermentation by Ascidian associated Vibrio sp., GA CAS2 World J Pharma Pharma Sci, 2014; 3: 756-770 28.Aruna K, Shah J, Birmole R Production and partial characterization of alkaline protease from Bacillus tequilensis strains CSGAB0139 isolated from spoilt cottage cheese Int J Appl Biol Pharma Tech, 2014; 5: 201-221 29.Asokan S, Jayanthi C Alkaline protease production by Bacillus licheniformis and Bacillus coagulans J Cell Tissue Res, 2010; 10: 21192123 30.Aunstrup K 1980 Proteinases In: Rose AH, ed Economic Microbiology: Microbial Enzymes and Bioconversions New York: Academic Press 5: 50-114 51 31 Badhe P, Joshi M, Adivarekar R Optimized production of extra cellular proteases by Bacillus subtilis from degraded abattoir waste J BioSci Biotechnol, 2016; 5: 29-36/ 32.Bajaj BK, Jamwal G Thermostable alkaline protease production from Bacillus pumilus D-6 by using agro-residues as substrates Adv Enzyme Res, 2013; 1:30-36 33 Barrett AJ, Rawlings ND, O’Brien EA The MEROPS database as a protease information system J struct boil, 2001; 134(2-3):95-102 34.Bayoudh A, Gharsallah N, Chamkha M, Dhouib A, Ammar S, Nasri M Purification and characterization of an alkaline protease from Pseudomonas aeruginosa MN1 J Ind Microbiol Biotechnol, 2000; 24:291- 295 35 Bergey DH, Buchanan RE, Gibbons NE (1974), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA: 15-36 36.Bhaskar N, Sudeepa ES, Rashmi HN, Tamil Selvi A Partial purification and characterization of protease of Bacillus proteolyticus CFR3001 isolated from fish processing waste and its antibacterial activities Bioresour Technol, 2007; 98:2758-2764 37 Boominadhan U, Rajkumar R, Sivakumaar PKV, Joe MM Optimization of protease enzyme production using Bacillus Sp isolated from different wastes Bot Res Int, 2009; 2:83-87 38.Burhan A, Nisa U, Gokhan C, Omer C, Ashabil A, Osman G Enzymatic properties of a novel thermostable, thermophilic, alkaline and chelator resistant amylase from an alkaliphilic Bacillus sp isolate ANT-6 Process Biochem, 2003; 38:1397-1403 39.Chu W H Optimization of extracellular alkaline protease production from species of Bacillus J ind microbial Biotechnol, 2007; 34:241-245 52 40.Cupp-Enyard C Sigma’s non-specific protease activity assayCasein as substrate J Vis Exp, 2008; 19:899 41 Dorcas K, Pindi PK Optimization of protease production from Bacillus cereus Int J Curr Microbiol Appl Sci, 2016; 5:470-478 42.El Zawahry YA, Awny M, Tohamy EY, Abou Zeid AAM, Reda FM Optimization, characterization and purification of protease production by some Actinomycetes isolated under stress conditions Proceeding Of The Second Scientific Environmental Conffer, Zagazig Uni, 2007; 153-175 43.Esakkiraj P, Sankaralingam S, Usha R, Palavesam A, Immanuel G Solidstate protease production using anchovy waste meal by moderate halophile Serratia proteamaculans AP-CMST isolated from fish intestine Ann Microbiol, 2011; 61:749-755 44.Frankena J, Koningstein GM, Van Verseveld HW, Stouthamer AH Effect of different limitations in chemostat cultures on growth and production of exocellular protease by Bacillus licheniformis Appl Microbiol Biotechnol, 1986; 24:106-12 45.Fujiwara N, Masui A, Imanaka T Purification and properties of the highly thermostable alkaline protease from an alkalophilic and thermophilic Bacillus sp J Biotechnol, 1993; 30:245-256 46.Gessesse A, Gashe BA Production of alkaline protease by alkaliphilic bacteria isolated from an alkaline soda lake Biotechnol Lett, 1997; 19:479481 47.Ana Maria Mazotto et al., (2012), Keratinases and sulfide from Bacillus subtilis SLC to recycle feather waste 48.Gupta A, Khare SK Enhanced production and characterization of a solvent stable protease from solvent tolerant Pseudomonas aeruginosa PseA Enzyme Microb Technol, 2007; 42:11-16 53 49.Gupta A, Roy I, Patel RK, Singh SP, Khare SK, Gupta MN One-step purification and characterization of an alkaline protease from halo alkaliphilic Bacillus sp J Chromatogr A, 2005; 1075:103-108 50.Gupta R, Beg QK, Lorenz P Bacterial alkaline proteases: Molecular approaches and industrial applications Appl Microbiol Biotechnol, 2002; 59:15-32 51 Haddar A, Agrebi R, Bougatef A, Hmidet N, Sellami-Kamoun A, Nasri M Two detergent stable alkaline serine proteases from Bacillus mojavensis A21: