Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Xác định một số chi nấm gây bệnh đốm lá trên lan Dendrobium spp

Để làm sáng tỏ mầm bệnh gây nên các vết bệnh trên,các phân lập từ lá có triệu chứng bệnh đã được phân nhóm và thực hiện thử nghiệm xác định khả năng gây bệnh trên Dendrobium spp.. Thử ng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

-KHOA -KHOA HỌC SINH HỌC

XÁC ĐỊNH MOT SO CHI NAM GÂY BỆNH DOM LA

TREN LAN Dendrobium spp.

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : HUỲNH THỊ HÒNG PHÁN

Mã số sinh viên : 19126131

Niên khóa : 2019 — 2023

TP Hồ Chi Minh, 08/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH MỘT SÓ CHI NÁM GÂY BỆNH ĐÓM LÁ

TREN LAN Dendrobium spp.

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

GS TS BÙI CÁCH TUYẾN HUỲNH THỊ HONG PHAN

`

Bat Cah Tayo

TP Hồ Chi Minh, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến với gia đình em Con xin khắc ghi công ơn

sinh thành của cha mẹ, con xin cảm ơn cha mẹ đã nuôi dưỡng, chăm sóc, che chở cho

con dé vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống và học tập Chị cảm ơn em trai đã yêu

thương, quan tâm và chăm sóc cha mẹ trong những lúc anh đi học xa nhà Con cảm ơn gia đình luôn theo dõi, ủng hộ việc học tập và làm việc của con, là động lực mạnh mẽ

và chỗ dựa tốt nhất cho con

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm

TP Hồ Chi Minh cùng tất cả quý thầy cô Khoa Khoa học Sinh học đã tận tình dạy d6,

giúp đỡ em trong thời gian theo học tại trường.

Con xin chân thành cảm ơn GS TS Bùi Cách Tuyến, PGS TS Lê Đình Đôn và

ThS Võ Thị Thúy Huệ đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho con những kiến thức quý

báu và tạo mọi điều kiện tốt nhất dé em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này

Minh xin cảm ơn các bạn tại phòng thí nghiệm Chan đoán bệnh cây luôn sẵn sanggiúp đỡ mình trong suốt quá trình hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này

Minh xin gửi lời cảm ơn đến với tập thể lớp DH19SM đã đồng hành và giúp đỡmình trong suốt thời gian học tập tại trường

Trân trọng cảm on !

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Em tên Huỳnh Thị Hồng Phan, MSSV: 19126131, Lớp: DH19SM, thuộc ngànhCông nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây

là Khóa luận tốt nghiệp do bản thân em trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong

nghiên cứu là hoàn toan trung thực và khách quan Em xin hoàn toản chịu trách nhiệm

trước Hội đồng về những cam kết này

Tp Hô Chi Minh, tháng 08 năm 2023

fh

và gây rụng lá ở giai đoạn cuối Để làm sáng tỏ mầm bệnh gây nên các vết bệnh trên,

các phân lập từ lá có triệu chứng bệnh đã được phân nhóm và thực hiện thử nghiệm xác

định khả năng gây bệnh trên Dendrobium spp trong điều kiện phòng thí nghiệm Kếtquả nghiên cứu cho thấy các phân lập gây bệnh sau 21 ngày gây nhiễm với tỉ lệ gây vếtbệnh từ rất thấp (8,3%) đến cao (100%), một số phân lập không gây vét bệnh Dựa vàođặc điểm hình thái đại thể và vi thể, các tác nhân gây bệnh đốm lá được xác định là

Fusarium spp., Colletotrichum spp., Curvularia spp và Pestalotiopsis spp Trong đó

Pestalotiopsis spp chi được phan lập từ các lá có đốm tròn với quang vàng nhạt,Fusarium spp xuất hiện tại cả ba nhóm triệu chứng bệnh và Curvularia spp có rat itphan lập Cho đến hiện tại, Pestalotiopsis spp và Curvularia spp được biết là lần đầugây bệnh đốm lá trên Dendrobium spp Thử nghiệm kiểm tra đặc điểm sinh học đã thựcthực hiện và xác định môi trường PDA ở 25°C phù hợp nhất đối với sự sinh trưởng củatan nam, trong khi bao tử chống chịu và qua thể được quan sát trên môi trường OMA.Kết quả nghiên cứu gợi ý sự đa dang về tác nhân gây bệnh đốm lá và cần thiết cho phattriển các phương pháp phòng trừ bệnh đốm lá trên Dendrobium spp

Từ khóa: Fusarium spp., Colletotrichum spp., Curvularia spp., Pestalotiopsis spp.

Dendrobium spp., bénh dém 1a

stages The fungal isolates were characterized based on the morphological features of

the artificial media and the pathogenicity tests on the healthy Dendrobium spp leaves The study results showed that the isolates caused disease after 21 days of infection with the pathogenicity rate from very low (8.3%) to high (100%), some isolates did not cause disease Based on the macroscopic and microscopic morphological characteristics, the causative agents of leaf spot disease were identified as Fusarium spp., Colletotrichum spp., Curvularia spp and Pestalotiopsis spp In which Pestalotiopsis spp isolated only from round spotted leaves with pale yellow halo, Fusarium spp appeared in all three groups of disease symptoms and Curvularia spp there are very few isolates Until now, Pestalotiopsis spp and Curvularia spp known to cause leaf spot disease on Dendrobium spp Biological characterization testing was performed and determined that PDA at 25°C was most suitable for the growth of fungal colonies, while resistant spores and fruit bodies were observed on OMA The study results suggest a diversity of pathogens causing leaf spot and are necessary for the development of methods to control leaf spot

on Dendrobium spp.

MỤC LỤC

Trang

LOI CAM 090.7 iXÁC NHAN VA CAM DOAN :ssssssessesssessesssessesssessesstsssessesssesseessetieesesiesiesseeseeseeseees ii

¡9y ,Ô iii

AB TRA Ces seccoech nenesgiver iecastnroectimen nadernet unineeierioers tetera neti eerie teem terion iv IMG, TG sane ninnniawnegniineion tne nnn HH ng HH nrg ei anoint oi onlenindnsinninonien cornclnonnoirn V

DAME BAGH CAG GHỮ VIET TAT sơnangguanioBigt2Hhg9Egi32NG9/5/000140104581000G010003307008g0 viiiDANH SÁCH CAC BẢNG -2222¿-22222222221222221.222 1.2 ixTHANH SẠCH Bá LINE eeeeoeeniesdibiedierodesdEenobsrgabbskieiiiniEp28g605ginl01gn-NE xEST U00 511 `Ẻ |

lO, banggnggughot tot hanGGIGENELSUGAGGETGSDIIGGSUEIGGIESLGIGSNGSGSHGIGHSSSIS.00008 g.H0 |1.2 Mục tiêu của đề tài - 5-5-5221 CS 12212211111111212111211111112111 111 rre 1

WSs \1:durre Thực THIẾN:ssssezsp230s9553002335:00308003638008835E483SS954218g09G485ST2.28xQBEIEGE31E43050AGA8059038SE 1

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU -2-©2222222222222222E+2EE+2ESz2zxr>zxrrrez 22.1 Téng quan vé Dendrobitm nugg§ạạử ẢẢ 22.1.1 Phân bố và đa dang của Dendrobium spp -:.-:-s:-scssssecsessesssesessessessesseessesseessees 22.1.2 Đặc điểm hình thái và điều kiện sinh thái của Dendrobium spp -. 3

2.1.3 Sơ lược về triệu chứng bệnh đốm lá trên Dendrobium Spp -5- 4

2.2 Các nghiên cứu về nam gây bệnh đốm lá trên Dendrobium SỤp - - 52.2.1 Một số nghiên cứu về Fusarium spp gây bệnh đốm lá trên Dendrobium spp 52.2.2 Nghiên cứu về Colletotrichum sp gây bệnh đốm lá trên Dendrobium spp 82.2.3 Một số nghiên cứu về Alternaria spp gây bệnh đốm lá trên Dendrobium spp .82.2.4 Nghiên cứu về Cladosporium sp gây bệnh đốm lá trên Dendrobium spp 92.2.5 Nghiên cứu về Trichoderma sp gây bệnh đốm lá trên Dendrobium spp 10

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2 25S2S22E22E2222222zzzzzzz 11

Vv

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ¿- 2¿22+22++22++2EEEEE2EECEEErEErrrrrrrrree 11 3.2 Vat let V4 ĐhƯƠHE Phap HBHIỆH CU acess cenccccenseeneenssrsveunsn sees eanenes meena 11

S01 eatin mẫu Thí ng] HN HH Hy hưu kg E16003031.6g2075001 113.2.2 Hóa chat, dung cụ va thiẾt Di cccccccccccccecsesseeeceesseeseesessseeseteseesssneaeeeees 113.2.3 Phuong pháp thu thập va phân lập mam oo cece ees eesseesseessesssessesstessteeneess lãi3.2.3 Phương pháp xác định khả năng gây bệnh của nam trên Dendrobium spp 123.2.4 Định danh các mẫu nam bằng đặc điểm hình thái - 2 2 22552225222 133.3 Xử lý số liệu -. - -©s+S12E21921211212212112111211112111121121211211121121111111 11211 rreg 13CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2- 2 S+S<‡E2EE£EE2EEEEEEEErkerkrei 144.1 KẾT quả - 2-52-2222 21E21921221212122121211121111111212111111212121121211211 11 xe 14

