BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH-KHOA -KHOA HỌC SINH HỌC KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CÁC SUBTYPES ETEC, DAEC VÀ EAEC CUA Escherichia col
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP
XÁC ĐỊNH SU HIỆN DIEN CAC SUBTYPES ETEC, DAEC
VÀ EAEC CUA Escherichia coli TRONG MOI TRƯỜNG NHÀ NUÔI CHIM YEN BANG KY THUAT MULTIPLEX PCR
Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC
Sinh viên thực hiện : TRÀN NGỌC THẢO NGUYÊN
Mã số sinh viên : 18126112
Niên khóa : 2018 - 2022
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH
-KHOA -KHOA HỌC SINH HỌC
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP
XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CÁC SUBTYPES ETEC, DAEC
VÀ EAEC CUA Escherichia coli TRONG MOI TRƯỜNG NHÀ NUÔI CHIM YEN BANG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR
Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện
TS BSTY ĐINH XUÂN PHÁT TRAN NGỌC THẢO NGUYEN
TP Thú Đức, 08/2023
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin cảm ơn Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
và Khoa Khoa học Sinh học đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị, môi trườnghọc tập và sinh hoạt tốt dé em có thé học tập và hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp
Em xin cảm ơn thầy có van học tập TS Huỳnh Văn Biết đã tận tình lắng nghe,thấu hiểu và giúp đỡ trong những vấn đề khó khăn mà em gặp phải trong quá trình định
hướng chuyên ngành cũng như trong quá trình học tập.
Em xin cảm ơn thầy hướng dẫn TS BSTY Đinh Xuân Phát, chị Nguyễn Thị Mi
Mi, chị Cao Trần Quỳnh Như đã tạo tiền đề, hướng dẫn, góp ý và chỉnh sửa nội dungcủa đề tài trong suốt quá trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm
Con xin cảm ơn mẹ và gia đình đã tạo điều kiện cho con có thể hoàn thành quátrình học tập tại trường cũng như hỗ trợ, đồng hành và tin tưởng con xuyên suốt quá
trình học tập nảy.
Cuối cùng, em xin cảm ơn các anh, các chị, các bạn, các em tại phòng thí nghiệm
Công nghệ Gene — BIO313 luôn hỗ trợ em tận tình trong quá trình học tập, học hỏi va
thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm
Em xin cảm ơn.
Trang 4XÁC NHAN VA CAM DOAN
Tôi tên Trần Ngọc Thảo Nguyên, MSSV: 18126112, Lớp: DH18SM thuộc ngànhCông nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Thanh phó Hồ Chí Minh, xin cam đoan:Đây là Khóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin
trong nghiên cứu là hoàn toan trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm trước Hội đồng về những cam kết này
Tp Ho Chi Minh, ngày 07 tháng 09 năm 2023
Người việt cam đoan
Trần Ngọc Thảo Nguyên
mn IRR\
ul
Trang 5TÓM TẮT
Nghiên cứu được tiến hành với mục đích xác định sự hiện diện các subtypes
Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), Diffusely adherent Escherichia coli (DAEC)
và Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) của vi khuan E coli trong môi trườngnhà nuôi chim yến bằng kỹ thuật Multiplex PCR (mPCR) Quy trình mPCR phát hiện
được xây dựng dựa trên các các gen e/f (ETEC), đaaE (DAEC) và aa/4 (EAEC) tương
ứng với kích thước sản phâm khuếch đại lần lượt là 629 bp, 480 bp và 340 bp thông quatối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp và nồng độ của các cặp môi, kiểm tra độ đặc hiệu và giới hạnphát hiện của phản ứng mPCR Sau quá trình tối ưu hóa, mPCR được thực hiện tại nhiệt
độ 56°C với nồng độ các cặp mùi elt: daaE: aatA tương ứng với ty lệ 2: 2,5: 2 (0,4 uM:0,5 uM: 0,4 uM) Giới han phát hiện của phản ứng mPCR là 10° ng/pL (107 pg/pL).
Cuối cùng, quy trình mPCR đã thiết lập được ứng dụng trên 90 các mẫu thực địa bao
gồm 67 mẫu phân, 23 mẫu phết bề mặt tổ yến được thu thập từ 30 nhà nuôi chim yến ở
ba tinh Bình Duong, Đồng Nai và Thành phó Hồ Chí Minh Kết quả khảo sát cho thay
sự hiện diện của subtype ETEC chiếm 32/90 mẫu cho kết quả dương tính chiếm tỷ lệ35,56 % và không có sự hiện diện của hai subtypes DAEC và EAEC trên các nền mẫu
được khảo sát Nghiên cứu này đã phát triển và xây dựng thành công mPCR phát hiện
các subtypes E coi mang gen độc lực, đồng thời cũng chứng minh được sự hiện củasubtype ETEC trong nhà nuôi chim yến
Từ khóa: Escherichia coli, ETEC, DAEC, EAEC, Multiplex PCR.
ll
Trang 6The research was conducted to the identification of subtypes absent Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), Diffusely adherent Escherichia coli (DAEC), and Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) of Escherichia coli (E coli) bacteria in the swiftlet house environment by Multiplex PCR technique (mPCR) The mPCR was established to determine the presence of pathogens ETEC, DAEC, and EAEC based on elt, daaE, and aatA virulence genes with product sizes of 629 bp, 480 bp, and 340 bp,
respectively through optimizing annealing temperature and môi concentrations,checking the specificity of méis and determining the limit of detection of mPCR assay
After optimizing the mPCR process, the mPCR was conducted with an annealing temperature of 56°C and the ratio of primer concentrations e/t: daaE: aatA was 2: 2.5:
2 (0.4 uM: 0.5 uM: 0.4 uM), respectively The limit of detection of mPCR was 107 ng/HL (102pg/uL) And finally, the mPCR was applied to determine the presence of
pathogens in 90 samples, including 67 fecal samples and 23 nest surface samples collected from 30 swiftlet houses from Binh Duong, Dong Nai province, and Ho Chi Minh City After that, the investigation showed that 32 out of 90 samples (35.56 %) were positive for e// gene (ETEC), and did not detect the presence of EAEC and DAEC.
