3.1. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy các dòng vi sinh vật đất với vi khuẩn Ralstonia solanacrum
Sử dụng dòng vi sinh vật đất có đối kháng mạnh với vi khuân Ralstonia
solanacearum do bộ môn cung câp đê tiên hành thí nghiệm.
Kết quả Hình 3.1 cho thấy tại thời điểm 24 giờ sau cấy, các nghiệm thức đều cho kết quả không có khả năng đối kháng giữa dịch nuôi cấy các dòng vi sinh vật đất với vi
khuan Ralstonia solanacearum gây héo xanh trên cây cà chua.
A: CCFN 1.1; B: CCLD 2.2; C: DXT1; D: DXT6; E: DHT3; F: ĐHT7; G: ĐNHI;
H: DHH3; I: DNHS; J: Kêt quả đôi kháng trực tiệp của DXT1 với vi khuân R. solanacearum (Đặng Thị Huỳnh Như, 2022)
Đặng Thị Huỳnh Như (2022), đã chứng minh 9/9 dòng vi sinh vật đất trên đều có khả năng đối kháng với vi khuân Ralstona solanacearum bằng phương pháp đối kháng trực tiếp khuẩn lạc. Với vòng kháng khuẩn dao động từ 6,1 đến 16,7 mm. Nhu vậy, các dòng vi sinh vật đất chỉ có khả năng đối kháng với vi khuan Ralstonia solanacearum khi có sự tồn tại của vi sinh vật. Dịch nuôi cay hoac cac hop chat sinh ra
trong quá trình nuôi cây không có kha năng kiêm soát vi khuân R .solanacearum.
3.2 Khảo sát khả năng sinh IAA trong điều kiện phòng thí nghiệm
Kết quả Hình 3.2 sau khi bồ sung thuốc thử Salkowski có 4/9 vi sinh vật được ký hiệu là CCLD 2.2 (C), DXT1 (E), DHT7 (F) và ĐNH3 (G) chuyên sang màu đỏ, cho thay 04 VSV này có khả năng sinh IAA.
Ce n
Pony
Hình 3.2 Kết qua khảo sát khả năng sinh IAA của các dòng vi sinh vật
A: ĐNHI: B: ĐXTó; C: CCLD 2.2; D: DHT3; E: DXT1; F:DHT7; G: DNH3;
H: DNHS: I: CCFN 1.1; J: DC
Hình 3.3 cho thấy hàm lượng IAA được sinh ra sau 48 giờ nuôi cấy của 4 VSV dao động từ 7,21 ng/ml đến 24,50 pg/mL. Trong đó VSV có khả năng sinh tông hợp IAA cao nhất là DXT1 (24,50 ug/mL) và thấp nhất là DHT7 (7,21 pg/mL). Kết qua khảo sát này tương tự với kết quả của Văn Thị Phương Như (2015) đã phân lập được 182 dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa có khả năng sinh IAA dao động từ 10 ug/ml — 20 ug/ml. Nguyễn Thị Thúy Nga (2015) khảo sát IAA nội sinh phân lập từ cây thông đã
thu được 02 chủng có khả năng sinh IAA là QI8 (15,382 ug/ml) và QT (11,872 ug/ml).
Hàm lượng IAA tạo ra phụ thuộc vào loài, dòng vi khuẩn, điều kiện nuôi cấy như pH, nồng độ oxy và giai đoạn phát triển.
30,00
24,50a 25,00
21,17b 20,96b
20,00
E® 15,00
10,00
7,21¢
0,00
ĐXT1 ĐNH3 CCLD 2.2 ĐHT7
Hình 3.3 Hàm lượng IAA được tạo ra của các vi sinh vật
Các số có cùng ký tự đi kèm thé hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thong kê ở mức œ = 0,01; CV = 4.15
3.3. Khảo sát khả năng cố định đạm của các vi sinh vật trong điều kiện phòng
thí nghiệm
Kết quả Hình 3.4 sau khi bổ sung phenol tat cả nghiệm thức đều chuyển sang màu xanh, chứng tỏ có sự xuất hiện của hypochloride. Điều này chứng minh của 9/9 vi
sinh vật déu có khả năng cô định đạm.
A: CCFN 1.1; B: ĐXTI; C: DHT3; D: DNH5; E: DXT6; F: DNH1; G: CCLD 2.2;
H: DHT7; I: DNH3; J: DC
Sau 48 giờ nuôi cấy trong môi trường Burk không đạm. Hàm lượng NH¡” được sinh ra dao động từ 0,0103 mg/L đến 0,1361 mg/1 (Hình 3.5). Trong đó, CCLD 2.2 có hàm lượng NH,’ sinh ra nhiều nhất là 0,1361 mg/l và thấp nhất là DXT6 va ĐNH5 với 0,0103 mg/l. Kết quả khảo sát này tương tự với kết quả phân lập vi khuẩn Burkholderia nội sinh cây khóm ở tỉnh Tiền Giang do Trần Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp (2012) hàm lượng NH," tổng hợp được ở ngày thứ 2 đạt 0,12 mg/1 và kết quả trong bản báo cáo của tác giả Nguyễn Đắc Khoa (2022) hàm lượng NH¿' do vi khuẩn Serratia nematodiphila CT-78 ở ngày nuôi cay thứ 2 dat được là 0,02 mg/l.
