Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Đánh giá một số đặc điểm liên quan đến khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của một số chủng xạ khuẩn Streptomyces spp

Khả năng thúc day tăng trưởng của các chủng xạ khuẩn được đánh giá qua ba nội dung gồm: khảo sát đặc điểm sinh hóa liên quan đến khả năng thúc đâytăng trưởng ở thực vật, đánh giá khả năn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

ĐÁNH GIÁ MỘT SO ĐẶC DIEM LIÊN QUAN DEN KHẢ NANG THÚC DAY TANG TRƯỞNG THỰC VAT

CUA MOT SO CHUNG XA KHUAN Streptomyces spp.

Nganh hoc : CONG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : DO THỊ THANH HUYEN

Mã số sinh viên : 19126068

Niên khóa : 2019 — 2023

TP Thủ Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

-TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HQC SINH HQC

KHOA LUAN TOT NGHIEP

ĐÁNH GIA MOT SO DAC DIEM LIEN QUAN DEN

KHA NANG THUC DAY TANG TRUONG THUC VAT CUA MOT SO CHUNG XA KHUAN Streptomyces spp.

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiệnPGS.TS NGUYÊN VŨ PHONG BO THỊ THANH HUYENThS TRAN THỊ THANH HUONG

TP Thu Đúc, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng gửi đến PGS.TS Nguyễn Vũ Phong, Khoa Khoa học Sinh học,Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Người đã trực tiếp tận tình hướngdẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài này lời cảm ơn chân thành

và sâu sắc nhất

Xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Trần Thị Thanh Hương, Th.S Hà Thị Trúc Mai, chi

Đặng Huỳnh Thúy Vy và các anh, chị, bạn của phòng Sinh học tích hợp thực vật đã hỗ

trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài này

Xin cảm ơn lãnh dao, Ban Giám hiệu cùng các Thay, Cô khoa Khoa học Sinh học

đã tạo điều kiện, góp ý, chỉ dẫn cho tôi hoàn thành tốt khóa luận của mình

Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình vẫnluôn đồng hành, cô vũ, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian họctập và thực hiện tốt luận văn này

Xin chân thành cảm on!

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Đỗ Thị Thanh Huyền, MSSV: 19126068, Lớp: DH19SHD, thuộc ngành

Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây

là Khóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong

nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

trước Hội đồng về những cam kết này

Tp Hô Chi Minh, ngày 28 tháng 02 năm 2024

Người viet cam đoan

ll

TÓM TẮT

Nghiên cứu khảo sát khả năng thúc đây tăng trưởng của ba chủng xạ khuẩn

Streptomyces spp Khả năng thúc day tăng trưởng của các chủng xạ khuẩn được đánh

giá qua ba nội dung gồm: khảo sát đặc điểm sinh hóa liên quan đến khả năng thúc đâytăng trưởng ở thực vật, đánh giá khả năng kích thích nảy mầm và khả năng kích thíchtăng trưởng của xạ khuẩn đối với cà chua ở điều kiện in vitro, đánh giá khả năng kíchthích tăng trưởng của xạ khuân đối với cây cà chua ở điều kiện nhà lưới Kết quả khảosát sinh hóa cho thay các chủng xạ khuẩn Streptomyces spp sinh enzyme phân giảicellulose, phân giải lân, tạo màng sinh học, tạo phức sắt, có khả năng cô định dam, sinhtông hợp gibberellic acid (GAs) Trong điều kiện in vitro, khả năng kích thích nay mam,kích thích tăng trưởng của ba chủng xạ khuẩn Stretomyces đã được khảo sát Kết quảcho thay nghiệm thức xử lí với H2O có tỷ lệ nảy mầm cao hơn ở giai đoạn 48 giờ và 72giờ, đặc biệt ở giai đoạn 48 giờ là 64,33% so với các nghiệm thức xử lí bởi xạ khuẩn có

tỷ lệ nảy mầm dao động từ 41,67% đến 46,67% Các thí nghiệm cho thấy ở giai đoạnnay mam xạ khuẩn Streptomyces chưa tác động đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài thân và số

lá, tuy nhiên hệ rễ lại phát triển nhiều rễ con hơn so với các nghiệm thức đối chứng.Trong điều kiện nhà lưới, nghiệm thức xử lí với xạ khuẩn cho chiều cao cây và hệ rễphát triển hơn so với nghiệm thức xử lí với H2O và môi trường Gause I, cao nhất lànghiệm thức xử lí với chủng BT06 có chiều cao thân là 345,00 mm Kết quả nghiên cứucho thay các chủng Streptomyces spp khảo sát đều cho thấy có tiềm năng trong việcthúc đây tăng trưởng ở thực vật, đặc biệt là Streptomyces spp BT06

Từ khóa: Cà chua, cô định đạm, sinh tổng hợp GAs, Streptomyces, thúc đây tăng

trưởng thực vật.

1H

The study investigated the growth-promoting ability of three strains of Streptomyces spp The ability to promote growth of actinomycete strains is evaluated through three

contents including: surveying biochemical characteristics related to the ability to promote

growth in plants, evaluating the ability to stimulate germination and the ability to promote

growth in plants, stimulate growth of actinomycetes in tomatoes in in vitro conditions,

evaluate the ability to stimulate growth of actinomycetes in tomato plants in greenhouse conditions Biochemical survey results showed that the actinomycete strains Streptomyces spp produces enzymes that decompose cellulose, phosphate solubilization, biofilm formation, siderophore formation, nitrogen fixation and biosynthesize gibberellic acid (GA).

