2.1 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát quá trình nhân sinh khối cấp II của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng
KT - ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2.
Khảo sát nguyên liệu làm chất mang tạo chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn
Bacillus subtilis chung KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2.
Đánh giá khả năng đối kháng của chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn
Bacillus subtilis chủng KT — DD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 sau thời
gian tồn trữ với nắm gây bệnh lở cô rễ trên cây họ cà trong phòng thí nghiệm.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 02 năm 2023 đến tháng 08 năm 2023.
Thí nghiệm được tiễn hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa
Nông học, Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
2.3 Vật liệu thí nghiệm
2.3.1 Dụng cụ, thiết bị máy móc
Dung cụ: đĩa petri (đường kính 80 mm), ống eppendorf, bình tam giác thủy tinh (250 mL), ống nghiệm, pipet (GLISON, FRANCE), thước đo, dung cụ cấy, que
cay.
Các thiết bị gồm: tủ cấy khử trùng (IIAC2 — 4E8, Esco, Singapore), nồi hap khử trùng (MC40L, ALP, Japan), cân điện tử (PX224, Ohaus, Mỹ), bếp điện, máy lắc (SSLI, Stuart, Anh), máy Nanovue Plus (Anh), Máy lắc Vortex - ZX3 (Velp, Y).
2.3.2 Vật liệu nghiên cứu
2.3.2.1 Vi khuẩn đối kháng
Nguồn vi khuẩn đối kháng được cung cấp từ phòng thí nghiệm của Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. Bao gồm: vi khuẩn
Bacillus subtilis chung KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2.
Hình 2.1 Vi khuẩn B. subtilis chủng KT - ĐDI (A) và
P. agglomerans chủng O — BT 1.2 (B)
2.3.2.2 Mau nam Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum va Pythium vexans Mẫu nam Rhizoctonia bicornis chủng ODT02, Fusarium oxysporum chủng KTDT0I và Pythium vexans chủng KTDT22 dùng dé đánh giá khả năng đối kháng được cung cấp từ Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm
TP.HCM.
Hình 2.2 Mẫu nam R. bicornis chủng ODT02 (A), F. oxysporum chủng KTDT0I (B)
và P. vexans chủng KTDT22 (C)
2.3.3 Môi trường và hóa chất
Hóa chất sử dụng: cồn 70%, cồn 96%, agar, peptone (Trung Quốc), glycerol (Trung Quốc), NaCl (Trung Quốc), cao nam men (Việt Nam), chitosan (Việt Nam), CaCO: (Trung Quốc), CMC (Japan).
Môi trường tăng sinh khối cấp II
Mật rỉ đường: Công ty TNHH Thiên Thảo Hân. Thành phần: sucroza 44%,
glucoza 13%, fructoza 10%, axit amin 3%.
Cám gạo: Công ty TNHH Xây dựng Dich vụ môi trường nguồn sông xanh. Thanh phan: protein, vitamin B6, vitamin E, canxi, đường, chat xơ tiêu hóa được, calori.
Bột bắp: Công ty cô phần bột — thực phâm Tài Ký.
Cao nam men: Công ty TNHH ICFood Việt Nam. Thành phan: nitrogen > 9%, amino nitrogen > 3%, độ âm < 6%, sodium chloride < 2%, pH 5,3 — 7,2.
Biochar: Công ty TNHH xuất khẩu than tự nhiên và than sinh học.
Bột talc: Công ty TNHH Sản xuất Thương mại Nguyên Liệu Công Nghiệp Miền Nam (Simico). Thành phan: 60% SiOa, 30% MgO.
Humic: được sản xuất và phân phối bởi Công ty TNHH Sản xuất Thương mại
Dịch vụ công nghệ sinh học Abio Việt Nam.
Môi trường PGA — Potato Glucose Agar: Khoai tây 200 g, Agar 20 g, Glucose
20 g, nước cat 1000 mL. Hap khử tring ở 121°C.
