DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 02/2023 đến tháng 06/2023 tại Phòng Chân đoán
Bệnh cây, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông
Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Nguồn mẫu thí nghiệm
Khao sát và thu thập 30 cây Dendrobium spp. từ thang 10/2022 đến 3/2023 ở vườn lan tại huyện Hóc Môn, thành phố Hồ Chí Minh (10°55’08.2”N 106°40°05.2”E).
3.2.2. Hóa chat, dụng cụ và thiết bi
Đề tài sử dụng bộ hóa chất phân lập vi sinh và bộ hóa chất nhuộm mô học. Dụng cụ gồm các dụng cụ thường qui trong phòng thí nghiệm vi sinh. Thiết bị như tủ cấy vô trùng, cân phân tích, nồi hap, lò vi sóng, tủ say, kính hién vi.
3.2.3. Phương pháp thu thập và phân lập nắm
Dựa vào điều kiện khí hậu thực tế tại huyện Hóc Môn va tình hình nhiễm bệnh đốm đá trên lan Dendrobium spp., xác định thu thập tổng cộng 30 mẫu với 3 lần thu mẫu. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu theo hướng dẫn của Drenth and Sendall (2001). Mẫu được bảo
quản trong túi zip polythene có chứa hạt silical gel, giữ khô trong tủ mát với thời gian lưu
trữ tối đa 3 ngày. Ghi chú kí hiệu nhóm bệnh, số hiệu mẫu và thời gian thu thập mẫu.
Môi trường nuôi cấy được xử dụng trong nghiên cứu được hấp tiệt trùng ở 121°C/1 atm/20 phút. Bảo quản ở nhiệt độ phòng, sau 2 ngày đồ môi trường vào dia petri, 10 ml/ đĩa đường kính 85 mm. Các môi trường gồm WA (20 g agar, 1 | nước), PDA (20 g agar, 20 g D-glucose, 200g khoai tây, 1 1 nước), OMA (20 g yến mach, 20 g agar, 1 1 nước), CLA (5 g lá cam chướng, 20 g agar, 1 1 nước). Lá có triệu chứng dém bệnh được làm sạch với giấy thấm, cắt thành hai đến ba mảnh (4 cm? /manh), khử trùng các mảnh cắt với Ethanol 70°
trong 30 giây và NaClO 1% trong 2 phút. Tiếp tục rửa qua ba lần nước vô trùng, cắt nhỏ thành mảnh 1 cm?, làm khô với giấy thâm vô trùng và đặt lên đĩa thạch WA. Sau 3 ngày,
il
cắt khối thạch nắm tại vùng phát triển đặt sang môi trường PDA, ủ ở 25°C trong điều kiện tối. Dựa vào sự tương đồng về đặc điểm hình thái và kí hiệu mẫu tại vườn lan, tên mẫu được đặt theo thứ tự: Nhóm nắm (I, IL, IIL, IV và V; phân loại theo đặc điểm hình thái đại thé và hình thái vi thé quan sát được), thứ tự lay mẫu (1, 2, 3 và 4; thứ tự lay mẫu trên cùng một cây lan Dendrobium spp.), kí hiệu mẫu tại vườn. Các mẫu được bảo quản trong thạch nghiêng, bảo quản trong nước cất và bảo quản trong dầu khoáng.
3.2.3. Phương pháp xác định khả năng gây bệnh của nam trên Dendrobium spp.
Vật liệu nghiên cứu là các cây lan nuôi cay mô 3 tháng tuổi phát triển khỏe mạnh, có từ hai đến ba lá, chiều đài lá 5 — 7 em. Lá được khử trùng nhanh bằng Ethanol 70%, và nước cất vô trùng. Cây được đặt vào hộp chủng có lót lớp giấy giữ âm vô trùng. Huyền phù bào tử 105 bảo tử/ml được chuẩn bị từ tan nắm 7 ngày tuổi. Cây được vệ sinh sạch và khử trùng bề mặt với Ethanol 70° trong 30 giây. Ong tiêm vô trùng đường kính mũi kim 0,7 mm được dùng dé tạo vết thương trên lá (3 điểm/1á). Thí nghiệm bó trí ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức, (1) nghiệm thức có vết thương (chủng 4 cây với 5 pl huyền phù bao tử/điểm chủng), nghiệm thức không có vết thương (chủng 4 cây với 5 ul huyền phù bào tử/điểm chủng), nghiệm thức đối chứng có và không có vết thương ( chủng 2 cây với 5 pl nước cất vô
tring/diém chủng). Đặt các hộp chủng được tao 16 thoát khí và giữ am bang nước cất vô
trùng, 12 giờ sáng/tối, 25°C. Theo dõi các triệu chứng trong vòng 21 ngày sau khi gây nhiễm. Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ nhiễm bệnh sau khi gây bệnh ở 7 NSC, 14 NSC và 21 NSC.
