2.1 Nội dung nghiên cứu
Khao sát khả năng đôi kháng của dịch nuôi cây các dòng vi sinh vat dat với với vi khuan Ralstonia solanacearum.
Khao sat khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng của các dòng vi sinh vat đất trong điều kiện phòng thí nghiệm
Khảo sát khả năng kiêm soát mâm bệnh của các dòng vi sinh vật đât trong điêu kiện phòng thí nghiệm
Khao sát khả năng tạo màng sinh học của các vi sinh vật đất trong điêu kiện
phòng thí nghiệm.
2.2 Thời gian và phương pháp nghiên cứu
Đề tài được thực hiện: Từ tháng 08 năm 2022 đến tháng 02 năm 2023.
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, Đại học Nông Lâm TP.HCM.
2.3 Vật liệu thí nghiệm
2.3.1 Đối tượng thí nghiệm
Bảng 2.1: Các vi sinh vật đất được thực hiện trong thí nghiệm.
STT Kí hiệu Chi*
1 CXT3 Ralstonia solanacearum 2 CCFN1.1 Pseudomonas sp.
3 CCLD-2.2 Actinobacteria 4 DXT1 Pseudomonas sp.
3 DXT6 Bacillus sp.
6 DHT3 Pseudomonas sp.
7 DHT7 Pseudomonas sp.
8 DNH1 Bacillus sp.
9 DNH3 Pseudomonas sp.
10 DNH5 Bacillus sp.
*: định danh bang đặc điểm sinh hóa
2.3.2 Dụng cụ, thiết bị máy móc
Dụng cụ: dia petri (15 x 90 mm), ống eppendorf (1000 pl), bình tam giác, ống nghiệm (18 x 180 mm), pipet (GLISON, France), giấy lọc, bông gòn hút nước, thước đo, que cấy, ống đong,....
Thiết bị nghiên cứu: Tủ cấy khử trùng (2AC2 — 6E8, Esco, Singapore), lò Microweve, máy đo pH (SI Analytics, Germany), máy do EC (SI Analytics, Germany), nồi hap vô trùng autoclave, kính hiển vi (CX23, Olympus, Japan), tủ sấy khử trùng (MC40L, ALP, Japan), may lac (Stuart) va mot số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm.
2.3.3. Thành phan môi trường
Môi trường LB - Luria Broth: thành phan 1 lít peptone 10 g, cao nấm men 5 g, NaCl 10 g, agar 20 g, nước | lít, pH 7,0. Hap khử trùng ở 121°C trong 20 phút.
Môi trường KBA (King'B Agar): Thành phần: Peptone 20 g, Glycerol 10 g, K2HPOs, khan 1,5 g, MgSO¿ .7H2O 1,5 g, Agar 15 g, nước cất 1000 ml. Trộn chung tat cả các thành phần ngoại trừ MgSO¿.. Điều chỉnh pH đến 7.2. Từ từ thêm MgSO và lắp đều. Hấp khử trùng ở 121°C trong 25 phút.
Môi trường LB (Luria Broth) bồ sung L — Trytophan: Bacto — Trytophan 10 g, NaCl 5 g, cao nam men 5 g, L — Trytophan 1 g, nước cất 1000 ml.
Môi trường Cas-Blu Agar: Hòa tan 60,5 mg CAS vào 50 ml nước cat, sau đó thêm 10 ml dung dich sắt (ID, khuấy đều và thêm 40 ml HDTMA (72,9 mg HDTMA và 40 ml nước cat). Khi dùng đem pha loãng dung dịch 10 lần sau đó bổ sung 2% agar rồi đem hấp khử trùng.
Thuốc thử Salkowski R2 (Glickmann và Dessaux, 1995): cân 0,45 g FeCl: cho vào 100 mL acid HaSOx 10,8 M khuấy đều và bảo quản trong chai sậm màu, đặt trong tối.
Đệm phosphate: dung dich A (0,136 g KHzPO¿ trong 100 mL nước cat), dung dịch B (0,174 g K2HPOs trong 100 mL nước cat). Pha dung dich A và B theo tỷ lệ 39 mL A + 61 mL B, thêm nước cất vừa đủ 200 mL, pH =7.
Môi trường NBRIP: 10 g succrose; 0,1 g (NHa4)2SOa; 0,25 g MgSO4.7H20; 0,2 g
KCl; 5 g MgCh.6H20; 5 g Cas(PO¿)s; nước cất vừa đủ 1 lít
Môi trường Winograndsy I: 2 g (NH4)2SOu; 0,5 g MgSOu; 2 g NaCl; 1 g KzHPOau;
0,001 g CaCOs; 0,4 g FeSOu; Agar 15 g; 1 lit nước cất.
