Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Khảo sát quá trình nhân sinh khối cấp II và tạo dạng chế phẩm của vi khuẩn Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans phòng trừ bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà

TÓM TẮTĐề tài nghiên cứu “Khảo sát quá trình nhân sinh khối cấp II và tạo dạng chếphẩm của vi khuẩn Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans phòng trừ bệnh lở cỗ rễ trên cây họ cà” đã đư

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

2 2 2 2K 2 2K 2k

KHOA LUAN TOT NGHIEP

KHẢO SAT QUÁ TRÌNH NHÂN SINH KHOI CAP II VÀ TAO

DANG CHE PHAM CUA VI KHUAN Bacillus subtilis VA

Pantoea agglomerans PHONG TRU BENH LO CO RE

TREN CAY HOCA

SINH VIÊN THỰC HIỆN : NGUYEN QUANG HIENNGÀNH : BẢO VỆ THỰC VẬTKHÓA : 2019 — 2023

Thành phó Hồ Chí Minh, tháng 8/2023

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN SINH KHÓI CÁP II VÀ TẠO

DẠNG CHE PHAM CUA VI KHUAN Bacillus subtilis VA

Pantoea agglomerans | PHONG TRU BENH LO CO RE

TREN CÂY HO CÀ

Tac gia

NGUYEN QUANG HIEN

Khoá luận được dé trình dé đáp ứng yêu cầucấp bằng kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật

LỜI CẢM ƠN

Con xin khắc ghi công ơn sinh thành, dưỡng dục của cha mẹ Cảm ơn cha mẹ

và những người thân trong gia đình đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con, là nguồnđộng lực to lớn dé con có thé vượt qua mọi khó khăn, vấp ngã va có được như ngày

hôm nay.

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô cùng Ban lãnh đạo của Khoa Nông họcTrường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho em

trong suốt quá trình em thực hiện đề tài

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Võ Thị Ngọc Hà vàThS Pham Kim Huyén đã tận tinh hướng dan, truyền đạt cho em nhiều kiến thứcchuyên môn và nhiều kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình thực hiện khoá luận

Cảm ơn bạn Nguyễn Thị Kim Ngân và bạn Hồ Ngọc Như Tiền là cộng sự, là

người luôn đồng hành và giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài Tôi

xin gửi lời cảm ơn đến bạn Trương Thị Ngọc Hân, bạn Huỳnh Thường Vương và các

bạn tại phòng thí nghiệm bệnh cây của Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Trường Đại học

Nông Lâm Thành phó Hồ Chi Minh đã luôn hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận

Gửi lời cảm ơn déén tập thể lớp DH19BV đã đồng hành với tôi trong 4 nămhọc tập và nghiên cứu ở Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Trân trọng cảm ơn!

Thành phố Hồ Chi Minh, thang 8 năm 2023

Sinh viênaeNguyễn Quang Hiển

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Khảo sát quá trình nhân sinh khối cấp II và tạo dạng chếphẩm của vi khuẩn Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans phòng trừ bệnh lở cỗ

rễ trên cây họ cà” đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật —

Khoa Nông học, Trường đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh từ tháng 2/2023 đếntháng 8/2023 Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá điều kiện nhân sinh khối cấp II tối ưu vàtạo dạng chế phẩm của vi khuan Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoeaagglomerans chủng O — BT 1.2 phòng trừ bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà

Khao sát điều kiện tăng sinh khối và tuyên chọn nguyên liệu làm chất mang tạochế phâm dạng bột được bồ trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại Đánh giá khả năngđối kháng của chế phẩm được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 15 nghiệm thức,

14 nghiệm thức chế phẩm với 7 chế phâm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis chủng

KT - DDI và 7 chế phẩm chứa vi khuan Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 và

1 nghiệm thức đối chứng nắm bệnh

Đề tài đã xác định được điều kiện nhân sinh khối cấp II tốt nhất của vi khuẩnBacillus subtilis chủng KT — ĐDI trên môi trường cám gạo kết hợp mật ri đường, nhiệt

độ 35°C; pH = 6,5; trong thời gian 36 giờ và vi khuan Pantoea agglomerans chủng

O —BT 1.2 trên môi trường LB; nhiệt độ 30°C; pH = 7, trong thời gian 36 giờ Trong các

loại chất mang khảo sát, cám kết hợp bột tale có khả năng duy trì mật số vi khuẩn cao khiphối trộn dòng vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomeranschủng O — BT 1.2 sau 28 ngày tồn trữ Trong điều kiện phòng thí nghiệm ở thời điểm 28ngày sau tồn trữ, chế phâm cám kết hợp bột tale chứa vi khuẩn Bacillus subtilis chủng

KT - ĐDI duy trì khả năng đối khang nam Rhizoctonia bicornis chủng ODT02 với hiệusuất đối kháng cao nhất là 64,83%, chế phẩm cám kết hợp bột tale chứa vi khuẩnPantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 duy trì khả năng đối kháng nam Fusariumoxysporum chủng KTDT0I và Pythium vexans chủng KTDT22 với hiệu suất đốikháng cao nhất lần lượt là 62,50% và 58,06%

MỤC LỤC

Trang Trang tua 1 S ÔỎ 1 LEGG (ee ii

TT HH Se 1H

Ll GöecneeeaneseeinitiotoietiETGSGGBSSGITSESG31SSBGISGSSSSISEGBSBERBSSEGEONGIHGSUNSGESESUEEHESGSSSSSSSSESSSSSGIGMEE989ND3588 IV Danh sách các bảng, 2-5-5522 2222 2 HH HH H22 2 re Vill P16 Ji lá 0 ix

Damth sach chit vit tat x

Đặt vấn AG occ eccccseeeccsssssseeessssseesssssssvecesssssvesssssssvessssssseesesssuvessessssesssssueseseessseveceessseeeseesseeeeeseeee 1

MUC tu 00011 HỶŸỶỔÂ4 2

0 8 2C0 TP 5Chương 1 TÔNG QUAN TAT TTB essctscssssacsssameiisnccsnisinasnsannciaon insscninssaimsnanasassaaiosnien 31.1 Giới thiệu tong quan về cây họ cà -2 ©2CV222222222EEEEEEE222222222222222222222222222 2e 31.2 Tổng quan bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà -22222222EEEEEEEEEEEE222222222222222222222222226 4

1.2.1 Tac nln án 0 ,Ô 4

12.2 Triếu:chững bên eres ese enercierereeme ee eee 4

1.2.3 Rhizoctonia bicornis gây bệnh lở cô rễ -2222222¿¿2zzzscSEEEEEEEEEvvvceeeeccee 41.2.3.1 Đặc điểm của nắm Rhizoctonia bi€OfHiiS 2 ©225s+2C2++2EEEE2SEEEEE222EEEE222112222EEeccee 41.2.3.2 Điều kiện phát triển và gây hại -222222222222+2222222E22E222222222222 rrrrrrrrrrrrre 51.2.3.3 Sự lan truyền và xâm nhiễm của nam Rjizocfowia bicoris cccc22 51.2.4 Fusarium oxysporum gây bệnh lở cỗ rễ 0222222222 61.2.4.1 Đặc điểm của nắm Fusarium OXJSDOTIMHH -2255-222222222222222222222 2222212222222,06 61.2.4.2 Điều kiện phát triển và gây hại -2222222222222222222222222222222122222222.222222222222,1ee 71.2.4.3 Sự lan truyền và xâm nhiễm của nắm Fusariwm OXJSDOFun -52 7

1.2.5 Pythium vexans gây bệnh lở cô rễ -22222 2222222 2EEEEEEEEEErrrrrrrrrrrrrrrerrree 7

1.2.5.1 Đặc điểm của nắm Py this V€Xđf1 -22222222222222222222222222222111122 2122211 ce 71.2.5.2 Điều kiện gây hại và phổ kí chủ -22222222EEEEE2222+222EEEEEE222ztttEEEEErrrccee 8

1.3 Tổng quan về vi khuẩn đối kháng -2222222+++£+922EEEEEEEEEEE222222errrrrrrtEEEEErrrrre §

1.3.1 Vi khuan Bacillus SUBtHLS 5 NNM 8

1.3.1.1 Đặc điểm của vi khuân Bacillus svbtilis cccccccccssscssssesssseessssesssssseessssesssssesssssseesessveees 8 1.3.1.2 Tính đối kháng của vi khuẩn Bacillus subfilis -2222222222Z55222222222222cccccccce+ 9 1.3.1.3 Nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subfilis -222222<-55522222225552 9 1.3.2 Vi khuẩn Pantoea aggÏOifief'đW15 2222222222222222222222222222EEEEE22222222222222222222222222e 11 1.3.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn Pantoed 4g8ÏOIi€rđW4 -2222222222222222222zzzttttccccccre 11 1.3.2.2 Nghiên cứu ứng dụng của vi khuân Pantoea đg8ÏOI6f'4W -©ccc22 11 1.4 Tổng quan về khả năng tăng sinh khối của vi sinh vật -+ 13

1.4.1 Môi trường và thời gian nuôi cấy -222222++++++22222EEEEEEEEE22 2 errrrrrrrrrrrrrrk 13 I ho ÔỎ 14 1.4.3 pH MmOi tung 177 14

dices ee | 14 1.5.1 Chat mang áo .ẽ-ậẬÃ , 14

1.5.2 Các nghiên cứu san xuất chế phẩm vi sinh 222222222222z+z+ttt2EErrrr 16 Chương 2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

VAN) (00:01 ,ÔỎ 18 NO ee Cell Ol oi e112 1 Ee | ann 18 QS Vt HEU thí WIS csc ressscesssavcesseseeeseaneeseaseacsneresnecemsemaenensaeereneensrsmeneremsemeeemeneenees 18 2.3.1 Dụng cụ, thiết bị máy MOC o cccccssscssssseeeeseeeescescsscesssssnineeeeeeseseeseessessssisnnteeseeeeeeeeeeee 18 De 2 MITE,HCUDHIGHREUE.sssssse6S1sz6685016066616.01040560306438053G36-81143516383:3360-<8A2GRBGSE8:G8:3G8041824148.1280038 19 ? 9⁄0 /§‹n oi j1 18 ố.ẻ., 19