In conclusion, we successfully conducted and developed an mPCR procedure to detect these pathogens, demonstrating that ETEC existed in the swiftlet houses environment.
Key words: Escherichia coli, ETEC, DAEC, EAEC, Multiplex PCR.
IV
Trang 7MỤC LỤC
LOI CAM 0 iXÁC NHẬN VA CAM ĐOAN 5-25 22212212212212212111212111122 re ii
i iii
RBS TRANG WN ccsccazstreisntsmvoitim avant ects antes oto tional tinge finn Ditelenoaii iv I/180/906/94 V
IP ])IZ4-” 8743 s19z10%).1là Jl 3nng Xa vii
AN BE Bĩi Oe cece viiiDÁNH SACH CAC HINT ossssccossssuusssssanuncoveusstsvesessenevcessisivneesseuniseseunuiseconsnuuvosesessies ix
ha ca |
(Cg ce: (| sunanaaaningonhe toa Gikiin0rQvEGGGSRGUNGUEAGGEĐ140/G01G1401704G011003603801000600138g530 2
1⁄8 NGL tite (hi hIỆH ce scoseeeeeusesacaseosesanawexeneenesuasvssnameenenauer unsere nen enereeaee merece 2
2.1 So lược về kỹ thuật PCR (Polymearase Chain Reaction) 2: 5z55z225+2 3
2.1.1 Sơ lược về kỹ thuật PCR 2-22 2+2S22E12EE2211221221121122112112212212211221212 2 e2 35.1.2 Nguyễn tc thực hiện phân ng PU các 6661011602100 15400000618000150100606650, 4
2:2: KY thuật GiGi GI crvsscescsecnesswrscevunerseavcessnsenanesesevsaroowvueesevennnavenuenue nies ver 010300 E20.080.00038 52.3 So lược về kỹ thuật mPCR (Multiplex Polymerase Chain Reaction) 6
2.3.1 Sơ lược về kỹ thuật mPCR 2-22 +22E+2E22E2E2E1231211211211211211211211212222 22 xe, 62.3.2 Nguyên tắc thực hiện phan ứng mPCR 22222222+2EE22E22+rzxzrzzrez 62.4 Sơ lược về ngành nuơi chim yến và các vấn đề liên quan 2 2 2252252252 72.5 Sơ lược về vi khuẩn # coli và phân loại các subtypes gây bệnh - 72.5.1 Sơ lược về vi khuẩn E €oÏj ¿- + 5s s+EEk‡ 2 2E E1212111111111111111 111.1 xe 7
2.5.2 Phân loại các subtypes # co/i mang gen độc lực gây bệnh - 9 252.1; Entetotoxiseni¢ !: @oli (ELEC) sssse6ieessseglogC0o0 l9 10081558IGH6285/800720 251820166 3612869 10 25.2.2 Dittuselyvadherent 2 coli (DAEC) scccssnvesssesnssnnrconsmesccesseeerenscencesenatsenss eens 10 2:53: SHESFGHSEGEZEHWSuUEI COll (EAL C) ssesssccmsuesmsavenmnsneswsnerasun neesenseewenenvnerumeamisutes lãi2.6 Do chế gây liệnl”, ~S~.~-~~rex2k 227m eL.1cccmE.Z,rrre-xdcrvzerrTrrrrerercrrerxrerccee 15
2 1H nH tựu,nGhHIỂT €Ữ wcssscssvcrsexassasrennsenssnaescenaanaancan care 071310008108091611381618861046.600/34-0336 13
Trang 82.7.1 Thành tựu nghiên cứu trong nue - + 55 52 2< S21 ** E1 1e 13 2.7.2 Thanh tựu nghiên cứu nước ngoal ec eeeeeceeceeseeeeeeseeeeeseeseeeseeseeesesseeeseeeeeees 14
CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 2-2 2+S2z2S22E+£E2zzzzczxczz 153.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -2-22222221222122212221222122112112212 222 13
3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cỨU - - +2 ceeceeceeeeececeecnecaeeneeneeaeees 153.2.1 Các đối chứng và mẫu thực địa 2- 2 222+2222E22E122122212212212221221222 2 xe 15
3.2.2 Các hóa chất va dụng cụ thí nghiệm -2- 2 2+22+S22EE+EE2EE2EE2EE2EE2EE2Exzrxsred 15
3.51 HWƠHE DHTi TTEHIETi(GỮU, 26k 6216 care ainsi b0 664611 gesSlt cae sneanmaltes 16
3.2.3.1 Ly trích DNA của các mẫu đối chứng -2-©2222++22222E22E222222E22222xee2 163.2.3.2 Tối ưu nhiệt độ bat cặp của các phan ứng sPCR -2- 2 5z52z225z+2 173.2.3.3 Tối ưu nhiệt độ bắt cặp của phản ứng mPCR - 2 222222z22z22z22zzzzzz+2 183.2.3.4 Tối ưu nồng độ các cặp mỗi trong phản ứng mPCR 2 2 252522 183.2.3.5 Kiểm tra độ đặc hiệu các cặp môi trong phan ứng MPCR 19
3.2.3.6 Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng MPCR 5- 5555 +++<<<+x 20
3.2.3-:7 Ứng dụng mPCR để khảo sát các tác nhân trên nền mẫu thực địa 203.3 Xử lý số liệu ¿-2¿©2-22222222121221121121121121121121121121121121121121121121121121 1212 xe 21
CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2-52 2+S++E2E2E2E22E2E2E2Exzxe2 27
4,1 Kết quid nghÏễn GỨU eesceseeknieni0 in 1011002001000 0016061111610610160011011001180.6 22
4.1.1 Tối ưu nhiệt độ bat bap của các phản ứng sPCR - 2 2+ 22S22Ez+Ez+zz+2 27,
4.1.2 Tối ưu nhiệt độ bắt cặp của phan ứng mPCR - 2 2225222z222222zz2z22+2 224.1.3 Tối ưu nồng độ các cặp môi trong phản ứng mPCR 2-22 55222z552 23
