Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Xác định sự hiện diện của Pediococcus pentosaceus và Lactobacillus plantarum trong thực phẩm lên men bằng phương pháp PCR

Hồ Chí Minh, tôi xin cam đoan khóa luận “Xác định sự hiện diện của Pediococcus pentosaceus va Lactobacillus plantarum trong thực phẩm lên men bằng phương pháp PCR” là nghiên cứu do tôi t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO _

ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HQC SINH HQC

=

XAC DINH SU HIEN DIEN CUA Pediococcus pentosaceus

VA Lactobacillus plantarum TRONG THUC PHAM LEN MEN

BANG PHUONG PHAP PCR

Nganh : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : NGUYÊN THỊ NHƯ Ý

Mã số sinh viên : 19126240

Niên khoá : 2019 — 2023

TP Thủ Đức, 02/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO _

ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HQC SINH HOC

KHOA LUAN TOT NGHIEP

XÁC ĐỊNH SU HIEN DIEN CUA Pediococcus pentosaceus VA

Lactobacillus plantarum TRONG THUC PHAM LEN MEN

BANG PHUONG PHAP PCR

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiệnPGS.TS NGUYÊN BẢO QUỐC NGUYEN THỊ NHƯ Ý

TP Thú Đức, 02/2024

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ban giám hiệu nhà Trường, quý Thay, Côkhoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạođiều kiện, cơ hội, truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt

thời gian học tập tai Trường.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc, người Thầy tậntình hướng dẫn, truyền đạt nguồn kiến thức quý báu, chỉ bảo giúp em tìm ra hướng giảiquyết các van đề trong nghiên cứu khoa học và cung cấp tạo điều kiện dé em hoàn thành

đề tài tốt nghiệp

Em xm gửi lời cảm ơn đến các anh chị, các bạn đã luôn bên cạnh, hướng dẫn,giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và làm dé tài tại phòng thí nghiệm Bệnh học vàChân đoán phân tử Cảm ơn mọi người đã cùng nhau cô gắng và nỗ lực hết mình để cóthé cùng nhau tiến lên, cùng nhau phát triển dé trở thành những phiên bản tốt hơn

Cuối cùng, con xin cảm ơn gia đình, Ba Me đã luôn bên cạnh, hi sinh không kểmỏi mệt, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con dé con có thé học tập và phát triển bản thân

Con cảm ơn Ba Mẹ vì luôn tin tưởng và ủng hộ những quyết định của con.

Em đã nỗ lực hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học của mình trong khả năng cóthể Bên cạnh đó vẫn còn những thiếu sót trong quá trình làm đề tài, em rất mong đượcquý Thay, Cô thông cảm, tận tình chi bảo va đóng góp ý kiến giúp đỡ dé em hoàn thiệnkhóa luận tốt nghiệp của mình

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Nguyễn Thi Như Ý, MSSV: 19126240, Lớp: DH19SHB thuộc ngànhCông nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, tôi xin cam đoan

khóa luận “Xác định sự hiện diện của Pediococcus pentosaceus va Lactobacillus

plantarum trong thực phẩm lên men bằng phương pháp PCR” là nghiên cứu do tôi trựctiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và kháchquan Tôi xin hoan toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng về những cam kết này

TP HCM, ngày tháng năm 2024

Người việt cam đoan

ul

TÓM TẮT

Pediococcus pentosaceus va Lactobacillus plantarum là hai loài vi khuân thuộc

nhóm vi khuẩn lactic (LAB) có kha nang lên men axit lactic, tạo vi chua cho thực phẩm

và nâng cao giá trị dinh dưỡng Ngoài ra, vi khuân LAB có thé tạo ra axit lactic và các

hợp chat bacteriocin có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm Nhờvậy, việc sử dụng vi khuan LAB trong chế biến thực phẩm nhằm nâng cao giá trị thựcphẩm và sức khỏe người tiêu dùng có tiềm năng rat lớn Nghiên cứu này được tiến hànhnhằm mục đích xác định nhanh chóng sự hiện diện các loài vi khuẩn Pediococcuspentosaceus và Lactobacillus plantarum, ngoài ra đánh giá được loài vi khuan chiếm ưuthế trong thực phẩm lên men thương mại bằng phương pháp PCR dựa trên các primer

cụ thể Các cặp primer đặc hiệu được thiết kế dựa trên các vùng trình tự đặc hiệu củatừng loài và đã được đánh giá tính đặc hiệu thông qua phản ứng PCR đồng thời với DNAcủa 13 loài vi khuẩn đã được xác định khác Sau đó, sản phẩm lên men thương mại tạikhu vực Hồ Chi Minh được thu thập dé tách chiết DNA và xác định thành phan loàibằng các cặp primer đặc hiệu đã thiết kế Kết quả nghiên cứu cho thấy đã phát hiện đươc

2 loài vi khuẩn là Pediococcus pentosaceus và Lactobacillus plantarum, trong đô vikhuan Lactobacillus plantarum chiếm ưu thế trên các mẫu nghiên cứu Nhờ vậy, nghiêncứu này đã cung cấp thêm thông tin về việc áp dụng phương pháp PCR để xác địnhthành phần vi khuẩn và đánh giá chất lượng của quá trình lên men

Từ khoá: sản phâm lên men, PCR, lactic bacteria, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum

1H

Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus plantarum are two species of bacteria belonging to the lactic acid bacteria (LAB) group that have the ability to ferment lactic acid, creating sour taste for food and enhancing nutritional value Previous research has demonstrated that the lactic bacteria (LAB) that are present in it have the capacity to ferment lactic acid, giving food a sour flavor and boosting its nutritional value Additionally, LAB bacteria may create lactic acid and bacteriocin substances which can suppress certain bacteria that lead to food rotting Therefore, the use of LAB

bacteria in food processing to improve food’s value and consumer health has a lot of promise This study was conducted with the aim of quickly determining the presence of

the bacterial species Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus plantarum, in addition

to evaluating the dominant bacterial species in commercial fermented foods by using the PCR method based on specific primers Specific primer pairs were designed based

on the specific sequence regions of each species and were evaluated for specificity by PCR with 13 other identified bacterial species Then, commercial fermentation products

in the Ho Chi Minh area were collected for DNA extraction and species components identification with these primers The research results showed that two bacterial species were detected: Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus plantarum, in which Lactobacillus plantarum bacteria dominated the research samples As a result, this study was given more information about applying the PCR method to identify bacterial components and evaluate the qualification of the fermented process.

Keywords: lactic bacteria, commercial fermented product, PCR approach, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum

1V

MỤC LỤC

Trang

LOI CAM 0907 iXÁC NHAN VA CAM DOAN ssssessesssessesssessecssessessuessessesssessesssessesatessessesssesaeeaeeeses ii

OE 7 1 ` iii

dÄ ST XD s‹xs.ssicsese-sovBsncde accents ictal instinct etn ist ati saem sb dare ean ataaannee eas 1V

J3 1134 2/7/2/7744/47440i; 1.0 uy viiiM.9Is83tosn: cm - ix

CIETY a ort eerie itera |1.1 Đặt vấn đề -s- + 2s 21221221211211211211211211111111111111211111111212121 21c rre 11.2 Mục tiêu đề tài - 5-52 223221 221221211212212111111211211112121111222112121222 2121221 rre 5

1.3 NOi dung there W161 ooo 2,

2.1 Tổng quan về thực phẩm lên men 2- 2© 2222+2z2+E+£xzzzzxzxezrsrzsczrss-x+32.1.1 Nguồn gốc của thực phẩm lên men - 2-22 222++E+z+rxezxezrxerrezzerrxrx2

2.1.2 Lợi ích của thực phẩm lên men - 2-22 2 22S+E2SE2E£EE2EE2E22E22223225222222222222e 3

2.2 Tổng quan về nhóm vi khuẩn lactic có trong thực phẩm lên men - 52.2.1 Khai niém va phan loai nhom vi khuẩn lactic 252 +s+cs222E22xczxzrsrxerxrex 52.2.2 Lợi ich va ứng dung của nhóm vi khuẩn lactic -2- 2 2z s2 2s+2sz2+z>sz>s2 52.3 Tổng quan về PedioCOCCUS PENLOSACCUS -2-22©2-S22S2222EE2E22E2EE2E2E223222232212222e2 6