2.3.2.2 Mẫu nam Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum và Pythium vevaws 19

2.3.3 MGi trrdng Va hOa 88 19

VÀ 39ì0)(90.580)0 1950134015000) 1 21

2.4.1 Đánh giá khả năng nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT —- ĐDI va Pantoea aggliomerans chẳng O— BT LỄ iiiiiiieieiiraeee 21 2.4.1.1 Khao sát môi trường và thời gian nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuân Bacillus subtilis chung KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 21

2.4.1.2 Khảo sát điều kiện nhiệt độ nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis

chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 -c-c-c 22

2.4.1.3 Khao sát điều kiện pH nhân sinh khói cấp II thích hop của vi khuẩn Bacillus subtilis

chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 - 22

2.4.2 Khảo sát nguyên liệu lam chất mang tạo chế pham dang bột chứa vi khuẩn Bacillus

subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 23

2.4.3 Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuân Bacillus subtilis chủng KT —DD1 và Pantoeaagglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế pham sau thời gian tồn trữ với nắm gây bệnh lở cô

rễ trong điều kiện phòng thí nghiệm -VVVVEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrrrrrrrrrrrrrrrrrre 25

2.4.3.1 Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuan Bacillus subtilis chủng KT — DD1 và

Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế phẩm sau thời gian tồn trữ với nam

Rhizoctonia bicornis chủng OI'T2 ©7<57-5-+c+cc+zesrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrree 25

2.4.3.2 Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI va

Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế pham sau thời gian tồn trữ với namFusarium oxysporum chủng KTDT01 2- 5-5-5522, 2H 26

2.4.3.3 Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuan Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và

Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế phẩm sau thời gian tồn trữ với namPyihiumvexsans chime TT T2: sxscsssszssssssessoinssl0AGGSSSRGGSISSIGRGSGQGSidlgaSG8EONG6833880ãA 26

2.5 Phương pháp xử lý số liệu -2222222EVEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrrrrrvrrrrrrrrrre 27Chương 3 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN 222222222EEE22222222222222222222222222ee 28

3.1 Kết quả đánh giá khả năng tăng sinh khối cấp II của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng

KT—- ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 -© ©5<-5S2 28

3.1.1 Kết quả khảo sát môi trường và thời gian tăng sinh khối của vi khuân Bacillus subtilis

chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 -++ 28

3.1.2 Kết quả khảo sát điều kiện nhiệt độ tăng sinh khối của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng

KT- ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BY 1.2 -c-cc-ccccceccrcee 30

3.1.3 Kết quả khảo sát pH tăng sinh khối của vi khuẩn chủng KT — ĐDI và Pantoea

agglomerans chủng O — ĐT 1.2 sscsssssssssexssussssensesecssssessessnsssazsvasssapaunareansstsanrssseansssseeriseanseapeests 31

3.2 Kết quả khảo sát nguyên liệu làm chat mang tạo chế pham dang bột chứa vi khuan Bacillus

subtilis chủng KT— ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 33

3.3 Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của vi khuân Bacillus subtilis chủng KT - ĐDI vaPantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế pham sau thời gian tồn trữ với nam gâybệnh lở cô rễ trong điều kiện phòng thí nghiệm -2222z++++zz+t£2t2zrr+ 36

3.3.1 Kha năng đối kháng của vi khuân Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea

agglomerans chủng O — BT 1.2 sau thời gian tồn trữ với nam Rhizoctonia bicornis

DHÚHID: G) 0) ee ce ee ec ee 618 36

3.3.2 Khả năng đối khang của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea

agglomerans chủng O — BT 1.2 sau thời gian tồn trữ với nam Fusarium oxysporumching qua 38

3.3.3 Khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pamoeaagglomerans chủng O — BT 1.2 sau thời gian tồn trữ với nam Pythium vexans

Ủng 65p 3 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO ©©2222222£222EEEEEE2222EEE22221222222222221112222222222222e 46

OO RE EEOUEOAESSESE 54

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 3.1 Mật độ quang (ODøø) của vi khuan B subtilis chủng KT — ĐDI khi tăng sinh khốitrong 5 loại môi trường tại các thời điểm ở nhiệt độ phòng (28 + 29C) 29Bang 3.2 Mật độ quang (ODø) của vi khuân P agglomerans chủng O — BT 1.2 khi tăng sinhkhối trong 5 loại môi trường tại các thời điểm ở nhiệt độ phòng (28 + 2°C) 30Bảng 3.3 Mật độ quang (ODs0o) của vi khuẩn B subtilis và P agglomerans khi tăng sinh khối

ở các mức nhiệt độ khác nhau 2-22-2252 225252 S2S£E£S£E£E£E£E£E+E£E£E££££££££E£E£EzEzEzErxzerrree 31

Bang 3.4 Mật độ quang (ODsø) ở các mức pH của vi khuan B subtilis chủng KT — ĐDI và

P deglomerans ching O BY 1: ssssssssessssssnsgistiinibsatndikssdisllsg1318344081ã353100810216339161343060080 52

Bang 3.5 Mật độ quang (OD600) của vi khuẩn B subtilis chủng KT — ĐDI trong chế phẩm

tại thời điểm 7, 14 và 28 ngày sau tồn trữ 222222+2+2222222E2222222222222222 2222Errrrk 34

Bảng 3.6 Mật độ quang (ODsoo) của vi khuân P agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chếphẩm tại thời điểm 7, 14 va 28 ngày sau tồn trữ -2 ©VCEE2222+2+222E2222222222222222222e 35Bảng 3.7 Bán kính tản nam và hiệu suất đối khang của vi khuan B subtilis chủng KT —DD1

và P agglomerans chủng O — BT 1.2 sau tồn trữ với nam R bicornis chủng ODT 02 trong

PHÒNG Thị HG HH TT uesnensenaiieoisendsiiaoiiietiddgsGSL140LG3351459S8P4SHSESSGESEESMSEHDSSGRGEGSEDIESHESBELEEEGEELESHR 37

Bảng 3.8 Bán kính tản nam và hiệu suất đối kháng của vi khuẩn B subtilis chủng KT —ĐDI

và P agglomerans chủng O — BT 1.2 sau tồn trữ với nam F oxysporum chủng KTDT 01 trong

j8/22/02/71/83/301122 PS CC CC ee errs 40

Bảng 3.9 Bán kính tan nam và hiệu suất đối khang của vi khuan B subtilis chủng KT —DD1

và P agglomerans chủng O — BT 1.2 sau tồn trữ với nam Pythium vexans chủng KTDT 22

IWoriBiiplitier.tHiiffdhiHCTTs:z:scccttcccccgceccEiititzcrpoistiiktzsespsivcgiicszecvetsxsositstgizcEgiriSdaEEissoiioisssee 4

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Chu kì của nắm Öj/zoefonia Sp -©22222222222222222zzzztttEEEEEEEErrrrrrreeeccee bìHình 2.1 Vi khuẩn B subtilis chủng KT — ĐDI và P agglomerans chủng O — BT 1.2 19Hình 2.2 Mẫu nam 2 bicornis chủng ODT 1.2, F oxysporum chủng KTDT 01 và P vexans

cola) totes 00 DA 19

Hình 2.3 Môi trường nhân sinh khói cấp lI -2222EEEEE2222222222++z+zttttEEEErr+ 21Hình 2.4 Chế phâm chất mang sau khi trộn -vvvvvvvvvvvvcv+ 24Hình 2.5 Bồ trí chế phẩm chứa vi khuẩn đối khang với nam trên đĩa petri 25Hình 3.1 Kha năng đối kháng của chế phâm đối với nam Rhizoctonia bicornis chủng ODT 02theo trình tự từ mạnh đến yếu (thời điểm 28 NSTT) -2222EEE222222zz+2222222ze+ 38Hình 3.2 Kha năng đối kháng chế phẩm đối với nam Fusarium oxysporum chủng KTDT 01

theo trình tự từ mạnh đến yếu (thời điểm 28 NSTT) -2222222++z2++ttt2rrrzzz+ 4I

Hình 3.3 Khả năng đối kháng của chế phẩm đối với nam Pythium vexans chủng KTDT 22theo trình tự từ mạnh đến yếu (thời điểm 28 NSTT) -22222222222222222222rrrrx 44

DANH SACH CHU VIET TAT

Ban kinh tan nam

Carboxymethylcellulose

Cộng tác viên

Food and Agriculture Organization

(Tổ chức Luong thực va Nông nghiệp của Liên hợp quốc)Hiệu suất đối kháng

Môi trường Luria Broth

Lần lặp lại

Ngày sau tồn trữ

Môi trường Potato Glucose Agar Trách nhiệm hữu han

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Cây họ cà (Solanaceae) xuất hiện hầu hết các lục địa, bao gồm nhiều loài quantrọng trên thé giới như khoai tây, cà chua, cà tím, ớt (Olmstead và ctv, 2008) Cây họ ca

không chỉ được biết đến là rau hay cây lương thực, làm cảnh, chúng còn chứa nhiều loại

alkaloid rất có ý nghĩa về mặt khoa học (Shah và ctv, 2013) Theo Samuels (2015), cókhoảng 28 triệu ha cây họ cà được gieo trồng (chủ yếu là khoai tây, cà chua, ca tim và

ớt chuông), sản xuất ra khoảng 540 triệu tan, mang lai mot nguồn lợi lớn cho nền kinh

tế Tại Việt Nam, các cây họ cà được trồng ở tỉnh Lâm Đồng với hơn 13.000 ha (Thống

kê của Chi cục TT&BVTV tỉnh Lâm Đồng) Tuy nhiên, việc sản xuất còn gặp nhiều hạnchế, một trong những nguyên nhân chính là do ảnh hưởng của các loại bệnh hại Trêncây họ cà, nắm và vi khuẩn gây hại làm xuất hiện nhiều bệnh như héo xanh, Sương mai,

thán thư, héo rũ Do tính chất thâm canh qua nhiều năm, tại các vùng sản xuất nông

nghiệp Việt Nam, sự tích lũy, lan truyền của các tác nhân gây bệnh trong nước tưới, câygiống không sạch bệnh và khí hậu nhiệt đới là những yếu tố tạo điều kiện thuận lợi cho

sự phát triển của bệnh lở cô rễ, gây ra bởi các loại nam có pho ký chủ rộng như

Pythium sp., Rhizoctonia sp., Fusarium sp (Burgess va ctv, 2009).