Under laboratory conditions, the ability to stimulate germination and growth of three

Streptomyces strains was investigated The results showed that treatments treated with H20 had a higher germination rate at 48 and 72 hours, especially at 64.33% at 48 hours compared to treatments treated with actinomycetes Germination rate ranges from 41.67%

to 46.67% Experiments showed that at the germination stage, Streptomyces did not affect

the germination rate, stem length and number of leaves, but the root system developed

more rootlets than the control treatments In greenhouse conditions, the treatment with actinomycetes gave the plant height and root system more development than the treatment with HaO and Gause I environment, the highest height was the treatment with strain BT06

plant height is 345.00 mm Research results should that strains of Streptomyces spp.

Surveys show that it has potential in promoting growth in plants, especially Streptomyces spp B106.

Keywords: GAs production, nitrogen fixation, plant growth promoting, Streptomyces

spp., tomato.

1V

MỤC LỤC

LOI CAM 09 iXÁC NHAN VA CAM ĐOAN 27222 222222122121121211211212112112121121121211 2111 x6 iiTOM TAT 1ä iii

ABSTRACT -.-52-2222222212221221211221221121122112112112112112112111112112112212211221212 21 xe iv

DANH SÁCH CÁC CHU VIET TẮTT - 2-2 ©2222222E2EE2EE2E+2EEZE+2EEzzEezzrerxee viiiTUNH RE ee es ixDANH SÁCH CÁC HINH 0.0 c.ccsccssessessessessessessessecsessessessessessessessessessessesseesessessessesaeaes x

1.1 Đặt vấn đề - s21 21221221221211211112112112111111111111212121121211111 1 ecreg 1Erg | a |

I6) (U0800001-ã/0ii40i50101075—=ÖÔÖ Ö 1

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 20.0 ccccccsscssssessessessseseesessesesseseesessesstessensseeeesees 32.1 Tổng quan về xa khuân Streptomyces Spp scsssessessessesssessesstessessesssesseessessesseeees 32.1.1 Phan loai, phan bố va vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên -. -.Ä

°à 5104 0 4

2.1.2.3 Bào tử 2 25222 2222212212211211211211211211211211211212211212122221211212112 re 5

2.1.2.4 Điều kiện anh hưởng đến xa khan oo ccs ecseeseesesseeseesessessessessesseseeeseees 52.2 Khả nang sinh tổng hợp các chat thúc day tang trưởng thực Vat 5

2.2.1, Khả hăng phân giải CellulQ$Š:sxs.seasscsssssesissi146651211661601010135536846656165/3005 5936388 40 5

2x2 NO TANS PAR DHIÃI JÃTToccecsssesasdianoihniidtotoiBGGDlGSGSSHGLSSEGSR-AGHSSSSSDGSESSGEEESSSHGEIEGISUG83035868 5

2.2.3 Kha năng sinh tong hợp Biofilm: - 2-52 222S22222E22E2E22E221222232222222222 2222 62.2.4 Khả năng sinh tong hợp IAA 2 2-52¿525222E22E£2E2EE£EE£EEtZEEEZEZEerxrrxrzrrre 6

2210, Khả nãng sinh ChÀocssuassensetiss11948550000001391501360168000301649Đ0/003830VE0G13/2G0SG0GD3GS018SGUS60GE8 a

2.2.7 Khả năng cố định đạm 2© 2+222+2E22EE22E12221122112712271227112712271211211 221 2e 7

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài HƯỚC - 5 5+2 *S+**+2skEsekerrrrrrrrxre 7 3,3,1 Tink hình nghiên cứu TONE HƯU se sesenanog0210231444564858385533565SE015NGESS013183323053538 if

2.3.2 Tình hình nghiÊn cứu Hgoài 1G Cs .csicsivconcincsesnenctenasirierennenirniaienannecaat 8

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP -. -2-©22-55+5522c+2zxszzesrcee 93.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -¿©222222+22122EE22E122212221222122212221222 22.2 9

3.2 Vat li@ur mghién COU 9

33 PHOS PhS PHS WISH GIỮU so senpse gái s6 soars 258605150ã083836881588d93/8S83u86g63880 0955 0/14481805488u8 10

3.3.1 Khảo sát các đặc điểm liên quan đến khả năng thúc đây tăng trưởng của xạ

(hôn: ễ tgpfitriyppitott | | x««eneeskndendeinvienorgcoingkgsrSeniErrEuugfog102400x/NGAE0103.010/202001021000501 10

3.3.1.1 Khảo sát khả năng phân giải cellulose - +55 55+<<+c+sc+seeererrserree 10

3.3.1.2, Khảo sát kha năng phân giải lÂẦN, -:sccccsceciisss54615160161B11110001601601441855004G55 11

3.3.1.3 Xác định kha năng sinh phức sto ccc cece cecseesseesseessesssessseesseestesseeseeneees lãi3.3.1.4, Xác định khã năng sinh tông hợp TAN cccsnccrsscsnnesinmnnsretammanmnmenannses 11

3.3.1.5 Xác định kha năng hình thành biofilm eee eeeeeeeeeseeseeseeseeeeereees 12

33.136, Khảo sắt khá năng sinh GAS soozecseeeeososcssiabgiisbioosS20i00033051898360302E8599990130/05.9888g0.8 12

3.3.1.7 Định tính khả năng cố định đạm - 22 22222222EE+EE2EE+EE2EEzrxrrrrzrxeer 133.3.2 Khao sát khả năng thúc day tăng trưởng thực vật của xạ khuẩn trong điều kiện in

1 5 sa na TT sẽ 13

3.3.2.1 Khảo sát khả năng kích thích nảy mầm hạt cà chua của xạ khuẩn trong điều

NINH GP) WIE tytc 5124 GEXSESNGRESEIOIVSDOBGELHESRBE-EEEORhHGNEIBleblindgdtkiSSEIEESHSISSXSQAG23RC3fbSSL- QuSLSĐcgRlbsbit 13