Môi trường LB — Luria Broth: Peptone 10 g, cao nam men 5 g, NaCl 10 g, agar 20 g, nước cất 1000 mL. Hap khử trùng ở 121°C.
Môi trường bột bắp + mật rỉ đường: Mật ri đường 7 g, bột bắp 2 g, nước cất 1000 mL. Hap khử trùng ở 121°C.
Môi trường cám gạo + mật rỉ đường: Mat ri đường 7 g, cắm gạo 25 g, nước
cat 1000 mL. Hap khử trùng ở 121°C.
Môi trường khoai tây + mật rỉ đường: Mật rỉ đường 7 g, khoai tây 200 g, nước
cat 1000 mL. Hap khử trùng ở 121°C.
Môi trường cao nắm men + mật rỉ đường: Mật ri đường 7 g, cao nam men 5 g, nước cất 1000 mL. Hấp khử trùng ở 121°C.
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Khảo sát khả năng nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillus
subtilis chủng KT — DD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2
2.4.1.1 Khảo sát môi trường và thời gian nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT - ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong điều kiện phòng thí nghiệm
Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên hai yếu tố gồm 2 vi khuẩn. Với 5 môi trường (bột bắp + mật rỉ đường, cám gạo + mật rỉ đường, khoai tây + mật ri đường, cao nắm men + mật ri đường, LB) và 4 mức thời gian (12 gid, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ), 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL là 3 ống nghiệm.
Hình 2.3 Môi trường nhân sinh khối cấp II. Bột bắp + mật rỉ đường (A),
cám gạo + mật rỉ đường (B), khoai tây + mật rỉ đường (C),
cao nam men + mật ri đường (D), LB (E)
Phương phỏp thực hiện: Hỳt 1 mL dung dịch khuẩn cú giỏ trị ODứoo là 0,3 ở môi trường nhân sinh khối cấp I vào mỗi ống nghiệm chứa 20 mL dung dịch môi trường sau đó lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (28 + 2°C) (Nguyễn Thị Ngọc Sương và ctv,
2016)
Chỉ tiêu theo dõi: Do mật độ quang (OD600) tại thời điểm 12 giờ, 24 gid, 36 giờ và 48 giờ sau khi nhân sinh khối.
2.4.1.2 Khảo sát điều kiện nhiệt độ nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn
Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2
Bồ trí thí nghiệm:
Dựa trên thí nghiệm mục 2.4.1.1 chọn môi trường và thời gian tối ưu để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến nhân sinh khối của vi khuẩn B. subtilis chủng KT — ĐDI và
P. agglomerans chủng O — BT 1.2.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố ở 3 mức nhiệt độ 25°C, 30°C và 35°C với 2 vi khuẩn, 3 lần lặp lại (LLL), mỗi lần lặp lại (LLL) là 3
ông nghiệm.
Phương phỏp thực hiện: Hỳt 1 mL dung dịch khuẩn cú giỏ trị ODứoo là 0,3 ở môi trường nhân sinh khối cấp I vào mỗi ống nghiệm chứa 20 mL dung dịch môi trường tối ưu ở mục 2.4.1.1 lần lượt đối với dòng vi khuẩn B. subtilis chủng KT - ĐDI và P.
agglomerans chủng O—BT 1.2. Sau đó lắc 150 vòng/phút ở các mức nhiệt độ 25°C, 30°C và 35°C (Nguyễn Thi Ngọc Sương va ctv, 2016).
Chỉ tiờu theo dừi: Do mật độ quang (ODứo) sau thời gian tối ưu ở mục 2.4.1.1 đối với vi khuẩn B. subtilis chủng KT - ĐDI và P. agglomerans chủng O— BT 12.