4.1.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp moi dùng trong phản ứng mPCR 24
4.1.5 Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng mPCR eee eee 25 4.1.6 Khao sat trên các mẫu thực dia c.ccccececccccccsesescscseseseeesecesscsesesesecseseseseseeseeeees 26
AD AGO) lÙÃTÏössn 01s ng 1560086 81381505 25636855138 E133535A33133534804553535.0555SE.SESESSSAIESXL4E44445525588-I55.0538.38 2)CHUONG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ - 2-52 2S E2E2E211211211211211211 212 xe 30
Trang 9DANH SÁCH CAC CHỮ CAI VIET TAT
Clostridium perfringens Diffusely adherent È coliĐồng bang Sông Cửu LongDeoxyribonucleic Acid Escherichia coli
Enteroaggregative E coli Enterohemorrhagic # coli Enteroinvasive E coli Enteropathogemc E coli Ethidium Bromide
Enterotoxigenic E coli kilobase
Limit of detection multiplex Polymerase Chain Reaction National Center of Biotechnology Information nanogram/micro liter
Polymerase Chain Reaction single Polymerase Chain Reaction picogram/micro liter
Shiga toxin—producing È coli
Vil
Trang 10DANH SÁCH CÁC BANG
Bang 3.1 Các thành phan trong các phản ứng sPCR 2-52 22522222 552: 17Bang 3.2 Các thành phan trong phản ứng mPCR 22 2 225222zz2zz22zz2 18Bảng 3.3 Dãy các nồng ba cặp mỗi dùng trong phản ứng mPCR được khảo sát 19
Bảng 4.1 Giá trị OD của các Ø€T óc c1 St S11 1 1H HT TH HH Hết 25
Bang 4.2 Kết quả thí nghiệm lặp lại LOD 3 lần 2 22-©2z225z225+225c+2 26
vill
Trang 11DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Các thành phan của phản ứng PCR -2- 2 2 s+SS2S£+£E+£xzz+zzxzxez 3
Hình 2.2 Quá trình tao ban sao trong phản ứng PCR -5-<5-<5-<s<2 4
Hình 2.3 Cơ chế phân tách các phân tử DNA theo kích thước trong điện di 5
Hình 2.4 Hình ảnh vi khuẩn E coli được quan sát -2-©22©222222222222z2zzsz+2 8 Hình 2.5 Cơ chế hoạt động của các subtypes của E COL i c.cecceccescescessessessessessesseees 9 Hình 2.6 Các yếu tố độc lực gây bệnh trên các subtypes E coli mang gen độc lực 10
Hình 2.7 Cơ chế xâm nhập của subtype DAEC -22©2¿22222222z+22z22z22 11 Hình 2.8 Tổng quan về cơ chế lây nhiễm của các E coli mang gen độc lực 12
Hình 3.1 Quy trình xác định giới hạn phát hiện của phản ứng mPCR 20
Hình 4.1 Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của phản ứng SPCR 22
Hình 4.2 Kết qua khảo sát nhiệt độ bắt cặp của phản ứng mPCR 23
Hình 4.3 Kết quả khảo sát nồng độ các cặp mồi trong phan ứng mPCR 24
Hình 4.4 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của các cặp môi trong phản ứng mPCR 25
Hình 4.5 Kết quả khảo sát giới han phát hiện phan ứng mPCR 26 Hình 4.6 Kết quả khảo sát trên nhóm mẫu thực địa 2-2 22 2+s+2zzzzzs2 27
IX
Trang 12CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Trong nhiều năm gần đây, ngành chế biến và xuất khẩu các sản phẩm từ yến đượcđầu tư, phát triển vượt trội với nhiều nhà nuôi chim yến được xây mới ở các tỉnh như:Khánh Hòa, Tiền Giang, Thành phố Hồ Chi Minh, Bạc Liéu, do những lợi ích manglại không những về kinh tế cho người nuôi yến mà còn có giá trị trong sức khỏe và làm
đẹp, từ đó nhiều phương pháp được đề ra nhằm thu hút chim yến đến làm tô Trong đó,ngành nuôi yến tại Khánh Hòa được đánh giá cao ở cả thị trường trong nước và nướcngoài vì xuất hiện những loài yến nồi tiếng như Aerodramus Fuciphagus Germani cho
năng suất tô yến rất lớn hằng năm cũng như là giá trị dinh dưỡng
Chim yến là loài chim hoang đã, có tập tính di cư theo mùa, thường làm tổ ởnhững vùng có khí hậu ấm áp, thiên nhiên hoang sơ, nhiều biển đảo và đồi núi, vì tậptính đi cư nên chim yến có nguy cơ cao mang các bệnh thường gặp trên loài gia cầmkhác như bệnh cúm A (H5N1, H7N9, H10N&, ), bệnh tiêu chảy các cấp theo Sở Y tếtỉnh Bình Định, 2020 Việc theo dõi, phát hiện và điều trị những bệnh nêu trên là rấtkhó, nếu không kiểm soát được những nguyên nhân gây bệnh ở chim yến dẫn đến nguy
cơ lây lan sang người, đồng thời ảnh hưởng không nhỏ đến nguồn nguyên liệu đầu vào
của ngành chế biến yến sào của cả nước