3.3.2.2 Thử nghiệm khả năng kích thích tăng trưởng của xạ khuan trên cây cà chuatromg GiGU Kit i71 07 2 ẽ 13

VI

3.3.3 Khao sát ảnh hưởng của các dòng xạ khuẩn Streptomyces spp đến sự sinh

trưởng của cây cả chua trong nha ÏƯỚI - + 252252 +22 *S2**2E 2E zErrerrererrrrree 145A Vince itt i l NưaiagggnasoanstgotbeqoitkpsS88096I3000080008500100/0500374000.0040.E 15CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 52 52 2E2E£2E22EEE2EEEEEerkerree l6

Bh KẾT HỖ ng gunỹgn ng phan ngnGHS HO E0HD303013/150001016009 0810100 )5130300/00000013000000016151)50008/49g0E l64.1.1 Các đặc điểm liên quan đến khả năng thúc day tăng trưởng của ba chủng xa

khuan Streptomyces Spp 8N" 16

3,1;1.1; Khả năng phân 2141 C6llUGSŠussxeesssssivoaeboiaiisii0L3818006380188806100155096609934380088 16

4.1.1.2 Khả năng phân giải lân c5 252 2222222 22123221 2112122121212 211gr 17

ALA, Rie năng shữu th hư Ta susgoinodgoietieoogetiB053800868480014610010010400 803800 6ã 184.1.1.5 Khả năng tong hop biofilm - 2-22 ©2222222E22EE2EE2EE2EEE2EE2EEEEE2EEEEerrrrev 19

4.1.1.6 Khả năng sinh GAS ¡sscsesiissrsodiE5041648483131040038686360363.007355%581433131G13518 3133908828136 20

4.1.2.2 Khao sát kha năng kích thích tăng trưởng của xạ khuẩn lên hạt cà chua trong

GUMS HD sa seugbiShgitgaSiogiioisilSafL)38EbSSU14aB8812883E08i283laEinli2ãB43i3ầS80g3584305858:sExg838sg05iasusi 23

4.1.3 Khả năng kích thích tăng trưởng của xạ khuẩn đến cây cà chua trong điều kiện

THA UOT eon eviews caus ceweseweavecsvavinwenaunvent g0 u40 00x 0g 0086106010 00161110 00/0410000000014.200010011016i0808/1i08 106123000010” 25

ALD MAO) [HAT 82 cect acre aces lance seed eral ee net oe cles sale ae Tad la ie il og el 28

CHUONG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ, -2-©22E22E22E22E22121121121121121222 2x2 305.1 Kết ane ccccc ccc ecesecsessescsesessecsesssssecssesecsessssssesuessssesissseassassessesaesnsaesessesaeeaeeees 30

| | 30TAI LIEU THAM KHAO woioiecccccccceccsscssessesseesessssecsecscsssssssesessecsessssessessessesseceesseeaeeaes 31

Vil

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

CAS: Chrome azurol S

CMC: Carboxy methyl cellulose

CV: Coeficient of variation

GAs: Gibberellins

G1: Gause I

IAA: Indole-3-acetic acid

ISP2: International Streptomyces Project - 2

ISP9: International Streptomyces Project - 9

NT: Nghiệm thức

7N-SLT: 7 ngày sau lần tưới

vill

DANH SÁCH CAC BANG

Bảng 4.1 Khả năng phân giải CMCC (252 2212212212121 21 1E 1H re 16Bang 4.2 Chỉ số hòa tan lân của 3 chủng xạ khuẩn sau 7 ngày - 17

Bang 4.3 Khả năng sinh tổng hợp IAA (g/mL) của 3 chủng xạ khuẩn sau 7 ngay 18Bang 4.4 Khả năng sinh tổng hop GAs (g/mL) của 3 chủng xạ khuẩn sau 7 ngày 20Bảng 4.5 Tỷ lệ hạt cà chua nảy mầm sau 48 giờ và 72 giờ đưới sự tác động của xạkhuẩn ở điều kiện i7 Vi/FO -¿- 2-52 S2+SE2E2EEEE2E21211211212112112111111112112112111 21121 re 22

Bang 4.6 Chiều dai chôi, chiều dài rễ của cà chua sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường

Bảng 4.7 Chiêu cao cây cà chua dưới sự tác động của xạ khuân ở điêu kiện nhà lưới

Ua CAC Biad GOAN oo 25 Bảng 4.8 So lá cây cà chua dưới sự tac động của xạ khuân ở điêu kiện nha lưới qua các

WTA OAM saxp42v6121363553656036g30488555800S0%-3E8g000L83060PRMEBILSEIHIUIRS-EPXGSLESRGSHIEISSEiISNNH3iL-0AiBiBtiiMRSi 27

Bảng 4.9 Trọng lượng tươi và chiều dài rễ của cây ca chua sau 7N-SLT4 27

1X

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Khuẩn lạc Streptomyces spp trên các môi trường khác nhau 4

Hình 4.1 Vong phân giải CMC của 3 chủng xạ khuẩn Streptomyces spp 16

Hình 4.2 Vòng phân giải lân sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường Pikovskaya 17

Hình 4.3 Các chung Streptomyces trên môi trường sau 14 ngày - 17

Hình 4.4 Đường chuẩn IA A - 2222 S22 ©sS22EE2EEECACE+E+E+E.EE.rrrrerrrrrrerree 18 Hình 4.5 Kha năng sinh tổng hop TAA .0.ccccccccccsccssessesseessessessecsesssesseesessseseteseeees 19 Hình 4.6 Biofilm bam thành ống nghiệm sau 7 ngày nuôi cay các chủng xa khuan 19

Hình 4.7 Đường chuẩn GAs 2-52-2222 21221221221221221221212121212121 2121 xe 20 Hình 4.8 Kha năng sinh tông hợp GAs -2-52- 52 5222S22E22E22E22E2212321221221222e22e2 21 Hình 4.9 Sự hiện diện của xạ khuẩn trên môi trường Bruk’s vô đạm 21