2.4.1.3 Khảo sát điều kiện pH nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn
Bacillus subtilis chủng KT — DD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2
Bồ trí thí nghiệm:
Dựa trên thí nghiệm ở mục 2.4.1.1 và mục 2.4.1.2, từ đó chọn môi trường, thời
gian và nhiệt độ tối ưu dé khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến sinh khối của vi khuân
B. subtilis chủng KT — ĐDI và P. agglomerans chủng O— BT 1.2.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tổ ở 4 mức pH là 6; 6,5; 7 và 7,5 với 2 vi khuẩn, 3 lần lặp lai (LLL), mỗi lần lặp lại (LLL) là 3 ống
nghiệm.
Phương thức thực hiện: Hút 1 mL dung dịch khuẩn ở môi trường nhân sinh khối cấp I vào mỗi ống nghiệm chứa 20 mL dung dich môi trường tối ưu ở mục 2.4.1.1 lần lượt đối với dòng vi khuẩn B. subtilis chủng KT — ĐDI và P. agglomerans chủng O - BT 1.2. Sau đó lắc 150 vòng/phút với nhiệt độ tối ưu ở mục 2.4.1.2 (Nguyễn Thị
Ngọc Sương và ctv, 2016).
Chỉ tiờu theo dừi: Do mật độ quang (ODứo) sau thời gian tối ưu ở mục 2.4.1.1 đối với vi khuẩn B. subtilis chủng KT — ĐDI và P. agglomerans chủng O - BT 12.
2.4.2 Khảo sát nguyên liệu làm chất mang tạo chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn
Bacillus subtilis chung KT — DD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2
Nguyên liệu dùng làm chat mang dang bột chứa dong vi khuẩn B. subtilis chủng KT - ĐDI và P. agglomerans chủng O— BT 1.2 bao gồm cám, humic, bột tale và biochar với các tiêu chí lựa chọn như dé tìm, giá thành rẻ, giúp vi khuan duy trì mật số lâu nhất, duy trì khả năng đối kháng (Đặng Hoài An và ctv, 2017).
Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu té, gồm 2 dòng vi khuẩn. Với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 7 nghiệm thức: Chất mang cám bổ sung 10% chitosan (cám); chất mang cám bổ sung 10% tale và 10% chitosan (cám + talc); chat mang tale b6 sung 10% chitosan (talc); chất mang biochar bổ sung 10% chitosan (biochar); chất mang biochar bổ sung 10% tale và 10% chitosan (biochar + talc); chat mang humic bổ sung 10% chitosan (humic); chat mang humic bổ sung 10% talc và 10% chitosan (humic + talc), mỗi nghiệm thức là 3 túi zip.
Phương pháp thực hiện:
Hỗn hợp chat mang thực hiện theo quy trình của Vidhyasekaran và Muthamilan (1995) với công thức: 1.000 g chất mang + 10 g CMC + 15 g CaCO: và bồ sung chất phụ gia có cải tiến với các chất mang khác nhau. Sau đó, phân phối từng loại hỗn hợp chất mang sau khi trộn vào các đĩa petri (5 g/đĩa) và hấp khử trùng 2 lần, mỗi lần cách
nhau 24 giờ.
Vi khuẩn sau khi nhân sinh khối ở điều kiện tối ưu ở mục 2.4.1 được tiến hành đo mật độ quang (ODứoo). Sau đú, dựa vào kết quả ở đường chuẩn dộ pha huyền phự vi khuõn ODứoo = 0,3 (Vừ Thị Phương Trang, 2013). Bơm 2 mL huyền phự vi khuẩn đối kháng vào đĩa petri chứa hỗn hợp chất mang và trộn đều hỗn hợp. Sau đó cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 40°C trong thời gian 24 giờ. Và tồn trữ trong túi zip ở điều kiện nhiệt
độ phòng.
Sau thời gian 7, 14 va 28 ngày tồn trữ, mật độ vi khuẩn được xác định bằng cách cân 1 g chế phẩm cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước cat đã khử trùng, lắc đều. Tiến hành đo mật độ quang (ODứoo) bằng mỏy đo quang phụ (bước súng 600 nm).
Chỉ tiờu theo dừi: Do mật độ quang (ODứứ) ở thời điểm 7, 14 và 28 ngày sau tồn trữ.