0,1600
e188 0,1361a
0,1200
0,1000 a |
DB 0,0800
E 0,0575b
0,0600
0,0457 bc 0,0378 bcd
0,040 0,0299 bcd 0,0299 bed
0,0200 Ỉ | 0,0142 cd0,0142 cd 0,0103¢
0,0000 a 6 @
ĐNH3 ĐHI7 CCLD2.2 ĐNH1 ĐXI6 ĐNH5 ĐHTI3 ĐXT1 CCFN1.1
Tên các vi sinh vật
Hình 3.5 Hàm lượng NH¿ được sinh ra của các vi sinh vật
Các số có cùng kỷ tự di kèm thé hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thong kê ở mức œ = 0,01, CV=26.66
3.4 Khảo sát khả năng hòa tan lân trong điều kiện phòng thí nghiệm
Kết quả khảo sát định tính xác định 4/9 VSV có khả năng tạo vòng sáng không màu trên môi trường NBRIP đặc (Hình 3.6). Điều này cho thấy có 04 VSV có khả năng
hòa tan lân khó tan. Những VSV có khả năng tạo vùng sáng trên môi trường NBRIP đặc
được nuôi cấy trên môi trường NBRIP lỏng và khảo sát lượng P2Os tạo ra sau 07 ngày.
A: CCFN 1.1; B: DNH3; C: DHT3; D: DXT1; E: DC
Kết qua sau 07 ngày nuôi cay hàm lượng PzOs tạo ra dao động từ 104.99 pgP/mL đến 245,34 gP/mL (Hình 3.7). Trong đó, dat giá trị cao nhất là DNH3 (245,34 ugP/mL) và thấp nhất là DXT1 (104,99 ugP/mL). Kết quả nay tương tự với nghiên cứu của Kumar
(2008) khi phân lập Enterobacter sp. trong môi trường pH = 7 có khả năng hòa tan lân
khó tan 229 pg/mL, theo Chen (2006) tùy thuộc vào môi trường pH vi khuẩn hòa tan lân khó tan giao dong từ 31,5 ug/mL đến 898 ug/mL và theo báo cáo của Nguyễn Thị
Thu Hà va Cao Ngọc Điệp (2008) khi phân lập nội sinh trong cây cỏ trên môi trường
LGI kha năng hòa tan lân tốt nhất với lượng lân hòa tan là 283,33utg/mL sau 10 ngày
nuôi cây.
300,00
245,34a 250,00
200,00
=z= Oe 122,53 ab
= 108,89 ab 104,99b
100,00
50,00 i
0,00
CCFN 1.1 ĐNH3 ĐHT3 ĐXT1
Tên vi sinh vật
Hình 3.7 Kết quả khảo sát hòa tan lân khó tan của các vi sinh vật
Các số có cùng ký tự di kèn thể hiện sự khác biệt không có ÿ nghĩa thống kê ở mức œ = 0,01, CV=33.66
3.5 Khảo sát khả năng sinh tống hợp Siderophore
Theo Hình 3.8 cho thấy sau 72 giờ nhỏ dịch nuôi cấy, có 04 VSV có khả năng
tạo vòng halo màu vàng trên môi trường CAS-blu agar là DHT3, DXT1, CCFN 1.1 va
ĐNH3. Theo mô ta về đặc tính vi sinh vật sinh siderophore của Schwyn và ctv (1987),
các vi sinh vật sinh siderophore sẽ có màu vàng cam, cam trên môi trường CAS. Như
vậy có 4/9 VSV có khả năng sinh siderophore, 04 vi sinh vật này tiếp tục được nuôi cấy dé xác định lượng siderophore sinh ra.
A: DHT3; B: ĐXT1; C: CCFN 1.1; D: DNH3; E: Đối chứng
Dé xác định lượng siderophore do các vi sinh vật tạo ra, 04 vi sinh vật có khả
năng tạo vòng halo được nuôi trong môi trường LB lỏng trong 48 giờ và được xử lý.
Hàm lượng siderophore (percent siderophore unit _ psu) do vi sinh vật tạo ra được thé
hiện qua Hình 3.9.