2.4 Phương pháp nghiên cứu
Mục Tên thí nghiệm
1 Khả sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy các dòng vi sinh vật đất đối với vi
khuân Ralstonia solanacearum trong phòng thí nghiệm 2 Khảo sát khả năng sinh IAA của các dòng vi sinh vật
3 Khao sát khả năng có định đạm của các dong vi sinh vật
4 Khao sát khả năng phân giải lân của các vi sinh vật
5 Khap sát khả năng sinh hợp chất siderophore của các vi sinh vật
6 Khao sát kha năng tạo nano bạc của các vi sinh vật
7 Khao sát khả năng sinh enzyme protease của các vi sinh vật.
8 Khao sat kha nang tao mang sinh hoc cua cac vi sinh vat.
2.4.1 Khảo sát kha năng đối kháng của dịch nuôi cấy các dòng vi sinh vat dat đối
với vi khuân Ralstonia solanacearum.
Vi khuẩn Ralstonia solanacearum CXT3 từ nguồn vi khuẩn phòng thí nghiệm bộ môn được chọn đề đánh giá tính đối kháng. Tính đối kháng của các dòng vi sinh vật đất được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi sinh vật đất với vi khuẩn bệnh. Dịch nuôi cấy vi sinh vật đối kháng có khả năng khuếch tán trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn bệnh. Dịch nuôi cấy vi sinh vật đối kháng được vi khuẩn bệnh sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với mỗi dòng vi sinh vật là một nghiệm thức và mỗi NT là | đĩa petri, mỗi NT với 3 LLL.
Cách tiến hành
Thí nghiệm được bố trí theo tiêu chuẩn ngành TCVN 9300:2014
Vị khuân
Dùng micropipet vô trùng hút 6 pl từ huyền phù vi khuẩn ®. solanacearum cây vào đĩa petri chứa 20 mL môi trường KBA đã chuẩn bị sẵn.
Dùng que cấy tam giác vô trùng chang đều cho đến khi dịch vi khuẩn thấm hoàn toàn trên bề mặt thạch. Chú ý không dé dịch vi khuẩn dính vào thành đĩa petri. Đợi 20 - 30 phút cho bề mặt thạch khô, dùng ống thép vô trùng đường kính khoảng 5 mm khoan 4 lỗ thạch, loại bỏ phần thạch vừa khoan. Lưu ý dùng que cấy vô trùng có mũi nhọn tách và gạt nhẹ nhàng thỏi thạch, tránh làm vỡ hoặc chạm vào bề mặt thạch xung quanh lỗ đục.
Dùng pipet vô trùng hút 6 wl nước cất vào lỗ khoan ở trung tâm dé đối chứng, 3 lỗ khoan còn lại hút 6 ul dịch vi sinh vật đối kháng đã được ly tâm tốc độ 14.000 vòng/phút trong 15 phút đưa vào mỗi lỗ khoan, giữ ở điều kiện nhiệt phòng trong thời gian 24 giờ. Sau khi cấy tránh di chuyên đĩa petri. Khi dịch khuẩn khô lại có thé di chuyên nhưng cần nhẹ nhàng.
Nước cât
Dịch nuôi cấy
VSV
R. solanacearum
Hình 2.1 Bồ trí dich chiết vi khuẩn đối kháng vi khuan Ralstonia solanacearum trên
đĩa petri theo phương pháp cây khuêch tán giêng thạch Theo dỗi chỉ tiêu:
Hoạt tính đối kháng của dịch nuôi cấy vi sinh vật đối kháng được thé hiện thông qua vòng vô khuẩn sau 1, 2 ngày sau cấy được biểu thị bằng công thức:
Kích thước vòng vô khuẩn (mm) = (D1+D2+D3)/3-d
Trong đó:
DI, D2, D3 là đường kính tương ứng của 3 vòng vô khuan trên 1 dia petri (mm) d là đường kính vòng cấy vi sinh vật có ích (mm)
ằ Tớnh khỏng khuan được biộu hiện khi vũng vụ khuẩn > 2 mm + Kích thước vòng vô khuân < 5 mm: tính kháng yếu
+ Kích thước vòng vô khuẩn từ 5 đến 10 mm: tính kháng trung bình + Kích thước vòng vô khuẩn > 10 mm: tính kháng mạnh
2.4.2 Khao sat khả năng sinh IAA
Phuong phap thi nghiém
Thi nghiệm được bô trí theo kiêu hoàn toàn ngau nhiên với môi vi sinh vật là một
nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 LLL.