Bệnh tiêu chảy gây ra bởi các subtypes mang gen độc lực gây bệnh È coli trên
chim yến, các loài gia cầm khác chưa có vaccine phủ hợp cho việc phòng ngừa căn bệnhnày Nên việc dùng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại dé phat hién nhanh su hién
diện của tác nhân gây bệnh là điều cần thiết Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về cácbệnh do vi khuẩn £ coli thông thường và các E coli mang gen độc lực, tuy nhiên những
nghiên cứu trên các subtypes DAEC và EAEC còn khá hạn chế và mới
Do đó, trong nghiên cứu này, dựa trên kỹ thuật Multiplex PCR nhằm kiểm tra vàphát hiện sự hiện diện của các subtypes ETEC, DAEC và EAEC gây bệnh trên chủng vi
khuẩn E coli dé kịp thời có những biện pháp xử lí thích hợp nhằm đảm bảo được chatlượng cũng như độ an toàn của các sản phẩm từ yến cung cấp ra thị trường
Trang 131.2 Mục tiêu của đề tài
Tối ưu thành công quy trình mPCR dé xác định sự hiện diện các subtypes ETEC,DAEC và EAEC của E coli thông qua các gen độc lực lần lượt là elt, daaE và aa/A
Áp dụng quy trình mPCR đã được tối ưu, dé xác định sự hiện diện các subtypes
ETEC, DAEC và EAEC của E coli trên các mẫu thực địa được thu thập từ nhà nuôi
chim yến
1.3 Nội dung thực hiện
Nội dung 1: Tối ưu quy trình mPCR dùng dé xác định sự hiện diện các subtypes
ETEC, DAEC và EAEC:
Tối ưu nhiệt độ bắt cặp của các phản ứng sPCR (dùng một cặp môi)
Tối ưu nhiệt độ bắt cặp của phản ứng mPCR (dùng 3 cặp mồi)
Tối ưu nồng độ các cặp môi dùng trong phản ứng mPCR
Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp môi dùng trong phan ứng mPCR
Xác định giới han phát hiện của phản ứng mPCR.
Nội dung 2: Áp dụng quy trình mPCR đã được tối ưu, để xác định sự hiện diệncác subtypes ETEC, DAEC và EAEC của E coli trên các mẫu thực dia được thu thập
từ nhà nuôi chim yên.
Trang 14CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU
2.1 Sơ lược về kỹ thuật PCR (Polymearase Chain Reaction)
2.1.1 Sơ lược về kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùnghợp, được nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1983, được cấp bằngsáng chế vào năm 1985 và đạt giả Nobel về Hóa học vào năm 1993 Và đây được xem
là nền tảng, cho các kỹ thuật sinh học phân tử sau này (Kadri, 2020)
Phản ứng PCR được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực chân đoán vi sinh, như visinh lâm sang, kiểm nghiệm thực phẩm (Hồ Thị Thanh Thủy va ctv, 2020) Ngoài ra
PCR còn được ứng dụng trong chân đoán bệnh, thử nghiệm trong nông nghiệp và công
việc điều tra pháp y (Rahman và ctv, 2013)
dNTPs
Primer
Template New DNA DNA
DNA strand polymerase
Hình 2.1 Các thành phần của phản ứng PCR (Thermo Fisher
Scientific: https://www.thermofisher.com).
Trình tự môi là các trình tự oligonucleotide được bổ sung vào mach DNA đơn,mỗi cặp mồi phải đặc hiệu cho một trình tự DNA nhất định Vì thế, việc thiết kế mồi là
yếu tô quan trọng dé một phan ứng PCR được thực hiện DNA polymerase cho phép các
dNTP bắt cặp bố sung với DNA mạch khuôn tạo ra sản phẩm với trình tự DNA mục
tiêu Taq polymerase là enzyme polymerase được phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt ở suối
nước nóng Thermo aquaticus, chịu được nhiệt độ trên 100 °C để có thể chịu được quátrình biến tính của phản ứng PCR (Kadri, 2020)
Trang 152.1.2 Nguyên tắc thực hiện phản ứng PCR
PCR dựa vào khả năng biến tính xen kẽ các phân tử DNA mạch đôi và lai cácmach đơn bồ sung một cách có kiểm soát Quy trình PCR cơ bản bat đầu dùng nhiệt débiến tính các DNA mạch đôi thành DNA mach đơn, sau đó các môi (5° - 3’) bắt cặp vàtổng hợp bồ sung với đầu 3’ của đoạn DNA khuôn (Lodish va ctv, 2012) Các sản phẩmcủa mỗi bước tổng hợp đóng vai trò là khuôn mẫu cho các bước tiếp theo Phản ứngPCR gồm 3 giai đoạn cơ bản: biến tính (Denaturation), bắt cặp (Annealing) và kéo dai
` Denaturation > Annealing > Extension | —_—
2' =2 copies 2? = 4 copies 2 =8 copies
Hình 2.2 Quá trình tạo ban sao trong phản ứng PCR (Thermo Fisher
Scientific: https://www.thermofisher.com).