Hình 4.10 Hạt ca chua nảy mam sau 72 giờ nuôi cấy -2 2z 55222522 22 Hình 4.11 Chiều dai mam hat cà chua sau 72 giờ ngảy nuôi cấy . -5- 23 Hình 4.12 Ré và chồi cây cà chua sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/4 24

Hình 4.13 Hình thái rễ cà chua sau 5 ngày xử lí với xạ khuẩn -. -25252¿ 24 Hình 4.14 Cây cà chua dưới tác động của xạ khuẩn trong nhà lưới sau 28 ngày 26

Hình 4.15 Chiều dài thân và chiều dài rễ của cây cà chua sau 28 ngày xử lí với xạ

‡huốn ở điều Kiện nhà |: seo basecuntsidBiodirdtdsiooiiisdiolitgpsloedi00501/10G30<00400406-00081 60.26 28

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Van đề liên quan đến môi trường vẫn luôn là chủ đề luôn được quan tâm, nhiều biệnpháp bảo vệ môi trường, cải thiện chất lượng các tài nguyên đất, nước được quan tâmhơn Việt Nam với hơn 75% (năm 2020) đất canh tác nông nghiệp thì sự tác động củaviệc canh tác đến môi trường đất, nước là rất lớn, từ năm 1960 thuốc bảo vệ thực vật cónguồn gốc hóa học đã được sử dụng và ảnh hướng nhiều đến môi trường cũng như sức

khỏe của người sử dụng.

Chính phủ cũng xem đây là một trong những mục tiêu cần cải thiện thông qua cácnghị quyết về chiến lược phát triển nông thôn và nông thôn bền vững giao đoạn 2021 —

2030 Chiến lược đề cập đến phát triển nông nghiệp theo hướng hữu cơ: xây dựng các

quy trình thân thiện môi trường, thuận thiên, ưu tiên sử dụng phân bón hữu cơ, phân bón

vi sinh, các loại thuốc bảo vệ thực vật mang nguồn gốc từ sinh học

Các chế phẩm bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ vi sinh vật với nhiều ưu điểm thânthiện với môi trường Trong đó, xạ khuẩn là một trong những loại vi sinh vat có nhiềutiềm năng bảo vệ thực vật thông qua khả năng sinh tông hợp các chất có ít cho cây trồng,các chat kháng sinh mang lại hiệu quả phòng trừ bệnh hại mà không dé lại các tồn dukhông mong muốn trong đất và cây trồng, khoảng 80% kháng sinh có nguồn từ xạ khuẩn(Dhanasekaran, 2016) và trong số đó thì chi Streptomyces được thông kê có tiềm năngtiết nhiều kháng sinh nhất (Intra, 201 1)

Chính vì những tiềm năng mà chi xạ khuẩn Streptomyces mang lại nên đề tài “Banhgiá một số đặc điểm liên quan đến khả năng thúc day tăng trưởng thực vật của một sốchủng xạ khuân Streptomyces spp.” được tiền hành nhằm góp phan cho nền nông nghiệp

xanh và sạch.

1.2 Mục tiêu đề tài

Đánh giá một số đặc điểm liên quan đến kha năng thúc day tăng trưởng thực vật củamột số chủng xạ khuẩn Streptomyces spp nhằm tạo chế phẩm phân bón sinh học

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Khảo sát các đặc điểm sinh hóa liên quan thúc day khả năng tăng trưởngcủa xạ khuẩn Streptomyces spp

Nội dung 2: Thử nghiệm khả năng kích thích tăng trưởng của xạ khuẩn trên cây càchua trong điều kiện in vitro.

Nội dung 3: Thử nghiệm hiệu quả thúc day tăng trưởng của xạ khuẩn trên cây cachua trong nhà lưới.

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Téng quan vé xa khuan Streptomyces spp

2.1.1 Phân loại, phân bố và vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên

Streptomyces là một trong những chi xạ khuẩn đại điện, lớn nhất của ngành

Actinobacteria Phân loại khoa học theo Waksma và Henrici, 1943 thi Streptomyces

thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, họ

Streptomycetaceae, chi Streptomyces Chúng là những vi sinh vật hiểu khí, Gram dương,thiếu độ bền acid (non-acid fast) chúng có thời gian tăng trưởng chậm, thường là lớnhơn 03 ngày, phân nhánh rộng rãi, cấu trúc khuẩn lạc phức tạp, hình thành các khuẩn tykhí sinh và khuẩn ty cơ chat

Tính đến tháng 01 năm 2023 chi Streptomyces có 699 loài được công bố hợp lệ và

có tên chính xác so năm 2012 là 533 loài đã được giới thiệu trong Bergey's Manual of

Systematic Bacteriology cho thấy số loài của chi Streptomyces được nghiên cứu và timthay mỗi năm có thé đạt đến hàng chục loài (Komaki, 2023) Đồng thời chỉ tiết trên cũngchứng minh các nghiên cứu quan tâm đến tiềm năng mà chi xạ khuẩn này mang

Streptomyces phân bô rộng rãi trong môi trường nước, đất, trầm tích biển, không

khí, các chất hữu cơ khác, chúng cũng được tìm thấy ở vùng rễ hoặc bên trong rễ cây,tuy nhiên chúng tập trung nhiều nhất là ở trong đất