purification, characterization and potential application as a laundry detergent additive, Bioresour Technol, 2009; 100:3366-3373 52.Charles Molnar et al, 2015, Concepts of Biology – 1st Canadian Edition 53 Hameed A, Keshavarz T, Evans CS Effect of dissolved oxygen tension and pH on the production of extra cellular protease from a new isolate of Bacillus subtilis K2, for use in leather processing J ChemTechnol Biotechnol, 1999; 74:5-8 54.Hameed A, Natt MA, Evans CS Production of alkaline protease by a new Bacillus subtilis isolate for use as a bating enzyme in leather treatment World J Microbiol Biotechnol, 1996; 12:289-291 55 Hoshino E, Maruta K, Wada Y, Mori K Hydrolysis of human horny cells by alkaline protease: morphological observation of the process J Am Oil Chem Soc, 1995; 72:785-79 56.Huang Q, Peng Y, Li X, Wang H, Zhang Y Purification and characterization of an extracellular alkaline serine protease with dehairing function from Bacillus pumilus Cur microbiol, 2003; 46:169-173 57 Jani SA, Parekh YM, Parmar TN, Dalwadi TJ, Patel HB, Parmar SK Screening and characterization of alkaline protease producing Bacillus strain B-4 Bacillus flexus and study of its potential for alkaline protease production Int J Curr Microbiol Appl Sci, 2016; 5:767-787 54 58.Jayasree D, Sandhya Kumari TD, Kavi Kishor PB, Vijayalakshmi M, Lakshmi Narasu M Optimization of production protocol of alkaline protease by Streptomyces pulvereceus Inter JRI Sci Technol, 2009; 1(2):79- 82 59.Tambekar DH and Tambekar SD, (2012) Partial Characterization and optimization of alkaline protease production of bacillus pseudofirmus 60.Joshi SG, Tejashwini MM, Revati N, Sridevi R, Roma D Isolation, identification and characterization of a feather degrading bacterium Int J Poult Sci, 2007; 6:689-693 61 Kalpana Devi M, Rasheedha Banu A, Gnanaprabhai GR, Pradeep BV, Palaniswamy M Purification, characterization of alkaline protease enzyme from native isolate Aspergillus niger and its compatibility with commercial detergents Ind J Sci Technol, 2008; 1:1-6 62.Kalpana VN, Sravani N, Vigneshwari T, Devi Rajeshwari V An inexpensive substrate for the production of alkaline protease by Bacillus sp and its application studies of Manihot esculenta Der Pharmacia Lettre, 2016; 8:220-232 63.Kanchana M, S Padmavathy Optimization of extracellular alkaline protease enzyme from Bacillus sp The Bioscan, 2010; 5:85-87 64.Khusro A Statistical approach for optimization of independent variables on alkali-thermo stable protease production from Bacillus licheniformis strain BIHPUR 0104 Electron J Biol, 2015; 11:93-97 65.Kumar CG, Tiwari MP, Jany KD Novel alkaline serine proteases from alkalophilic Bacillus spp.: purification and some properties Process Biochem, 1999; 34(5):441-449 66.Kumar D, Kumar V, Verma AK, Singh P, Dubey A Characterization and immobilization of partially purified alkaline protease extracted from 55 rhizospheric soil bacterium, Bacillus megaterium strain EN-2 and Bacillus subtilis strain EN-3 Afr J Microbiol res, 2014; 8:33-39 67.Lakshmi BKM, Ratnasri PV, AmbikaDevi K, Hemalatha KPJ Screening, optimization of production and partial characterization of alkaline protease from haloalkaliphilic Bacillus sp J Res Eng Technol, 2014; 3:435- 443 68.Liu S, Fang Y, Lv M, Wang S, Chen L Optimization of the production of organic solvent-stable protease by Bacillus sphaericus DS11 with response surface methodology Bioresour Technol, 2010; 101:7924- 7929 69.Maal KB, Emtiazi G, Nahvi I Production of alkaline protease by Bacillus cereus and Bacillus polymixa in new industrial culture mediums and its immobilization Afr J Microbiol Res, 2009; 3:491-497 70.Mala M, Srividya S Partial purification and properties of a laundry detergent compatible alkaline protease from a newly isolated Bacillus species Y Ind J Microbiol, 2010; 50:309-317 71 Maurer KH Detergent proteases Curr opin Biotechnol, 2004; 15(4):330334 72.Mehta VJ, Thumar JT, Singh SP Production of alkaline protease from alkaliphytic actinomycete Bioresour Technol, 2006; 97:1650-1654 73 Moon SH, Parulekar SJ A parametric study of protease production in batch and fed-batch cultures of Bacillus firmus Biotechnol Bioeng, 1991; 37:467-83 74.Naik LS, Aruna K, Sreevennela P, Ramana Devi V Isolation and biochemical