Đánh giá định lượng khả năng sinh LAA
Khả năng tổng hop IAA của vi sinh vật được xác định bằng thuốc thử Salkowski, sự kết hợp của IAA với Fe** và H' trong thuốc thử sẽ tạo thành phức tris - (indole — 3 - aceto) iron (III) Fe[(CsHứN)CHaCOO]› cú màu hồng hoặc đỏ. Nồng độ IAA được ghi nhận khi đo độ hấp thu quang phô của dung dich ở bước sóng 530 nm (Gordon và Weber,
1951; Kamnev và ctv, 2001).
Dựng đường chuẩn IAA
Cân 0,001 g IAA tinh khiết hòa tan 10 ml dung dịch đệm phosphate được nồng độ là 100 pg/ml. Pha loãng ra các nồng độ 0; 2,5; 5; 10; 15; 20; 30; 40 pg/ml. Lay 1,5 ml thuốc thử salkowski R2 cho vào 8 ống nghiệm chứa 1,5 ml dung dich IAA ở các nồng độ pha loãng trên. Tiến hành vortex các ống nghiệm va để trong tối khoảng 25 phút để phan ứng màu xảy ra, nồng độ [AA càng cao thì màu hồng càng đậm, sau đó tiến hành đo quang phố OD ở bước sóng 530 nm.
Cách thực hiện:
Vi khuẩn ở mật số 105 CFU/ml được nuôi trong môi trường LB lỏng có bé sung thêm trytophan ở nồng độ 0,1 g/l, đặt trên máy lắc ở nhiệt độ phòng và dé ở điều kiện tối dé IAA sinh ra không bị phân hủy. Khảo sát khả năng sinh IAA của vi khuẩn ở thời điểm 02 ngày sau khi chủng. Hút 2 ml dịch nuôi vi khuẩn ở mỗi thời điểm ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút dé loại bỏ tế bào. Hút 1,5 ml phan dịch trong phía trên cho vào các ống nghiệm, sau đó bé sung thêm 1,5 ml thuốc thử Salkowski R2, trộn đều dung dịch. Hỗn hợp dé 6n định ở nhiệt độ phòng trong 25 phút trong điều kiện tối dé phản ứng tạo màu xảy ra. Mẫu đối chứng là môi trường LB có bổ sung trytophan ở nồng độ 0,1 g/l và thuốc thử Salkowski R2.
Đọc kết quả: Hàm lượng IAA được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang ở
bước sóng 530 nm.
2.4.3. Khảo sát khả năng cố định đạm
Khả năng cô định dam thông qua lượng NH¿” được tao ra bởi các vi sinh vật sẽ phản ứng với phenol tạo ra indolphenol trong môi trường kiềm có màu xanh khi có mặt
hypochloride.
Phương pháp thí nghiệm
Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với mỗi vi sinh vật là một nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 LLL.
Xây dựng đường chuẩn NH+*
Sáu ống nghiệm được đánh số theo thứ tự từ 0 đến 5 với ống 0 là đối chứng âm, lần lược thêm các thành phan trong Bảng 2.1 vào ống nghiệm:
Bang 2.1 Thanh phần đường chuan NH¿”
, i Ong nghiém
Hoa chat 0 i 2 3 FT 5 Nước cat (ml) 5 4 3 2 1 0 DD NH¡' chuẩn (ml) 0 1 2 3 4 5
DD phenol - sodium nitroprusside 2 2 2 2 2 2 DD EDTA (ml) 1 1 1 1 1 1 DD Sodium hypochloride 4 4 4 4 4 4
Cách thực hiện
Cho 2 ml huyền phù vi khuẩn vào ống eppendorf, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Hút 1 ml dịch vi khuẩn đã được ly tâm cho vào ống nghiệm và lần lược cho vào các thành phần sau: 4 ml nước cất, 2 ml dung dich phenol — sodium nitroprusside, 1 ml EDTA, 4 ml dung dich sodium hypochlorite. Tiến hành khuấy các ống nghiệm trên máy khuấy va dé ổn định khoảng 15 — 20 phút trong điều kiện tối ở
nhiệt độ 30°C cho phản ứng màu xảy ra.
Đọc kết quả: Hàm lượng NH," được xác định bằng phương pháp so sánh màu ở bước sóng 636 nm trên quang phổ kế (Page, 1982).