Giai đoạn biến tinh: may PCR được gia nhiệt đến 95°C, ở nhiệt độ này các liênkết hydro không thé duy trì trạng thái và bị phá vỡ dẫn đến việc các DNA sợi đôi đượctách thành các DNA sợi đơn, mở đầu cho chuỗi phản ứng (Lodish và ctv, 2012)
Giai đoạn bắt cặp: tiếp tục hạ nhiệt độ xuống khoảng 50 - 60 °C các liên kết hydro
được tái cấu trúc, các cặp môi tương ứng (chiều 5’ - 3”) được gắn vào trình tự DNA
mạch khuôn ở đầu 3’ Tuy thuộc vao nhiệt độ bắt cặp của các cặp mỗi mà thiết kế chu
trình nhiệt cho phù dé khuếch đại được sản phẩm đặc hiệu và tránh các trường hợp bắtcặp chéo tạo sản phâm phụ (Lodish và ctv, 2012)
Giai đoạn kéo đài: tiến hành gia nhiệt lên 72 °C, Taq polymerase liên kết với các
DNA sợi đơn, các nucleotide tiến hành bat cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bé sung.Quá trình được lặp đi lặp lại với chu trình nhiệt không đối thường là 20 - 35 chu kỳ tùythuộc kích thước DNA mục tiêu với số bản sao tăng lên theo cấp số nhân sau mỗi chu
kỳ (Lodish và ctv, 2012).
Trang 162.2 Kỹ thuật điện di
Sản phẩm được tạo thành là các đoạn gen chứa trình tự DNA mục tiêu ban đầu,được khuếch đại chính xác ở kích thước mong muốn Việc phát hiện và phân tích các
sản pham PCR được thực hiện nhanh chóng thông qua quá trình điện di các sản phẩm
PCR va quan sát trên gel agarose (hoặc poly acrylamide) dưới tia cực tim (Kadri, 2020).
Phương pháp phổ biến dé hiển thi band DNA đã phân tích bang điện di gel là u
gel trong dung dịch chứa thuốc nhuộm ethidium bromide phát huỳnh quang Phân tửdạng phang này gắn với DNA bang cách cài vào giữa các cặp bazơ, làm tăng nồng độ
ethidium bromide trong DNA cũng như tăng độ phát huỳnh quang nội tai của nó Do
vậy khi chiếu tia cực tím, các vùng gel chứa DNA sẽ phát huỳnh quang sáng hơn nhiều
so với các vùng không chứa DNA (Lodish và ctv, 2012).
Minus Solution Minus
Hình 2.3 Cơ chế phân tách các phân tử DNA theo kích thước trong
điện di (Matsusada Precision: https://www.matsusada.com).
Các phan tử DNA mang điện tích âm lớn nên chuyền động về cực dương khi tiếnhành điện di gel, phần vật chất gel làm ngăn cản sự khuếch tán ngẫu nhiên nên nhữngphân tử DNA có cùng chiều dài (kích thước) sẽ cùng đi chuyển, tạo thành một band với
độ rộng của band bằng độ rộng của các giếng chứa hỗn hợp DNA và chất phát huỳnh
quang khi tiến hành chạy điện di Có nhiều phương pháp điện di gel được ứng dụng, tùy
thuộc vào kích thước sản phẩm điện di mong muốn mà lựa chọn phương pháp phù hợp,
các phân tử DNA nhỏ khoảng 10 đến 2000 nucleotide được điện di trên gelpolyacrylamide, các phân tử DNA lớn hơn từ khoảng 200 nucleotide đến trên 20 kb
được điện di trên gel agarose (Lodish và ctv, 2012).
Các band của sản phẩm phân tách được quan sát dưới tia cực tím sử dụng chụp
ảnh phóng xạ tự ghi (nếu các đoạn được đánh dấu phóng xạ) hoặc nhuộm bằng chất phát
5
Trang 17huỳnh quang gan DNA (ví dụ là ethidium bromide) Về cơ chế thực hiện phản ứng, EtBr
gắn với DNA bằng cách cài vào giữa các cặp bazơ làm tăng nồng độ ethidium trong
DNA đồng thời lam tăng độ phát huỳnh quang nội tại của nó Vì vậy, các vùng gel cóchứa DNA sẽ phát huỳnh quang sáng hơn (tùy thuộc lượng DNA có trong sản phẩm) sovới các vùng gel không chứa DNA khi chúng ta chiếu tia cực tím (Lodish và ctv, 2012).2.3 Sơ lược về kỹ thuật mPCR (Multiplex Polymerase Chain Reaction)
2.3.1 Sơ lược về kỹ thuật mPCR
Multiplex PCR, một kỹ thuật được xây dung, cải tiến dựa trên cơ chế của PCRnhằm giúp tiết kiệm được thời gian cũng như hóa chất phản ứng, tổng hợp đồng thờinhiều sản phẩm mục tiêu với các kích thước phân tách khác nhau từ các cặp mồi trong
cùng một phản ứng PCR (Markoulatos và ctv, 2002; Nguyễn Thành Luân và ctv, 2019).
Bên cạnh việc kiểm tra đồng thời nhiều yêu tố gây bệnh khác nhau, thì phản ứngmPCR có thê kiểm tra nhiều trình tự gen độc lực khác nhau cho cùng một yếu tố gâybệnh ở các chủng vi khuẩn phô biến như: E coli, Salmonella (Perry va ctv, 2007)
Các ứng dụng của kỹ thuật mPCR có thể ké đến như: phân tích đột biến và đa
hình (mutation and polymorphism analysis), phân tích định lượng (quantitative analysis), và phát hiện RNA (RNA detection) (Elnifro và ctv, 2000).