characterization of protease isolated from Bacillus sp SVN12L Int J Res Pure Appl Microbiol, 2013; 3:94-101 75 Najafi MF, Deobagkar D, Deobagkar D Potential application of protease isolated from Pseudomonas aeruginosa PD100 Electron J Biotechnol, 2005; 8:197-203 56 76.Nascimento WCA, Martins MLL Studies on the stability of protease from Bacillus sp and its compatibility with commercial detergent Braz J Microbiol, 2006; 37:307-311 77 Olajuyigbe FM, Ehiosun KI Production of thermostable and organic solvent-tolerant alkaline protease from Bacillus coagulans PSB-07 under different submerged fermentation conditions Afr J Biotechnol, 2013; 12:3341-3350 78.Pant G, Prakash A, Pavani JVP, Bera S, Deviram GVNS, Kumar A, Panchpuri M, Prasuna RG Production, optimization and partial purification of protease from Bacillus subtilis J Taibah Univ Sci, 2015; 9:50-55 79.Elisavet loannmou et al, (2022), Development of Enzyme-Based Cosmeceuticals: Studies on the Proteolytic Activity of Arthrospira platensis and Its Efficient Incorporation in a Hydrogel Formulation 80.Pastor MD, Lorda GS, Balatti A Proteases obtention using Bacillus subtilis- 3411 and amaranth seed meal medium at different aeration rate Braz J Microbiol, 2001; 32(1):6-9 81 John G Holt, Noel R Krieg, Peter H.A Sneath, James T Staley, Stanley T William (1994), Bergey’s Mannual of determinative bacteriology, A Waverly company, pp30, 83,93,486,532, 559,560,566 82.Harry Seeley, Jonh Lee (1994), Laboratory manual of Microbiology, pp 437 83.Klaus Mosbach (1987) Part C: Immobilized Enzyms and Cells- Academic Press, INC 84.Kushner, D.J (1983), Deverlopment of salt-resistant active transport in a moderately halophilic aerobic bacteria Microbiol Mol Biol Review 62, 504-544 57 85.M F Chaplin and C Bucke, (1990), Enzyme Technology Cambridge University Press 86.Rosovitz, M J., Voskuil, M I., Chambliss, G H (1998), Bacillus In: A Balows and B I Duerden (Eds), Systematic Bacteriology, Arnold Press, London 709-720 87.Todar, K Ph D (2008), Bacillus and related endospore-forming bacteria Todar’s online textbook of bacteriology 88.Wolfgang Gerhartz (1990), Enzym in industry V.H.C Weiheim, New York 89.Priest, F.G and Grigorova, R (1991), Method for studying the ecology of endospore – forming bacteria Method in microbiology 22, 565 – 591 90.Todar, K Ph D (2008), Bacillus and related endospore – forming bacteria Todar’s online textbook ò bacteriology 91 Rosovitz, M J., Voskuil, M I., Chambliss, G H (1998), Bacillus In: A Balows and B I Duerden (Eds), Systematic Bacteriology Arnold Press, London: 709 – 720 92.Schallemey, M., Singh, A and Ward, O P (2004), Developments in the use of Bacillus species for industrial production Can J Microbiol 50, - 17 58 PHỤ LỤC Tên Màu Hình dáng Bề mặt chủng khuẩn lạc P1 Vàng chanh Tròn Lồi Mép nguyên - P2 Vàng chanh Tròn Lồi Mép nguyên - P3 Trắng ngà Tròn Lồi Mép nguyên - P4 Trắng Tròn Lồi Mép nguyên + P5 Trắng đục Tròn Nhăn Mép ria - P6 Trắng đục Tròn Nhăn Mép nguyên - P7 Trắng đục Tròn Nhăn Mép ria - P8 Vàng chanh Tròn Lồi Mép nguyên + P9 Trắng đục Tròn Lồi Mép nguyên - P10 Trắng đục Tròn Lồi Mép nguyên + P11 Trắng đục Tròn Nhăn Mép nguyên + P12 Trắng đục Tròn Phẳng Mép nguyên - P13 Trắng Tròn Nhăn Mép ria - P14 Đỏ hồng Tròn Nhăn Mép nguyên - P15 Đỏ hồng Tròn Nhăn Mép ria - P16 Trắng đục Tròn Phẳng Mép nguyên - P17 Trắng đục Tròn Phẳng Mép xẻ thùy - P18 Trắng đục Tròn Phẳng Mép xẻ thùy - P19 Đỏ hồng Tròn Nhăn Mép nguyên - P20 Trắng đục Tròn Nhăn Mép xẻ thùy - P21 Vàng Tròn Lồi Mép nguyên - P22 Trắng đục Tròn Phẳng Mép nguyên - P23 Trắng đục Tròn Phẳng Mép nguyên + P24 Trắng đục Tròn Phẳng Mép ria - khuẩn lạc khuẩn lạc 59 Mép Gram khuẩn lạc D-d (cm) Phụ lục 1: Bảng đặc điểm khuẩn lạc, gram hoạt tính chủng vi khuẩ Phụ lục 2: Dựng đồ thị đường chuẩn Tyrosine Phụ lục 3: Ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease Phụ lục 4: Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ protease 60 Phụ lục 5: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt độ protease Phụ lục 6: Ảnh hưởng nguyên tố kim loại ến hoạt độ protease Phụ lục 7: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease Phụ lục 8: Phân lập vi khuẩn sinh protease kiềm 61 Phụ lục 9: Nhuộm gram chủng vi khuẩn tuyển chọn Phụ lục 10: Khả sinh enzyme catalase chủng vi khuẩn 62