Tỉ lệ vết bệnh (TLVB, %) = (số điểm chủng có triệu chimg/téng điểm chủng) x 100. Do đường kính vết bệnh (DKVB, mm) theo công thức: d = (dl + đ2) /2. Trong đó: d1 và d2 là độ dài chiều đài và chiều rộng của vết bệnh.
Nhuộm mô học vết bệnh chủng theo phương pháp của Theo Chia — Lin Chung (2006):
Mẫu mô lá (đã xuất hiện triệu chứng bệnh) có kích thước 1 x 1 em”. Ngâm mẫu trong dung dich A (acid acetic : ethanol = 1 : 3, v/v) dé 24 giờ. Sau đó dé bỏ dung dich A, rửa qua 2 lần nước cất và ngâm mau trong dung dich B (acid acetic : ethanol : glycerol = 1 : 5 :1, v/v/v), giữ mẫu trong 3 giờ. Đồ bỏ dung dịch B, cho thuốc nhuộm (0,01% trypan blue trong lactophenol) dé mẫu sau 24 giờ. Loại bỏ dung dich thuốc nhuộm và rửa lai trong glycerol 60%. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần.
d2
3.2.4. Định danh các mẫu nắm bằng đặc điểm hình thái
Quan sát các đặc điểm đại thé: hình dáng, kích thước, đặc điểm tan nam (nhung mượt, mịn, len xốp, lồi lõm, có khía cạnh hay không,...). Màu sắc tản nắm mặt trên và mặt dưới, dạng mép khuẩn lạc (mỏng, day, phẳng, nhăn nheo,...), giọt tiết (nhiều, ít, màu sắc),...
Quan sát các đặc điểm vi thé: sợi nam (có vách ngăn, không có vách ngăn, có mau);
bào tử trần (kiểu phát sinh bào tử trần, hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt,...); kiểu sinh bào tử trần (thé bình, dang có khuyên ở đính, dang sinh bào tử trần đồng thời, dang sinh bảo tử trần không đồng thời, bảo tử đính kiểu nảy chồi, hình dạng, kích thước, màu sắc, cách sắp xếp, vị trí,...). Hình dang của macroconidia và microconida, số lượng vách ngăn, tế bào bản địa và sự hiện diện của bào tử chống chịu được lưu lại bằng hình ảnh.
Các tác nhân có khả năng gây bệnh được chọn dé quan sat cac dac diém sinh hoc, bao gồm thử nghiệm nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau (CLA, OMA) và thử nghiệm nuôi cay ở các mức nhiệt độ khác nhau (15°C, 20°C, 25°C, 30°C va 35°C). Chi tiêu theo dõi: Đường kính tan nấm, màu sắc, hình dang và đặc điểm hình thai đại thé. Quan sát đặc điểm và thời gian phóng thích bào tử, giai đoạn hình thành, phát triển các bao tử chống chịu và qua thé. Đặc điểm hình thái các tản nam Fusarium spp. được so sánh với kết
quả nghiên cứu của Gerlach và cộng sự (1982), hình thái Colletotrichum spp. được so sánh với khóa phân loại Colletotrichum sp. của Sutton (1995), hình thái A/ternaria spp. được so
sánh với kết quả nghiên cứu của Simmons và cộng sự (2007), hình thái Cladosporium sp.
được so sánh với kết quả trong nghiên cứu của Xiao và cộng sự (2017) và hình thái Trichoderma sp. được so sánh với kết quả nghiên cứu của Sarsaiya và cộng sự (2019).
3.3. Xử lý số liệu
Các số liệu được thống kê và trình bày bằng phần mềm Excel 2016, phân tích phương sai (ANOVA) và trắc nghiệm phân hạng bằng Minitab 2016.
13