2.3.2 Nguyên tắc thực hiện phan ứng mPCR
Tương tự như kỹ thuật PCR, ở giai đoạn biến tính DNA sợi đôi được gia nhiệtđến 95 °C và tiến hành tháo xoắn thành DNA mạch đơn Ở giai đoạn bắt cặp, thay vì chỉ
sử dụng một cặp môi thì ở phản ứng mPCR, có thể sử dụng đồng thời nhiều cặp môi
tổng hợp cùng lúc các sản phâm PCR mục tiêu có kích thước khác nhau.
Tuy nhiên, vì sử dụng đồng thời nhiều cặp môi khác nhau sẽ xảy ra các trườnghợp các cặp mồi tự bắt với nhau, tao ra nhiều sản phẩm phụ do cặp môi khuếch đạikhông đặc hiệu hoặc khả năng bắt cặp chéo, kết thúc quá trình tổng hợp DNA mục tiêuquá sớm, các sản phẩm trong mPCR cho kích thước gần nhau khó quan sát, cặp mỗi này
ức chế hoạt động của các cặp môi khác, Vì vậy việc kiểm tra các thông số và độ đặc
hiệu của các cặp môi trong phản ứng mPCR là cần thiết dé giảm thiểu các trường hop
nói trên.
Sử dụng các cặp môi có nhiệt độ bắt cặp tương tự nhau, kiểm tra trên các phầnmềm Blast của NCBI, Thermo Fisher Scientific (cac trinh ty môi tối có chiều dài từ
Trang 1818 - 30 bp, %GC từ 35 - 60 %), sự hiện diện của trình tự môi đó không tương đồng trêncác bộ gen của các mẫu vi khuẩn khác (Elnifro va ctv, 2000).
Sản phẩm mPCR được tạo thành gồm nhiều sản phẩm khác nhau tương ứng với
số lượng cặp môi được sử dụng và các đoạn gen đó được khuếch đại chính xác ở kíchthước mong muốn Cách quan sát kết quả tương tự như phản ứng PCR
2.4 Sơ lược về ngành nuôi chim yến và các vấn đề liên quan
Trong nhiều năm trở lại đây, ngành nuôi chim yến đã và đang trở thành ngànhnghé được quan tâm đầu tư va dem lại lợi nhuận, giá trị kinh tế cao, nhiều nhà nuôi chim
yến được xây dựng và đi vào hoạt động, tính đến tháng 12/2018 ghi nhận gần 9000 nhà
nuôi chim yến trải dài ở ba miền Bắc, Trung, Nam Việc phát triển ngành nuôi chim yến
sẽ kéo theo những van đề liên quan như việc đảm bảo nguồn thức ăn, chi phí xây dựng
và bảo trì nhà nuôi chim yến cũng như việc dam bao chất lượng tổ yến được cung cấpcho người tiêu dùng (Đỗ Văn Hoan, 2018; Nguyễn Lân Hùng Son, 2019)
Theo như chúng ta đã biết, tô yến là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao vàtốt cho sức khỏe người sử dụng (Trần Thị Lan Hương, 2015; Nguyễn Lân Hùng Sơn,2019) Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tô yến như nguồn thức ăn, môi trườnglàm tô, các bệnh thường gặp do tập tính sinh thái Vì vậy, việc phát hiện, phòng ngừa vàđiều trị là cần thiết (Hồ Thị Loan, 2018)
2.5 Sơ lược về vi khuẩn E coli và phân loại các subtypes gây bệnh
2.5.1 Sơ lược về vi khuẩn E coli
Vi khuẩn là những vi sinh vậy nhỏ bé có kích thước hiển vi (1 - 3 uum), cầu tao
bởi tế bao nhân sơ, là những vi sinh vật cổ xưa nhất xuất hiện khoảng 3,5 tỷ năm trướcđây Chúng sống ở khắp nơi trên Trái Đất như: đất, nước, không khí và cơ quan ruột ởđộng vật (như vi khuẩn E coli, Salmonella, ), thực hiện hoạt động dinh dưỡng dưới
nhiều hình thức như: hóa tự dưỡng, quang dưỡng, hóa dị dưỡng, quang dị dưỡng hoặc
có thê sống trong mối quan hệ ký sinh với cơ thé vật chủ (Vũ Văn Vu, 2015)
E coli là vi khuẩn gram âm, hiếu khí hoặc ky khí, có dang hình que, phần lớncau trúc có đuôi dé dé bám dính trên bề mặt vật chủ, thuộc chi Escherichia, thường duoctìm thấy trong hệ cơ quan đường ruột ở người và động vật nói chung E coli sống kýsinh trong đường ruột ở người và các loài động vật khác, phần lớn không gây hại cho cơthé vật chủ mà còn giúp tông hợp các chất như: glucose, lactose, chỉ số ít có mang các
nhóm mang gen độc lực gây bệnh như ETEC, DAEC, EAEC, EPEC, EHEC, là nguyên
7
Trang 19nhân gây bệnh tiêu chảy các cap ở người và các loài động vật nói chung (Campieri và ctv, 2001; Koochakzadeh va ctv, 2015).
Flagellum —
Nucleoid (DNA)
Ribosomes
Cytoplasm Plasma Membrane
E coli (Dreamtimes: https://www.dreamstime.com); (5) Vi khuan E coli duoc
quan sat dưới độ phóng đại 10961X thuộc chung O157:H7 (Public Heath Image
Library (PHIL): https://phil.cde.gov/default.aspx).
Ngoài ra, E coli con được xem như một vi sinh vật chi thi cho sự nhiễm phân ở
các loài động vật, thông qua phân các nhóm subtypes mang gen độc lực gây bệnh được
thải ra môi trường bên ngoài, tùy điều kiện mà chúng có thé tổn tại và phát triển nếu
trong thời gian này, các cơ thê động vật khác tiêp xúc với phân có chứa các vi khuân
Trang 20đang phân chia thì nguy cơ cao sẽ lây lan vả hình thành bệnh trên cơ thể vật chủ mới
(USGS science for a changing world: https://www.usgs.gov/).