°, 08H 0n Ừ,".'^'A':5 6

2.3.2 Đặc điểm của Pediococcus PentOSACeUS 5+©22-22c22+22csczcSzsrxrrrrerrrrrrrrcee 62.3.2.1 Phân bố và đặc điểm nuôi cấy - 222 ©222222EE22E222122122212712211221 22122226 62.3.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 2 2S SE+E2ESEE£EEEEEEEEEEEEEEEErErrkrrree §2.3.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Pediococcus pentosaceus trong nước và ngoài nước 7

PS 0ð in 2000.302 7 2.3.5.2 |À E:HIỆIEGUUUTTEOđI.THDPDI cại-i5509 6500003900120 388088650ã3003MLEj30480qEg38ifG80010.đg60g040i00d620 8

2.4 Tông quan về Lactobacillus plantarum c.ccccccccesvesvecsessessessessessessessessessessessesseeseees 9

QAL 0o nOỪỲỪỖD£ŒHĂHĂH 9

2.4.2 Đặc điểm của Lactobacillus plantarum ccccccscsscssesvessessessessesvessessessecsessessesseees 9

2.4.2.1 Phân bố và đặc điểm nuôi cấy 2-2 2+22+2ESEE22E22E221221212121712122ce 92.4.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 2-2 2+S2SE+EE2E£EE2EE2EEEE222252122222 222 9

2.4.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Lactobacillus plantarum trong nước và ngoài nước LŨ2:4.3.1 Ñghiễn CW TONS HƯỚỔ sáccssn g0 nã 61 618461014138536568655565165 63.904 C9635 40 80101A444039638 10 24:32: Nehiénetune0al THƯỚC cncnescmamnn neem ATER 10

CUNG, VAT LIB WA BHƯƠNGG PAD caeueeesaannnindrnddisntnsueditinigouicnoiostaestnai 1ã3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -222222+22++2E+2EE2EEt2EEZEE2Exzrxrrrrrrrres 12

BÀ 0 ean re at ere carr oe ac Sa SB eS 12

9.2.1, Doi tượng nghiÊn CIAL secoe xno ecssncstecncersecranasvesmnrenwrenensiaseressteacrremranenuaumnnness 1232.2 Thiệt bị vã đụng cụ nghiền 0 oo cnssovesnaveonrvvrevenvioeenvenisnndanisvaneaenssewoiuvenstwmsveties 123.2.3 Môi trường nuôi cấy và hoá chất - 2 2-©22+2222122E2221221222122122212212122 xe 123.2.3.1 Môi trường nuôi cấyy -+- + ©2+22+22122E1221223122122112212211211221 21122121 ee 1233.32 Hi đIT, - S.—-~chcecoene ghchhgcgHh hy Họga./20210n5E1722c6-1721239370m7e 267572505: 13

3.3 Phương phap nghiện GỮUsassesssssi se s002153161400369163156834855558058158300G6055815004349838888 133.3.1 Đánh giá primer bằng các phần mềm tin sinh học ứng dung - 14

3.3.2 Thu thập mẫu và phân lập 2 ¿2 2S 2E+S£2E£EE+EE2EEE£EE2E2EzEEzEzxzrxzei 14

3.3.2.1 Phương pháp thu thập mẫu -2- 22522 ©22E+EE£EE+£E£EEEEEEEErrrrrrrrrrrrer 14S532 Euưenerifprểfifn TU Ga ácuá nh ngu gan hấu hệt Ga ighngikixgakk xe 143.3.2.3 Kiểm tra các phản ứng sinh hóa đặc trưng -2-+22z+22+22z+zzzzzxeex 153.3.3 Ly trích DNA vi khuẩn và kiểm tra chất lượng DNA -2-75 - 163.3.3.1 Ly trích DNA vi khuẩn 2- cceecseeseeesseeseeceeeseeeseeseeeseestenseeenseesseeeees l63.3.3.2 Kiểm tra chất lượng mẫu DNA tổng sỐ - 2-22 2 22222+2z+2E222+2z222zxze l6

3.3.4 Thực hiện phản ứng PCR khảo sát primer P.pento F - P.pento R phát hiện loải vi

khuan Pediococcus PentOSACUS EEEEEEEEE nHgaa 173.3.4.1 Khao sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của primer ccc cceccceseessecseesesseeseseeeeeeees 17

33,42, Đánh giá độ THẠYV CUA DEHHTHSTseseseesssenasseioiikikkisSui4g6580033556148040106558300E9418033005E 18 3.3.4.3 Đánh giá độ đặc hiệu cua primer P.pento F - P.pento R - 19

3.3.5 Thực hiện phan ứng PCR khảo sát primer Plant F — Plant R phát hiện loài vi khuẩn

3.3.5.1 Khao sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của priimer - ccc ecsecseeseeseeseeseeseeees 19

3.3.4.2 Đánh giá độ nhạy CỦa DTIIT©T - + 5 2+ **£** + £v£vEerkrrerrerrrkerereererree 20 3.3.4.3 Đánh giá độ đặc hiệu của primer Plant F — Plant R - - 5555552 21

VI

3.3.0; Lhye hién phan img Colony PCR sus ssossessssescosseseenennsssennssncsnasssaxronvonsueveavaaaueenents 21 3.3.7 Thực hiện phản ứng Direct PCT - - 5-5 22+ 22x22 ng rệt 21

3.3.8 Đánh giá kết qua bang phương phương pháp giải trình ty gen - 21CHITIN 4 RET QUÁ Ws THAD LUẬN ccscnannamcamnacmmnccumsncumonaua 224.1 Kết quả đánh gia primer chuyên biệt trên In silico PCR amplification va NCBI 224.2 Kết quả phân lập vi khuẩn 2: 2¿©22+2222EE2EE2EEE2EE2EEE2E1221221271211221 21.222 254.3 Kết qua kiểm tra sinh hóa sàng 1oC cccscsesssesssesssessseessessseessesssesssesstessteeseeeeeees 25

4.4 Kết quả kiểm tra chất lượng 10 mẫu DNA ly trích trực tiếp - - 26

A Aad TOS gel lấn Ở soseentensnendirndnntotogigtiiStgIlf0ng9i000090001G096086090g9000g00/0010000000800063xgơt 264.4.2 Kết qua phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA . 274.5 Kết quả thực hiện phản ứng PCR khảo sát primer P.pento F - P.pento R phát hiện

loài vi khuẩn Pediococcus peHIÍOSđC€iS 5-5555 S52 S2SE22E2EE22E22E22EEEEEErErrrrrrrrree Df

4.5.1 Kết quả khảo sát nhiệt độ bat cặp tối ưu của primer -2- 22552522522 274.5.2 Kết quả đánh giá độ nhạy của primer P.pento F và P.pento R 28

4.5.3 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của primer -2+©22©52+522sz+x2zzxzxezsez 29

4.6 Kết quả thực hiện phan ứng PCR khảo sát primer Plant F va Plant R phát hiện loài

vi khuan Lactobacillus Plantarum RE num 294.6.1 Kết quả đánh giá độ nhạy primer - 2-22222+222EE+2E2EE2EE2ZEzzEEzzxzzrzcree 294.6.2 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của primer -2- 2 22 22z22z+2z2zzztzzzzzzree 3044-7 Kết quả phản ứng Direot PỨE eo ca Hả n0, 001111,1001031000002421g 06g06 30

4.7.1 Kết quả phản ứng Direct PCR với primer Plant F và Plant R 30

4.7.2 Kết quả phan ứng Direct PCR với primer P.pento F và P.pento R 314.8 Kết quả phản ứng Colony PCR 2-55-5222 2E2E2EEE21221221221221 22.2 re 314.9 Kết quả giải trình tự gen -©22©22222222222E2EE2Eerrrrrrrrrrrrrrere 324.9.1 Kết quả giải trình tự gen loài vi khuan Pediococcus penfosacews 3⁄24.9.2 Kết quả giải trình tự gen loài vi khuan Lactobacillus plantarum 33