2.4.4. Khảo sát khả năng phân giải lan
Phương pháp thí nghiệm
Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi vi sinh vật là một nghiệm thức, mõi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
2.4.4.1 Dinh tính khả năng hòa tan lân
Vi sinh vật được cay trên môi trường chứa lân khó tan (NBRIP) (Nautiyal, 1999) đặc và được ủ ở 30°C. Quan sát khả năng tạo vùng sáng màu quanh khuẩn lạc trên môi trường NBRIP do vi sinh vật sử dung nguồn lân khó tan (Cas(PO¿)a). Sau đó tiến hành
xác định khả năng hòa tan lân khó tan trên môi trường NBRIP lỏng.
2.4.4.2 Định lượng khả năng hòa tan lân
Xây dựng đường chuẩn lân
Dung dịch lân chuẩn được chuẩn bị bằng cách cho 1,757 g KH¿PO¿ vào 1 lít nước cất và khuấy bang bằng đũa thủy tinh cho tan hết đề tao dung địch có nồng độ 400 pg/ml.
pha loãng dung dịch trên dé tao dung dich lân chuẩn có nồng độ 4 ug/ml. chuẩn bị 6 ống nghiệm được bé sung các thành phan sau:
Bảng 2.2 Thành phần đường chuẩn khảo sát khả năng phân giải lân
: Ậ Ong nghiệm
Hóa chât 0 i 2 3 Ầ 5 Nước khử ion (ml) 5 4 3 2 1 0 Dung dịch lân (ml) 0 1 2 3 4 5 Dung dich B (ml) 1 1 1 1 1 1 Hàm lượng P (ug/ml) 0 0,8 1,6 2,4 3,2 4
Cách thực hiện
Dung dich huyền phù vi khuẩn được chủng vào bình tam giác có chứa 30 ml môi trường NBRIP lỏng, mẫu đối chứng không có vi khuẩn, lắc mẫu 120 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Hút 2 ml dịch huyền phù vi khuẩn cho vào ống eppendorf, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, hút 1 ml phan dịch bên trên và lần lượt cho vào các thành phan sau: 4 ml nước khử ion, 1 ml dung dich B. Sau đó các ống nghiệm được vortex và dé ôn định khoảng 15 - 20 phút ở nhiệt độ 30°C. Tiến hành đo hàm lượng lân bằng
phương pháp so màu ở 882 nm.
2.4.5 Khả năng tạo hợp chất Siderophore
Kha năng sinh siderophore của vi khuẩn được xác định bang cách sử dụng phức hợp thuốc nhuộm sắt - chrome azurol S (CAS) có màu xanh. Do siderophore có ái lực với sắt cao hơn thuốc nhuộm nên siderophore lấy sắt trong phức hợp thuốc nhuộm dẫn đến sự thay đổi màu của thuốc nhuộm từ màu xanh sang màu cam, tím (Schwyn và
Neilands, 1987).
Phương pháp thí nghiệm:
Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với mỗi vi sinh vật là một nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 LLL.
Tiến hành thí nghiệm:
2.4.5.1 Thí nghiệm định tính siderophore
Siderophore được tạo ra bởi các vi sinh vật được xác định theo phương pháp SD-
CASA (A Simple double-playerd Chrome Azurol S Agar) của Hu và Xu (2011). Chuan
bị môi trường CAS-blue agar [60,5 mg CAS hòa tan trong 50 ml nước, sau đó thêm 10
mL dung dich sat (II) (1 mM FeCl:.6H2O, 10 mM HCI)]. Khuấy đều và thêm 40 ml HDTMA (72,9 mg HDTMA + 40 ml H20). Khi dùng thi dem hỗn hợp pha loãng 10 lần sau đó bổ sung thêm 2% agar rồi dem khử trùng ở 121°C, 1 atm trong 20 phút.
Môi trường CAS-blue agar được đồ vào dia petri một lớp mỏng (khoảng 10 mL) trước, sau 10 phút cho agar đông lại, đồ thêm một lớp thật mỏng môi trường LB (khoảng 6 mL). Vi sinh vật được nuôi tăng sinh trong môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở
30°C trong 24 giờ. Dùng micropipette hút 3 yl dịch vi sinh vật trên nhỏ lên đĩa petri đã
chuẩn bị như trên (3 giot/dia) và ủ trong điều kiện tối.
Chỉ tiêu theo dõi:
Quan sát vòng halo màu vàng quanh khuẩn lạc của vi sinh vật từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 4 sau khi nhỏ dịch vi sinh vật vào đĩa petri. Vi sinh vật có khả năng tạo vòng halo vàng chứng tỏ có khả năng sinh hợp chất siderophore, những vi sinh vật có khả năng tạo siderophore sẽ tiếp tục thực hiện định lượng. Đối chứng thực hiện với điều kiện tương tự nhưng không nhỏ vi khuẩn vào dia petri.