4.1.1 Thu thập và phân lập các tác nhân gây bệnh trên Dendrobium spp 14

4.1.1.2 Phân lập mẫu nắm bệnh - 2-2 +S+£SE£EE£2E#EE2E2E22E225222223221223223222.2Xe2 154.1.2 Xác định khả năng gây bệnh của nam trên Dendrobium SPp - . 184.1.3 Định danh hình thái các tản nấm 2 2+ +SE+SE+E£EE£EE2EEEEEE2EEZEEEEEEErrxrei 224.1.3.1 Định danh hình thái tản nắm nhóm Ì -2- 2222 522E22E+2E+2E2zSzEzEzzzz2+2 224.1.3.2 Định danh hình thái tản nắm nhóm ÏI 2- 2 2222£2SE2E£2EE22E222+zZEz+2zzz+2 234.1.3.3 Định đanh hình thái tản nắm nhóm TII 2-22 2S£2E£2EE£E£2£Ez£Ez+Ez£+2 264.1.3.4 Định danh hình thái tản nắm nhóm IV 2- 2-52 +S+S2+E££E£EE+E££E+EE+EzzEzrxzez #74.1.3.5 Định danh hình thái tản nắm nhóm V 2¿ 22 522SS+2E+2E22E22E22E22E22222222 284.1.4 Đặc điểm sinh học các tản nam trên môi trường nuôi cấy -2-5- 304.1.4.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cây đến hình thai tản nắm - 304.1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hình thái tan nắm -2-5- 33

4.2 Thảo luận 2- 2-52 2S22E925122122112212211211211211211111211112111111121111211 21121 re 35

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ 2-52 +2S2+E22E921252212212112122121221 21 2e, 38

bì" Sr addiảằ‡Ừ— 38

5.2 Để nghị -2- 5-22 2S 21 2121212112112112121212111112112121121212112121211 121 re, 38

vi

TÀI LIEU THAM KHẢO 2-52 S1‡SE£2E92E2E9212112112112112121212121212121 21 xe 39I8! A2775 39

Ti Tiệu tiếng thư: NHÍ, ee 39

5108060 9 43

Phụ lục 1: Kết đá gay bệnh THAN LOocseeeearnianbiEdiSSSV1A01SE5848S0580890810382g8880 36g09 XI 43Phụ lục 2: Kích thước bào tử và giác bám của nấm -22+s2s+2z+zz+zzzzzzzzzez 49Phụ lục 3: Đường kính các chủng nam trên môi trường nuôi cấy - 53

vil

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

PDA: Potato D-glucose agar

OMA: Oat meat agar

WA: Water agar

viii

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Bảng 4.1 Triệu chứng bệnh đốm lá trên mẫu thu thập tại TP Hồ Chí Minh 15Bang 4.2 Các chủng nắm thu được trên mẫu bệnh đốm lá tại TP Hồ Chí Minh l6Bảng 4.3 Tỉ lệ xuất hiện vết bệnh nhân tạo trên Dendrobium 0 19Bảng 4.4 Kích thước vết bệnh nhân tạo trên Dendrobium Spp -5-55-52 20Bang 4.5 Đường kính tản nam (mm) sau 7 ngày nuôi cấy trên các môi trường 30

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 4.1 Triệu chứng đốm lá trên lan Dendrobium Spp -2 2-55z5525552 14Hình 4.2 Hình thái các tản nắm nhóm | - 2-2 2SS+SE+S£E£EE+EE2E£EE2EEZEzEEzEzzEcrxrei 17Hình 4.3 Hình thái các tản mam nhóm II -2- 2222 E+EEEE+EE+EE+ZE+EE2ZEZE2ZE2z2z2ze2 17Hình 4.4 Hình thái các tản nắm nhóm IIT - 2: 22S£S£EE£+E£EE+£E££E££Ez£E+£EzEzzzzzez 18Hình 4.5 Hình thái các tản nắm nhóm IV oo cccccecccscssessessesseesessecsessessessessessessessesseeees 18Hình 4.6 Hình thái các tản nắm nhóm V - 2-52 SS+S2+E+EE£EE£E£EE£EE2EEEECEErErrrrxrei 18Hình 4.7 Vết bệnh nhân tạo va bao tử nắm tại vết bệnh sau 21 ngày chủng 21Hình 4.8 Đặc điểm hình thai tan nấm nhóm I (1-2-0109) eececeeeeccessessesseeseeseeseeees 32Hình 4.9 Đặc điểm hình thái các tản nắm nhóm II - 2: 2 2+S£S2+E££E+££+EzzEzzzzzz 23Hình 4.10 Đặc điểm hình thái các tan nam nhóm TII - 2-52 sS2+S££££££2E£Ez£zzz4 26Hình 4.11 Đặc điểm hình thái tan nắm nhóm IV (IV-3-1579) 5:5525525522 27Hình 4.12 Đặc điểm hình thai các tản nam nhóm Vo cscceccccsseseeceeseesesseseeseeeeseeeeeeess 28Hình 4.13 Đặc điểm hình thái đại thé các tan nam sau 14 ngày nuôi cấy ở 25°C 31Hình 4.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến đặc điểm hình thái các tan nam 34Hình 4.15 Tỉ lệ phần trăm các tác nhân nam được phân lập từ ba nhóm triệu chứngđốm lá trên Dendrobium SỤỤ 5:52©52©522222522222E2222215251232212211212212112121221212 X65 35

bệnh bạc lá) (Sarsaiya va ctv, 2019; Zhang va ctv, 2023) Trong nghiên cứu này, các cây

lan Dendrobium spp có triệu chứng đốm lá được thu thập tại vườn lan thuộc thành phô HồChí Minh Ở thử nghiệm xác định khả năng gây bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm, các

tác nhân được xác định là Fusarium spp., Colletotrichum spp., Curvularia spp va

Pestalotiopsis spp Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rang Fusarium spp vaColletotrichum spp gây nên bệnh đốm lá, héo vàng và than thư trên Dendrobium spp.(Wang và ctv, 2018; Fernández-Herrera va ctv, 2020) Ở nghiên cứu này, Curvularia spp

và Pestalotiopsis spp được phát hiện là gây nên các vết bệnh tương tự đốm lá trên lanDendrobium spp Dựa trên giá trị kinh tế mà lan này mang lại, mục đích nghiên cứu là tìmhiểu về tác nhân gây bệnh đốm lá cho Dendrobium spp

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định một số chi nam gây bệnh đốm lá trên lan Dendrobium spp

1.3 Nội dung thực hiện

Thu thập va phân lập tác nhân gây bệnh trên lan Dendrobium spp.

Xác định kha năng gây bệnh trong phòng thí nghiệm của các chủng nam đã phân lập.Định danh các chủng nam bang đặc điểm hình thái và kiểm tra đặc điểm sinh học của

các tác nhân nâm trên môi trường nuôi cây nhân tạo.

CHƯƠNG 2 TÔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tông quan về Dendrobium spp

2.1.1 Phân bố va đa dạng của Dendrobium spp

Lan Dendrobium spp được biết với tên tiếng Việt là Lan hoàng thảo, thuộc giới

Plantea, bộ Asparagales, họ Orchidaceae, tông Podochileae va phân tông Dendrobiinae Ho

lan thuộc bộ Măng tây và là một trong những họ có số lượng loài lớn nhất của giới Thực

vật, với hơn 28000 loài được xác định trong 763 chi (ZhangS va ctv, 2018) Chi Lan hoàng

thao (Dendrobium spp.) có số lượng loài lớn, màu sắc và hình dáng rất đa dạng, gồm hơn

1200 loài Dendrobium spp phân bố ở lục địa nhiệt đới châu Á, Đài Loan, Nhật Bản,Malaysia, Singapore, Brunei, Philippines, Indonesia, Papua New Guinea, Uc, New Zealand,

các dao Thái Binh Duong (Cribb va Govaerts, 2005; Wood, 2006) Dendrobium spp đã có

mặt trên luc địa Chau A kể từ thé Tiệm Tân, sau đó chi này đã đa dạng hóa trong khu vực

và phân tán sang Malaysia và các lục địa khác (Xiang và ctv, 2016) Các loài ban đầu đượcphân bố chủ yếu ở các vùng có độ cao thấp (< 1000m), sau đó lan sang các khu vực có độcao cao hơn (> 1000 m) Ở Việt Nam, có 107 loài Dendrobium spp phân bố ở các vùng núi

từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển (Diém va ctv, 2020)

Các loài lan mới được mô tả với tốc độ khoảng 500 loài mỗi năm, chủ yêu phân loạidựa vào đặc điểm kiểu hình và môi trường sống Các chi mới được mô tả với tốc độ khoảng

10 — 13 chi mỗi năm (Chase và ctv, 2015) Sự đa dạng của Dendrobium spp không phảichỉ nằm ở kiểu gen mà còn là sự thay đổi kiểu hình qua từng độ cao và khu vực Ở ViệtNam, Dendrobium spp được xếp trong 14 tông, được phân biệt bằng thân (giả hành), lá vàhoa (D C Kiên, 2006) Tuy nhiên, nhiều loài tại nước ta đã bị tuyệt chủng hoặc bị đe dọatuyệt chủng, một số loài nằm trong danh mục đỏ của “Sách đỏ Việt Nam” (Quang va ctv,2018) Vì màu sắc và hình dang độc đáo, Dendrobium spp được xem là một loài lan thanhlịch, mang lại giá tri kinh tế cao Bên cạnh giá trị thường thức như một loại cây cảnh, một

số loài Dendrobium spp đã được báo cáo là có được tính truyền thống, có các hoạt tínhchống ung thư, chống viêm, chống oxy hóa, kháng nắm và tăng cường miễn dịch (Sattayasai

và ctv, 2009; Kim va ctv, 2015).