Biện pháp phòng trừ sinh hoc dựa trên sự van dung các tương tác của vi sinh vật

với nhau, để phát huy vai trò của vi sinh vật có lợi có khả năng kiểm soát các tác nhângây bệnh thông qua các cơ chế như tiết kháng sinh hay gián tiếp kích thích tính khángbệnh cây trồng đề ức chế sự phát triển của mầm bệnh, đây là hướng phát triển bền vững

trong sản xuất nông nghiệp trong tương lai do những ưu điểm của chúng như thân thiện

và an toàn với môi trường (Silva và ctv, 2004) Những vi sinh vật đối kháng có thể lànắm, vi khuân, chủ yếu là vi khuẩn sống quanh rễ cây, có thể có khả năng kích thíchtăng trưởng cây trồng, xâm nhiễm vào rễ cây và sống nội sinh trong thân, lá và các bộ

phận khác của cây (Compant và ctv, 2005).

Nhằm hướng đến việc sử dụng các vi khuẩn đối kháng vào thực tế trong việcphòng trừ bệnh lở cổ rễ thì điều kiện môi trường, thời gian, nhiệt độ và pH là các yếu tôảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Các chất mang đóng vai trò rất

quan trọng trong việc tồn trữ vi khuẩn giúp duy trì hiệu qua ứng dụng khi sử dụng ở điềukiện nhà lưới và ngoài đồng.

Xuất phát từ những thực tế trên, đề tài “Khảo sát quá trình nhân sinh khốicấp II và tạo dạng chế phẩm của vi khuẩn Bacillus subtilis và Pantoea agglomeransphòng trừ bệnh lở cỗ rễ trên cây họ cà” được thực hiện

Mục tiêu

Đánh giá điều kiện nhân sinh khối cấp II tối ưu và tạo dạng chế phẩm của vi

khuân Bacillus subtilis chủng KT — DD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2

phòng trừ bệnh lở cô rễ trên cây họ cà

Yêu cầu

Tìm ra môi trường, thời gian, nhiệt độ và pH tối ưu để nhân sinh khối cấp II của

vi khuan Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2

Đánh giá mật độ và khả năng đối kháng của chế phẩm dang bột chứa vi khuẩn

Bacillus subtilis chung KT — ĐDT và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 sau thời

gian 7, 14 và 28 ngày tồn trữ

Giới hạn đề tài

Đề tài được thực hiện trên 3 mẫu nam Rhizoctonia bicornis chủng ODT02,

Fusarium oxysporum chủng KTDT01 và Pythium vexans chủng KTDT22 gây bệnh lở

cô rề trên cây họ cà.

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu tong quan về cây họ cà

Cây họ cà có tên danh pháp khoa học là Solanaceae, là một loại thực vật có hoa.

Tên khoa học của họ này có nguồn gốc từ tiếng Latinh Solanum, nghĩa là “cây cà dược”

Ở Việt Nam, họ cà gồm các cây thân thảo hoặc cây nhỏ, phân bố rộng khắp cảnước Một số loài được trồng dùng làm thực phẩm (cà tím, cà pháo, cà chua, khoai tây),

gia vị (ớt), cây công nghiệp (thuốc lá) hoặc cây dược liệu

Cây cà chua có tên khoa học là Solanum lycopersicum L., thuộc họ cà

(Solanaceae) có nguồn gốc từ Nam Mỹ Theo Somraj và ctv (2017), cà chua là một loạicây rau quan trọng, phô biến và được trồng rộng rãi khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ởcác vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới Theo tổ chức nông lương thé giới (FAO),năm 2020 diện tích trồng cà chua trên thế giới vào khoảng là 5.051.983 ha, với sản lượng186.821.216 tan Là cây rau có giá trị, có san lượng chiếm 1/6 tông sản lượng rau hàng

năm trên thê giới và luôn đứng ở vi trí sô 1 về sản lượng.

Cây khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum L thuộc họ cà (Solanaceae)

có nguồn gốc ở vùng cao nguyên thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ Khoai tây được trồnglâu đời ở Nam Mỹ và được đưa vào châu Âu từ thế kỉ 16 Ở nước ta, khoai tây được dunhập vào từ người Pháp từ đầu thế kỉ 19 Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO), năm

2020 diện tích trồng khoai tây trên thế giới vào khoảng 16.494.810 ha với sản lượng

359.071.403 tan

Cây ớt (Capsicum annuum L.) có nguồn gốc nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Mỹ

Ở nước ta, cây ớt được du nhập từ Trung Quốc, An Độ Theo tô chức nông lương thégiới (FAO) cây ớt được xem là cây trồng quan trọng của vùng nhiệt đới Năm 2020, diệntích trồng ớt thế giới vào khoảng 2.069.990 ha với sản lượng 36 136.996 tan

1.2 Tổng quan bệnh lở cỗ rễ trên cây họ cà

Một sô triệu chứng bệnh lở cô rê đôi với cây ho cà như: chết rạp cây con, thôi rê,

thối gốc, thối thân, thối quả

Chết Tạp cây con: cây con có thể bị hại trước hoặc sau khi mọc khỏi mặt đất.

Trước khi nay mầm, bệnh gây chết đỉnh sinh trưởng Sau khi nảy mam, nam gây ra cácvết bệnh màu nâu đậm, nâu đỏ hoặc hơi đen ở gốc cây sát mặt đất, phần thân non bị thắtlại, trở nên mềm, cây con bị đỗ gục và chết (Đã Tấn Dũng, 2013)

Cây lớn cũng bị hại nhưng chủ yếu chỉ bị hại ở phần vỏ Bệnh có thê xuất hiện

gây hại ở cả cây trưởng thành gây hiện tượng thối rễ hoặc thối gốc thân khi điều kiệnngoại cảnh thích hợp cho nam phát triển

Ở gốc cây, triệu chứng ban đầu là vết lõm màu nâu hoặc hơi nâu đỏ sát mặt đất,

vết bệnh có thê lan rộng quanh gốc thân và lan xuống rễ, gốc thân bị lở loét Bệnh chủ

yếu gây hại ở phần cổ rễ, phần gốc sát mặt đất Khi mới xuất hiện, nếu quan sát kỹ có

thê thấy những vết bệnh có màu khác với vỏ cây, phần vỏ này bị rộp lên, sau đó lan dầnbao quanh toàn bộ phần cô rễ hoặc gốc cây Dần dần phần vỏ này khô teo lại, khi gặp

trời mưa hoặc độ âm cao sẽ bị thối nhũn, bong ra, cây sẽ héo dần và chết (Võ thị Thu

Oanh, 2007).

1.2.3 Rhizoctonia bicornis gây bệnh lở cỗ rễ

1.2.3.1 Đặc điểm của nắm Rhizoctonia bicornis

Theo Đỗ Tan Dũng (2013), nam R bicornis có đặc điểm chung là: tản nắm phát

triển ban đầu có màu vàng nâu, nâu vàng nhạt, về sau chuyển sang nâu sam R bicornis

có 3 loại sợi nam: sợi nam bò (runner hyphae), sợi nam phân nhánh (lobate hyphae) va

các tế bào dạng chuỗi (moniloid cells)

Nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự phát triển của nam, nhiệt độ tối thích với sự pháttriển của nắm là 28 — 31°C Trong phòng thí nghiệm, nam R bicornis có thé mọc tốt trênmôi trường PDA Ở môi trường PDA nam sinh trưởng rất nhanh, sau 3 ngày nuôi cấy,

đường kính tản nam lên đến 8,12 cm (Võ Thị Dung và ctv, 2017)

1.2.3.2 Điều kiện phát triển và gây hại

Nhiệt độ cho sự xâm nhiễm của nắm có thể xảy ra là 23°C — 25°C, nhưng tối hảo

nhất là 30°C — 32°C, âm độ từ 96 — 97% Ở 32°C nắm xâm nhiễm trong vòng 18 giờ(Võ Thanh Hoàng, 1993) Ở nhiệt độ thấp dưới 10°C và cao hơn 38°C sợi nam ngừngphát triển Hach nam có thé chịu ngập trong 96 giờ mà không giảm sức sống nếu nhưgiữ khô từ 24 — 168 giờ sau khi ngập (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tè, 1998)

Nhiệt độ và độ âm là điều kiện cho bệnh phát triển và lây lan, biên độ nhiệt ngày

đêm lên cao cũng có lợi cho bệnh phát triển Theo Võ Thanh Hoàng (1993), bệnh xảy

ra nặng ở ruộng bón nhiều phân đạm Bón phân lân cao cũng làm tăng bệnh, trong khibón nhiều kali sẽ giảm bệnh Natri có đặc tính ức chế sự phát triển của nắm Do đó, vùng

bị nhiễm mặn có hàm lượng natri trong dat cao, ít bị bệnh hơn so với vùng nước ngọt

đất và vận chuyên hạt giống (Kareem và Hassan, 2018) Nắm có khả năng lan truyềntheo 2 chiều: đứng hoặc ngang Lan truyền theo chiều đứng chủ yếu là sợi nam, vết bệnhphát triển dần lên lá, chồi và các bộ phận khác Bệnh lan truyền theo chiều ngang từ nơi

này sang nơi khác bằng hạch nam va sợi nam, sự lan truyền chủ yếu nhờ dòng nước,

hạch nắm bị nước cuốn đi gặp kí chủ thích hợp sẽ bám vào hay do nước mưa (Tô Thị

Thùy Hương, 1993).