45,000 42,357a
40,000 36,447 a
35,000 32,160 a 32,280 a
30,000
= 25,000
2)
# 20,000
15,000
10,000
5,000
0,000
CCFN1.1 ĐNH3 ĐHT3 ĐXT1 Tên vi sinh vật
Hình 3.9 Hàm lượng siderophore được sinh ra của các vi sinh vật
Các số có cùng ký tự di kèm thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở múc a = 0,01; CV=14.67
Hình 3.9 cho thấy hàm lượng siderophore của các vi sinh vật sau 48 giờ nuôi cấy dao động từ 32,160 psu đến 42,357 psu. Hàm lượng siderophore được sinh ra không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của Nguyễn Đắc Khoa (2022) hàm lượng siderophore của vi khuan Serratia nematodiphia
CT-78 tạo ra sau 48 giờ là 48,19 psu.
Hệ số A/A: của CCFN 1.1 là 0.576 thuộc vi sinh vật có khả năng sản xuất siderophore cao (hệ số Az/A; là 0.4 - 0.6), còn lai ĐNH3 (0.677), ĐHT3 (0.636) và DXT1 (0.677) thuộc sản xuất siderophore trung bình (hệ số A⁄A; là 0.6 - 0.8) (Chen va ctv,
2010). Theo Neilands (1984), có sự tương quan giữa sự tăng trưởng của VSV và hàm
lượng siderophore. Hàm lượng siderophore thấp ở phase lũy thừa và đạt mức tối đa khi tiến gần đến phase ồn định ở mật số tế bào 108— 10° CFU/mL (Alexander và Zuberer, 1991). Như vậy hàm lượng siderophore có thể biến thiên tùy theo mật số của vi sinh vật
trong môi trường.
3.5 Khảo sát khả năng tạo nano bạc của các vi sinh vật trong điều kiện phòng
thí nghiệm
Vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường LB lỏng trong 24 giờ. Sau đó dịch nuôi cấy được ly tâm, thu dich nổi và b6 sung AgNO3 ImM đề xác định kha năng tạo
nano bạc của vi khuẩn. Theo Malarkodi (2013) và Adan (2018), nếu vi khuẩn có kha năng tao nano bạc thi sau khi bổ sung AgNos thì dung dịch sẽ chuyên sang màu nâu sam hay màu nâu cam. Tuy nhiên, kết quả sau bồ sung AgNo; vào dich nổi sau nuôi cấy các vi sinh vật đều không tạo thành màu nâu hay có sự chuyển màu của môi trường. (Hình 3.10)
A 5
Hình 3.10 Vi sinh vật sau khi bổ sung AgNo ở ngày thứ 07 A: Đối chứng; B: Mẫu thí nghiệm
Môi trường dinh dưỡng LB (A) và dịch nổi sau nuôi cấy vi sinh vật (B) ở thời điểm 07 ngày sau khi bổ sung AgNO3. Sau 7 ngày bồ sung AgNOs, môi trường dinh dưỡng LB và dịch nổi sau nuôi cấy của các vi sinh vật được do quang phổ UV-Vis với dãy phố từ 300 - 700 nm. Kết quả đo được trình bày ở Hình 3.11.
0.87)
14 e®00ren AORTA
Hình 3.11 Kết quả khảo sát nano bạc trên máy quang phé UV Vis
Hình 3.11 cho thay khi quét phổ UV-Vis ở day sóng 300 — 700 nm thì các mẫu môi trường LB bé sung AgNO3 ImM ở thời điểm 07 ngày (A) và các mẫu dịch lọc sau nuôi cấy vi khuẩn bé sung AgNO; 1mM ở thời điểm 07 ngày (B) đều không tạo thành peak ở dãy sóng 380 — 450 nm. Theo Adan (2018), nếu dung dich có khả năng khử AgNO; thành nano bạc (AgNP) thì độ hấp thụ của dung dich sẽ tạo thành peak ở dãy sóng 410 — 450 nm. Như vậy, với phương pháp này vẫn chưa phát hiện được những vi
sinh vat nay có khả năng khử AgNO: thành nano bạc.
2 a 2 v * 2 lệ se A eX on
3.6 Khảo sát khả năng sinh enzyme protease của các vi sinh vat trong điêu kiện phòng thí nghiệm
Kết quả khảo sát định tính khả năng sinh protease của các vi sinh vật trên môi trường Winograndsky I bé sung 1% casein cho thấy có 8/9 vi sinh vật có khả năng tạo
vùng sáng sau 48 giờ ủ. Và 01 vi sinh vật ký hiệu là DHT7 không có khả năng tạo vùng sáng. Như vay, 08 vi sinh vật có khả năng tạo vùng sáng màu được xác định có khả nang phân giải protein khó tan. Những vi sinh vật này được nuôi trong môi trường
Winograndsy I lỏng trong 48 giờ dé xác định hoạt độ enzyme protease được sinh ra.