2.1.2 Đặc điểm hình thái và điều kiện sinh thai của Dendrobium spp.

Những loài tô tiên của Dendrobium spp là thực vật biểu sinh, một số ít sống trên cạn

và thạch sinh (Hew và Yong, 1997; Xiang và ctv, 2016) Ở thành phố Hồ Chí Minh, lanDendrobium spp là loài phong lan và địa lan có nhiều thân giả (giả hành) và cơ quan sinhsản như hoa, trái Hoa lan đối xứng hai bên gồm ba lá đài và ba cánh hoa, với cánh hoa ởgiữa (hay còn gọi là môi hoa) có kích thước, hình dạng và màu sắc hoa đa dạng như trắng,vàng, hồng và tím Phan lớn cánh hoa Dendrobium spp có hình trứng, môi hoa có lôngmịn, là điểm nhấn và yếu tố quyết định chính cho giá trị làm cảnh của hoa lan Ba lá đài cómàu sắc và hình dạng tương tự cánh hoa Hoa lan có mùi hương rất đa dạng và đặc sắc, thuhút thị hiếu của thị trường cây cảnh tại thành phố Hồ Chí Minh và các khu vực khác Hoa

có thê mọc từ giả hành thành từng chùm hay từng hoa Hầu hết các loài có hoa lâu tàn, thờigian nở trung bình từ 1 — 2 tháng, có loài đến 3 tháng, có loài có thé nở hoa quanh năm.Cành hoa mọc ra từ các cuống lá ở giả hành hoặc ngọn sinh trưởng Hoa lan trong tự nhiênsinh sản bằng hình thức giao phấn và tạo quả Quả lan thuộc loại quả nang, khi hạt chín,các nang bung ra chỉ còn dính nhau ở phần đỉnh và gốc Ở một số loài, khi chín quả khôngnứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát Các giả hành có hệ thống nhánh nằmngang trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ Giả hành tương đối cứng, có dạnghình trụ hoặc hình nón, một phần của giả hành được bao bọc bởi các cuống lá Các giả hànhnày chịu trách nhiệm dự trữ nước cho cây và chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được

Có từ một đến nhiều lá được sắp xếp theo đạng mọc đối hoặc mọc cách, hình dạng khácnhau từ bầu dục, hình thoi đến mũi mác Lá không có gân, thường rất day va mong nước,một số loài có lá rụng vào mùa khô Dendrobium spp thuộc nhóm rễ khí sinh, có dạng hìnhtrụ, thon dai và có màu trắng, đỉnh sinh trưởng rễ màu xanh nhạt Rễ có khả năng phânnhánh mạnh tùy theo loài và điều kiện sinh trưởng

Dendrobium spp ở thành phô Hồ Chí Minh chủ yếu là loài ưa nóng với điều kiệnnhiệt độ 25°C — 35°C Các loài này sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện 60 — 70%ánh sáng tự nhiên, thời gian chiếu sáng trung bình 12 giờ/ngày và độ âm không khí 60 —70% Cây được bồ sung dinh dưỡng từ các loại phân bón hữu cơ dạng viên, rễ lan hap thụdan dan các dưỡng chất được phóng thích qua quá trình tưới nước

3

2.1.3 Sơ lược về triệu chứng bệnh đốm lá trên Dendrobium spp.

Ho lan nói chung và Dendronium sp được báo cáo là bị tấn công bởi các tác nhân lànam, gây ra nhiều triệu chứng khác nhau như bạc lá, đốm lá, thối thân, ri sắt và bệnh bạc láhoa Bệnh đốm lá, nam lá hay nắm hoa anh hưởng xấu đến thầm mỹ của cây và đa số khônggay chết cây Một số nghiên cứu trước đây đã chỉ ra tác nhân gây bệnh dém lá trên lan thuộc

về các chi nam Fusarium sp., Colletotrichum sp., Alternaria sp., Cladosporium sp Phanlớn tác nhân gây đốm lá trên Dendrobium thuộc chi Fusarium (Lee va ctv, 2003; Mohd va

M H., 2021; Sarsaiya va ctv, 2022), nam Colletotrichum sp chu yếu gây bệnh thán thư

(Lan va ctv, 2016; Ma và ctv, 2018; Fernández-Herrera và ctv, 2020), 4/ernaria sp chủ

yếu gây bệnh bạc lá (Uchida va ctv, 1979; Stfeda và ctv, 2013), Cladosporium sp chủ yêu

là nam mốc phát tán trong không khí và đôi khi gây nên các vết đốm nâu trên thực vật(Khan M và ctv, 2016; Zhang và ctv, 2022) Ngoài khả năng gây bệnh, một số loai thuộccác chi nắm này được biết đến là nam nội sinh có ich (endophyte), giúp điều hòa quá trìnhsinh trưởng và phát triển của cây Các loài nam nội sinh có thé chuyên từ giai đoạn cộngsinh sang gây bệnh cho cây chủ bởi một số điều kiện ngoại cảnh như stress hoặc do gene(Sarsaiya và ctv, 2019) Điều này ảnh hưởng đến việc xác định tác nhân gây bệnh chính, vì

vậy thử nghiệm gây bệnh nhân tạo được thực hiện trong nghiên cứu này.

Theo Mohd và M H (2021), triệu chứng của đốm lá là những vết bệnh có màu nâuhoặc nâu đen không đều xuất hiện trên lá, ở giai đoạn nặng, lá nhiễm bệnh bị khô và rụng

lá Mầm bệnh đốm lá do nắm thường ở dạng bao tử lây nhiễm qua các 16 mở tự nhiên nhưkhí không hoặc xâm nhập trực tiếp qua lớp biểu bì và thành tế bao của lá lan Các vết thương

hở do tác động vật lí hay do côn trùng thường là điều kiện giúp nắm bệnh dễ dàng xâmnhập, vì vậy thử nghiệm gây bệnh nhân tạo được thực hiện với hai nghiệm thức có gây vếtthương và không gây vết thương Dé xâm nhập trực tiếp, nắm tạo ra các enzyme thủy phannhư cutinase, cellulase, pectinase và protease dé phá vỡ mô ký chủ Khi ở bên trong lá cây,nam lay chất dinh dưỡng từ các tế bào và gây chết tế bào (hoại tử) Nắm gây bệnh xâm nhậpvào lá cây chủ yếu trong điều kiện nhiệt độ cao và mưa âm, vì vậy thử nghiệm kiểm tra khảnăng gây bệnh nhân tạo được thực hiện trên cây lan mô sạch bệnh trong điều kiện âm độcao (70% — 80%) và nhiệt độ ồn định (27°C)

2.2 Các nghiên cứu về nam gây bệnh đốm lá trên Dendrobium spp.

2.2.1 Một số nghiên cứu về Fusarium spp gây bệnh đốm lá trên Dendrobium spp

Nam Fusarium sp thuộc ngành Ascomycota, lớp Ascomycetes, bộ Hypocreales, họNectriaeae Fusarium sp được mô ta lần đầu bởi Mag và các cộng sự của ông năm 1809.Phân loài trong chi này rất phức tạp, một số sơ đồ phân loại học vẫn còn gây nhiều tranhcãi và hơn 1000 loài đã được xác định (Moretii, 2009) Chi Fusarium bao gồm nhiều loàinắm gây bệnh thực vật nguy hiểm nhất, xếp hạng thứ năm trong danh sách các loại nắm gâybệnh thực vật hàng đầu dựa trên tầm quan trọng về mặt khoa học và kinh tế (Ploetz, 2005;Dean và ctv, 2012) Hầu hết các loài trong chi Dendrobium spp và các chi lan khác đều đãđược báo cáo nhiễm bệnh do Fusarium spp (Leslie va ctv, 2006; Sarsaiya va ctv, 2019)

Ở các nghiên cứu trước day, Fusarium spp đã được báo cáo gây nên vét bệnh dém lá trênlan Dendrobium spp bao gồm F circinatum, F oxysporum, F proliferatum, F poae, F

sacchari, F solani (Ichikawa va ctv, 2000; Lee va ctv, 2003; Wang va ctv, 2018; Sarsatya

va ctv, 2019; Mohd va M H., 2021).