Xa khuẩn được nghiên cứu rộng rãi nhiều thập kỷ nay do tiềm năng trong việc sinhtong hợp chất chuyền hóa thứ cấp, ức chế enzyme, kháng phan bào, kháng côn trùng,diệt cỏ Tổng số lượng kháng sinh được tìm thấy hiện nay có 75% có nguồn gốc từ xạkhuẩn, trong đó chi Streptomyces chiếm hai phan ba (Mahajan va Balachandran, 2012).Khoảng 2.500 bài báo từ năm 2014-2016 được tìm thấy bằng cách tìm kiếmStreptomyces trong cơ sở dit liệu PubMed, đây là nguồn kháng sinh phong phú nhấtđược biết đến (Chapter, 2016)

2.1.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Streptomyces spp

2.1.2.1 Cau trúc tế bào và khuẩn ty

Chi Streptomyces là gram dương, hiếu khí, đường kính tế bào 0,5-2,0 um thiếu độbền acid nên khi nhuộm tế bào sẽ cho màu xanh lam Do chúng có thành tế bào mỏng

và ở thành tế bao của chúng thiếu acid mycolic Streptomyces phát triển tế bào dạng sợ

nam phân nhánh rộng rãi phức tạp Cau trúc sợi nắm đa nhân, phân nhánh, chính vì hìnhthái phức tạp và đễ nhằm lẫn làm các nhà nghiên cứu trước đây cho rằng chúng là nắmhoặc liên kết trung gian giữa vi khuẩn và nắm (Sharma, 1999).

Mạng lưới sợi nắm phân tán, lan ra tạo thành mạng lưới điều tiết bao gồm khuẩn tykhí sinh và khuẩn ty cơ chất Các khuẩn ty khí sinh xuất hiện trên bề mặt môi trường,

đa số trong số chúng sẽ tiếp tục tạo thành bào tử Khuẩn ty cơ chất phân hủy môi trường

dé tìm chất dinh dưỡng, chúng sẽ tiết ra các enzyme dé phân giải môi trường nuôi cấy.Các sợi nắm cơ chất giải phóng các chất dinh dưỡng sẽ được tái sử dụng lại, việc chúngtiết kháng sinh cũng được xem như là một cách để các vi sinh vật lận cận tiếp XÚC VỚInguồn dinh dưỡng nội sinh này (McCormick và Flardh, 2012)

2.1.2.2 Khuẩn lạc

Hình 2.1 Khuan lac Streptomyces spp trên các môi trường khác nhau

Khuan lạc của Streptomyces có thê có kích thước và màu sắc thay đổi theo từng điềukiện môi trường khác nhau Chi xạ khuân này thường cho thay xạ khuẩn mọc nỗi trênmặt môi trường, có các khuẩn ty khí sinh lan ra và khuẩn ty cơ chất đâm xuống mặt môitrường tìm kiếm dinh dưỡng Streptomyces virginiae sinh trưởng được trên các môitrường ISP, R2YE, NDYE nhưng màu sắc khuẩn lạc chúng thé hiện ở môi trường khácnhau là khác nhau, môi trường ISP1 cho thấy khuẩn ty khí sinh màu trắng, khuẩn ty cơchất màu vàng nâu, môi trường ISP2, ISP3, ISP4, ISP5 khuẩn ty khí sinh màu xám nâu,khuẩn ty cơ chat màu vàng còn môi trường ISP6 cả khuẩn ty khí sinh và khuan ty cơchất đều có màu nâu đen (Nguyễn Thị Ngọc Anh và ctv., 2021)

ra ở hai loại khuẩn ty khá giống nhau chỉ có sự khác biệt ở thành bao.

2.1.2.4 Điều kiện ảnh hưởng đến xạ khuẩn

Các điều kiện về nhiệt độ, độ 4m, pH đều có tác động đến sự sinh trưởng và pháttriển của xạ khuẩn Nhiệt độ lí tưởng cho sự phát triển của Streptomyces là 25°C-35°C

và pH 6,5—8,0 (GunJal va Bhagat, 2022).

Ngoài ra thì các nguồn cung cấp carbon khác nhau cũng dan đến quá trình tạo cácchất chuyên hóa thứ cấp 6 Streptomyces bị thay đổi, một nghiên cứu của (James vàEdwards, 1988) về khả năng tạo granaticin của Streptomyces thermoviolaceus sẽ caohơn khi nguồn carbon cung cấp có nguồn gốc từ xylan, fructose, glutamate hay prolinecho thay hàm lượng kháng sinh được sinh ra là nhiều nhất so với các nguồn carbon.2.2 Khả năng sinh tong hợp các chất thúc day tăng trưởng thực vật

2.2.1 Khả năng phân giải Cellulose

Là một hợp chất cấu trúc có vai trò quan trọng, đặt biệt là đối với thực vật, chúngchiếm 40% thành tế bào thực vật, polymer mang lại nhiều ứng dụng Do sự phô biến vàứng dụng rộng rãi, thì các phụ phâm từ cellulose cũng là một van đề quan tâm và cầnđược giải quyết biến chúng thành nguồn carbon đồi dào cho nhiều quá trình ChiStreptomyces qua các nghiên cứu đã chứng minh một số loài có khả năng phân hủycellulose, tuy nhiên vẫn chưa thật sự nổi bật (Book và ctv., 2014)

2.2.2 Khả năng phân giải lân

Trong đất có khoảng 95% lượng phốt pho ở dạng không hòa tan và kết tủa mà thựcvật không thé sử dụng được, là một nguyên tố đinh dưỡng đa lượng của cây nếu thiếulân cây trồng sẽ cho năng suất thấp, chất lượng nông sản không cao Hầu hết vi sinh vật

có khả năng chuyền đổi các dạng phốt pho hữu cơ và vô cơ thành dang thực vật có théhấp thu như HzPO*, HPO," quá trình này được gọi là khoáng hóa Xa khuẩn được nhậnthấy có khả năng trong việc phân giải lân (Nguyễn Tú Điệp và ctv., 2018) Trong số các

5

loài Streptomyces spp thi Streptomyces thermolilacinus, Streptomyces youssoufiensis,