Biochar + talc (D); Talc (E); Humic (F); Humic + talc (H).
2.4.3 Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT — ĐD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế phẩm sau thời gian tồn trữ với nắm gây bệnh lở cỗ rễ trong điều kiện phòng thí nghiệm
2.4.3.1 Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT - ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế phẩm sau thời gian tồn trữ với nam Rhizoctonia bicornis chủng ODT02
Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố. Với 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL là 15 nghiệm thức, trong đó có 14 nghiệm thức chế
phẩm, với 7 chế phâm (cám, cảm + talc, humic, humic + talc, biochar, biochar + tale và
talc) chita vi khuẩn B. subtilis chủng KT — ĐDI, 7 ché phẩm (cám, cám + talc, humic, humic + talc, biochar, biochar + tale va tale) chứa vi khuẩn P. agglomerans chủng O-BT 1.2 và 1 nghiệm thức đối chứng nam R. bicornis chủng ODT02.
Phương pháp thực hiện:
Cân 1 g chế phâm cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước cất đã khử trùng, lắc đều và tiến hành đo mật độ quang ODsoo tại thời điểm 7, 14 va 28 ngày tồn sau tồn trữ.
Sử dụng tăm bông đã hấp khử trùng thắm vào dung dịch chế phẩm đã pha chứa vi khuẩn B. subtilis chủng KT — ĐDI va P. agglomerans chủng O - BT 1.2 cấy 2 đường thang song song cách vị trí đặt thạch nam 2,5 cm trên đĩa môi trường PGA. Sau đó, tiến hành cấy thạch nam R. bicornis chủng ODT02 (đường kính 5 mm) vào tâm dia petri (Ferreira và
ctv,1991).
Nam gay bénh
Chế phẩm chứa vi khuẩn
đôi kháng
Hình 2.5 Bồ trí chế phẩm chứa vi khuẩn đối kháng với nam trên đĩa petri
Chỉ tiêu theo dõi: Bán kính tản nắm (mm) được đo cách nhau 24 giờ. Tiến hành đo và quan sát cho đến khi tản nắm phát triển chạm vào thành đĩa ở nghiệm thức đối
chứng thì ngưng quá trình đo.
Do bán kính trung bình theo công thức Moayedi và ctv (2009):
r=(i +r2)⁄2
Trong đó: rl, r2: Bán kính do từ tâm đến phan tản nắm phân bồ theo hướng vi khuẩn (mm).
Hiệu suất đối kháng (HSĐK) theo công thức của Moayedi va ctv (2009):
AE (%) =(C — TYC x 100
Trong đó: AE: Hiệu suất đối khang (%).
C: Bán kính tan nắm tương ứng ở nghiệm thức đối chứng (mm).
T: Bán kính tản nắm tương ứng ở nghiệm thức có vi khuân đối khang (mm).
Đánh giá hiệu suất đối kháng: theo thang đánh giá của Soytong (1988).
Hiệu suất đối kháng > 75%: có khả năng đối kháng tất cao.
Hiệu suất đối kháng từ 61% đến 75%: có khả năng đối kháng cao.
Hiệu suất đối kháng từ 51% đến 60%: có khả năng đối kháng trung bình.
Hiệu suất đối kháng < 50%: có khả năng đói kháng thấp.
2.4.3.2 Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT - ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế phẩm sau thời gian tồn trữ với nắm Fusarium oxysporum chủng KTDT01
Bố trí thi nghiệm, phương pháp thực hiện va chi tiêu theo doi: Tương tự mục 2.4.3.1.
2.4.3.3 Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT - DD1 và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế phẩm sau thời gian tồn trữ với nam Pythium vexans chủng KTDT22
Bồ trí thí nghiệm, phương pháp thực hiện và chỉ tiêu theo đối: Tương tự mục 2.4.3.1.
2.5 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được tông hợp, tính toán bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2019.
Các số liệu của các nghiệm thức được phân tích ANOVA, trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm SAS 9.1.
Chương 3