Tai Nhat Ban năm 2000, Ichikawa và cộng sự phát hiện Fusarium proliferatum gay

nên các vết bệnh đốm đen trên Dendrobium spp khi tim hiểu tác nhân gây bệnh trênCymbidium sp Tuy nhiên các mô tả về hình thái của phân lập F proliferatum trên môitrường nuôi cấy nhân tạo vẫn còn mơ hồ Ở những năm sau đó, F proliferatum được baocáo là gây bệnh đốm vàng trên một số loài địa lan Năm 2018, Wang và cộng sự một lầnnữa phân lập F proliferatum trên Cymbidium sp và thực hiện thử nghiệm gây vết thươngnhân tạo trên Dendrobium spp Kết quả nghiên cứu cho thay F proliferatum gây nên cácvết dém bệnh màu den, trũng ở phan giữa trên 14 Dendrobium spp Các phân lập được mô

tả khi nuôi cay trên môi trường PDA là có màu tím hoặc cam nhạt, sợi nam nhô cao trênmặt thạch Dai bào tử hình lưỡi liềm thuôn dai, đỉnh khá cong, có 3 — 5 vách ngăn với tếbào gốc kém phát triển, chiều đài trung bình 40,6 — 59,6 um Tiểu bao tử trong suốt có hìnhthoi đến hình bầu, không có vách ngăn, kích thước 5.6 — 15,8 x 1,7 — 4,4 wm Tiểu bảo tửhình thành từ các thé bình, xếp thành từng chuỗi ngắn hoặc trên các đầu giả Không pháthiện sự hình thành bào tử chống chịu của các phân lập này

Một số lượng lớn các cây Dendrobium spp được báo cáo là nhiễm bệnh hàng loạt trênruộng trồng lan của nông dân ở Jeonnam, Hàn Quốc Triệu chứng bệnh bat đầu là các đốmnhỏ màu đen xuất hiện trên lá và lá bắt đầu chuyển sang màu vàng từ đầu lá, cuối cùng gâycháy lá và chết cây Mầm bệnh được Lee và cộng sự (2003) phân lập từ mô nhiễm bệnh cómàu trắng trên môi trường PDA và dần chuyền sang màu tim sam theo thời gian Với nhiệt

độ tối ưu cho sự phát triển của tản nam là 25°C, cành sinh bào tử hình thành các đại bao tử

có hình lưỡi liềm, kích thước 25,0 — 30,0 x 2,5 — 3,5 pum, có 1 — 2 vách ngăn, các dai bao tử

3 — 4 vách ngăn rất hiếm khi được hình thành Các tiêu bao tử cũng được hình thành với sốlượng lớn, bao tử trong suốt có hình thoi det và không có vách ngăn, kích thước 5,5 — 15,0

x 1,5 — 3,0 um Tiểu bào tử hình thành thành từng chuỗi trên môi trường CLA và khôngphát hiện bào tử chống chịu Những đặc điểm trên phù hợp với mô tả của Booth vàWaterston (1964) về hình thái Fusarium moniliforme và đây cũng là mô tả đầu tiên về F.moniliforme gây đỗm lá trên lan Dendrobium spp

Năm 2014, một loạt các chi nam Fusarium được Srivastava và S mô tả là tác nhângay bệnh trên các loài lan 6 Hawaii Dendrobium spp được báo cáo là có tỉ lệ bị tan côngbởi các nắm như F proliferatum, F oxysporum, F solani, F ciranatum, F poae và F.begoniae Mặc đù các vết bệnh trên lá chưa được mô tả là có liên quan đến bệnh đốm lá,

nhưng nghiên cứu giúp thu hẹp các tác nhân gây bệnh trên Dendrobium spp Năm 2018,

nhóm tác giả trên tiếp tục nghiên cứu và xác định F oxysporum, F solani, F ciranatum,

F poae là tác nhân mới gây các đốm trên lá và be lá F oxysporum và F solani có tỉ lệ gâybệnh trung bình cao, triệu chứng bệnh được mô tả là các đốm tròn màu vàng đến đen, đôikhi liên kết với nhau tạo thành các vết cháy lá và gây thối chéi non F ciranatum và F poae

có tỉ lệ gây bệnh rất thấp, chỉ tạo các vét đốm bệnh nhỏ Theo mô tả của Srivastava và cộng

sự (2018), F oxysporum trên môi trường PDA có màu trắng đến tim, được đặc trưng bởi

sự sinh sản déi dao các tiểu bao tử và bào tử chống chịu ở đầu giả hoặc đơn thé bình Daibao tử dang hình trụ với hai đầu nhọn, có 3 vách ngăn mỏng và mật độ lớn trên quả thể màucam khi nuôi cấy trên môi trường CLA Tiểu bao tử hình bầu dục, elip hoặc hình hạt đậu,thường không có vách ngăn Tản nắm của F solani trên môi trường PDA có màu trắng đến

kem, mặt sau đôi khi có màu xanh lục Đại bảo tử hình lưỡi liềm tương đối thẳng, có 3—7

vách ngăn, có mật độ lớn trên các quả thể màu kem trên CLA Tiểu bào tử hình bầu dục,elip hoặc hình hạt đậu, thường không có vách ngăn Tiểu bao tử và bào tử chống chịu đínhtrên đầu giả của sợi nam, bao tử chống chịu này đôi khi đính theo cặp Tản nam của F.ciranatum trên môi trường PDA có màu trắng đến tim Dai bào tử hình trụ với hai đầu nhọn,hoi det và thường có 3 vách ngăn mỏng Tiểu bào tử hình bầu dục đến hình trứng và không

có vách ngăn, được đính trên các đơn thể bình và đa thé bình Cấu trúc sợi nắm cuộn trònđược tìm thấy khi nuôi cấy trên slide là đặc điểm dé nhận biết loài nam này Tản nam của

F poae trên môi trường PDA có màu nâu đỏ Đại bào tử có dạng hình trụ với hai đầu nhọn,

có 3 — 4 vách ngăn và chỉ được tim thấy với mật độ thấp trên PDA và quả thé trên CLA.Tiểu bao tử hình cánh hoa, không có vách ngăn hoặc có một vách ngăn, đính thành từngcụm trên đơn thé bình ở đầu giả sợi nam

Năm 2021, Mohd và M H nhận thấy triệu chứng bệnh đốm lá xuất hiện trênDendrobium spp tại Kedah và Penang ở Malaysia Triệu chứng bệnh được mô tả là các vếtmàu nâu xuất hiện trên lá, ở giai đoạn nghiêm trọng, lá bị khô và rụng Dựa trên đặc điểmhình thái va phân tử, tác nhân đã được xác định là F sacchari Tản nam của F saccharitrên PDA được mô tả là có màu trắng đến tim nhạt hoặc tim sam Dai bao tử được hìnhthành ở quả thể màu cam trên môi trường CLA, hình lưỡi liềm với tế bào đỉnh cong và có

3 — 5 vách ngăn, kích thước 38.2 + 3.6 x 3.6 + 0.7 um Tiểu bao tử hình bầu dục, không cóvách ngăn, hình thành trên đầu giả của sợi nắm, kích thước 6.80 + 1.3 x 2.0 + 0.5 um.Không tìm thấy bao tử chống chịu Các mô tả trên cũng phù hợp với mô tả hình thái F

sacchari phân lập trên địa lan của Dekham và cộng sự (2020).

Fusarium spp cũng là nhóm nam nội sinh phô biến trên ho Orchidaceae Nam nộisinh tạo ra các hoạt chất tương tự hoặc mạnh hơn cây chủ, kích thích sự sinh trưởng củacây Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra vai trò của Fusarium spp là một nhóm nam cộng sinh trên

rễ (Mycorrhizal) Trong điều kiện tự nhiên, sự nảy mầm và phát triển cây con của phonglan đòi hỏi sự tương hỗ với các nhóm nấm khác nhau trong đất Một số loài Dendrobiumspp bị đe dọa tuyệt chủng ở Trung Quốc được báo cáo là có các nam nội sinh hiếm gặp, cóứng dung trong y học cổ truyền (Chen và ctv, 2012) Một số loài Fusarium đã được báo cáo

có thé kháng lại các tác nhân gây bệnh khác cho cây chủ (Lakkin và ctv, 1996)

2.2.2 Nghiên cứu về Colletotrichum sp gay bệnh đốm lá trên Dendrobium spp.

Chỉ Colletotrichum thuộc ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ

Glomerellales, họ Glomerellaceae Colletotrichum sp được báo cáo lần đầu tiên bởi Corda

và các cộng sự của ông năm 1983 Các loài Colletotrichum là một trong những mam bệnhthực vật phổ biến nhất, và các phân loại trong chi này cũng rat phức tạp, với hơn 2200 loài