ALO Thao Wan oo 35

CHUONG 5 KET LUẬN VA KIEN NGHI 0 ecceccccsscsecsscseseesecsesevseceesersesseeevsesseeseeeees 36

DANH SÁCH CHU VIET TAT

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

bp : base pair

ctv : cộng tác viên

DNA : Deoxyribonucleic acid

EMP : Embden Meyerhof Parnas

kp : kilobase pair

LAB : Lactic axit bacteria (nhóm vi khuẩn lactic)

MRS : De Man - Rogosa - Sharpe

NCBI : National Center for Biotechnology Information PCR : Polemerase Chain Reaction

pH : potential of Hydrogen

spp : species (plural)

UV : Ultraviolet

vill

DANH SÁCH BANG

Trang

Bang 3.1 Thành phan phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rRNA 17Bảng 3.2 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự 16S

TRINA ng bon ö022104008EESEEEEEEDHSIESIESHBERGIHDRSHEIEXBISNGESSSGSHGERSEEEISESHSIGEEHGERLSREIEBESOSSLQSISSESLIEIRRGGA00300088 17

Bảng 3.3 Thanh phan phản ứng PCR khảo sát nhiệt độ bắt cặp phát hiện loài P

ID ETTOS A CEU Si scares tote vets oss al sett i RT Sl Ela Sn Ss TEE 18

Bảng 3.4 Chu trình phan ứng PCR khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu phát hiện loài P

22/21 80a 18 Bang 3.5 Chu trình phan ứng PCR đánh giá độ nhạy phat hiện loài P pentosaceus 19Bảng 3.6 Thanh phan phan ứng PCR đánh giá độ nhạy primer phát hiện loài 7.NiHNIEINITHÍGL›anggannaniisokatoiuiBiek2bgsiixElsbeiigdtloaui300030093g095:33ĐEhalssiMồĐingiauSSSIo:GIi-EuE0d0u3J3huohE423ã.305/210215.1382/048 20 Bang 3.7 Chu trình phản ứng PCR phát hiện loài LZ DÏ4nfafrWin - 5 55<5<5+ 20

Bang 4.1 Kết quả đo nồng độ OD 22-2552 ©222SE22E2EE2EEEEEE2EEEEE2232221223.222222erxee 26

1X

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Lợi ích của thực phẩm lên men đối với sức khỏe - 55 2⁄2 ⁄ <2 <2<2<2<5 4

Hình 2.2 Nguồn vi sinh vật chính cho thực phẩm và đồ uống lên men thông thường 4

Hình 2.3 Hình thái tế bào vi khuẩn PediocoC€HMS à 2 2 222225222115 115 15251211 say 6 Hình 2.4 Hình thái tế bào vi khuẩn Jcfobacillus 2c 222112111211 551 251551552 8 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thực hiện nghiên cứu - ¿22222222 cssss2 13 Hình 4.1 Giao diện công cụ In silico PCR amplification kiểm tra khả năng khuếch đại sản phẩm và độ đặc hiệu của primer P.pento F và P.pento R - 23

Hình 4.2 Kết quả kiểm tra khả năng khuếch đại sản phâm và độ đặc hiệu của primer P.pento F và P.pento R c2 Q20 een een cent cnet eee nh nh key 23 Hình 4.3 Kết quả kiểm tra sản phâm khuếch đại của primer bằng công cụ NCBI Blast 24

Hình 4.4 Kết quả kiểm tra chéo độ đặc hiệu của primer P.pento F và P.pento R với chỉ vỉ Welter HN suang nha Ha tà 0034 Ae eR eR RN 24 Hình 4.5 Hình thái khuẩn lạc thuộc nhóm vi khuẩn lactic ‹‹ -‹: <⁄-<: 25 Hình 4.6 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn theo phương pháp cấy ria 29

Hình 4.7 Hình thái tế bào vi khuẩn - -.c 221v khe 26 Hình 4.8 Kết quả phản ứng cafalase + + c ¿c2 1122211111222 11 112551111 ex 26 Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR 16S rRNA + cccc <2 52 a7 Hình 4.10 Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của primer P.pento F và P.pento R 28

Hình 4.11 Kết quả đánh giá độ nhạy của primer P pentoF và P pentoR 28

Hình 4.12 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của primer P pentoF và P pentoR 29

Hình 4.13 Kết quả đánh giá độ nhạy của primer Plant F và Plant R 29

Hình 4.14 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của primer Plant F và Plant R 30

Hình 4.15 Kết quả phản ứng Direct PCR với primer Plan F và Plan R phát hiện 7 ee A ee 3] Hình 4.16 Kết qua phan ứng Direct PCR với primer Pento F và Pento R phát hiện P IDGTIIGNGGIHỂ tạo nha thổi tình titnh¿indilgBigh- gà NHIOEGEG Đo hoESHlGEPUDAIHGISSHUENHHESB Wun Sede eR AS 31 Hinh 4.17 Két qua phan img Colony PCR phat hién P pentosaceus va L plantarum 32

Hình 4.18 Kết quả so sánh trình tự gen của mẫu Pe7 trên ngân hàng gen NCBI 33

Hình 4.19 Kết qua phân tích cây phát sinh loài mẫu Pe7 +: 33

Hình 4.20 Kết quả so sánh trình tự gen của mẫu Lpt8 trên ngân hàng gen NCBI 34

Hình 4.21 Kết quả phân tích cây phat sinh loài mẫu Lpt - 34

XI

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong giai đoạn phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp thực pham hiện nay,

an toàn thực phẩm vẫn luôn là vấn đề được quan tâm hang đầu nên việc sử dụng cácnguồn lợi khuẩn dé kiểm soát van dé sinh học ở trong thực phẩm ngày càng được ưachuộng Thực phẩm lên men chua không chỉ là một xu hướng âm thực đang ngày càngphô biến, mà còn mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe Việc sử dụng các thực phâm lênmen chua đã được các nhà nghiên cứu và chuyên gia dinh dưỡng khuyến nghị sử dụngbởi sự đa dạng về nhóm vi khuẩn có lợi và có tác động tích cực đến hệ tiêu hóa Mộttrong những từ khóa quan trọng được đề cập trong thực phẩm lên men chua là

“probiotic” Probiotic là nhóm các vi sinh vật có lợi cho hệ tiêu hóa, giúp duy trì sự cân

bằng vi khuẩn trong đường ruột Các sản phẩm lên men chua như yogurt, kombucha,kim chi, rau lên men, măng ngâm, dưa chuột muối và đặc biệt là sản phẩm muối chuaphô biến đều có chứa các probiotic tự nhiên Các nhóm lợi khuẩn có trong thực phamlên men chua ngoài góp phan giúp cải thiện tiêu hóa, hỗ trợ hap thụ chất dinh dưỡng từthức ăn, giúp chúng ta tận dụng tối ưu các chất dinh dưỡng mà cần tiêu thụ Với nhữnglợi ích trên và sự phô biến ngày càng tăng, thực phẩm lên men chua trở thành một xuhướng âm thực, một phần không thé thiếu trong chế độ ăn uống của nhiều người

Lợi ích mà các nhóm probiotic mang lại thì phô biến trong đó là nhóm vi khuẩnlactic (LAB) là một nhóm vi khuẩn rộng bao gồm các vi sinh vật có trong thực phẩmlên men, thức ăn chăn nuôi Nhóm vi khuẩn LAB có khả năng lên men axit lactic, sinh

ra các hợp chất bacteriocin có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm,

từ đó góp phan giúp nâng cao khả năng bảo quản thực phẩm, giúp tăng hương vị và giátrị đinh dưỡng của thực phẩm Các loại trái cây và rau quả lên men có thể là nguồn cungcấp men vi sinh tiềm năng vì có chứa lượng lớn một số vi khuẩn axit lactic nhất định.Với các lợi ích và tiềm năng của nhóm lợi khuẩn lactic, việc nghiên cứu các phươngpháp xác định nhanh chóng sự hiện diện của các loài vi khuẩn lactic bằng chi thị phân

tử là cần thiết Xác định sự hiện điện của vi khuẩn bằng phương pháp chỉ thị sinh họcphân tử cho kết quả nhanh chóng hơn các phương pháp truyền thống, và có thể xác địnhđược đến cấp loài của vi sinh vật mục tiêu Tuy nhiên, thực hiện bằng chỉ thị sinh học

phân tử có nhược điểm chi phí tốn kém và trình tự primer được thiết kế yêu cầu phải có

độ chuyên biệt cho loài mục tiêu.