Ẩ

1.2.4 Fusarium oxysporum gây bệnh lở cỗ rễ

1.2.4.1 Đặc điểm của nam Fusarium oxysporum

F oxysporum thuộc lớp nam bat toàn (Deuteromycetes), có khả năng gây nhiềuloại bệnh trên những cây trồng khác nhau Chúng hoại sinh hoặc ký sinh trên nhiều cây

trồng, cây ăn trái và rau, là nguyên nhân chính làm héo rũ Hệ sợi nam lan tỏa khắp mô

mạch và lấp kín mạch gỗ, sự lấp mạch gỗ sẽ cản trở quá trình vận chuyên nước làm héo

cây.

Hệ sợi nắm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nam thường không mau, chuyền maunâu khi già Hệ sợi nam sản sinh độc tố tiết vào hệ mach gây héo cây chủ Cơ thé dinhdưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, vách ngăn có lỗ thủng đơn giản ở giữa

Trong một tê bao có một nhân hoặc nhiêu nhân, vách tê bao bang chitin, glucan.

E oxysporum có thê tồn tại trong đất dưới dang bào tử áo qua thời gian dài, bào

tử áo có thé lưu ton trong đất từ 15 — 20 ngày Nhiệt độ thích hợp cho nam phát triển là

25°C — 30°C Bệnh lây lan qua thân rễ, đất bị nhiễm bệnh và truyền qua giống, ngoài

bệnh có thé lây lan qua nguồn nước và cơ giới F oxysporum thường tan công cây trồng

dễ dàng khi bị thiếu ánh sáng

EF oxysporum phát trién nhanh chóng trên môi trường PDA ở nhiệt độ 25°C vàhình thành tản nấm có hình thé tơi xốp như bông hoặc bằng phẳng hoặc lan rộng trênmôi trường nuôi cấy Mặt trên của tản nam có thé có màu trắng, kem, vàng, vàng cam,

đỏ, tím hồng hoặc tím Mặt dưới nó có thé không màu, vàng cam, màu đỏ, màu tía sam,

hay mau nau (Seifert, 1996).

1.2.4.2 Điều kiện phát triển và gây hại

Phân bố khắp nơi trên thế giới, nhiệt độ tối ưu cho F oxysporum phát triển là

27°C — 30°C, tối đa là 36°C — 40°C và tối thiểu là 7°C — 8°C, nhưng nhiệt độ thích hợp

cho sự xâm nhiễm là 35°C (Ou, 1985)

F oxysporum sông phô bién trong đất, lưu tồn dưới dang bao tử áo hoặc khuẩn

ty sông trên xác bã thực vật dư thừa hay những chất hữu cơ Một số loài tạo bào

tử đính bay trong không khí, đây là nguyên nhân gây ra những bệnh trên thân, lá và bông

(Burgess va ctv, 1994).

Các tác nhân gây bệnh héo F oxysporum cũng có thé có mặt ở vỏ rễ một số câykhông phải là ký chủ, kể cả cỏ dai va cây trồng Bao tử hậu hình thành trong vỏ

rễ khi cây chết F oxysporum tan công chủ yếu vào bộ rễ Đặc biệt, bệnh gây hai nặng

nề trong điều kiện stress nước, dùng phân bón quá nhiều hay rễ cây bị ton thương

1.2.4.3 Sự lan truyền và xâm nhiễm của nam Fusarium oxysporum

Sợi nắm và bào tử vô tính nảy mầm trong tàn dư cây bệnh và đất xâm nhiễm vào

rễ con còn non và lan dan vào các mach xylem Nam bệnh sau đó sẽ phát triển trong

mạch xylem và lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân Quá trình này gây phản ứng củacây, tạo ra các hợp chất phenol và thé san có màu nâu Những hợp chất này gây hiện

tượng hóa nâu của mạch dẫn, một dau hiéu dé nhan thay cua bénh héo khi cat ngang

than Hién tuong tac mach xylem làm giảm lượng nước di chuyền lên cây, khiến cho

cây bệnh bị héo rồi chết (Burgess và ctv, 2009)

1.2.5 Pythium vexans gây bệnh lở cỗ rễ

1.2.5.1 Đặc điểm của nắm Pythium vexans

Pythium vexans thuộc lớp Oomycetes, lớp nam này có những đặc trưng về hìnhthái và chu kỳ sống gần giống nắm thực Tuy nhiên chúng được phân biệt rõ ràng với

nam thực bởi di truyền học và cơ chế sinh sản của chúng (Erwin và ctv, 1996) Chúngsinh sản ra các sợi nam không vách ngăn, một đặc điểm chính dé phân biệt chúng vớicác nam chỉ khác Đặc điểm của lớp nắm Oomycetes là sinh các du động bao tử qua sinh

sản vô tính và sinh bào tử noãn thông qua sinh sản hữu tính (Võ Thị Thu Oanh, 2007).

Phần lớn Pythium vexans song trong đất, một vài loài liên quan tới nam rễ, hiệnđiện trong nước như những thực vật hoại sinh và một số loài sống ký sinh trên thực vậthay động vật sống dưới nước Pythium vexans hiện diện thông thường trong đất canh

tác hơn là đất tự nhiên, nhất là cây con trong vườn ươm mat hay vườn ươm rau Pythium

sp có phổ ký chủ rộng, có loài gây hại trên nhiều loại cây trồng và cũng có loài chi gây

hại trên một loại ký chủ như Pythium busimaninae (Plaats va Niterink, 1981).

Hon 330 loài Pythium đã được xác định, cho đến nay trong đó có nhiều loài gâybệnh cho cây trồng Những loại nam giả này gây ra nhiều bệnh cho cây trồng, bao gồmbệnh chết cây, thối rễ, thối cô rễ, thối mềm và thối thân trong các hệ thống sản xuất khác

nhau như vườn ươm, nhà kính và ruộng nông nghiệp (Sharma và ctv, 2020).

1.2.5.2 Điều kiện gây hại va pho kí chủ

Pythium vexans chủ yêu ảnh hưởng đến các mô còn non, chưa phát triển bất kỳlớp bảo vệ nào, sự lây nhiễm chỉ giới hạn ở hạt giống, cây con và rễ non Cây con sau

khi bị nhiễm bệnh thường đi kèm với các triệu chứng như giảm sinh trưởng, ngâm nước,

héo, đổi màu đen hoặc nâu và thối rễ Ở những cây trưởng thành hơn cây phát triển còi

cọc và rễ chuyền mau nâu là phô biến (Nawaz và ctv, 2016)

1.3 Tống quan về vi khuẩn đối kháng

Vi sinh vật đối kháng là những vi sinh vật có khả năng ức chế được sự phát triểncủa các tác nhân gây bệnh bằng nhiều cơ chế như: tiết chất kháng sinh, tiết enzymephân hủy vách tế bào hoặc cạnh tranh thức ăn và nơi ở với vi sinh vật gây bệnh

(Nelson, 2004).

Các vi khuẩn vùng rễ là những nhân tố tiềm năng dé kiểm soát tác nhân gây bệnhtrên cây trồng, Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans đã được chứng minh trong việc

kiểm soát bệnh do nắm (Joseph và ctv, 2012)

1.3.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

1.3.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis

B subtilis có hình thái đa dang bao gồm: Hình cau, hình trụ, elip, phố biến làhình que Vi khuẩn Gram dương có khả năng di chuyền nhờ tiêm mao Kích thước cơ

thé từ 1,0 — 1,2 pm x 3,0 — 5,0 um (Gordon và ctv, 1973) Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng

trưởng của B subtilis từ 28°C — 30°C, pH khoảng 5,5 — 8,5 B subtilis có khả năng sinh

bào tử, nhờ đó có thể tồn tại trong thời gian dài dưới các điều kiện khác nhau (Vos và

ctv, 2009) Qua kính hién vi, B subtilis đơn lẻ có hình dang như chiếc que, có bao nhay

(giác mạc) cấu tạo bởi polypeptit (Trần Thị Thu Hiền, 2010)

Khi phát triển trong môi trường lỏng, chúng thường làm đục môi trường Khuẩnlạc của các vi khuẩn thuộc chi Bacillus thường có mau trắng sữa hoặc không màu, hìnhthái và kích thước rất thay đôi giữa và trong loài, tùy thuộc nhiều vào thành phần dưỡngchat của môi trường và điều kiện phát triển khác Khuan lạc của B subtilis có dangkhông đều, đường kính 2 — 4 mm, mặt khuẩn lạc nhày hoặc như lớp màng, thường trởnên nhăn, cứng khi khô, ria khuẩn lạc thay đồi từ dang gon sóng, dang tia (Logan và De

Vos, 2009).

1.3.1.2 Tinh đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bào tử của B subtilis sản xuất kháng sinh là các peptit có trọng lượng phân tử

thấp Các peptit thé hiện một phổ hoạt động sinh học rộng bao gồm các hoạt động kháng

nam, kháng khuẩn, kháng virus (Emmert va ctv, 2004) B subtilis được chứng minh làsản sinh kháng sinh hoặc enzyme, với hơn 60 dạng chất kháng sinh khác nhau đã được

xác định (Compant và ctv, 2005).