2.4.5.2 Thí nghiệm định lượng siderophore
Siderophore do các vi sinh vật sinh ra được định lượng theo theo phương pháp
của Ghosh va ctv (2015). Chuẩn bị dung dich CAS: 9,1 mg CAS (chrome Azurol S) hòa tan trong 7,5 ml nước, sau đó thêm 1,5 mL dung dịch sắt (IID (1 mM FeCls.6H20, 10
mM HCl). Khuấy đều và thêm 6 ml HDTMA 10 mM (21,9 mg HDTMA + 6 ml H20).
Hỗn hợp trên được bổ sung nước cho đủ 100 mL và chỉnh pH = 5,6. Trước khi thực hiện thí nghiệm thì bổ sung 87,3 mg sulfosalicylic acid vào dung dịch trên và chỉnh pH = 5,6.
Vi sinh vật đã được nuôi cấy trên môi trường LB trong 48 giờ được chủng vào môi trường LB lỏng với mật số 107 CFU/mL va ủ trong điều kiện lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở 30°C trong 60 giờ. Sau 48 giờ, dịch nuôi cấy vi sinh vật được được ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch nỗi. Sau đó, 1,5 mL dịch nỗi được trộn với 1,5 mL dung dich CAS và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 630 nm so với đối chứng bao gồm 0,5 mL môi trường LB nhưng không chủng vi sinh vật và 0,5 mL dung dịch CAS. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và hàm lượng siderophore trong dịch nỗi được tính bằng cách sử dụng công thức sau:
% Don vị Siderophore (psu)=(Az- As) / Ar x 100
Trong đó:
A:: Độ hap thụ của đối chứng ở bước sóng 630 nm (thuốc thử CAS) As: Độ hap thụ của mẫu ở bước sóng 630 nm
2.4.6 Khảo sát khả năng tao nano bac
Sinh tông hợp nano bạc được thực hiện thông qua các phản ứng oxy hóa — khử bởi các enzym của vi sinh vật. Nếu vi sinh vật có khả năng tổng hợp nano bạc thì dịch lọc sau nuôi cấy vi sinh vật được bố sung dung dịch AgNO; sẽ chuyên từ không mau sang màu nâu. Sự khử ion bạc thành nano bạc được xác định bằng phương pháp quang phổ với máy quang phố UV Vis chùm tia kép với dai phổ từ 400 nm đến 600 nm và
quan sát các peak đặc trưng cho nano bạc ở bước sóng từ 410 - 440 nm. Đặc tính của
nano bạc được xác định thông qua kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy TEM) hay kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron
Microscopy SEM) (Malarkodi, 2013; Adan, 2018; Barkhade, 2018).
Phương pháp thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi vi sinh vat là một nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
Cách thực hiện
Khả năng tạo nano bạc các vi sinh vật được xác định theo phương pháp của Malarkodi (2013). Vi sinh vật được nuôi trên môi trường LB được chủng vào bình tam
giác 100 mL chứa 50 mL môi trường LB lỏng ủ ở 35°C trong 24 giờ. Sau đó lay 5 mL dịch nuôi cấy vi sinh vật chủng sang bình tam giác chứa 45 mL môi trường LB lỏng tiếp tục ủ ở 35°C trong 24 giờ. Dịch vi khuẩn được ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong
10 phút thu dịch nổi. Dịch nổi được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ là 0,22 pm.
Bồ sung 5 mL dung địch AgNO3 10 mM vào 45 mL dịch nổi sau lọc dé đạt nồng độ AgNO; trong hỗn hợp là 1 mM. Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trong 7 ngày trong điều kiện tối. Quan sát sự thay đổi màu sắc của dung dịch sau 1 — 7 ngày b6 sung AgNO; so với mẫu đối chứng. Nếu vi khuẩn có khả năng tạo nano bạc thì
màu dung dịch sẽ chuyên sang màu nâu sâm hay màu nâu cam.
Sự khử ion bạc thành nano bạc ở thời điểm 7 ngày sau khi bé sung AgNO: được xác định bằng phương pháp quang phổ với máy quang phô UV Vis chùm tia kép với dai phổ từ 300 nm đến 700 nm và quan sát các speak đặc trưng cho nano bạc ở bước sóng
từ 400 — 430 nm.
2.4.7 Khảo sat khả nang sinh enzyme protease
Phương pháp thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi vi sinh vật là một nghiệm thức, mõi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.