2.5.2 Phan loại các subtypes E coli mang gen độc lực gây bệnh
Dựa vào kha năng xâm nhập và khả năng sản sinh độc tố mà E coli được phân
thành sáu subtypes: Enteropathogenic EF co/i (EPEC), Shiga toxin - producing E coli (STEC), Enteroaggregative E coli (EAEC), Enterotoxigenic E coli (ETEC), Enteroinvasive È coli (EIEC), Diffusely adherent Z coli (DAEC) Bên cạnh đó, người
ta da phát hiện thêm một loại E co/i mới là Adherent invasive E coli (AIEC) (Toma va ctv, 2003; Cabrera-Sosa va ctv, 2011; Ali va ctv, 2021).
Trans-oS
Granuloma OD Phagosome formation
Enterocyte Goblet cell M cell ~~
Hinh 2.5 Co ché hoat động cua các subtypes của E coli (Croxen va ctv, 2013)
Co ché gây bệnh của các subtypes cua È coli gây bệnh nói chung và ba loạisubtypes được dùng trong nghiên cứu này là ETEC, DAEC và EAEC được trình bày ở
Hình 2.5 Về cơ bản, các subtypes này phải bám lên các tế bào ruột của cơ thể vật chủ thìmới có thé gây bệnh ETEC hay còn gọi là E coli sinh độc tố ruột sử dụng các yếu tổ xâmlan (CFs) nhằm gắn vào tế bào ruột của cơ thé vật chủ DAEC hay còn gọi là E coli kếtdính lan toa, chúng nam rải rác trên bề mặt tế bào ruột của cơ thể vat chủ khi có tác độnglàm tốn thương bề mặt tế bào ruột, chúng sẽ xâm nhập vào và lan tỏa ra những vùng xung
quanh đó EAEC hay còn gọi là E coli sinh tổng hợp đường ruột, loại nay tự tổng hợp
một lớp mang sinh học (biofilms) bao quanh nó và bề mặt hệ cơ quan ruột của vật chủ
Trang 21dẫn đến các yếu tô độc lực nay dính với bề mặt tế bào ruột gọi là “stacked brick” (Croxen
Shigella PAIs, pINV, stxt ¬
antivirulence genes, + Primarily S dysenteriae 1
>> flagella/fimbria*, * Not all EIEC
catabolic genes § LEE-positive STEC
v (Typical EPEC
EIEC/Shigella
Hình 2.6 Các yếu tố độc lực gây bệnh trên các subtypes E coi mang
gen độc lực (Croxen và ctv, 2013).
Mỗi subtypes E coli được phân loại dựa trên cơ chế xâm nhập và các gen độc lực
gay bệnh hiện diện trên mỗi subtypes đó Dựa vào Hình 2.6, subtype ETEC mang các yếu
tố xâm lần (CFs) được trình bày trước đó và hai loại độc tố khác là LT và ST, subtypeDAEC mang các yếu tô gây kết dính bề mặt ruột là Afa/Dr, subtype EAEC mang yếu tốsinh tổng hợp là pAA (Croxen và ctv, 2013)
2.5.2.1 Enterotoxigenic E coli (ETEC)
ETEC được nghiên cứu rộng rãi trên nhiều đối tượng khác nhau như các loài giasúc (Borriello và ctv, 2011; Nguyễn Tuan Anh và ctv, 2014), trên con người (Toma vàctv, 2003; Lê Thị Ai Vy va ctv, 2022) Bên cạnh các yếu tố xâm lan (CFs) (Madhavan
và ctv, 2015), ETEC còn có hai loại độc tố ruột (enterotoxin) đã được nghiên cứu sâu
về tính chất sinh lý, sinh hóa và tính truyền bằng plasmid đó là độc tố ruột không bềnnhiệt LT (Heat-labile toxin), độc tố ruột bền nhiệt ST (Heat-stable toxin) đây cũng làyếu tố được nghiên cứu nhiều ở subtype ETEC
2.5.2.2 Diffusely adherent E coli (DAEC)
Đối với subtype này các nghiên cứu còn hạn chế bởi vì sự biểu hiện của DAEC
trong môi trường tự nhiên không rõ rệt như các subtypes khác trong nhóm các E coli
mang gen độc lực gây bệnh DAEC được phân loại dựa vào yếu tố kết đính (DA) trên tếbào Hep-2 được điều hòa bởi Afa, F1845, Dr được mã hóa bởi các gen afa, daa, dra,
10
Trang 22những phức hợp này bám dính trên bề mặt đường ruột và gây một số trường hợp tiêu
chảy ở người (Meza-Segura va ctv, 2016; Zaidiva ctv, 2020).