đã được xác định Colletotrichum sp đã được bình chọn là nhóm nam gây bệnh thực vậtquan trọng thứ tám trên thé giới, dựa trên tam quan trọng về mặt khoa học và kinh tế (Dean

và ctv, 2012) Chi này là được biết đến với vai trò là tác nhân gây bệnh than thư trên hầuhết thực vật cũng như trên Dendrobium spp Ở giai đoạn bệnh than thư ban đầu, các vếtbệnh có thé có triệu chứng tương tự như vết bệnh đốm lá, với những đốm đen có phan tâmtrũng xuống và khá khô Do đó một số nghiên cứu về Colletotrichum sp gây nên các vếtbệnh có triệu chứng tương tự đốm lá cũng được tham khảo đề phục vụ cho nghiên cứu xácđịnh tác nhân gây bệnh đốm lá trên Dendrobium spp

Năm 2020, Fernández-Herrera vả các cộng sự lần đầu báo cáo sự hiện diện củaColletotrichum karstii gây nên các đốm bệnh trên Dendrobium spp tai Mexico Triệu chứngbệnh được mô tả là các đốm đen hình tròn, lõm ở phần tâm và được bao quanh bởi quangmàu nâu nhạt Trên môi trường PDA, tản nắm có màu trắng đến hồng, các vòng đồng tâm

có thé quan sát rõ ở mặt trên của đĩa thạch Bào tử đơn bào có hình trụ với hai đầu tròn,

kích thước 5,3 — 6,8 x 10,8 — 15,5 um.

2.2.3 Một số nghiên cứu về Alternaria spp gay bệnh đốm lá trên Dendrobium spp

Chi Alternaria thuộc ngành Ascomycota, lớp Phylum, bộ Pleosporales, ho

Pleospraceae Loài đầu tiên trong chi A/ternaria được Nees von Esenbeck mô tả từ vật liệuthực vật đã chết vào năm 1816, và hiện nay có 299 loài đã được xác định A/ternaria spp.được biết đến là nấm nội sinh của thực vật (Gallaud, 1905) và là mầm bệnh gây nên cáctriệu chứng đốm lá và bạc lá trên hoa lan trong các nghiên cứu của Yadav và cộng sự (2010).Một số ít nghiên cứu tại Trung Quốc chỉ ra A/ternaria spp gây các đốm bệnh trên lá củaDendrobium spp., các loài được báo cáo gây bệnh gồm A tenuissima va A alternata (Zhang

JZ và ctv, 2004; Wang và ctv, 2019).

Zhang JZ và các cộng sự (2004) đã xác định A fenuissima là tác nhân gây nên các

đốm đen trên lá Dendrobium spp tại Chiết Giang, Trung Quốc Theo mô tả của nhóm tácgia, tan nam A fenuissima trên môi trường PDA có màu xanh diếp cá đến xanh 6 liu, vớiviên mau trắng (2 — 5 mm) A fenuissima hình thành các chuỗi bao tử có chiều dai từ 6 đến

18 bao tử và một số chuỗi bao tử thứ cấp từ 2 đến 4 bào tử, đôi khi là cấu trúc bậc ba Daibào tử hình trứng, được phân chia bởi các vách ngang và vách dọc, chia bào tử thành 4 tế

bào, kích thước 5,8 — 13,7 x 13,9 — 43,0 um.

Wang và các cộng sự lần đầu tiên báo cáo A alternata là tác nhân gây nên các dém látrên Dendrobium spp tai Trung Quốc trong nghiên cứu của mình năm 2019 Triệu chứngbệnh được ghi nhận là những đốm đen xuất hiện trên lá và vết vệnh lan rộng tạo thành đốmhình tròn đến elip có quầng xám bao quanh Các phân lập A alfernata trên PDA cho tan

nắm có màu xanh 6 liu, có viền trắng Bào tử màu nâu hình thoi đến bầu dục, có 2 — 6 vách

ngăn ngang và 0 — 3 vách ngăn dọc, kích thước 11.08 — 19,09 x 15,27 — 35,27 um Dac

điểm hình thái trên cũng phù hợp với mô tả A alternata của Simmons (2007)

2.2.4 Nghiên cứu về Cladosporium sp gay bệnh đốm lá trên Dendrobium spp

Cladosporium là một chi nam thuộc ngành Ascomycota, lớp Dothideomycetes, bộ

Botryosphaeriales, họ Botryophaerlaceae Hiện nay có hơn 772 loài đã được xác định.

Cladosporium sp được biết đến là nam mốc phát tán trong không khí phổ biến nhất, trongkhi một số loài gây bệnh thực vật và một số loài khác có khả năng ký sinh nắm Nghiên cứu

về Cladosporium sp gây bệnh dém lá trên Dendrobium spp được thực hiện lần đầu bởi

Xiao và cộng sự (2017).

Theo Xiao và cộng sự (2017), biểu hiện bệnh là những đốm đen nhỏ trên lá, chúng cóthé phát triển trở thành vết hoại tử màu nâu hoặc den, ở giai đoạn nặng lá chuyển sang màuvàng hoặc vàng nâu Cladosporium sp khi cay trên PDA được mô tả là có mau xám chìđến xám đen, nhô cao trên mặt thạch và có các rãnh ở mặt trước tan nam Soi nam có màu

nâu với các vách ngăn, rộng 2 — 4 um Bào tử được đính thành chuỗi ngắn trên cành bào tử,

chuỗi có kích thước 50 — 150 um Bao tử có dạng elip đến không xác định, có thé phân

nhánh từ mọi hướng, kích thước 2 — 4 x 3 — 7 um.

2.2.5 Nghiên cứu về Trichoderma sp gầy bệnh đốm lá trên Dendrobium spp.

Trichoderma là một chi nam thuộc ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộHybocreales, họ Hypocreaeae Chi này được Christiaan Hendrik Persoon miêu tả lần đầunăm 1794, và được coi là chi bao gồm một loài là Trichoderma viride trong một thời giandài Nhờ vào kỹ thuật phân tử, từ năm 1995 đến hiện tai, có 88 loài thuộc chi Trichoderma

đã được xác định Ngoài tính ứng dụng phòng trừ sinh học, Trichoderma spp còn gây một

số bệnh trên nam và cây trồng, như 7: aggressivum (trước đây là 7: harzianum biotype 4)

là tác nhân gây bệnh nam mốc xanh trên Agaricus bisporus, T viride là tác nhân gây thốimốc xanh của hành tây và gây chết cây non Pinus nigra (Hatvani và ctv, 2017) Một sốnghiên cứu đã chỉ ra Trichoderma spp gây nên bệnh bạc lá và đốm lá trên Dendrobium

spp (Ventina va ctv, 2012; Sarsaiya và ctv, 2019).

Một số loài Dendrobium spp có mặt tại Trung Quốc mang được tinh cổ truyền, hỗtrợ điều trị các bệnh về tim mach, hô hap và tiêu hóa Vào năm 2018, một nhóm nghiên cứutại Quý Châu đã nhận thấy sự xuất hiện của các đốm tròn, màu đen trên D Nobile Các

phân lập nhanh chóng được quan sat và Trichoderma longibrachiatum đã được xác định là

tác nhân gây nên các đốm tròn này Theo mô tả của Sarsaiya và cộng sự (2019), tản namcủa 7 longibrachiatum trên môi trường PDA có màu trắng ở cả hai mặt đĩa thạch Soi namtrong suốt, không có vách ngăn, thể bình hình bình có đỉnh khá nhọn Bào tử hình cầu đến

elip, kích thước 3,5 — 7 x 2,0 — 3,0 um.

Triệu chứng bệnh dém lá khá đa dạng và dé bị nhầm lẫn với giai đoạn bệnh ban đầucủa một số bệnh khác (như thán thư, dém lá xám, đốm vòng) Do đó mà việc xác định rõ

cay Dendrobium spp dang gặp triệu chứng của bệnh nào cũng là một nội dung thực hiện quan trọng của nghiên cứu Ngoài việc phân lập các tác nhân từ mô có triệu chứng bệnh,

cần phải thực hiện thử nghiệm xác định khả năng gây bệnh của các phân lập trên lanDendrobium spp Dựa trên giá trị kinh tế va sự đa dang tác nhân gây bệnh, đề tài “Xác địnhmột số chi nam gây bệnh đốm lá trên lan Dendrobium spp.” đã được thực hiện

10

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 02/2023 đến tháng 06/2023 tại Phòng Chân đoán

Bệnh cây, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông

Lâm thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Nguồn mẫu thí nghiệm

Khao sát và thu thập 30 cây Dendrobium spp từ thang 10/2022 đến 3/2023 ở vườnlan tại huyện Hóc Môn, thành phố Hồ Chí Minh (10°55’08.2”N 106°40°05.2”E)

3.2.2 Hóa chat, dụng cụ và thiết bi

Đề tài sử dụng bộ hóa chất phân lập vi sinh và bộ hóa chất nhuộm mô học Dụng cụgồm các dụng cụ thường qui trong phòng thí nghiệm vi sinh Thiết bị như tủ cấy vô trùng,cân phân tích, nồi hap, lò vi sóng, tủ say, kính hién vi