1.2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát được sự hiện diện của Pediococcus pentosaceus va Lactobacillus

plantarum có trong mẫu thực phẩm lên men thương mai

Đánh giá được độ đặc hiệu của primer cho việc phát hiện loài Pediococcus

pentosaceus và primer Lactobacillus plantarum.

Đánh giá thành công loài vi khuẩn chiếm ưu thé trong các mẫu thực phẩm lên men

thu thập được.

1.3 Nội dung thực hiện

Đánh giá primer chuyên biệt cho Pediococcus pentosaceus bằng các công cụ tin

sinh ứng dụng.

Thu mẫu thực phẩm rau củ lên men

Phân lập các dòng vi khuẩn lactic trên môi trường chọn lọc và ly trích trực tiếp

DNA khuẩn từ dịch tăng sinh mẫu

Thực hiện phản ứng PCR trực tiếp trên các mẫu khuẩn lạc và DNA khuẩn được lytrích trực tiếp từ dịch tăng sinh mẫu

Định danh xác định loài vi khuẩn

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tổng quan về thực phẩm lên men

2.1.1 Nguồn gốc của thực phẩm lên men

Từ ngữ lên men bắt nguồn từ tiếng Latin fermentare, được định nghĩa là “lên men”

Từ lâu, việc lên men thực phẩm đã trở thành một phần không thể thiếu trong nền văn

hóa âm thực của nhiều quốc gia trên thế giới Tuy nhiên, trong những năm gần đây quátrình này đã dần chuyên từ quy mô hộ gia đình sang các hệ thống sản xuất công nghiệpquy mô lớn, phục vụ cho thị trường trên toàn cầu Một định nghĩa rộng về quá trình lênmen cho rang đó là “sự biến đổi của thực phẩm bởi nhiều loại vi khuẩn, nắm và enzyme

mà chúng tạo ra” (Katz, 2012) Điều dang chú ý là, ngoài định nghĩa do Katz đưa ra, cácquá trình lên men có thé sử dụng men dé chuyên đổi thực phẩm va đồ uống (Giraffa,2004) Thực pham và đồ uống lên men đã được vi sinh vật biến đổi theo cách van giữđược mùi vị và mùi hương mong muốn đối với con người (Steinkraus, 1997)

Các thực phẩm lên men là thành quả của các quá trình chuyền hóa do vi sinh vậtnhư vi khuẩn, nắm mốc va nam men thực hiện, dẫn đến sự thay đổi về tinh chat lý hóa

và cảm quan của thực phẩm ban đầu Những phương pháp lên men khác nhau được sử

dụng tùy thuộc vào nền văn hóa, nguồn thực phẩm có sẵn, sở thích về mùi vị, điều kiện

môi trường, nguyên liệu thô và sự phát triển của các công nghệ mới Các kỹ thuật lên

men phô biến bao gồm lên men lactic (sữa chua và dưa muối), lên men axit axetic (giám),

lên men rượu (rượu vang và bia) và lên men malolactic (quá trình sản xuất rượu vang)

(Anagnostopoulos và Tsaltas, 2019).

Sự hiểu biết khoa học về các nguyên tắc lên men đã góp phan đáng ké vao việcphát triển các sản phẩm thực phẩm lên men mới, nâng cao chất lượng và tính an toàncủa thực phẩm, đồng thời mở ra các cơ hội nghiên cứu mới dé khai thác tiềm năng củalên men trong sản xuất thực phâm bền vững và lành mạnh

2.1.2 Lợi ích của thực phẩm lên men

Các thực phâm lên men như sữa chua, kefir và dua cải bắp là một phan trong chế

độ ăn uống của con người trong suốt lịch sử đã thu hút được sự chú ý trong những nămgan đây về giá trị dinh dưỡng và lợi ich sức khỏe Do đó, thực phẩm lên men được coi

là nhiên liệu sinh học cho hệ vi sinh vật của con người, giúp tăng cường hệ thông miễn

dịch Thực phẩm lên men là những thực phẩm và đồ uống được sản xuất bằng cách sửdụng các chất hỗ trợ lên men dựa trên vi sinh vật cụ thể như nắm men và vi khuẩn, đặcbiệt là vi khuẩn axit lactic (LAB) Thông qua các phản ứng enzyme được kiểm soát, các

vi sinh vật nuôi cấy này biến đổi các chất nền là các thành phan thực phẩm thành nhữngsản phẩm có giá trị gia tăng, thúc đây các hoạt động lên men lành mạnh khác nhau Đồngthời trong quá trình lên men thực phẩm, những vi khuẩn này cũng tạo ra các hợp chất

có thé ức chế sự hư hỏng thực phâm và các vị sinh vật gây bệnh, từ đó mở rộng thời hạn

sử dụng của sản phẩm lên men Probiotic là các hệ vi sinh vật sống có đặc tính có lợicho sức khỏe, ngăn ngừa các bệnh về đường tiêu hóa và điều chỉnh hệ vi sinh vật củacon người Hình 2.1 Do đó, thực phẩm được lên men bởi một số chủng v1 khuẩn sinh

học nhất định có bằng chứng về lợi ích sức khỏe được gọi là thực phẩm lên men sinh

học (Ibrahim, 2023).

Gastrointestinal disorders

prevention

Healthbenefits offermentedfoods

Hình 2.1 Lợi ich của thực phẩm lên men đối

với sức khỏe ((Jeyaram, 2015):(Fang, 2018)).

Primary source of fermentative organisms for common fermented foods and beverages Microbial associations shown in the table are stable over time and show remarkable similarity in different regions or countries

Food Source of organisms Organisms

Yogurt Starter culture St thermophilus, L delbrueckii ssp bulgaricus

Cheese, sour cream Starter culture, backslopping Le lactis, Lu mesenteroides

Sausage Backslopping, starter culture, spontaneous L sake, L plantarum, S camosus, S xylosus, P acidlactici

Wine Spontaneous, starter culture Sa cerevisiae, O oeni

Beer Backslopping, starter culture Sa cerevisiae (L brevis)

Bread Starter culture Sa cerevisiae

Sourdough bread Backslopping L sanfranciscensis, C humilis

Sauerkraut or kimchi Spontaneous Lu mesenteroides, L plantarum, L brevis

Olives Spontaneous L plantarum

Soy sauce, miso Starter culture, spontaneous A soyae, Z rouxii, T halophilus

Tempeh Starter culture, backslopping R oligosporus

Natto Starter culture, backslopping B subtilis var natto

St., Streptococcus; L., Lactobacillus; Lc, Lactococcus; Lu., Leuconostoc; S., Staphylococcus; P., Pediococcus; Sa., Saccharomyces; O.,

Oenococcus; C., Candida; A., Aspergillus; Z., Zygosaccharomyces; T., Tetragenococcus; R., Rhizopus; B., Bacillus.

Bảng 2.1 Nguồn vi sinh vật chính trong thực phẩm và đồ uống lên men thông

thường (Marco, 2017).

2.2 Tống quan về nhóm vi khuẩn lactic có trong thực phẩm lên men

2.2.1 Khái niệm và phân loại nhóm vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là một nhóm lớn vi khuân Gram dương, không tạo bào tử, hình cầuhoặc hình que, lên men đường thành axit lactic Chúng được tìm thấy rộng rãi trong môitrường, bao gồm cả đất, nước, thực phẩm, đường ruột của động vật và người Vi khuẩnlactic có vai trò quan trọng trong quá trình lên men thực phẩm, chang hạn như sữa chua,phô mai, dưa cải bắp và kim chi Chúng cũng được sử dụng trong sản xuất bia, rượu

vang và các loại đồ uống lên men khác Một số loài vi khuẩn lactic có đặc tinh probiotic,

có nghĩa là chúng có lợi cho sức khỏe khi được tiêu thu (Shukla, 2014) Khai niệm vi

khuẩn axit lactic (LAB) là một nhóm sinh vật được phát triển vào đầu những năm 1900,trước sự phát triển khoa học và kỹ thuật tiên phong trong phần sau của thế kỷ 19 Sựtương tác cua LAB trong thực phẩm đã sớm được các nhà khoa học chú ý và dẫn đến sựđóng góp đáng ké của Pasteur vào quá trình lên men axit lactic vào năm 1857, sau đó là

sự phân lập lần đầu tiên của một chung vi khuẩn thuần khiết, Bacterium lactis, bởi Lister

vào năm 1873 (Stiles và Holzapfel, 1997).