Theo Intana va ctv (2008), nhiều kết quả nguyên cứu cho thấy B subtilis có khảnăng sản xuất một lượng lớn các chất kháng sinh như: gramicidin S, polymyxin,

tyrotricidin, bacilysin, chlotetaine, iturin A, mycobacillin, fungistatin và subsporin có

thé kiểm soát các bệnh cây trồng

1.3.1.3 Nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus spp đã được thử nghiệm trên một loạt các loại cây trồng khác nhau vàđược xác định rất có triển vọng về khả năng phòng trừ sinh học, cũng như kích thích sựtăng trưởng của cây, được xem như là tác nhân an toàn và tiềm năng cao trong

phòng trừ sinh học bệnh hại cây trồng (Mishra và Kumar, 2012) B subtilis và

B amyloliquefaciens có hiệu quả phòng trừ sinh học đối với nguồn bệnh có nguồn gốc

từ đất hoặc bệnh sau thu hoạch (Kotan và ctv, 2009)

Theo nghiên cứu của Broadbent và ctv (1977), ghi nhận B subtilis A13 có khả

năng kiểm soát bệnh do Sclerotium rolfsii và cải thiện sự phát triển của nhiều loài thựcvật Khi sử dụng B subtilis A13 dé xử lý hạt giống, nhận thấy làm tăng năng suất của

cà rốt 48%, yến mạch 33% và đậu phộng lên đến 37% B subtilis A13 được sử dụng décải thiện sự phát triển của cây trồng như sản xuất auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sựtăng trưởng và phát triển của đậu tương và ức chế các tác nhân gây bệnh có thể cũngbang cách kích thích tăng trưởng thực vật (Weller, 1988) Vi khuân B subtilis được ghinhận là có kha năng sản xuất lipopeptide hoạt động chống lại Xanthomonas campestris

pv campestris (Monteiro và ctv, 2005).

Theo các nghiên cứu cua Davey va ctv (2000), Kokare va ctv (2009),

B subtilis có kha năng sinh trưởng tạo mang sinh vat (biofilm) Thi nghiệm với rễ câyArabidopsis cho thay việc sử dung chủng B subtilis 6051 có hoạt tinh tao biofilm đồngthời tổng hop surfactin làm tăng kha năng hap thu của rễ cây Việc có mặt của surfactintrong biofilm còn ức chế sự phát triển của Salmonella enterica ở nồng độ

50 ug/ml, E coli và Proteus mirabilis ở mức cao hơn trong điều kiện in vitro Chat

surfactin từ chủng B subtilis có tác dụng cao hơn cả iturin A trong việc khang lại các

nam gây bệnh thực vật va nắm sinh độc tố aflatoxin Một số sản phẩm thương mại như

surfactin, serenade được tông hợp từ B subtilis có khả năng diệt các vi khuẩn gây bệnh

thực vật như Erwinia, Pseudomonas hay Xanthomonas trong công trình công bố của

Bais va ctv (2004).

Một số nguyên cứu trong nước về ứng dụng của Bacillus sp trong phòng trừ sinh

học bệnh cây trồng: B amyloliquefaciens có hiệu quả đối với bệnh thối củ gừng do vi

khuẩn R solanacearum (Trần Văn Nhã, 2011) Vi khuẩn B subtilis có hiệu quả kiểmsoát bệnh vàng lá thối củ gừng do nam Fusarium spp (Trần Thị Thúy Ái, 2011) Chế

phẩm từ vi khuẩn B subtilis phòng trừ bệnh hại cây trồng như nắm Rhizoctonia solani,Fusarium sp., Pyricularia oryzae (Kumar và ctv, 2017) Thuốc sinh học từ B subtilisphòng trừ nhiều loại bệnh như sương mai hại nho va cà chua; phan trắng, dém vàng haidưa chuột; thán thư hại xoài; đạo ôn, lem lép hạt lúa; héo vàng, chết cây con lạc (N guyén

Manh Chinh, 2010).

Theo nghiên cứu của Jagir va ctv (2018), vi khuân B subtilis chủng B44 được

phát hiện là nguồn tiềm năng hoạt tính sinh học có thể được thực hiện cho hoạt động đối

kháng của nó đối với nắm F oxysporum hiệu lực 35,9% Ngoài ra, nó có thé thúc daytăng trưởng thực vật kích thích sự phát triển của cây cà chua

Theo Thái Thị Huyền và ctv (2014), vi khuan Bacillus sp chủng S20D12 làmtăng tỉ lệ mọc 10,8% tại thời điểm 2 tuần sau gieo Tất cả các vi khuan lây nhiễm đềulàm tăng chiều cao cây Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuân Bacillus sp chủngS20D12 là vi khuẩn có kha năng kích thích sinh trưởng cây cà chua và hạn chế bệnh hạitốt nhất, đây là chủng tiềm năng trong sử dụng kích thích sinh trưởng và hạn chế bệnh

lở cổ rễ, thối trắng thân cà chua

Theo nghiên cứu cua Solanki và ctv (2012), đã tìm ra 2 chung Bacillus

(B subtilis MB14 và B amyloliquefaciens MB101) được xác định là đối kháng mạnh(thí nghiệm trên nam R solani) giảm tỉ lệ bệnh tương ứng 55,7% và 41,74% có thé được

sử dung dé quan lý bệnh lở cô rễ trên cà chua

1.3.2 Vi khuẩn Pantoea agglomerans

1.3.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn Pantoea agglomerans

Vi khuẩn gram âm không có vỏ bọc, hình que, lông roi, không tao bao tử thuộc

họ Enterobacteriaceae (Tambong, 2019) Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của Pantoeaagglomerans từ 28°C — 30°C, pH từ 2 — 8 tối ưu ở mức pH = 7

Khuan lạc của Pantoea agglomerans có sắc tô màu vàng, dang tròn, nhẫn, viền

phẳng và không đều, đường kính khuẩn lac 1 mm (Leonila và ctv, 2017)

Pantoea agglomerans có khả năng tạo ra các chất kháng sinh (herbicolin,pantocin, microcin, agglomerin, andrimid, phenazine) gây ức chế đối với mầm bệnhtrong đất (Lim và ctv, 2014)

1.3.2.2 Nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn Pantoea agglomerans

Vi khuẩn P agglomerans rat đa dạng, có khả năng thích nghỉ với điều kiện môitrường, được sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học dé chồng lại vi khuẩn và nam gâyhại cây trồng (Volksch và ctv, 2009)

Theo Sammer và ctv (2012), vi khuẩn P agglomerans chủng PA48B tạo ra khángsinh peptide phổ rộng 2 — amino — 3 (oxirane — 2, 3 — dicarboxamido) — propanoyl —valine có tac dụng ức chế E amylovora gây bệnh cháy lá hại lê và táo Theo nghiên cứucủa Vanneste va ctv (2002), cho thấy P agglomerans có hiệu quả kiểm soát bênh mốctrang gây hai kiwi và thuốc lá do nam Ascomycete, Sclerotinia và Sclerotiorum gây ra.

P agglomerans có hiệu quả ức chế sự phat triển của vi khuẩn Peptobacterium

atrosepticum gây bệnh xi mũ khoai tây (Sturz và Matheson, 1996) Theo nghiên cứu của

Hsieh và ctv (2005), đã ghi nhận xử ly hạt giống bằng P agglomerans giúp kiểm soátbệnh héo rủ đậu do vi khuân Curtobacterium flaccumfaciens pv flaccumfaciens gây ra.Theo Sadik và ctv (2013), P agglomerans chủng 2066 — 7 là tác nhân kiểm soát sinhhọc chống lại các bệnh do vi khuẩn P marginis, P ananatis, P viridiflava va

X retroflexus gây ra Ngoài ra, P agglomerans được ghi nhận có hiệu quả trong việc

ức chế sự phát triển của vi khuân Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa

(Hsieh và Buddenhagen, 1974).

Theo các kết quả nghiên cứu cho thay vi khuẩn P agglomerans có hiệu qua ức

chế các loại nam: Fusarium culmorum gây bệnh thôi gốc lúa mì và nam Pucciniarecondita f sp tritici gây bệnh gi sắt lúa mì (Kempf và ctv, 1989); Fusarium oxysporum,

Fusarium avenaceum va Fusarium gibbosum gay bệnh ở thực vat (Romanenko và

Alimov, 2000); Magnaporthe grisea nam gây bệnh đạo ôn trên lúa va Cladosporiumcucumerinum gây bệnh ghẻ trên bau bi, dưa chuột (Adetuyi, 1990); Rhizoctonia solani

gây bệnh trên lúa (Rosales va ctv, 1993); Colletotrichum musae và Lasiodiplodia gay

bệnh thối ngọn chuối (Gunasinghe va ctv, 2004); Colletotrichum orbiculare nam gây

bệnh than thư trên dưa chuột (Zhang va ctv, 1998).

Theo nghiên cứu của Nunes va ctv (2001), đã ghi nhận P agglomerans chủng

CPA —2 có khả năng kiểm soát nắm Botrytis cinerea, Penicillium expansum và Rhizopus

stolonifer gay bệnh sau thu hoạch trên quả lê Chung CPA — 2 khi được xử ly ở nhiệt độ

33°C trong 65 giờ giúp kiểm soát bệnh mốc xanh Penicillium Digitatum trên cây có múi

(Plaza và ctv, 2004).

Theo Zhang và ctv (2014), vi khuẩn P agglomerans chủng XM2 có hiệu quảtrong việc kiểm soát bệnh dém đen do nắm Alternaria alternata sau thu hoạch trên quả

lê Vi khuẩn P agglomerans chủng EPS125 kiểm soát nam gây bệnh thối nâu doMonilinia laxa và bệnh thối mềm do Rhizopus stolonifer trên quả mơ, đào sau thu hoạch

(Bonaterra và ctv, 2003).

1.4 Tổng quan về khả năng tăng sinh khối của vi sinh vật

Hiện nay có nhiều phương pháp chế tạo chế phẩm sinh học như sử dụng dịch

huyền phù tế bào vi khuẩn, dịch chiết nuôi cay vi khuẩn và các chế phẩm dạng bột bao

gồm bào tử vi khuẩn với khối lượng cơ chất ít và tế bào kết hợp bào tử vi khuẩn với tỷ

lệ cơ chất cao Mặc dù với các phương pháp sử dụng khác nhau nhưng cơ chế kích thích

sinh trưởng cây trồng của B subtilis có thể liên quan đến việc hòa tan lân, kích thích

khả năng kháng bệnh và đặc biệt là trực tiếp hạn chế tác nhân gây bệnh (Melo và ctv,

2009).