3.2.3 Phương pháp thu thập và phân lập nắm

Dựa vào điều kiện khí hậu thực tế tại huyện Hóc Môn va tình hình nhiễm bệnh đốm

đá trên lan Dendrobium spp., xác định thu thập tổng cộng 30 mẫu với 3 lần thu mẫu Phương

pháp thu thập và xử lý mẫu theo hướng dẫn của Drenth and Sendall (2001) Mẫu được bảo

quản trong túi zip polythene có chứa hạt silical gel, giữ khô trong tủ mát với thời gian lưu

trữ tối đa 3 ngày Ghi chú kí hiệu nhóm bệnh, số hiệu mẫu và thời gian thu thập mẫu

Môi trường nuôi cấy được xử dụng trong nghiên cứu được hấp tiệt trùng ở 121°C/1atm/20 phút Bảo quản ở nhiệt độ phòng, sau 2 ngày đồ môi trường vào dia petri, 10 ml/ đĩađường kính 85 mm Các môi trường gồm WA (20 g agar, 1 | nước), PDA (20 g agar, 20 gD-glucose, 200g khoai tây, 1 1 nước), OMA (20 g yến mach, 20 g agar, 1 1 nước), CLA (5

g lá cam chướng, 20 g agar, 1 1 nước) Lá có triệu chứng dém bệnh được làm sạch với giấythấm, cắt thành hai đến ba mảnh (4 cm? /manh), khử trùng các mảnh cắt với Ethanol 70°trong 30 giây và NaClO 1% trong 2 phút Tiếp tục rửa qua ba lần nước vô trùng, cắt nhỏthành mảnh 1 cm?, làm khô với giấy thâm vô trùng và đặt lên đĩa thạch WA Sau 3 ngày,

il

cắt khối thạch nắm tại vùng phát triển đặt sang môi trường PDA, ủ ở 25°C trong điều kiệntối Dựa vào sự tương đồng về đặc điểm hình thái và kí hiệu mẫu tại vườn lan, tên mẫu đượcđặt theo thứ tự: Nhóm nắm (I, IL, IIL, IV và V; phân loại theo đặc điểm hình thái đại thé vàhình thái vi thé quan sát được), thứ tự lay mẫu (1, 2, 3 và 4; thứ tự lay mẫu trên cùng mộtcây lan Dendrobium spp.), kí hiệu mẫu tại vườn Các mẫu được bảo quản trong thạchnghiêng, bảo quản trong nước cất và bảo quản trong dầu khoáng.

3.2.3 Phương pháp xác định khả năng gây bệnh của nam trên Dendrobium spp

Vật liệu nghiên cứu là các cây lan nuôi cay mô 3 tháng tuổi phát triển khỏe mạnh, có

từ hai đến ba lá, chiều đài lá 5 — 7 em Lá được khử trùng nhanh bằng Ethanol 70%, và nước

cất vô trùng Cây được đặt vào hộp chủng có lót lớp giấy giữ âm vô trùng Huyền phù bào

tử 105 bảo tử/ml được chuẩn bị từ tan nắm 7 ngày tuổi Cây được vệ sinh sạch và khử trùng

bề mặt với Ethanol 70° trong 30 giây Ong tiêm vô trùng đường kính mũi kim 0,7 mm đượcdùng dé tạo vết thương trên lá (3 điểm/1á) Thí nghiệm bó trí ngẫu nhiên gồm 3 nghiệmthức, (1) nghiệm thức có vết thương (chủng 4 cây với 5 pl huyền phù bao tử/điểm chủng),nghiệm thức không có vết thương (chủng 4 cây với 5 ul huyền phù bào tử/điểm chủng),nghiệm thức đối chứng có và không có vết thương ( chủng 2 cây với 5 pl nước cất vô

tring/diém chủng) Đặt các hộp chủng được tao 16 thoát khí và giữ am bang nước cất vô

trùng, 12 giờ sáng/tối, 25°C Theo dõi các triệu chứng trong vòng 21 ngày sau khi gâynhiễm Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ nhiễm bệnh sau khi gây bệnh ở 7 NSC, 14 NSC và 21 NSC

Tỉ lệ vết bệnh (TLVB, %) = (số điểm chủng có triệu chimg/téng điểm chủng) x 100 Dođường kính vết bệnh (DKVB, mm) theo công thức: d = (dl + đ2) /2 Trong đó: d1 và d2 là

độ dài chiều đài và chiều rộng của vết bệnh

Nhuộm mô học vết bệnh chủng theo phương pháp của Theo Chia — Lin Chung (2006):Mẫu mô lá (đã xuất hiện triệu chứng bệnh) có kích thước 1 x 1 em” Ngâm mẫu trong dungdich A (acid acetic : ethanol = 1 : 3, v/v) dé 24 giờ Sau đó dé bỏ dung dich A, rửa qua 2lần nước cất và ngâm mau trong dung dich B (acid acetic : ethanol : glycerol = 1 : 5 :1,v/v/v), giữ mẫu trong 3 giờ Đồ bỏ dung dịch B, cho thuốc nhuộm (0,01% trypan blue tronglactophenol) dé mẫu sau 24 giờ Loại bỏ dung dich thuốc nhuộm và rửa lai trong glycerol60% Quan sát mẫu dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần

d2

3.2.4 Định danh các mẫu nắm bằng đặc điểm hình thái

Quan sát các đặc điểm đại thé: hình dáng, kích thước, đặc điểm tan nam (nhung mượt,mịn, len xốp, lồi lõm, có khía cạnh hay không, ) Màu sắc tản nắm mặt trên và mặt dưới,dạng mép khuẩn lạc (mỏng, day, phẳng, nhăn nheo, ), giọt tiết (nhiều, ít, màu sắc),

Quan sát các đặc điểm vi thé: sợi nam (có vách ngăn, không có vách ngăn, có mau);bào tử trần (kiểu phát sinh bào tử trần, hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt, ); kiểusinh bào tử trần (thé bình, dang có khuyên ở đính, dang sinh bào tử trần đồng thời, dangsinh bảo tử trần không đồng thời, bảo tử đính kiểu nảy chồi, hình dạng, kích thước, màusắc, cách sắp xếp, vị trí, ) Hình dang của macroconidia và microconida, số lượng váchngăn, tế bào bản địa và sự hiện diện của bào tử chống chịu được lưu lại bằng hình ảnh

Các tác nhân có khả năng gây bệnh được chọn dé quan sat cac dac diém sinh hoc,bao gồm thử nghiệm nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau (CLA, OMA) vàthử nghiệm nuôi cay ở các mức nhiệt độ khác nhau (15°C, 20°C, 25°C, 30°C va 35°C) Chitiêu theo dõi: Đường kính tan nấm, màu sắc, hình dang và đặc điểm hình thai đại thé Quansát đặc điểm và thời gian phóng thích bào tử, giai đoạn hình thành, phát triển các bao tửchống chịu và qua thé Đặc điểm hình thái các tản nam Fusarium spp được so sánh với kết

quả nghiên cứu của Gerlach và cộng sự (1982), hình thái Colletotrichum spp được so sánh với khóa phân loại Colletotrichum sp của Sutton (1995), hình thái A/ternaria spp được so

sánh với kết quả nghiên cứu của Simmons và cộng sự (2007), hình thái Cladosporium sp.được so sánh với kết quả trong nghiên cứu của Xiao và cộng sự (2017) và hình tháiTrichoderma sp được so sánh với kết quả nghiên cứu của Sarsaiya và cộng sự (2019).3.3 Xử lý số liệu

Các số liệu được thống kê và trình bày bằng phần mềm Excel 2016, phân tích phươngsai (ANOVA) và trắc nghiệm phân hạng bằng Minitab 2016

13

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Thu thập và phan lập các tác nhan gây bệnh trên Dendrobium spp.

Dựa vào triệu chứng Mohd và M H (2021) đã mô tả và tiến hành thu mẫu láDendrobium spp tại huyện Hóc Môn, thành phố Hồ Chí Minh Tổng cộng 30 mẫu lá cótriệu chứng đốm lá được khảo sát và thu thập Triệu chứng đốm lá điển hình là những đốmtròn màu nâu đen đến đen, có quầng vàng xung quanh Có ba dạng triệu chứng đốm lá được

chia thành 3 nhóm triệu chứng như Hình 4.1/Bang 4.1.