Ngày nay, LAB bao gồm khoảng 20 chi mà Aerococus, Carnobacterium,

Enterococus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus va Weissella được coi là LAB chính

(Limsowtin va ctv, 2002) Về hình thái, vi khuẩn lactic được chia lam 4 chi:Lactobacillus, Pediococcus, Streptococus va Leuconostoc Ngày nay, người ta bỗ sungthêm một chi nữa là Bifidobacterium có hình dang biến đôi (Đỗ Thị Bich Thủy, 2022)

2.2.2 Lợi ích và ứng dụng của nhóm vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là một nhóm vi khuẩn có lợi, quan trọng trong ngành công nghiệpthực phẩm và dinh đưỡng, đóng vai trò chủ đạo trong quá trình lên men thực phẩm màcòn mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người Các nghiên cứu khoa học về dinhdưỡng đã chỉ ra rằng vi khuẩn lactic có khả năng tăng cường hệ miễn dịch và giúp duytrì độ cân bằng của hệ vi sinh đường ruột Nhóm vi khuẩn này giúp điều chỉnh pH trongruột và ức chế sự phát triển của các loại vi khuẩn gây hại, có thé giúp giảm nguy cơ mắccác bệnh về tiêu hóa, ngoài ra cũng có khả năng tạo ra các chất chống oxy hóa, chất

chống vi khuẩn tự nhiên giúp bảo vệ cơ thể trước các tác nhân gây hại đến sức khỏe

thông qua thực phẩm Đồng thời, nhóm vi khuẩn LAB còn nâng cao hiệu suất tiêu hóa

và độ hap thụ dưỡng chat có trong thực phẩm Một số vi khuẩn sinh axit lactic phổ biến

như Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus pentosus,

Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc mesenteroides (Swain va ctv, 2014).

Vi khuẩn lactic đã chứng tỏ vai trò quan trọng trong việc cân bằng lợi khudn đường

ruột và duy trì sức khỏe con người, hỗ trợ tăng cường hệ miễn dich của cơ thé Vớinhững sản phẩm thực phẩm lên men chua như: kim chi, rau muối lên men, măng ngâm,

có chứa vi khuẩn lactic càng phát triển, càng đa dang, con người có thé tan dụng nhữnglợi ích mà chúng mang lại dé tạo ra một xu hướng âm thực lành mạnh, sức khỏe và giá

trị Vi khuân lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như nông nghiệp, công

nghiệp, y học, công nghệ thực phẩm và môi trường Đặc biệt là những ứng dụng trongcông nghệ bảo quản và chế biến thực phẩm (Đỗ Thị Bích Thủy, 2022)

2.3 Tổng quan về Pediococcus pentosaceus

Chi: Pediococcus -_ 4

; Hinh 2.3 Hinh thai té bao Loài: Pediococcus pentosaceus Pedigcoccus pentosaceus.

2.3.2 Đặc điểm của Pediococcus pentosaceus

2.3.2.1 Phân bố và đặc điểm nuôi cấy

Pediococcus pentosaceus được nghiên cứu và tìm thấy rộng rãi trong thực phẩmlên men, thủy sản, động vật sống, sản phẩm thực vật và phân, nhiều chủng ?.pentosaceus cuỗi cùng đã được chứng minh là có liên quan đến đường tiêu hóa của conngười (Barros và ctv, 2001) Cho đến nay, ngày càng có nhiều bằng chứng thực nghiệmchỉ ra rang P pentosaceus có thê được sử dụng làm chất bảo quản sinh học cho thực

phẩm, thực vật hoặc động vật hoặc như một ứng cử viên probiotic.

Pediococcus pentosaceus có thé được nuôi cây trong điều kiện ky khí va vi hiếukhí, nhiệt độ tôi ưu cho sự phát triển ở 28 - 32°C va pH trong khoảng 6,0 - 6,5 Trongđiều kiện hiếu khí, các vi khuẩn tạo ra axit axetic với ít axit lactic hơn Trên môi trường

thạch MRS khuân lạc Pediococcus pentosaceus có màu trang xám mịn, tròn lôi, viên

đều, bề mặt láng bóng, mờ đục, không sinh bào tử và vi khuẩn không có khả năng diđộng Các khuẩn lạc có kích thước nhỏ có đường kính khoảng 1 - 2,5 mm Khuan lạc có khảnăng phân giải CaCO khi môi trường nuôi cấy có bổ sung 0,5% CaCO2¿ (Raccach, 2014).2.3.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa

Pediococcus pentosaceus là vi khuân Gram dương, phân chia thành hai mặt phẳng

để tạo thành các tế bảo tứ giác Tế bảo dạng cầu khuẩn tròn (đường kính 0,4 - 1,4 mm)theo cặp và hình tứ giác Một số chủng P pentosaceus có enzyme phân giải protein như

protease, di-peptidase, dipeptidyl aminopeptidase và amino-peptidase Pediococcus

pentosaceus thé hiện hoạt động mạnh mẽ của leucine va valine arylamidase Các loài

thuộc chi Pediococcus thường âm tính với catalase và benzidine Hoạt động catalase có

thé được phát hiện ở một số Pediococcus spp khi được nuôi trong môi trường có hàmlượng carbohydrate thấp hoặc cao (Raccach, 2014) Hầu hết các chủng P pentosaceus cóthé chuyên hóa glucose, ribose, galactose, arabinose va fructose thành DL-lactate (Garvie,1986) Chi một số chủng P pentosaceus có thé lên men lactose và xyloza (Ray, 1995)

2.3.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Pediococcus pentosaceus trong nước và ngoài nước

2.3.3.1 Nghiên cứu trong nước

Thị trường thực phẩm và nguyên liệu lên men đã có nhiều phát triển trong nhữngnăm gần đây Cho đến nay, các sản phẩm sữa lên men (sữa chua) vừa là nguồn tiềmnăng của các chủng vi khuẩn có lợi (men vi sinh) vừa là dạng tiêu chuẩn dé cung cấp

các chủng chức năng đó.

Năm 2020, Lê Thi Hảo và ctv đã nghiên cứu, khảo sát tiềm năng probiotic củachủng Pediococcus pentosaceus phân lập từ bia Việt Nam Kết quả chi ra các chủng vikhuẩn này thê hiện khả năng kháng axit và muối mật tốt, cũng như khả năng ức chế các

vi khuẩn gay bệnh thông thường

Năm 2019, Nguyễn Thi Trà My đã đánh giá khả năng lên men của Pediococcus

pentosaceus dé sản xuất axit lactic từ tinh bột khoai lang Kết quả cho thay Pediococcuspentosaceus có khả năng lên men tỉnh bột khoai lang thành axit lactic với hiệu suất cao.Nồng độ axit lactic đạt được sau 24 giờ lên men là 10,2 g/L, tương ứng với hiệu suất lênmen là 85,4% Nghiên cứu này cho thay Pediococcus pentosaceus là một tác nhân lênmen tiềm năng dé sản xuất axit lactic từ tinh bột khoai lang

Theo Trần Thị Thu Hà (2020), đã nghiên cứu sử dụng Pediococcus pentosaceus

để lên men rượu vang từ nước ép nho Ninh Thuận Kết qua cho thấy Pediococcus

pentosaceus có khả năng lên men nước ép nho Ninh Thuận thành rượu vang với chatlượng tốt Rượu vang lên men bằng Pediococcus pentosaceus có màu sac đẹp, hương vịthơm ngon và nồng độ cồn đạt 12,5% Nghiên cứu này cho thấy Pediococcuspentosaceus là một tác nhân lên men tiềm năng dé sản xuất rượu vang từ nước ép nho

Ninh Thuận.