Streptomyces rochei va Streptomyces carpinensis đã được bao cáo là những loài có khả

năng hòa tan phốt pho tốt nhất (Sreevidya và ctv., 2016)

2.2.3 Khả năng sinh tổng hợp Biofilm

Biofilm hay mang sinh học là cụm chỉ tập hợp các nhóm vi sinh vật bám vào các bề

mặt phi sinh học, bao bọc nhóm vi sinh vật này là một lớp polymer dạng keo như một

lớp bảo vệ trước môi trường, chúng được Van Leeuwenhoek phát hiện ra rất sớm nhờ

sự hỗ trợ từ kính hién vi Sự hình thành màng sinh hoc có vai trò như “lớp áo bảo vệ” visinh vật với nhiệt độ Các nghiên cứu cho thay Streptomyces cũng sinh màng học, chúngđược ứng dụng dé khử độc chat thải và xử lí sinh học đất bi 6 nhiễm kim loại cứng, hệthông lọc nước (Vinogradoya và ctv., 2015)

2.2.4 Khả năng sinh tổng hop IAA

IAA (indole acetic acid) là auxin chính trong thực vật, chúng tham gia vào quá trình

sinh trưởng và phát triển, cũng như là sự phân chia và kéo dài tế bào, phản ứng sáng làmột chất vô cùng quan trọng của cây trồng Auxin được sinh ra ở đỉnh thân và cành,auxin có nhiều trong các cơ quan sinh trưởng mạnh như: hạt đang nảy mầm, lá đangsinh trưởng, làm cho các tế bào đài ra, kích thích việc tạo hoa, quả không hạt và ức chế

sự rụng lá, rụng quả không có enzyme phân giải Vì không có enzyme phân giải không

nên sử dung auxin nhân tạo đôi với nông phẩm được sử dụng làm thức ăn trực tiếp sẽ

gây hai cho người va động vật Tuy nhiên, trong nông nghiệp Auxin tự nhiên và cả nhân

tạo được sử dụng làm chất kích thích với nồng độ thích hợp cho từng loại cây và từnggiai đoạn sẽ mang đến nhiều tác động có lợi

IAA cũng được sản xuất thông qua vi sinh vật phụ thuộc vào cảm ứng L- tryptophan.Một số nghiên cứu chứng minh một số xạ khuẩn Streptomyces chiếm wu thé trong sảnxuất IAA, tuy nhiên việc tạo IAA 6 Streptomyces không én định, nó phụ thuộc rất nhiềuvào điều kiện nuôi cấy, đặc tính của từng loài (Myo và ctv., 2019) Streptomyces spp.sản xuất acid indole -3-acetic (IAA) cải thiện sự phát triển của cây trồng bằng cách tăngkhả năng nay mầm của hạt giống, tăng chiều dài rễ và trọng lượng khô trên ớt (Passari

và ctv., 2015), trên gạo (Gopalakrishna, 2013).

2.2.5 Khả năng sinh phức sắt Siderophores

Trong điều kiện thiếu sắt hầu hết các loài nhân sơ tạo ra nhiều chất tạo phức có trọnglượng phân thử thấp (thường nhỏ hơn 1000 Da) có ái lực cao như siderophores làm hòatan sắt trong môi trường và dẫn nó vào trong tế bào (Crosa và Walsh, 2002) Sự sản xuấtsiderophores của vi khuẩn, xạ khuẩn được coi là một kha năng quan trọng vừa cung cấpcho sự sống của vi sinh vật vừa giúp phân giải sắt ở các dạng khó hấp thụ cho cây

2.2.6 Khả năng sinh GA

Tương tự như IAA thì GA (Gibberellic Acid) cũng là một chất điều hòa sinh trưởng,

có vai trò quan trọng ở thực vật, thúc đây sự nây mam, tăng trưởng lá, tang sự phan chia

tế bào mô phân sinh Gibberellin được tiết ra ở các cơ quan còn non vả có nhiều ở lá,

củ, chồi đang nay mầm Một số loài của chi Streptomyces được khang định có khả năng

sinh GA (Rashad và ctv., 2015).

2.2.7 Khả năng có định dam

Khả năng có định đạm hay có định nito là chi khả năng biến đổi nito tự do trongkhông khí thành các hợp chất có nitơ, đáp ứng nhu cầu sử dụng Nhóm vi sinh vật cókhả năng cé định đạm đóng vai trò hết sức quan trọng, tận dụng nguồn nitơ có sẵn trongkhông khí chuyển dé thành dang cây có thể sử dụng được, cũng như thành dang chochính bản thân chúng sử dụng Hau hết vi sinh vật sử dụng enzyme nitrogenase dé thựchiện quá trình cố định sinh học nitơ trong khí quyền (Kim và Rees, 1994) Đề thử nghiệmkhả năng cố định đạm, tiến hành cấy vi sinh vật ở điều kiện vô đạm, sự sống của chúngtrên môi trường vô đạm cho thấy chúng có khả năng sử dụng nguồn nitơ trong khôngkhí Các nghiên cứu báo cáo rang các chủng Streptomyces phân lập có kha năng có định

nitơ mạnh mẽ (Sellstedt và Richau, 2013) Loài Streptomyces thermoautotrophicus có

khả năng cố định nitơ trong khí quyên thành dạng sinh học nhờ hai loại enzymesmolypden denitrogenase và mangan super oxit oxidoreductase, tuy nhiên van cần thêmnhiều nghiên cứu liên quan đến sự cố định nito của Streptomyces trong đất

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Phong Lan và cộng sự, vào năm 2015, đã phát

hiện và xác định sáu chủng xạ khuẩn Streptomyces có khả năng chống lại namPyricularia grisea bao gồm S cavourensis S27, S xiamenensis S257, S viriabilis S28,

S iakyrus S233, S scopuliridis $136, và S fulvissimus S30 Những chủng nay không

chỉ chống lại nam hiệu quả mà còn thé hiện khả năng phát triển ôn định dưới điều kiệnnhiệt độ cao và môi trường có nồng độ muối cao, đồng thời còn có khả năng sản xuấtIAA (Indole-3-acetic acid) ở nồng độ cao Điều này chỉ ra tiềm năng của vi khuẩnStreptomyces trong việc thúc day tăng trưởng của thực vật Tiếp theo, trong năm 2016,Phan Thị Hồng Thảo đã tiến hành nghiên cứu về các đặc điểm sinh học va khả năngtổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật của xạ khuẩn nội sinh Streptomyceshebeiensis TQR§-7, mở rộng hiểu biết về lợi ích của vi khuẩn này trong nông nghiệp.