IIllÌllll

Hinh 4.1 Triệu chứng đốm lá trên lan Dendrobium spp (a-c) Triệuchứng dom lá thuộc nhóm triệu chứng NI-N3

14

Bảng 4.1 Triệu chứng bệnh đốm lá trên mẫu thu thập tại TP Hồ Chí Minh

Nhóm Triệu chứng

triệu chứng Mặt trước lá Mặt sau lá

Vùng bệnh gồm nhiều đốm đen hình tròn, ovalđến Có hoặc không có

NI không xác định, đôi khi có quang màu tím vàng các đốm den

bao quanh Kích thước đốm 2 — 5 mm

Đốm màu nâu đen đến đen, hình oval đến hơi tròn, Có quang màu vàngN2 phan trung tâm khô Kích thước đốm 5— 8mm bao quanh đốm bệnh

Đốm nâu đen đến đen, hình tròn đến oval, đôi khi Có hoặc không cókhông xác định Kích thước đốm 2 - 5 mm,có mảng phấn trắngquang màu vàng nhạt bao quanh, phần trung tâm bám trên bề mặt lá.đốm đôi khi lõm xuống

Trong tông số 44 chủng nam phân lập được, có 7 chủng thuộc nhóm I, 19 chủng nhóm

IL, 5 chủng nhóm III, 8 chủng nhóm IV và 5 chủng nhóm V Trong đó, nhóm I, II va II đa

số được phân lập từ lá thuộc nhóm triệu chứng NI Nhóm IV và V đa số được phân lập từ

các lá có triệu chứng bệnh N3.

đi

Bang 4.2 Các chủng nam thu được trên mẫu bệnh dém lá tại TP Hồ Chí Minh

Nhóm nắm Chủng nam a eu Nhóm nam Chung nam vite

I I-1-1413 NI H II-1-1470 N3 [ I-2-109 Nl II II-2-1470 Nl

Hình 4.6 Hình thái các tản nắm nhóm V4.1.2 Xác định khả năng gây bệnh của nắm trên Dendrobium spp.

Dựa trên sự khác biệt về đặc điểm hình thái đại thể, tổng cộng có 20 chủng đại điệncho 5 nhóm nam được sử dụng dé xác định khả năng gây bệnh nhân tao Mức độ gây hạicủa các chủng nam và các nhóm nam khác nhau Nhìn chung, tỉ lệ gây bệnh và kích thướcvết bệnh ở nghiệm thức có gây vết thương cao hơn nghiệm thức không gây vết thương vàtăng theo thời gian sau gây bệnh Các chủng nam thuộc nhóm nam II, IV và V có tỉ lệ gâybệnh và đường kính vết bệnh trung bình cao Các vết thương đạt đường kính từ 0,7 mm sau

ít nhất 7 ngày gây bệnh và đường kính vết bệnh lớn nhất sau 21 ngày gây bệnh Các chủngthuộc nhóm I không gây vết bệnh trên Dendrobium spp., chỉ có chủng I-2-0109 gây mộtvết bệnh duy nhất trong tổng số 24 vét bệnh nhân tạo ở cả hai nghiệm thức

18

Bảng 4.3 Tỉ lệ xuất hiện vết bệnh nhân tạo trên Dendrobium spp.

: KVT CVT

Chủng nầm

7NSC I14NSC_ 21NSC 7NSC 14NSC 21NSC I-1-1413 0% 0% 0% 0% 0% 0% 1-2-0109 0% 0% 0% 0% 0% 8,3% 1-2-1453 0% 0% 0% 0% 0% 0% I-1-1502 0% 0% 0% 0% 0% 0% 1-2-1579 0% 0% 0% 0% 0% 0%

TB nhóm I 0% 0% 0% 0% 0% 1,7% II-1-0131 0% 0% 25,0% 8,3% 25,0% 50,0% I-1-1413 0% 16,7% 33,3% 0% 33,3% 58,3% I-2-0121 0% 8,3% 50,0% 0% 33,3% 66,7% II-1-0418 0% 0% 58,3% 0% 83,3% 100% H-2-0418 0% 0% 50,0% 0% 58,3% 75,0% I-4-0418 0% 0% 0% 0% 0% 8,3% I-2-0131 0% 0% 33,3% 0% 33,3% 58,3% H-2-1470 0% 16,7% 58,3% 0% 66,7% 75,0% II-1-1579 0% 0% 0% 0% 0% 0%

TB nhóm II 0% 4,6% 34.2% 0,9% 37,0% 54,6% III-1-1189 0% 0% 0% 0% 0% 0% III-1-0109 0% 0% 0% 0% 0% 8,3% II-2-1417 0% 0% 25,0% 0% 8,3% 42,0%

TB nhóm III 0% 0% 8,3% 0% 2,8% 16,8% IV-3-1579 0% 42,0% 58,3% 25,0% 100% 100%

TB nhóm IV 0% 42,0% 58,3% 25,0% 100% 100% V-3-0418 0% 0% 8,3% 0% 42,0% 83,3% V-2-D5 0% 0% 8,3% 0% 8,3% 50,0%

TB nhóm V 0% 0% 8,3% 0% 25,1% 66,7%

DC 0% 0% 0% 0% 0% 0%

19

Bảng 4.4 Kích thước vết bệnh nhân tạo trên Dendrobium spp.

- KVT CVT

Ching nam

7NSC I14NSC_ 21 NSC 7NSC 14NSC 21 NSC 1-1-1413 0+0 0+0 O+0 0+0 0+0 Ha) 1-2-0109 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0,8 + 0,0 1-2-1453 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 I-1-1502 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0

1-2-1579 0+0 Ủa.Ö 0+0 0+0 0+0 0+0

II-1-0131 0+0 0+0 09401 059400 122403 12202 I-1-1413 0+0 ,BSÖNI 1ã &Ú/i 0+0 15+01 L302 II-2-0121 0+0 0,.9+0,0 1,0+0,1 0+0 1Ot00 11401 II-1-0418 0+0 0-0 IL2202 0+0 09201 Loads II-2-0418 0+0 020 18201 0+0 12204 22203 I-4-0418 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 1,0 + 0,0 II-2-0131 0+0 020 LI¿jD1 0+0 13201 1#&0 II-2-1470 0+0 1,4+0,2 1,9+0,1 0+0 14403 21202 I-1-1579 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0

TB nhóm II 0 LJ 13 0,9 Lv 1,4 II-1-1189 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 III-1-0109 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 1,0+0,0 IH-2-1417 0+0 0+0 1,340,4 0+0 1O40,0 1120,1

TB nhóm III 0 0 l5 0 1,0 Ll IV-3-1579 O£0 182402 18240,1 2,0200 22402 2340,1

TB nhóm IV 0+0 1,8 1,8 2,0 Za 2,3 V-3-0418 0+0 020 £17240,0 0+0 Lita 174035 V-2-D5 0+0 020 L1it00 0+0 09400 104202

ĐC 0 0 0 0 0 0

20

Nhóm I Nhóm II Nhóm III Nhóm IV Nhóm V

x a

Wes A

Hình 4.7 Vết bệnh nhân tạo và bao tử nam

bệnh trên lá KVT (bên trái) va CVT (bên phải) (B) Bào tử nảy mam trong 2—4 giờ san khi nhỏ trên bé mặt lá (C) Bào tử và đĩa bào tử dưới lớp biéu bì Bar = 25 ym.

Sau 21 ngày, tat cả năm nhóm nam đều gây nên vết bệnh trên lá Dendrobium spp ởnghiệm thức có gây vết thương Nhìn chung, các vết bệnh này đều là đốm có dạng tròn đếnkhông xác định, màu nâu đen hoặc đen Da số vết bệnh có quang vàng bao quanh ở thửnghiệm không có vết thương và vết bệnh đen, hơi nhô lên bề mặt ở thử nghiệm có vếtthương Bào tử nảy năm nhóm nảy mam trong 2 — 4 giờ sau khi bom dịch huyền phù bào

tử lên bề mặt lá Bảo tử nấm nhóm I nảy mầm bang cách mọc chi, bao tử nhóm III hìnhthành các giác bám và bao tử ở các nhóm còn lại hình thành ống mầm hình trụ dai, khôngphân nhánh Các sợi nắm xâm nhập vào lớp biểu bì và gắn kết lại với nhau, và tạo thành đĩabào tử, riêng nhóm nắm I không có sợi nắm xâm nhập vào tế bào Khi các đĩa bào tử xuấthiện, có thé quan sát vết bệnh nâu đen đến đen trên bề mặt lá Các tái phân lập đã được thựchiện va tản nam của các phân lập này có đặc điểm hình thái tương đồng với các chủng nam

đã được sử dụng dé gây bệnh trước đó

21

4.1.3 Định danh hình thái các tản nắm

4.1.3.1 Định danh hình thái tản nam nhóm I

Hình 4.8 Đặc điểm hình thái tan nam nhóm I (1-2-0109) (a) Hinh thái tản nắm

(PDA, 21 ngày), (b-d) cành sinh bào tử (e) Bào tử Bar = 25 um, nhuộm với Trypan

blue/Lactophenol 0,02%.