A: CCEN 1.1; B: ĐNHS; C: ĐNHI; D: DXT6; E: DXT1; F: DNH3; G: CCLD 2.2;
H: ĐHT3; I: DHT7
Kết quả khảo sát cho thấy hoạt độ enzyme protease được sinh ra sau 48 giờ dao động từ 2,261 U/mL đến 9,401 U/mL (Hình 3.13). Trong đó, hoạt độ cao nhất là ĐNHI (9,401 U/mL) và thấp nhất là DHT3 và DNH3 (2,261 U/mL). Kết quả này cao hơn nhiều so với kế quả Nguyễn Hữu Tuyền va ctv (2019) xác định được hoạt độ enzyme protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Bs04 đạt 0,7 U/mL và thấp hơn kết quả quả Phạm Thị Tuyết Ngân và ctv (2021) hàm lượng enzyme protease của vi khuẩn Streptomyces DH3.4 dat 12,4 U/ml. Theo Palsaniya và cộng sự (2012) ham lượng enzyme protease được tạo ra phụ thuộc vào nhiều yếu tổ khác nhau như chủng
vi sinh vật, điêu kiện nuôi cây, môi trường, chat cảm ứng, nhiệt độ pH.
10,000 9,401a
9,043 ab 9,000
8,000
7,021 be 7,000
5,831c 6,000 5,434cd
|
£ 5,000
5 4,000 3,451 de
3,000 2,261e 2,261e
2,000
1,000
0,000
CCFN1.1 DNHS ĐNH1 ĐNH3 CCLD2.2 ĐHT3
Tên vi sinh sett
Hình 3 13 Kết quả khảo sat khả năng sinh enzyme protease của các vi sinh vật
Các số có cùng ký tự di kèm thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ởmức a = 0,01; CV= 12.36
3.7 Khảo sát khả năng tao màng sinh học của các vi sinh vật trong điều kiện
phòng thí nghiệm.
Kết quả Hình 3.14 cho thấy màu tím kết tinh được phát hiện trên thành ống của cả 9 dòng vi sinh vật khảo sát, đồng nghĩa với việc trên thành ống này có vi sinh vật bám. Tuy nhiên, lượng vi sinh vật bám trên thành mỗi ống lại khác nhau. Điều này chứng
tỏ, đa sô các vi sinh vật đêu có khả năng tạo màng sinh học nhưng khả năng tạo màng sinh học của mỗi chủng là khác nhau.
Hình 3.14 Khả năng bám trên thành ống eppendorf của các vi sinh vật
A: DXT1; B: DHT3; C: DNH3; D: CCFN 1.1; E: DNH5; F: DNH7; G: ĐNHI;
H: DXT6; I: CCLD 2.2; J: ĐC
Kha năng tao màng sinh hoc của các chủng vi khuẩn đã phân lập tiếp tục được đánh giá thông qua tỉ lệ giữa giá trị ODsoo của dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi ống eppendorf để đánh giá mật độ vi khuẩn sống tự do trong dung dich nuôi và giá trị ODs70 đánh giá mật độ vi khuẩn tạo màng sinh học bám trên thành trong ống eppendorf. Giá trị ODsoo/ODs;o càng nhỏ, chứng tỏ vi khuẩn có kha năng tạo màng sinh học lớn va ngược lại. Kết quả khảo sát được thé hiện trên Hình 3.16 cho thấy, 09 vi sinh vật có khả năng tạo mang sinh học, tỉ lệ ODsoo/ODs;o dao động từ 0,25 đến 1,897, Trong đó, chủng CCEN 1.1 có thi lệ OD600/ODs70 thấp nhất với giá trị là 0,25 thé hiện khả năng tạo mang sinh học tốt nhất. Giỏ trị ODứoo/ODs;o được xỏc định cũng tương đồng với lớp mang sinh học dày đặc bám trên thành ống eppendorf của chủng CCFN 1.1 được thé hiện ở
Hình 3.14.
Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Hoàng Phương Hà và ctv.
(2013), đã phân lập và tuyển chọn được 02 chủng vi khuẩn từ các mẫu nước thải được
thu thập tai Hà Nội có khả năng tạo mang sinh học lớn là chủng NLI-6 và NLI-7 với gia
trị ODứzo/ODs;o đạt lần lượt là 0,38 và 0,32. Tỏc gia Trần Thị Dao va ctv (2021) cũng đã phân lập được 07 chủng vi khuẩn có tên là B22.5, B22.8, B22.9, B22.10, B22.11, B22.18 và B22.20 có khả năng tạo màng sinh học đạt giá trị lần lượt là: 0,50; 0,57; 0,29;
0,36; 0,18; 0,42; 0,28.