Đề chế tạo chế phẩm sinh học, việc lựa chọn các yếu tố về điều kiện tăng sinhkhối bao gồm thành phần môi trường, nhiệt độ, pH, thời gian, trong phòng thí nghiệm

trước khi áp dụng vào sản xuất trên quy mô công nghiệp nhằm tiết kiệm chi phí, mang

lại sản phẩm chất lượng tốt cho cả người sản xuất và tiêu dùng

1.4.1 Môi trường và thời gian nuôi cấy

Thành phần môi trường dinh dưỡng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đếnhoạt động sông cũng như khả năng duy trì hoạt tính sinh học của vi sinh vật Theo Okafor(2007), môi trường lỏng thường được sử dụng trong nhân nuôi vi khuẩn Môi trườngcần đáp ứng day đủ yêu cầu đinh dưỡng của vi khuẩn, cũng như các mục đích kỹ thuậtcủa quy tình sản xuất Dinh dưỡng phải được thiết lập sao cho thúc đây hiệu quả nhất

sự tổng hợp sản phẩm

Môi trường cần đáp ứng điều kiện dinh dưỡng sao cho vi khuân rút ngắn đượcgiai đoạn chuẩn bị, sau đó phát triển dé cho sinh khối Trong nghiên cứu, vi khuẩnthường được nhân nuôi môi trường tổng hợp với hóa chất tinh khiết, nhưng trong sảnxuất môi trường có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng Trong sản xuất, cần chú ý chọn

nguồn cung cấp thành phần dinh dưỡng sao cho có chi phí thấp, luôn hữu dụng, có chất

lượng 6n định và thuận lợi cho quá trình xử lý sau nhân nuôi (Dahod va ctv, 2010)

Theo Nguyễn Đức Lượng và ctv (2006), thời gian là yếu tô quan trọng ảnh hưởngđến sinh khối, xác định thời điểm thu sinh khối của vi khuẩn nhiều nhất có ý nghĩa thực

tế trong việc tạo chế phẩm sinh học

1.4.2 Nhiệt độ

Theo Nguyễn Thị Lâm Đoàn (2021), nhiệt độ là một trong những yếu tố then

chốt, tác động trực tiếp đến khả năng sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật Mỗi vi

khuẩn phát triển trong một khoảng nhiệt độ nhất định Nhiệt độ quá thấp một số vi khuẩnkhông phát triển được nhưng van còn sống, ở nhiệt độ quá cao cũng có thé gây chết visinh vật do sự biến tính của các protein và vật chất di truyền

1.4.3 pH môi trường

Bên cạnh yếu tố về môi trường, thời gian và nhiệt độ thì độ pH của môi trườngcũng có tác động rất lớn đến khả năng sinh trưởng của vi sinh vật Trong các thông sốảnh hưởng đến quá trình lên men, pH là một trong các yếu tô quan trọng ảnh hưởng đến

sự sinh trưởng và chuyên hóa của vi khuẩn Theo Pan và ctv (2021), cho thấy mật độ vikhuẩn thấp nhất trong điều kiện pH = 5 và pH = 9; điều kiện nhân sinh tối ưu cho vi

và mục đích sử dụng.

Dựa trên cơ chất nuôi vi khuẩn chế pham vi sinh còn có thé phân thành các loạisau: chế phẩm nhân nuôi trên cơ chất gelatin, dich thé, khô, đông khô và bột Trong đó,chế pham dạng bột được hau hết các nước trên thé giới sản xuất Vì quy trình sản xuấtđơn giản, dé làm, ít tốn kém, giá thành thấp, nguyên liệu có sẵn trong tự nhiên, mật số

vi sinh vật còn hiệu lực trong chế phẩm cao Sinh khối vi sinh vật được chủng vao chấtmang các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ tự nhiên có tác dụng làm nơi cư trú và bảo vệ sinh

vật trong chế phẩm từ khi sản xuất đến khi sử dụng Đặc biệt, dạng chất mang này thíchhợp với những vi khuẩn gram dương có khả năng sinh nội bảo tử trong điều kiện khô

hạn (Nguyễn Xuân Thành, 2003)

Trong chế pham vi sinh bao gồm chất mang và kèm theo một số thành phần khác.Theo Smith (1992), ngoài việc chất mang phải đảm bảo hai tính chất cơ bản là hỗ trợtăng trưởng của vi sinh vật và duy trì mật số mong muốn của các chủng vi sinh vật trongkhoảng thời gian chấp nhận được, thì cần đảm bảo tính khả thi và tính kinh tế khi thựchiện Chất mang phải có khả năng giữ nước cao, không độc với các dòng vi khuẩn chủngvào và an toàn đối với môi trường

Cám là một sản phẩm có giá trị dinh dưỡng khá cao trong quá trình sản xuất gạovới các thành phần chính: protein (6,7 — 17,2%), chất béo (4,7 — 22,6%) và cellulose(6,2 — 26,9%) (Saunders, 1985) Cám được sử dụng làm chất mang dé tạo chế phâm sinhhọc sử dụng vi khuẩn P fluorescens dé phòng trừ bệnh chết cây con trên cây bông vải.Kết quả cho thấy chế phâm sử dụng cám làm chất mang giảm bệnh đến 31,25% sau haitháng tổn trữ (Ardakani va ctv, 2010)

Bột talc: có công thức hóa học MgaS14O¡o(OH)a, còn được gọi là hoạt thạch gồmcác thành phần: MgO (31,7%); SiO› (63,5%); HạO (4,8%) Trong tồn trữ vi khuẩn thì

bột tale được sử dụng như chất mang dé vi khuan bám vào Ngoài vai trò là chất mang,bột talc chứa magie là một loại khoáng giữ vai trò đặc biệt trong ôn định ribosome, màng

tế bao, acid nucleic và can cho hoạt động của các enzyme Do đó có thể xem bột talc là

nguôn khoáng bô sung cho môi trường tôn trữ vi khuân.

Biochar có thành phần chính là hydro, oxy và nguồn carbon phong phú

(70 — 80%) Biochar giúp tăng khả năng giữ chất dinh dưỡng, giảm độ chua của dat,thay đổi hệ thống vi sinh vật cũng như cấu trúc đất tốt hơn Ngoài ra, biochar còn làđược làm vật liệu chất mang rất hiệu quả thay thế cho các vật liệu chất mang khác đã sửdụng phô biến trước đây như than bùn và lignite Cấu trúc biochar có những kẽ hở và lỗhỏng giúp bảo vệ sinh tổn tại trong thời gian dài Các nghiên cứu trước đây cho thấybiochar có hiệu quả giảm tỷ lệ mắc bệnh héo xanh cà chua (Gao và ctv, 2019)

Humic có thành phần gồm C, H, O, N Hàm lượng nguyên tố này khác nhau dựavào loại đất, thành phần hóa học của tàn dư sinh vật, trong điều kiện mùn hóa:

C: 56,2 — 61,9%; H: 3,4 — 4,8%; O: 29,5 — 34,8%; N: 3,5 — 4,7% Humic là thành phầncủa hợp chất mùn chúng có vai trò tạo nên cấu trúc đất tơi xốp, khả năng giữ nước, sựtrao đổi ion và cation và liên quan mật thiết đến quá trình chelate các khoáng chất.

Carboxymethylcellulose (CMC): là dẫn xuất hòa tan cua cellulose, dé bị thủyphân bởi các enzyme cellulose của sinh vật, CMC được dùng để xác định khả năng sảnxuất các enzyme phân hủy cellulose không kết tỉnh của các sinh vật (Paul và Diana,

1993).

Calcrum Carbonate (CaCOs): có hoạt tính làm tăng pH môi trường, do đó trong

các công thức tồn trữ vi khuẩn thường chứa CaCO; dé giúp ổn định pH Ti lệ trộn

CaCO:: chất mang thường là 15:1000 dé ổn định pH ở mức trung tính (Vidhyasekaran

và Muthamilan, 1995; Bharathi và ctv, 2004).

Chitosan là một hợp chất cao phân tử sinh hoc, cấu tạo bởi hàng ngàn gốcGlucosamine, được thủy phân từ chat Chitin có trong vỏ cứng của các loài giáp xác và

côn trùng Nếu thủy phân đến cùng sẽ tạo ra Glucosamine, Chitin, Chitosan và

Oligoglucosamine là những sản phẩm sinh học không độc, có khả năng phân hủy trong

tự nhiên, không gây ô nhiễm môi trường, có hoạt tính sinh học cao, nhóm độc IV, không

độc với người và môi trường.

1.5.2 Các nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh trong và ngoài nước

Theo Huỳnh Văn Nghi (2014), đã nghiên cứu thành công với chế phâm dạng bột

từ dong vi khuẩn B amyloliquefaciens dé phòng trị bệnh hại trên cây ớt Kết qua chothấy, chế phẩm chứa tỷ lệ nội bào tử càng cao sẽ sống sót càng lâu theo thời gian tồntrữ Trong đó, chế phâm chứa 100% nội bào tử vẫn duy trì mật số 8,91x108 CFU/g đến

7 tháng tồn trữ và vẫn còn hiệu lực khi đưa ra thí nghiệm ngoài nhà lưới

Theo nghiên cứu của Đặng Hoài An và ctv (2017), cho kết quả tuyên chọn chatmang tồn trữ vi khuẩn B aerophilus đối kháng với vi khuân Xanthomonas oryzae pv.oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa có khả năng duy trì mật số cao sau 6 tháng tồn trữ Kết

quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Phi Oanh và ctv (2022), cho thấy vi khuẩn Rhodococcus

sp XL6.2 duy tri mật số cao trong 6 tháng khi tồn trữ trong chất mang bột talc

Theo Sallam và ctv (2013), đã nghiên cứu sử dụng chất mang là bột talc và bột

gỗ dé tồn trữ vi khuẩn B subtilis và B cereus đối kháng với F solani gây bệnh thôi dua

đỏ có khả năng duy trì mật số vi khuan cao trong 6 tháng tồn trữ Nghiên cứu của Tehrani

va ctv (2007), tồn trữ B cepari có mật số vi khuẩn cao và vẫn duy trì hiệu lực đối kháng

với nắm R solani sau 6 tháng tồn trữ Vidhyasekaran và Muthamilan (1995), đã sử dung

bột tale dé tồn trữ vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phòng bệnh ở đậu có khả năng

duy tri mật số vi khuan trong 8 tháng tồn trữ

Các chủng vi khuẩn B subtilis B amyloliquefaciens và B pumilus trong chếphẩm bột talc, mun cưa và vỏ trau cho thay kha năng sống sót tốt trong 9 tháng tồn trữ.Đồng thời, khi xử lý các chủng này cho thấy sự tăng cường các hoạt động của cácenzyme liên quan đến phòng vệ như phenyl alanin amonio lyase, peroxidase, chitinase

và a-1,3-glucanase trong lá chè (Chakraborty và ctv, 2013).