2.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Nghiên cứu về ảnh hưởng của Streptomyces déi với sự sinh trưởng và năng suất củacác loại cây trồng đã thu hút sự chú ý rộng rãi trong cộng đồng khoa học Các công trìnhnghiên cứu khác nhau đã khám phá tiềm năng của Streptomyces trong việc thúc day tăngtrưởng thực vật và cải thiện sức đề kháng của cây trồng Aldesuquy và ctv (1998) đãnghiên cứu anh hưởng của dịch lọc nuôi cấy Streptomyces đôi với cây lúa mì Theo sau

đó Olanrewaju và Babalola (2019) đã công bố kết quả nghiên cứu về ý nghĩa và tươngtác của Streptomyces trong việc thúc day tăng trưởng thực vật, nhắn mạnh vai trò của vikhuẩn này trong việc kích thích tăng trưởng Đồng thời, nghiên cứu của Maila và ctv(2017) đã chỉ ra rang chủng Streptomyces PMS có khả năng thúc đây sự phát triển vàsức đề kháng của cây cà chua nhờ vào các đặc tính sinh hóa như sinh siderophores vàACC deaminase Wahyudi và cộng sự vào năm 2019 cũng đã nhẫn mạnh tiềm năng củaStreptomyces spp lay từ đất vùng rễ của ngô trong việc làm chất kích thích tăng trưởngthực vật Ngoài ra, Sadeghi và cộng sự trong năm 2012 đã công bố nghiên cứu về hoạtđộng thúc đây tăng trưởng thực vật, sản xuất auxin và siderophore của Streptomycestrong điều kiện đất mặn, mở rộng hiéu biết về khả năng ứng dụng của vi khuẩn này trongcác điều kiện môi trường khác nhau Những nghiên cứu này cung cấp thông tin về khảnăng và tiềm năng của Streptomyces trong lĩnh vực nông nghiệp, đặc biệt là trong việcthúc đây tăng trưởng và cải thiện sức khỏe cho các loại cây trồng

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 03 năm 2023 đến tháng 03 năm 2024, tại Phòng Sinh học

tích hợp Thực vật, Khoa Khoa học Sinh học — Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

Các chủng xạ khuân Streptomyces được cung cấp bởi Phòng Sinh học tích hợp Thực

vật, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.

Hạt giống cà chua Phú Nông, Việt Nam

3.2.2 Hóa chất, trang thiết bị và dụng cụ

3.2.2.1 Hóa chất

Môi trường Gause I (g/L): 20 g tinh bột; MgSO4.7H20 0,5 g; K;HPO¿ 0,5 g;

FeSO4.7H20 0,01g; KNO3 1 g; NaCl 0,5 g; Agar 20 g; nước cat đủ 1 lít

Môi trường Gause I lỏng (g/L): Tinh bột tan 20 g; KzHPO¿ 0,5 g; NaCl 0,5 g;

MgSO¿.7HaO 0,5 g; KNO3 1 g; FeSO¿ 0,01 g; nước cất đủ 1 lít; pH = 7,0

Môi trường ISP2: Malt extract 10g; Yeast extract 4g; Glucose 4g; Agar 20g; nước

Môi trường Pikovskaya Agar: Glucose (10 g/L); (NH1)2SOu (0,5 g/L); Yeast extract

(0,5 g/L); NaCl (0,2 g/L); MgSO4.7H20 (0,1 g/L); KCI (0,2 g/L); MnSO4.H20 (0,002

g/L); FeSOx.7HaO (0,002 g/L) Hap khử trùng ở 121°C / latm Các nguồn P vô cơ nhưCa3(PO4)2; AIPO¿; bột quặng P hoặc các nguồn P hữu cơ như lecithin được hấp khửtrùng riêng rẽ và bỗ sung vào môi trường ở nồng độ cuối cùng là 5 g/L Điều chỉnh pH

đạt 7,0 + 0,2 ở 25°C.

Thuốc thử Salkowskii: 0,5 M ferric chloride (FeCl3) và H2SOx perchloric acid

9

Thuốc thử Lugol: Cân 2 g KI và 1 g Iodua, thêm vào 2 mL nước Lắc hoặc đun chođến khi hòa tan hoàn toàn, bổ sung thêm cho đủ 300 mL nước Bảo quản trong bình tối

ở nhiệt độ phòng trong 01 tháng.