Ngoài các nghiên cứu về ứng dụng và tầm quan trọng của loài Pediococcuspentosacues trong ngành công nghiệp thực phẩm, loài vi khuẩn nay còn được nghiên

cứu ứng dụng rộng rãi trong sự phát triển ngành nông nghiệp Theo nghiên cứu của

Nguyễn Thị Thu Hiền va ctv (2023), nghiên cứu về tiềm năng sử dụng vi khuẩnPediococcus pentosaceus trong nông nghiệp Vi khuan này có kha năng sản xuất nhiềuloại chất kháng khuẩn, bao gồm axit lactie, hydrogen peroxide, bacteriocin và các chấtchuyền hóa khác Những chất kháng khuẩn này có thể ức chế sự phát triển của các loại

vi khuẩn gây bệnh thực vật, chang hạn như Pseudomonas syringae, Xanthomonas

campestris va Erwinia amylovora Ngoài ra, P pentosaceus còn có khả năng kích thích

sinh trưởng thực vật và tăng cường khả năng chống chịu của cây trồng đối với các điềukiện bat lợi Do đó, P pentosaceus được coi là một loại vi khuẩn bảo vệ thực vật có tiềm

năng trong nông nghiệp.

2.3.3.2 Nghiên cứu ngoài nước

Vào năm 2020, Li va ctv, đã phân tích đặc điểm của hai chủng lợi khuẩnPediococcus pentosaceus TO2 và LX3, thuộc dong dõi II và dòng dõi I tương ứng Kếtquả cho thấy cả hai chủng đều có khả năng ức chế các tác nhân gây bệnh thực phẩm phổbiến như Listeria monocytogenes, Escherichia coli 0157:H7 va Salmonella enterica

Cơ chế ức chế được xác định là đo sản xuất axit lactic va các chất kháng khuẩn nhưpediocin Nghiên cứu này cung cấp thông tin hữu ích về tiềm năng sử dụng Pediococcus

pentosaceus dạng men vi sinh để kiểm soát các tác nhân gây bệnh thực phẩm

Theo Zhang và ctv (2020), nghiên cứu này đã điều tra sự thay đổi của quan thé vikhuẩn và các chất chuyển hóa trong hỗn hợp dâu tây nguyên chất lên men vớiPediococcus pentosaceus ZB15 Kết quả cho thấy quá trình lên men đã làm tăng đáng

kế số lượng Pediococcus pentosaceus và làm giảm số lượng các vi khuẩn khác như

Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae Đồng thời, quá trình lên men cũng sản sinh

ra các chất chuyền hóa như axit lactic, axit axetic và các axit hữu cơ khác, góp phần vào

hương vị và mùi thơm đặc trưng của hỗn hợp dâu tây lên men

Năm 2021, El-Kholy và ctv, đã đánh giá những nghiên cứu gần đây về việc sửdụng Pediococcus pentosaceus như một chất kích thích sinh trưởng thực vật Các kếtquả cho thấy rằng Pediococcus pentosaceus có thé cải thiện sự nảy mam của hat, tangtrưởng của cây con, năng suất cây trồng và chat lượng nông sản Loại vi khuẩn này cũng

có thê giúp cây trồng chống chịu với các điều kiện bắt lợi như hạn hán, mặn và bệnh tật.2.4 Tông quan về Lactobacillus plantarum

2.4.1 Phân loại

Theo Zheng và ctv (2020) và Bergey (1923) vi khuan Lactobacillus plantarum thuộc:

Giới: Bacteria `2” 9n,

a 2, ee | ~ ‘ee tý

Ngành: Bacillota : eit —v ers

Lớp: Bacilli ee oa keop: Bacilli sẻ "`" -.

Bộ: Lactobacillales TH to+ * Ai : ¥* > & “ws nN 4

Họ: Lactobacillaceae % ae &; 6

— Zs 7 a 4 z

Chi: Lactibacillus (Lactiplantibacillus) + B 2 a —

Hình 2.4 Hình thai tê bào Lactobacillus plantarum.

$

Loài: Lactobacillus plantarum

2.4.2 Đặc điểm của Lactobacillus plantarum

2.4.2.1 Phân bố và đặc điểm nuôi cấy

Lactobacillus plantarum (hiện nay là Lactiplantibacillus plantarum) là một loài vì

khuẩn khá phổ biến của chi Lactibacillus, đồng thời là một vi khuẩn axit lactic được timthấy trong đường tiêu hóa của con người, động vật có vú, nước bọt và các sản phẩm thựcphẩm lên men cũng như thực vật ky khí (Zheng va ctv, 2020)

L plantarum có thê được nuôi cay môi trường ky khí và vi hiếu khí, trên môi

trường thạch MRS khuẩn lạc có dạng tròn lồi, màu trắng sữa, bề mặt khuẩn lạc nhẫn

bóng L plantarum được biết đến trong số các vi khuẩn axit rất linh hoạt, tăng trưởngtốt trong pH 5,5 - 5,8 và có thé phát triển ở nhiệt độ từ 12 - 45°C nhưng nhiệt độ phattriển thích hợp là 30 - 35°C và có khả năng chịu nồng độ NaCl 5,5% Vi khuẩn 7

plantarum được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4°C (Bergey, 1923).

2.4.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa

Vi khuẩn L plantarum là Gram đương, có dang hình que có dau tròn, thang, đườngkính rộng 0,9 - 1,2 pm và dai 3 - 8 pum, xuất hiện đơn lẻ, theo cặp hoặc thành chuỗi ngắn,không có khả năng di động và không sinh bào tử Tính chất đặc trưng của Lactobacillus

plantarum là khả năng di hóa arginine, và sinh ra nitric oxide Lactobacillus plantarum

có kha năng phân giải amino axit tyrosine, arginine, có đến 6 con đường khác nhau

chuyên hóa arginine và đều sinh ra nitric oxide Có khả năng lên men dị thể, quá trình

lên men hexose thông qua con đường trao đổi chất EMP dẫn đến sự hình thành axit

D-và L-lactic Ngoài axit lactic, loài vi khuẩn nay còn sản xuất axit axetic, etanol D-và axitformic Mặt khác, pentose được lên men để tạo thành axit lactic và axit axetic với sự có

mặt của phosphoacetolase cảm ứng (Corsetti và Gobbetti, 2002).

2.4.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Lactobacillus plantarum trong nước và ngoài nước2.4.3.1 Nghiên cứu trong nước

L plantarum là probiotic tiềm năng và chủ yếu có nguồn gốc từ hệ thong thực

phẩm lên men bao gồm dưa chua, dua cải bắp, kim chi Hàn Quốc, 6 liu ngâm nước muối,các loại trái cây và rau quả lên men khác cũng như một số loại pho mát, xúc xích lênmen Theo Nguyễn Thị Thu Hà (2020), đã nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vikhuan Lactobacillus plantarum, bao gồm kha năng lên men đường, sản xuất axit lactic,khả năng chịu axit và muối, khả năng tạo thành bào tử, khả năng kháng thuốc khángsinh Đánh giá khả năng ứng dụng của chủng vi khuẩn trong sản xuất sữa chua và bảo

quản thực phẩm

Năm 2020, Nguyễn Thi Hang đã nghiên cứu tác động của vi khuan Lactobacillusplantarum trên bệnh nhân viêm đại tràng mãn tính Kết quả nghiên cứu cho thấy rang vikhuẩn Lactobacillus plantarum có tác dung cải thiện triệu chứng viêm đại tràng mãn

tinh ở bệnh nhân Bệnh nhân dùng vi khuẩn Lactobacillus plantarum có mức độ nghiêm

trọng của các triệu chứng giảm đáng ké so với nhóm đối chứng

Theo Huỳnh Thị Kim Thoa (2020) đã đánh giá hiệu quả của vi khuẩn Lactobacillusplantarum trong điều trị hội chứng ruột kích thích Kết quả nghiên cứu cho thay rằng vikhuẩn Lactobacillus plantarum có hiệu quả trong điều trị hội chứng ruột kích thích.Bệnh nhân dùng vi khuẩn Lactobacillus plantarum có mức độ nghiêm trọng của cáctriệu chứng giảm đáng kế so với nhóm đối chứng