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Sương và ctv (2016), đã xác định được

điều kiện nhân sinh khối cấp I của vi khuẩn Bacillus spp chủng B68 va Pseudomonasspp chủng T15 lần lượt trên môi trường LB va King’s B sau 24 giờ nuôi cấy Theo TranTiến Dũng va ctv (2017), đã lựa chọn được môi trường phù hợp với vi khuẩn Bacillus

subiilis chủng SHV 06 và Pseudomonas chlororaphis chủng SHV 2.2 nhân sinh khối

tối ưu trên môi trường AB04, PCOI, trong đó sử dụng mật rỉ đường, cao nam men làmnguồn dinh dưỡng Nghiên cứu của Nguyễn Đắc Khoa va ctv (2017), chất mang bột tale

có khả năng duy trì mật số vi khuân S nematodiphila chủng CT — 78 cao nhất và duy tri

hiệu lực đối kháng sau 6 tháng tôn trữ

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát quá trình nhân sinh khối cấp II của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng

KT - ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2.

Khảo sát nguyên liệu làm chất mang tạo chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn

Bacillus subtilis chung KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2.

Đánh giá khả năng đối kháng của chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn

Bacillus subtilis chủng KT — DD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 sau thời

gian tồn trữ với nắm gây bệnh lở cô rễ trên cây họ cà trong phòng thí nghiệm

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 02 năm 2023 đến tháng 08 năm 2023

Thí nghiệm được tiễn hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa

Nông học, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM.

2.3.2 Vật liệu nghiên cứu

2.3.2.1 Vi khuẩn đối kháng

Nguồn vi khuẩn đối kháng được cung cấp từ phòng thí nghiệm của Bộ môn Bảo

vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Bao gồm: vi khuẩn

Bacillus subtilis chung KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2.

Hình 2.1 Vi khuẩn B subtilis chủng KT - ĐDI (A) và

P agglomerans chủng O — BT 1.2 (B)

2.3.2.2 Mau nam Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum va Pythium vexans

Mẫu nam Rhizoctonia bicornis chủng ODT02, Fusarium oxysporum chủng

KTDT0I và Pythium vexans chủng KTDT22 dùng dé đánh giá khả năng đối kháng đượccung cấp từ Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm

TP.HCM.

Hình 2.2 Mẫu nam R bicornis chủng ODT02 (A), F oxysporum chủng KTDT0I (B)

và P vexans chủng KTDT22 (C)

2.3.3 Môi trường và hóa chất

Hóa chất sử dụng: cồn 70%, cồn 96%, agar, peptone (Trung Quốc), glycerol

(Trung Quốc), NaCl (Trung Quốc), cao nam men (Việt Nam), chitosan (Việt Nam),CaCO: (Trung Quốc), CMC (Japan)

Môi trường tăng sinh khối cấp II

Mật rỉ đường: Công ty TNHH Thiên Thảo Hân Thành phần: sucroza 44%,

glucoza 13%, fructoza 10%, axit amin 3%.

Cám gạo: Công ty TNHH Xây dựng Dich vụ môi trường nguồn sông xanh Thanh

phan: protein, vitamin B6, vitamin E, canxi, đường, chat xơ tiêu hóa được, calori.

Bột bắp: Công ty cô phần bột — thực phâm Tài Ký

Cao nam men: Công ty TNHH ICFood Việt Nam Thành phan: nitrogen > 9%,amino nitrogen > 3%, độ âm < 6%, sodium chloride < 2%, pH 5,3 — 7,2

Biochar: Công ty TNHH xuất khẩu than tự nhiên và than sinh học

Bột talc: Công ty TNHH Sản xuất Thương mại Nguyên Liệu Công Nghiệp MiềnNam (Simico) Thành phan: 60% SiOa, 30% MgO

Humic: được sản xuất và phân phối bởi Công ty TNHH Sản xuất Thương mại

Dịch vụ công nghệ sinh học Abio Việt Nam.

Môi trường PGA — Potato Glucose Agar: Khoai tây 200 g, Agar 20 g, Glucose

20 g, nước cat 1000 mL Hap khử tring ở 121°C

Môi trường LB — Luria Broth: Peptone 10 g, cao nam men 5 g, NaCl 10 g, agar

Môi trường cao nắm men + mật rỉ đường: Mật ri đường 7 g, cao nam men

5 g, nước cất 1000 mL Hấp khử trùng ở 121°C

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Khảo sát khả năng nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillus

subtilis chủng KT — DD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2

2.4.1.1 Khảo sát môi trường và thời gian nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi

khuẩn Bacillus subtilis chủng KT - ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2trong điều kiện phòng thí nghiệm

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên hai yếu tốgồm 2 vi khuẩn Với 5 môi trường (bột bắp + mật rỉ đường, cám gạo + mật rỉ đường,

khoai tây + mật ri đường, cao nắm men + mật ri đường, LB) và 4 mức thời gian (12 gid,

24 giờ, 36 giờ, 48 giờ), 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL là 3 ống nghiệm

Hình 2.3 Môi trường nhân sinh khối cấp II Bột bắp + mật rỉ đường (A),

cám gạo + mật rỉ đường (B), khoai tây + mật rỉ đường (C),

cao nam men + mật ri đường (D), LB (E)

Phương pháp thực hiện: Hút 1 mL dung dịch khuẩn có giá trị ODøoo là 0,3 ởmôi trường nhân sinh khối cấp I vào mỗi ống nghiệm chứa 20 mL dung dịch môi trườngsau đó lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (28 + 2°C) (Nguyễn Thị Ngọc Sương và ctv,

2016)

Chỉ tiêu theo dõi: Do mật độ quang (OD600) tại thời điểm 12 giờ, 24 gid, 36 giờ

và 48 giờ sau khi nhân sinh khối

2.4.1.2 Khảo sát điều kiện nhiệt độ nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn

Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2

Bồ trí thí nghiệm:

Dựa trên thí nghiệm mục 2.4.1.1 chọn môi trường và thời gian tối ưu để khảo sátảnh hưởng của nhiệt độ đến nhân sinh khối của vi khuẩn B subtilis chủng KT — ĐDI và

P agglomerans chủng O — BT 1.2.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố ở 3 mức nhiệt

độ 25°C, 30°C và 35°C với 2 vi khuẩn, 3 lần lặp lại (LLL), mỗi lần lặp lại (LLL) là 3

ông nghiệm.

Phương pháp thực hiện: Hút 1 mL dung dịch khuẩn có giá trị ODøoo là 0,3 ở

môi trường nhân sinh khối cấp I vào mỗi ống nghiệm chứa 20 mL dung dịch môi trường

tối ưu ở mục 2.4.1.1 lần lượt đối với dòng vi khuẩn B subtilis chủng KT - ĐDI và P

agglomerans chủng O—BT 1.2 Sau đó lắc 150 vòng/phút ở các mức nhiệt độ 25°C, 30°C

và 35°C (Nguyễn Thi Ngọc Sương va ctv, 2016)

Chỉ tiêu theo dõi: Do mật độ quang (ODøo) sau thời gian tối ưu ở mục 2.4.1.1đối với vi khuẩn B subtilis chủng KT - ĐDI và P agglomerans chủng O— BT 12.2.4.1.3 Khảo sát điều kiện pH nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn

Bacillus subtilis chủng KT — DD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2

Bồ trí thí nghiệm:

Dựa trên thí nghiệm ở mục 2.4.1.1 và mục 2.4.1.2, từ đó chọn môi trường, thời

gian và nhiệt độ tối ưu dé khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến sinh khối của vi khuân

B subtilis chủng KT — ĐDI và P agglomerans chủng O— BT 1.2.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tổ ở 4 mức pH

là 6; 6,5; 7 và 7,5 với 2 vi khuẩn, 3 lần lặp lai (LLL), mỗi lần lặp lại (LLL) là 3 ống

nghiệm.

Phương thức thực hiện: Hút 1 mL dung dịch khuẩn ở môi trường nhân sinhkhối cấp I vào mỗi ống nghiệm chứa 20 mL dung dich môi trường tối ưu ở mục 2.4.1.1lần lượt đối với dòng vi khuẩn B subtilis chủng KT — ĐDI và P agglomerans chủng

O - BT 1.2 Sau đó lắc 150 vòng/phút với nhiệt độ tối ưu ở mục 2.4.1.2 (Nguyễn Thị

Ngọc Sương và ctv, 2016).