Tản nắm chủng I-2-0109 sinh trưởng chậm, đạt đường kính 85 mm sau 17 ngày nuôicấy trên PDA ở 25°C trong điều kiện tối Tản nam có đường kính trung bình 17 mm sau 3ngày nuôi cấy, với tốc độ sinh trưởng trung bình 4,9 + 2,5 mm/ngày ở những ngày tiếp theo.Tản nam có dạng hình tròn, có các vòng tròn đồng tâm màu trắng xen ké vàng nhạt, ria tannam màu trắng Bề mặt tan nam khá nhay, mọc sát mặt thạch và ăn sâu vào thạch, khôngthay rõ sợi nam bằng mắt thường Soi nam trong suốt, không có vách ngăn, sợi nam gấpkhúc và đính thành từng cụm Soi nắm phinh to ở các ngạch phân nhánh và cảnh sinh bao

tử, cảnh sinh bào tử đính các cụm bao tử ở đỉnh Bào tử đơn bao trong suốt, hình trụ, haiđầu nhọn hoặc một đầu nhọn, có chứa giọt dầu, kích thước 6,8 + 1,0 x 3,1 + 0,3 um (n =30) Bao tử nay mầm bang cách mọc chồi từ một trong hai đầu của bào tử, có thể mọc thànhtừng chuỗi ngắn từ 2 đến 3 bào tử

22

Tản nắm chủng II-1-0131 sinh trưởng khá nhanh, đạt đường kính §5 mm sau 9 đến

10 ngày nuôi cấy trên PDA ở 25°C trong điều kiện tối Tản nắm có đường kính trung bình

40 mm sau 3 ngày nuôi cấy và tốc độ sinh trưởng đạt 3,8 + 2,2 mm/ngày ở những ngày tiếptheo Ở 3 — 4 ngày đầu, tan nắm có màu trắng, sau đó chuyên sang mau cam ở cả mặt trên

và dưới, phan ria bông xốp gon sóng Ở mặt trên, các sợi nấm màu trang bông nhẹ và cóvòng đồng tâm Sợi nắm trong suốt, thăng, tương đối mảnh, phân nhánh và có thành mỏngkích thước 15,3 + 2,2 um x 2,5 + 1,3 um (n = 15) Đại bào tử hình thành từ đa thể bình ởcác đỉnh sinh trưởng hoặc các ngạch phân nhánh, đính thành các cụm gồm 3 — 13 bào tử.Đại bào tử có dạng hình đĩa CD, thắng đến hơi cong với hai đầu nhọn, có từ 2 đến 6 váchngăn (đa số có 3 vách ngăn), kích thước 22,8 + 3,6 x 4,2 + 0,9 um (n = 30) Tiểu bảo tử cóhình trụ với hai đầu nhọn, không có hoặc có một vách ngăn Theo Wang và cộng sự (2021),chủng nam này là Fusarium equiseti

Tản nam chủng II-1-1413 sinh trưởng khá nhanh, đạt đường kính 85 mm sau 8 ngàynuôi cay trên PDA 6 25°C trong điều kiện tối Tản nắm có đường kính trung bình 37 mmsau 3 ngày nuôi cấy và tốc độ sinh trưởng đạt 9,6 + 6,1 mm/ngày ở những ngày tiếp theo.Tản nắm có dang hình tròn, màu trắng ở mặt trên và màu xám xanh xen kẽ trắng ở mặtdưới Các sợi nam bông xép nhô cao trên bề mặt thạch, có nhiều giọt tiết trong suốt Cáchạch nam hình tròn, màu xám xanh xuất hiện ở mặt dưới tản nam sau 14 ngày nuôi cay Soinắm trong suốt với các vách ngăn như thân tre Bào tử có đạng hình trụ với 2 đầu tròn hoặc

hình đậu, kích thước 16,3 + 3,1 x 5,4 + 1,0 um (n = 30) Theo khóa phân loại của Sutton

(1995), chủng nam này là Colletotrichum sp

Chung II-2-0121: Trên môi trường PDA, tản nắm sinh trưởng khá nhanh, đạt đườngkính 85 mm sau 9 ngày nuôi cấy ở 25°C trong điều kiện tối Tản nắm có đường kính trungbình 30 mm sau 3 ngày nuôi cấy và tốc độ sinh trưởng đạt 9,2 + 4,8 mm/ngày ở những ngàytiếp theo Tan nam có dạng hình tròn, ở 3 — 4 ngày đầu tản nam có màu trắng ở mặt trước

và sau, đến ngày thứ sáu ở tâm có các hạch nắm mau đen Tản nam nhô cao trên bề mặtthạch, vùng tâm có mang màu xám xanh đến vàng Soi nam trong suốt, dai và phân nhánh.Bào tử hình trụ có hai đầu tròn, phần giữa cong, kích thước 19,0 + 3,3 x 10,0 + 2,4 um (n=30) Theo khóa phân loại của Sutton (1995), chủng nam này là Colletotrichum sp

24

Tản nam chủng II-1-0418 sinh trưởng khá nhanh, đạt đường kính 85 mm sau 7 ngàynuôi cây trên PDA ở 25°C trong điều kiện tối Tản nam có đường kính trung bình 36 mmsau 3 ngày nuôi cấy và tốc độ sinh trưởng đạt 12,3 + 5,1 mm/ngày ở những ngày tiếp theo.Tản nắm có dạng hình tròn, ở 2 — 3 ngày đầu tản nắm có màu trang, sau đó tâm xuất hiệnmau tím nhạt rồi lan dần hết tản nam Mặt dưới tan nắm có các vòng đồng tâm Soi namtrong suốt, dai và khá it phân nhánh Ở giai đoạn phát bảo tử, sợi nắm phân nhánh mạnhvới các nhánh ngắn, đỉnh hình tròn hoặc hình búp đơn giản Bào tử dạng hình trụ với haiđầu nhọn hoặc một dau tròn, kích thước 8,3 + 1,6 x 3,0 + 0,5 um (n = 30) Theo Gerlach vàcộng sự (1982), chủng nam này là Fusarium sp.

Tan nam chủng II-2-0418 sinh trưởng khá nhanh, đạt đường kính 85 mm sau 9 ngàynuôi cay trên PDA ở 25°C trong điều kiện tối Tản nam có đường kính trung bình 24 mmsau 3 ngày nuôi cấy và tốc độ sinh trưởng đạt 10,2 + 5,8 mm/ngay ở những ngày tiếp theo.Tản nắm có dạng hình tròn, màu tím đậm với rìa màu trắng, sợi nắm bông, nhô cao trên bềmặt thạch Sợi nắm có màu tím nhạt, có vách ngăn và hơi phình ở các ngạch phân nhánh

Bao tử được phóng thích từ các cảnh sinh bao tử, có đỉnh hình bình Dai bào tử có hình tru

với hai đầu tròn, hình hạt đậu hoặc hình đĩa CD, kích thước 7,1 + 1,6 x 2,7 + 0.8 um (n =30) Theo Gerlach và cộng sự (1982), chủng nam nay là Fusarium sp

Tan nam chủng II-2-0131 sinh trưởng khá nhanh, đạt đường kính 85 mm sau 8 ngàynuôi cấy trên PDA ở 25°C trong điều kiện tối Tản nam có đường kính trung bình 32 mmsau 3 ngày nuôi cấy và tốc độ sinh trưởng đạt 10,6 + 3,9 mm/ngày ở những ngày tiếp theo.Tản nam có dạng hình tròn, màu cam vàng ở cả hai mặt, vòng tâm có sợi nam trắng nhôcao trên bề mặt thạch Soi nắm trong suốt, có các vách ngăn, phân nhánh mạnh Bao tử códạng hình đĩa CD, thắng đến hơi cong với 2 đầu nhọn, có từ 3 đến 6 vách ngăn (đa số có 4

vách ngăn), kích thước 30,5 + 17,7 x 8,4 + 3,3 um (n = 30) Theo Gerlach và cộng sự

(1982), chủng nam này là Fusarium sp

Tan nam chủng II-2-1470 sinh trưởng khá nhanh, đạt đường kính 85 mm sau 9 ngàynuôi cây trên PDA ở 25°C trong điều kiện tối Tan nam có đường kính trung bình 20 mmsau 3 ngày nuôi cấy và tốc độ sinh trưởng đạt 10,8 + 5,6 mm/ngày ở những ngày tiếp theo

Tan nam có dạng hình tròn, mau nâu nhạt đên trắng xám, sợi nam nhô cao trên bê mặt

25

thạch Sau 14 ngày nuôi cấy, xuất hiện các hạch nam màu xám xanh bên dưới tan nam Soinam thang, phân nhánh, phình to và phát bao tử ở đỉnh sinh trưởng Bào tử có dạng hìnhhat đậu đến hình lưỡi liềm, kích thước 7,9 + 2,6 x 2,7 + 0,8 um (n = 30) Bao tử xếp thànhtừng chuỗi hoặc từng cụm từ 5 đến 18 bào tử, đôi khi đính trên đầu giả Theo Gerlach vàcộng sự (1982), chủng nam này là Fusarium sp.

4.1.3.3 Định danh hình thái tan nắm nhóm II

nhánh kép Giác bám màu nâu nhạt có hình tron, oval hoặc hình chùy, kích thước 8,5 + 1,9

x 6,0 + 1,1 pm (n =30), giác bám có thé phân nhánh kép hoặc mọc ra từ bao tử Bào tử cóhình trụ, hai đầu nhọn hoặc một đầu nhọn, kích thước 6,7 + 2,6 x 1,5 + 0,9 um (n = 30).Theo Weir và cộng sự (2012), chủng nắm này là Colletotrichum Sp

26