2.4.3.2 Nghiên cứu ngoài nước

Theo Raftar (2021), Lactobacillus plantarum là một loài vi khuẩn lactic phô biến

trong đường tiêu hóa của người và động vat Vi khuẩn này được biết đến với các đặc

tính có lợi cho sức khỏe, bao gồm khả năng sản xuất axit lactic, ức chế vi khuẩn có hại,thúc day hệ miễn dich và cải thiện tiêu hóa Bài báo này cung cấp tong quan về vai trò

10

cua Lactobacillus plantarum trong sức khỏe và bệnh tật, tập trung vao các nghiên cứu

gan đây về tác động cua vi khuân này đôi với các bệnh đường ruột như viêm ruột, hội

L plantarum có tác dụng đáng kê đến chiều cao cây (tăng trung bình 13%), khối lượngtươi (tăng 22%), khối lượng khô (tăng 18%), diện tích lá (tăng 25%) và các thông số

sinh trưởng khác L plantarum cũng có tac dụng tang cường kha năng kháng bệnh cho

cây trồng Trong một nghiên cứu, L plantarum đã giảm được 50% mức độ nhiễm bệnh

của cây cà chua do vi khuan Xanthomonas campestris gây ra.

Năm 2020, Egamberdieva đã nghiên cứu về Lactobacillus plantarum như mộtRhizobacteria thúc đây tăng trưởng thực vật và vai trò tiềm năng của nó trong nôngnghiệp bền vững Nghiên cứu này đã phân lập và xác định 4 dòng Lactobacillus

plantarum có khả năng thúc đây sinh trưởng thực vật từ vùng rễ của lúa mì và kê Các

loài Lactobacillus plantarum có thé sản xuất các hợp chất thúc day sinh trưởng thực vatnhư auxin, cytokinin và gibberellin Loài Lactobacillus plantarum cũng có khả năng cốđịnh đạm và phân hủy phosphate, giúp cải thiện khả năng hấp thu dinh dưỡng của câytrồng Nghiên cứu chỉ ra rang Lactobacillus plantarum có tiềm năng ứng dụng trongnông nghiệp bền vững

11

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện từ tháng 08/2023 đến tháng 11/2023

Địa điểm thực hiện đề tài nghiên cứu tại RIBE 302-304, phịng thí nghiệm Bệnhhọc và chân đốn phân tử - Viện nghiên cứu Cơng nghệ Sinh học và Mơi trường, TrườngĐại học Nơng Lâm Thành phĩ Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mau vi khuẩn lactic được phân lập va DNA vi khuẩn được ly trích từ 10 mẫu thực

phẩm rau củ muối chua thương mại được thu thập từ các chợ truyền thống và siêu thị

trong khu vực Thành phĩ Thủ Đức, Thanh phĩ Hồ Chí Minh

Mẫu đối chứng dương Lactobacillus plantarum (Lpt8) và Pediococcus pentosaceus

(Pe7) được phân lập từ các mẫu thu thập được va định danh trong nghiên cứu này

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: máy PCR (SimpliAmpTM, Applied

Biosystems, US), máy điện di gel (Mupid® - 2plus, BioPioneer Tech, Japan), máy chụp hình gel (MultiDoc, It, US), máy ly tâm (Mcrofuge® 16, Beckman Coulter, Germany),

nồi hấp vơ trùng, lị vi sĩng (EMM2023MW, Elextrolux, Sweden), tủ mat, tủ âm 20°C,

tủ sấy, tủ an tồn sinh học, cân điện tử (SPS402F, Ohaus, China), máy vortex (MX - S,JVLAB, China), máy đo quang phổ (BioDropTM Lite, BioDrop, England)

Dụng cụ trong nghiên cứu: Micropipet, đầu tuýp, đĩa petri, Ống nghiệm, ống

eppendorf, đèn cồn, que cấy, lam kính, cốc thủy tinh, bình thủy tinh, ống đong, túi dap

mẫu (stomacher filter bàs).

3.2.3 Mơi trường nuơi cấy và hố chất

3.2.3.1 Mơi trường nuơi cay

Mơi trường tăng sinh De Man - Rogosa - Sharpe agar (MRS agar): Peptone 10 g/L,

Meat extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Glucose 20 g/L, Tween 80 1g/L, CHsCOONa

5 g/L, Dimontum citrate 2 g/L, MgSO, 0,2 g/L, MnSOx 0,05 g/L, K2 HPO, 2 g/L Mơi

trường MRS agar cĩ bồ sung thêm 0,5% CaCO¿ Điều chỉnh pH 6,2 + 0,2 Hap tiệt trùng

ở 121°C trong 15 phút.

12

Môi trường nuôi cấy De Man - Rogosa - Sharpe broth (MRS broth): Môi trườngMRS không bồ sung Agar 12 g/L và 0,5% CaCO: Điều chỉnh pH 6,2 + 0,2 Hap tiệt

trùng ở 121°C trong 15 phút.

3.2.3.2 Hoá chất

Hóa chat dùng trong ly trích DNA tổng số: STE buffer (pH = 8; NaCl 100 nM,

Tris - HCl 10 nM, EDTA 1 mM), Lysis buffer, PCI (Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol với tỷ lệ 25:24:1), Cloroform, Isopropanol, Ethanol 70%, Elution buffer, Enzyme Lysosome.

Hóa chat dùng trong phản ứng PCR: Nuclease-Free-Water, Dream Taq Green PCR

Master Mix, primer 1489 R, primer 63 F, primer Plan F, primer Plan R, primer P.pento

F, primer P.pento R.

Hóa chất dùng trong điện di gel: Agarose, loading dye, ladder 1 kb (Thermo Scientific),

ladder 100 bp, dung dich gel red, dung dịch đệm TBE 0,5X (Tris HCI: Borate: EDTA).

3.3 Phuong pháp nghiên cứu

Các phương pháp thực hiện trong nghiên cứu được sơ đồ hóa theo Hình 3.1

Đánh giá và kiêm tra primer dựa vào

các công cụ sinh tin học

Thu thập mẫu

Tăng sinh mẫu

Phân lập và chọn lọc vi khuân lactic Ly trích trực tiếp DNA tông số

Khảo nhiệt độ bắt cặp tối ưu của primer

trên mâu đôi chứng

Đánh giá độ nhạy của primer trên mau

đối chứng

Thực hiện phản ứng Colony PCR phát Thực hiện phan ứng Direct PCR phat

hiện L plantarum va P pentosaceus hién L plantarum va P pentosaceus

Danh gia két qua

Hình 3.1 So đồ quy trình thực hiện nghiên cứu

13

3.3.1 Đánh giá primer bằng các phần mềm tin sinh học ứng dụng

Dựa vào cơ sở dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) hỗtrợ tìm kiếm các cơ sở đữ liệu genome và protein, chọn lọc các vùng trình tự chuyên

biệt dé thiết kế primer cho khuẩn Pediococcus pentosaceus

Primer chuyên biệt phát hiện loài P pentosaceus được thiết kế trên phần mềmPrimer3Plus dựa vào vùng trình tự protein chuyên biệt đã được chon lọc trước đó Kết

quả cho việc sử dung Primer3Plus ta sẽ được các cặp đoạn primer tương ứng vớiTemplate Sequence đã nhập vào và phù hợp với các thông số đã được thiết lập trước

Kiểm tra đoạn primer đã thiết kế dựa trên cơ sở dữ liệu In silico PCR amplification,đây là công cụ hỗ trợ tính toán kết quả lý thuyết của một phản ứng PCR bằng cách sửdụng một bộ primer nhất định để khuếch đại trình tự DNA từ bộ gen Từ đó đánh giáđược kha năng phát hiện của primer đã thiết kế với loài vi khuẩn mong muốn và đánh

giá được tính đặc hiệu, tính chuyên biệt của đoạn trình tự primer.