Chỉ tiêu theo dõi: Do mật độ quang (ODøo) sau thời gian tối ưu ở mục 2.4.1.1

đối với vi khuẩn B subtilis chủng KT — ĐDI và P agglomerans chủng O - BT 12.2.4.2 Khảo sát nguyên liệu làm chất mang tạo chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn

Bacillus subtilis chung KT — DD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2

Nguyên liệu dùng làm chat mang dang bột chứa dong vi khuẩn B subtilis chủng

KT - ĐDI và P agglomerans chủng O— BT 1.2 bao gồm cám, humic, bột tale và biocharvới các tiêu chí lựa chọn như dé tìm, giá thành rẻ, giúp vi khuan duy trì mật số lâu nhất,duy trì khả năng đối kháng (Đặng Hoài An và ctv, 2017)

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu té,gồm 2 dòng vi khuẩn Với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 7 nghiệm thức: Chất mang cám

bổ sung 10% chitosan (cám); chất mang cám bổ sung 10% tale và 10% chitosan(cám + talc); chat mang tale b6 sung 10% chitosan (talc); chất mang biochar bổ sung

10% chitosan (biochar); chất mang biochar bổ sung 10% tale và 10% chitosan

(biochar + talc); chat mang humic bổ sung 10% chitosan (humic); chat mang humic bổ

sung 10% talc và 10% chitosan (humic + talc), mỗi nghiệm thức là 3 túi zip

Phương pháp thực hiện:

Hỗn hợp chat mang thực hiện theo quy trình của Vidhyasekaran và Muthamilan

(1995) với công thức: 1.000 g chất mang + 10 g CMC + 15 g CaCO: và bồ sung chấtphụ gia có cải tiến với các chất mang khác nhau Sau đó, phân phối từng loại hỗn hợpchất mang sau khi trộn vào các đĩa petri (5 g/đĩa) và hấp khử trùng 2 lần, mỗi lần cách

nhau 24 giờ.

Vi khuẩn sau khi nhân sinh khối ở điều kiện tối ưu ở mục 2.4.1 được tiến hành

đo mật độ quang (ODøoo) Sau đó, dựa vào kết quả ở đường chuẩn dé pha huyền phù

vi khuân ODøoo = 0,3 (Võ Thị Phương Trang, 2013) Bơm 2 mL huyền phù vi khuẩn

đối kháng vào đĩa petri chứa hỗn hợp chất mang và trộn đều hỗn hợp Sau đó cho vào

tủ sấy ở nhiệt độ 40°C trong thời gian 24 giờ Và tồn trữ trong túi zip ở điều kiện nhiệt

độ phòng.

Sau thời gian 7, 14 va 28 ngày tồn trữ, mật độ vi khuẩn được xác định bằng

cách cân 1 g chế phẩm cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước cat đã khử trùng, lắc

đều Tiến hành đo mật độ quang (ODøoo) bằng máy đo quang phô (bước sóng 600 nm)

Chỉ tiêu theo dõi: Do mật độ quang (ODøø) ở thời điểm 7, 14 và 28 ngày sautồn trữ

Biochar + talc (D); Talc (E); Humic (F); Humic + talc (H).

2.4.3 Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT — ĐD1

và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế phẩm sau thời gian tồn trữ với

nắm gây bệnh lở cỗ rễ trong điều kiện phòng thí nghiệm

2.4.3.1 Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng

KT - ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế phẩm sau thời giantồn trữ với nam Rhizoctonia bicornis chủng ODT02

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu

tố Với 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL là 15 nghiệm thức, trong đó có 14 nghiệm thức chếphẩm, với 7 chế phâm (cám, cảm + talc, humic, humic + talc, biochar, biochar + tale vàtalc) chita vi khuẩn B subtilis chủng KT — ĐDI, 7 ché phẩm (cám, cám + talc, humic,humic + talc, biochar, biochar + tale va tale) chứa vi khuẩn P agglomerans chủngO-BT 1.2 và 1 nghiệm thức đối chứng nam R bicornis chủng ODT02

Chỉ tiêu theo dõi: Bán kính tản nắm (mm) được đo cách nhau 24 giờ Tiến hành

đo và quan sát cho đến khi tản nắm phát triển chạm vào thành đĩa ở nghiệm thức đối

chứng thì ngưng quá trình đo.

Do bán kính trung bình theo công thức Moayedi và ctv (2009):

r=(i +r2)⁄2

Trong đó: rl, r2: Bán kính do từ tâm đến phan tản nắm phân bồ theo hướng vi khuẩn (mm)

Hiệu suất đối kháng (HSĐK) theo công thức của Moayedi va ctv (2009):

AE (%) =(C — TYC x 100

Trong đó: AE: Hiệu suất đối khang (%)

C: Bán kính tan nắm tương ứng ở nghiệm thức đối chứng (mm)

T: Bán kính tản nắm tương ứng ở nghiệm thức có vi khuân đối khang (mm).Đánh giá hiệu suất đối kháng: theo thang đánh giá của Soytong (1988)

Hiệu suất đối kháng > 75%: có khả năng đối kháng tất cao

Hiệu suất đối kháng từ 61% đến 75%: có khả năng đối kháng cao

Hiệu suất đối kháng từ 51% đến 60%: có khả năng đối kháng trung bình

Hiệu suất đối kháng < 50%: có khả năng đói kháng thấp

2.4.3.2 Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng

KT - ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế phẩm sau thời giantồn trữ với nắm Fusarium oxysporum chủng KTDT01

Bố trí thi nghiệm, phương pháp thực hiện va chi tiêu theo doi: Tương tự mục 2.4.3.1.2.4.3.3 Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng

KT - DD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế phẩm sau thời giantồn trữ với nam Pythium vexans chủng KTDT22

Bồ trí thí nghiệm, phương pháp thực hiện và chỉ tiêu theo đối: Tương tự mục 2.4.3.1

2.5 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được tông hợp, tính toán bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2019.Các số liệu của các nghiệm thức được phân tích ANOVA, trắc nghiệm phân hạngbằng phần mềm SAS 9.1

Chương 3

KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả khảo sát khả năng tăng sinh khối cấp II của vi khuẩn Bacillus subtilis

chủng KT — DD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2

3.1.1 Kết quả khảo sát mơi trường va thời gian tăng sinh khối của vi khuẩn Bacillus

subtilis chủng KT — DD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2

Thanh phan mơi trường dinh dưỡng là yếu tố quan trong ảnh hưởng rat lớn đến

hoạt động sống cũng như khả năng duy trì hoạt tính sinh học của vi sinh vật Nhằmhướng tới mục tiêu tạo chế phẩm vi sinh để phịng trừ nam gây bệnh lở cổ rễ trên cây

họ cà, từ đĩ khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng sinh khối của vi khuẩn

B subtilis chủng KT — ĐDI và P agglomerans chủng O — BT 1.2 được tiến hành

Kết quả mật độ quang ở Bảng 3.1 cho thấy giá trị trung bình tăng sinh khối vớicác mức thời gian 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ cĩ giá tri ODøoo lần lượt là 0,11; 0,17;0,26 và 0,15 khác biệt giữa các nghiệm thức rất cĩ ý nghĩa trong thống kê Riêng giá trị

trung bình thời gian ở thời điểm 36 giờ cĩ giá trị ODsoo cao nhất đạt 0,26

Giá trị trung bình mơi trường tăng sinh khối ở nghiệm thức cám gạo kết hợp mật

ri đường cĩ giá trị ODøoo cao nhất dat 0,32 và khác biệt rất cĩ ý nghĩa thống kê với các

nghiệm thức cịn lại Trong đĩ, nghiệm thức bột bắp kết hợp mật rỉ đường cĩ giá trịODào thấp nhất là 0,05

Trong mơi trường cám gạo kết hợp mật ri đường ở thời gian 36 giờ, vi khuẩn

B subtilis chủng KT — ĐDI tăng sinh khối cao nhất cĩ giá trị ODøoo đạt 0,49 và khác

biệt rất cĩ ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức cịn lại

Nhu vay, vi khuẩn B swbtilis chủng KT —- ĐDI tăng sinh khối tối ưu trên mơi trường

cám gạo kết hợp mật rỉ đường trong thời gian 36 giờ

Bang 3.1 Mật độ quang (ODsø) của vi khuẩn B subtilis chủng KT — ĐDI khi tăng sinhkhối trong 5 loại môi trường tại các thời điểm ở nhiệt độ phòng (28 + 2°C)

Macrae Thời gian nhân sinh khối (T) 8/0

12 giờ 24 giờ 36giờ — 48 giờ

Trong cột các giá trị có cùng kí tự theo sau thi sự khác biệt không co ý nghĩa thống kê TB (T): trung

bình về thời gian TB (M): trung bình về môi trường Các môi trường bột bap, cắm gạo, khoai tây, nam men có kết hợp mật rỉ đường, ngoại trừ môi trường LB **: Khác biệt rat có ý nghĩa thông kê ở mức 0,01.

Kết quả mật độ quang ở Bảng 3.2 cho thấy, vi khuân P agglomerans chủng

O — BT 1.2 dao động có giá trị ODsoo từ 0,03 đến 0,51 Giá trị trung bình thời gian caonhất tại thời điểm 36 giờ có giá trị ODøoo đạt 0,28 và khác biệt rất có ý nghĩa thống kê

so với các nghiệm thức còn lại Đối với giá trị trung bình các môi trường tăng sinh khối

ở nghiệm thức LB có giá trị ODøoo cao nhất đạt 0,33 và khác biệt rat có ý nghĩa thống

kê với các nghiệm thức còn lại Trong đó, nghiệm thức bột bắp kết hợp mật rỉ đường có

giá trị ODøoo thấp nhất là 0,042

Trong 5 loại môi trường khảo sát, môi trường LB ở thời điểm 36 giờ dòng vikhuan P agglomerans chủng O — BT 1.2 tăng sinh khối cao nhất có giá trị ODsoo đạt0,51 và khác biệt rất có ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức còn lại Riêng môi trườngbột bắp kết hợp mật ri đường ở thời điểm 48 giờ có giá trị ODøoo thấp nhất là 0,04

Như vậy, vi khuan P agglomerans chủng O — BT 1.2 tăng sinh khối tối ưu trên

môi trường LB trong thời gian 36 gio.