Adherence to intestinal epithelial cells
Healthy IECs DAEC infection @® DApattern ® _ Biofilm (Cah) ®
POOR HDDS be ae eee
Pathogenesis
Complement resistance Ironacquisition @_ Sat ® ET2 (O)
errre eecce eeece
mi 7 MG 3912| tải AG
/ DAF Hf RCECAMS sŠ” TJ K@ IR Z1 @ Sat @ acquisition (1355) 7 Gb x * resistanceron Em >< Complement
system factors
Hình 2.7 Cơ chế xâm nhập của subtype DAEC (Zaidi, M B va ctv, 2020)
2.5.2.3 Enteroagøregative E coli (EAEC)
Nhiéu nghiên cứu subtype EAEC trên đối tượng là con người vì sự hiện diện của
EAEC trên người là rõ ràng nhất Trong nghiên cứu về khả năng khuếch đại của gen
agsR trên subtype EAEC, người đã chia EAEC thành hai nhóm là EAEC điển hình
dương tính với gen aggR (tEAEC) và EAEC không điển hình âm tính với gen aggR
(aEAEC) (Nataro, 2005) Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) vào năm 2011, EAEC
-STEC O104:H4 là nguyên nhân cho đợt bùng phát dịch bệnh tiêu chảy ra máu ở 16 quốc
gia trên thé giới (Zaidi va ctv, 2020)
11
Trang 232.6 Cơ chế gây bệnh
Secondary transmission
Asymptomatic or Humans
cross contamination _-~‡ EAEC STEC |- Sewage
STEC EAEC <7” EPEC EIEC ~s STEC EIEC
ETEC EIEE z” ETEC „ ETEC
© A Consumption Consumption,
Transmission
Hình 2.8 Tổng quan về cơ chế lây nhiễm của các E coli mang gen độc
lực (Croxen và ctv, 2013).
Cơ chế lây nhiễm của vi khuẩn E coli được chia làm hai con đường lây nhiễm
chính là nguồn tác nhân bắt nguồn từ động vật (sơ cap) và nguồn tác nhân bắt nguồn từ
con người (thứ cấp) Đối với con đường lây nhiễm sơ cấp với vật chủ là động vật, ghi
nhận sự hiện diện của subtype ETEC, chúng lây nhiễm trực tiếp giữa động vật đangmang mầm bệnh với động vật đang khỏe mạnh hoặc có thé lây nhiễm trực tiếp sang conngười thông qua các hoạt động sinh hoạt hằng ngày như ăn uống thịt động vật Bên cạnh
đó, có thé lây nhiễm gián tiếp thông qua các nguồn thức ăn, nguồn nước mang mam
bệnh khi các nguồn tác nhân này tiếp xúc với loài động vật mang mam bệnh Khi chấtthải của chúng đi vào môi trường thông qua các hoạt động hấp thụ vào đất, vào nguồnnước dẫn đến việc nguồn thực phâm và nguồn nước chứa nguồn vi khuẩn gây bệnh, con
người khi tiếp xúc với thực phẩm bao gồm động vật và thực vật, Thông qua việc tiêu
thụ thức ăn, nước uông hoặc có thê tiép xúc với nguôn nước thông qua hoạt động vui
12
Trang 24chơi, sinh hoạt, dẫn đến việc mang các chủng vi khuẩn E coli mang gen độc lực gây
bệnh (Croxen và ctv, 2013).
Đối với con đường lây nhiễm thứ cấp ở vật chủ là người, có sự hiện diện của hai
subtypes ETEC, EAEC Con người là vật chủ mang các chủng vi khuẩn E coli mang
gen độc lực gây bệnh, thông qua các hoạt động sinh hoạt, vui chơi, trao d6i chất có thégây lây nhiễm các chủng vi khuẩn này giữa các cá thể người với nhau, hoặc gián tiếpgây lây nhiễm cho động vật qua các chất thải thải ra môi trường Tuy nhiên, sự hiện diệncủa các subtypes E coli gây bệnh trên người ghi nhận tỷ lệ thấp (Croxen va ctv, 2013)
Subtype ETEC hiện điện trong hầu hết các nguồn lây nhiễm như động vật, con
người, thực phẩm, nguồn nước Trong đó, nguồn tác nhân động vật được xem là cơ chế
lây nhiễm phô biến của subtype ETEC, nhiều nghiên cứu được tiến hành dựa trên tácnhân này, ghi nhận sự hiện rộng rãi, phố biến của subtype ETEC trên động vật
2.7 Thành tựu nghiên cứu
2.7.1 Thành tựu nghiên cứu trong nước
Năm 2014, Nguyễn Tuấn Anh và ctv đã xây dựng thành công quy trình Multiplex
PCR dé phát hiện ba loài vi khuân với các cặp mỗi tương ứng Salmonella spp (SA
-F/R), C perfringens (CL - F/R) và E coli - ETEC (EC - F/R) là nguyên nhân gây tiêu
chảy cấp ở lợn trên các mau phân va mẫu mô ruột non của lợn con so sinh bị nghi nhiễmbệnh ở Khu vực Đồng Nai
Dé xác định khả năng phát hiện các E coli mang gen độc lực cũng như so sánhkhả năng phát hiện giữa hai phương pháp PCR và LAMP Trong nghiên cứu của Trần ThịThanh Huyền và ctv (2019), 25 mẫu vi khuẩn được phân lập từ mẫu phân của bệnh nhântiêu chảy, 1 mẫu âm tính và 2 mẫu vi khuẩn YTN1, YTN2 là những vi khuẩn E coli khônggay bệnh dé tiến hành phản ứng LAMP với 4 cặp môi được thiết kế đặc hiệu dé khuếchđại gen eae đồng thời thí nghiệm cũng tiến hành xác định giới hạn phát hiện gen eae cho
cả hai phương pháp.
Trong nghiên cứu của Lê Thị Ái Vy và ctv (2022), khảo sát tỷ lệ và tính đề khángkháng sinh của E coli ở trẻ em Thí nghiệm được tiến hành trên 81 chủng F coli phânlập từ mẫu ở trẻ em dưới 5 tuổi tiêu chảy cấp tại bệnh viện Hoàn Mỹ (Đà Lạt) bằng cácphản ứng Multiplex Realtime PCR để xác định các gen sinh độc tố: EAEC, ETEC,
EPEC, EHEC, E coli O157 với các E coli thường trú.
13