3.3.2 Thu thập mẫu và phân lập

3.3.2.1 Phương pháp thu thập mẫu

Tiến hành thu thập mẫu tại các chợ (chợ Linh Trung, chợ Tám Giang) và siêu thị(CoopXtra, Bách hóa xanh) trên địa bàn Thành phó Thủ Đức, Thành phó Hồ Chí Minh

Kết quả thu thấp được 10 mẫu rau củ lên men (muối chua), mẫu khi thu thập được bảo

quản ở điều kiện lạnh và mang về phòng thí nghiệm tiến hành xử lý mẫu ngay và bảoquản mẫu ở 4°C sau đó tiễn hành phân lập

Sau khi thu thập mẫu xong, tiến hành khử khuẩn bề mặt bên ngoài bao bì chứamẫu bằng cồn 70° Sau đó, cân 1 g mẫu và 1 mL nước sản phẩm lên men bỏ vào túi đậpmẫu vả tiến hành dap nát mẫu Hút 1 mL phần dung dich đã nghiền cho vào ống nghiệm

chứa 9 mL môi trường MRS broth và ủ trong vòng 24 giờ ở 37°C.

3.3.2.2 Phương pháp phân lập mẫu

Mẫu sau khi được xử lý và tăng sinh trong môi trường MRS broth, ủ ở 37°C trong

vòng 24 giờ, sau đó được tiến hành phân lập

Chuan bị đĩa thạch: rót môi trường vào mỗi dia petri khoảng 15 mL trong môitrường vô trùng Khi môi trường đông đặc, lật ngược đĩa va dé khô ở nhiệt độ phònghoặc trong tủ ấm 37°C khoảng 12 giờ hoặc dé qua đêm

Chuẩn bị 6 ống nghiệm, mỗi ống có chứa 9 mL nước cất đã hấp khử trùng phaloãng mẫu ở nồng độ 101,107,103,10'1, 105,105 Tiến hành ding micropippet hút 1 mL

14

dung dịch mẫu đã tăng sinh cho vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều, được nồng độ phaloãng 101 Sau đó, dùng micropippet hút tiếp 1 mL dung dich từ ống thứ nhất vào ống

2 và lắc đều, được nồng độ pha loãng là 103, tiếp tục tiến hành cho đến ống thứ 6

Dùng micropippet hút 0,1 mL từ mỗi nồng độ pha loãng 10, 10°, 10 cho vàodia petri có chứa môi trường MRS agar đã được bổ sung 0,5% CaCO; (mỗi nồng độ lặplại 3 lần) Tiếp theo, dùng que cấy trang cây đều dung dịch khuẩn trên bề mặt môi trườngcho thật khô Sử dụng parafin quan ki dia lại để môi trường bên trong không bị nhiễmkhuẩn từ bên ngoài Dia cấy khuẩn được ủ ở 37°C trong vòng 48 giờ, ở điều kiện ky khítùy nghi Sau 48 giờ, quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa, chọn những khuẩn lạc cóhình thái điển hình của Pediococus va Lactobacillus có khả năng tạo vòng phân giảiCaCO: Dùng tăm đã hap khử trùng bắt khuẩn và cấy điểm trên dia petri khác chứa môitrường MRS có bồ sung 0,5% CaCO; (Xiao và ctv, 2015)

3.3.2.3 Kiểm tra các phản ứng sinh hóa đặc trưng

Nhuộm Gram: mục đích quan sát hình thái, kích thước tế bào, kiểm tra được vi

khuẩn là Gram dương hay Gram âm

Phương pháp thực hiện: nhỏ 1 giọt nước lên lam kính sạch, dùng que cấy vô trùnghoặc tăm đã hấp khử trùng lấy một ít khuẩn lạc dàn đều lên lam kính để tạo vết bôi Cốđịnh mẫu vi khuẩn bằng các ho trên ngon lửa đèn cồn và dé nguội Nhuộm với dungdich Crystal violet trong khoảng 30 giây (bước này sẽ giúp nhuộm tat cả thành tế bảo vikhuẩn thành màu tim) sau đó rửa đưới vòi nước cat chảy nhẹ Tiếp theo nhuộm với dungdịch Lugol trong khoảng 30 giây (dung dịch sẽ giúp gắn màu tím vào thành tế bào đậmhay nhạt tùy thuộc vào loại thành tế bào của vi khuẩn), rửa sạch với cồn 96° đến khimiếng lam kính không còn màu, sau đó rửa lại bằng nước cất Cuối cùng nhuộm Safarinkhoảng 30 giây (bước này giúp các thành tế bào đã được tây màu tím bắt lại màu đỏ,những thành tế bào đã bị nhuộm tím sẽ không bị ảnh hưởng) và rửa sạch bằng nước cắt

Đề khô tự nhiên lam kính Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi với vật kính quansát 100X (nhỏ thêm giọt dầu soi kính) Những vi khuẩn Gram dương có thànhpeptidoglycan day sẽ bắt màu tim, vi khuẩn Gram âm có thành tế bao mong sẽ bat màuhồng Tiến hành chọn những vi khuẩn Gram dương dé thực hiện các thí nghiệm tiếp

theo trong nghiên cứu này (Trần Thanh Mến va ctv, 2019)

Kiểm tra phản ứng Catalase: mục đích để phát hiện vi sinh vật có hệ enzymecatalase Phương pháp thực hiện: dùng que cay vòng vô trùng hoặc tăm đã hap khử trùng

15

lay một ít khuẩn lạc đặt lên lam kính, nhỏ một giọt H2O> lên vết vi khuẩn trên lam kính.

Vi khuẩn có enzyme catalase sẽ thủy phân HO thành H20 và giải phóng O> tạo bọt khí.Quan sát phan ứng, chọn lọc những vi khuẩn có phan ứng catalase âm tính, không tạobọt khí (Axelsson, 2004).

3.3.3 Ly trích DNA vi khuẩn và kiểm tra chất lượng DNA

3.3.3.1 Ly trích DNA vi khuẩn

Mau sau khi thu thập về được xử lý và tăng sinh trong ống nghiệm chứa môi trườngMRS broth, ủ ở 37°C trong 24 giờ Sau đó tiễn hành ly trích trực tiếp DNA vi khuẩn

theo phương pháp của Sambrook và Russell (2001).

Bước 1: dùng micropippet hút 1 mL dich tăng sinh vi khuẩn vào tube 1,5 mL; lytâm 10000 vòng/phút trong 3 phút; loại bỏ phần dịch nổi phía trên thu sinh khối tủa phíadưới tube (lặp lại 3 lần)

Bước 2: rửa cặn khuẩn bằng cách thêm 400 uL STE buffer vào tube chứa cặnkhuẩn; vortex; ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút; loại bỏ phan dịch nổi thua tủa (lặplại 2 lần)

Bước 3: phá vỡ thành tế bao vi khuân Thêm 400 pL Lysis buffer vào tube; vortexđều hỗn hợp khuan và hóa chất; ủ ở 65°C trong 1 giờ

Bước 4: cho 300 4L, PCI vào tube và đảo nhẹ cho đều hỗ hợp; ly tâm 13000

vòng/phút trong 10 phút.

Bước 5: thu dịch nổi Hút 300 pL dịch nổi vào tube mới và thêm 100 pL

Chloroform (ty lệ 3:1); ly tâm 13000 vòng/phút trong 8 phút.

Bước 6: hút 200 uL dịch nổi vào tube mới và thêm 100 pL Isopropanol, đảo nhẹcho đồng nhất mẫu, ủ lạnh trong 30 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong 13 phút; loại

bỏ phan địch nổi, thu tủa DNA

Bước 7: rửa tủa DNA Thêm 480 pL Ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/phút trong

10 phút Loại bỏ dich nổi (lặp lại 2 lần) Dé khô mẫu ở điều kiện tự nhiên

Bước 8: thêm 50 ulL TE buffer và bảo quan mẫu ở -20°C

3.3.3.2 Kiểm tra chất lượng mẫu DNA tổng số

Tiến hành do OD dé kiểm tra chất lượng mẫu DNA về nồng độ và độ tinh sạchmẫu sau khi ly trích bằng máy đo quang phổ Biodrop

16