Crystal Violet 0,1%: A: 2 g và 100 mL metanol (CH30H); B: 20 mL acid axetic glaciad (CH3COOH) với 80 mL nước Pha hai dung dich A va B lai với nhau, dung dịch

bảo quan trong lọ tối, bao quan 15 - 30°C tránh ánh sáng

Môi trường Burks không N (Park et al., 2005): 10 g sucrose, 0,1 g MgSO4.7H2O,

0,41 g KH2PO4, 0,52 g K2HPO4, 0,05 g NaSO4, 0,2 g CaCl2, 0,005 g FeSO4.7H2O,

0,0025 g NaMoO4.2H2O, thêm nước cat cho đủ 1 L và hiệu chỉnh pH 7,0

Môi trường CAS: chrome azurol S (CAS) 60,5 mg, hexadecyltrimetyl amoni

bromua (HDTMA) 72,9 mg, Piperazin-1,4-bis (acid 2-ethanesulfonic) 30,24 g, 1 mM FeCl3.6H20 trong 10 mM HCI 10 mL, agar (0,9% w/v) (Schwyn va Neilands, 1987).3.2.2.2 Trang thiét bi

Kính hién vi, cân kỹ thuật, máy vortex, nồi hap tiệt tring autoclave, máy ly tâm, tủcấy, tủ sấy khử trùng, lò vi sóng, máy đo OD, máy lắc, tủ lạnh, máy đo pH

3.2.2.3 Dụng cụ

Que cấy, găng tay, khẩu trang, đèn cồn, micropipette, ống ly tâm Falcon, dau tip,ống đong, ống nghiệm, dia petri, chai thủy tinh, cốc thủy tinh, bình định mức, giấy lọc,pipet, chậu trồng 25 x 21 em, khay ươm hạt, thước dây, bình phun, dụng cụ ghi chép số

liệu, giá thé: đất sạch, phân chuồng, vôi, sơ dừa.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khao sát các đặc điểm liên quan đến khả năng thúc day tăng trưởng của xạkhuẩn Streptomyces spp

3.3.1.1 Khao sat kha nang phan giai cellulose

Tiến hành: Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường Gause I, sau đó sử dung phương phápchấm điểm cấy khuẩn lạc đơn của xạ khuẩn chấm trên môi trường CMC agar (g/L -

CMC 5 g; agar 20 g; NaaHPO¿ 6,8 g; KH¿PO¿ 3 g; NaCl 0,5 g; (NH¿);SO¿ 1,3 g;

MgSO¿.7H›O 0,58), chờ cho khô rồi ủ ở 28 - 30°C trong 7 ngày Cho thuốc thử Lugolvào đĩa môi trường, để yên trong 4 phút rồi gạn bỏ phần thuốc thử dư thừa CMC trongmôi trường sẽ phản ứng với thuốc nhuộm cho màu nâu sam Ghi nhận kết quả bằng sựxuất hiện của vòng sáng màu vàng xung quanh khuẩn lạc chỉ ra khả năng phân giải CMCcủa các chủng xạ khuân (Pinheiro và ctv., 2015)

10

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệmthức là một chủng xạ khuẩn được thực hiện trên 3 đĩa petri và lập lại hai lần.

Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá khả năng phân giải CMC của xạ khuẩn dựa vào đườngkính phân giải, đường kính được đo bằng vòng sáng xung quanh khuan lạc xạ khuẩn với

đơn vị đo là mm.

3.3.1.2 Khảo sát khả năng phân giải lần

Tiến hành: Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường Gause I, sau đó sử dụng phương phápchấm điểm cấy khuẩn lạc đơn của xạ khuẩn chấm trên môi trường Pikovskaya Agar

(Glucose 10 g/L; (NH4)2SOu 0,5 g/L; NaCl 0,2 g/L; MgSO4.7H20 0,1 g/L; KCL0,2 g/L; Yeast extract 0,5 g/L; MnSOa.HaO 0,002 g/L; FeSO4.7H20 0,002 g/L; Agar 20 g/L).

Chờ cho khô rồi ủ ở 30°C, kết quả ghi nhận sau 7 ngày Sự hiện điện của vòng tan xungquanh khuẩn lạc chỉ ra khả năng hòa tan các nguồn lân (Soltam và cộng sự, 2010)

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bé trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗinghiệm thức là một chủng xạ khuẩn được thực hiên trên 3 đĩa petri và lặp lại ba lần.Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá khả năng hòa tan lân của xạ khuẩn dựa vào đường kínhphân giải và đường kính khuẩn lạc, đường kính phân giải được đo vòng phân giải xungquanh khuân lạc, còn đường kính khuẩn lạc là đo khuẩn lạc với đơn vị đo là mm

Chỉ số hòa tan lân = tổng đường kính vòng tan (khuẩn lạc + vòng tan) / đường kínhkhuẩn lạc

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bé trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi

nghiệm thức là một chủng xạ khuẩn được thực hiên trên 3 đĩa petri và lặp lại ba lần.

Chỉ tiêu theo dõi: đánh giá khả năng sinh phức sắt dựa vào vòng sáng vàng cam xuấthiện xung quanh khuẩn lạc

3.3.1.4 Xác định khả năng sinh tổng hợp IAA

Tiến hành: Nuôi cay xạ khuẩn trên môi trường ISP2 (Malt extract 10 g; Agar 20 g;Glucose 4 g; Yeast extract 4 g; nước cất du 1 lit; pH=7,0) bổ sung 0,1% tryptophan ở

11

28°C, tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 07 ngày Ly tâm 3200 vòng trong 10 phút dé loại

bỏ sinh khối Hút 2 mL dịch nổi phía trên cho vào ống nghiệm mới, thêm 4 mL thuốcthử Salkowski U hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng trong 25 phút Hon hợpchuyền sang màu hồng chi ra sự hiện điện của IAA trong dịch nuôi cay Do độ hap thu

của hỗn hợp ở bước sóng 530 nm

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bé trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗinghiệm thức là một chủng xạ khuẩn được thực hiện trên hai ống nghiệm, thí nghiệmđược lặp lại hai lần

Chỉ tiêu theo đõi: nồng độ IAA được xác định dựa trên đường tương quan giữa nồng

độ IAA chuẩn với giá trị ODs30 m

3.3.1.5 Xác định khả năng hình thành biofilm

Tiến hành: nuôi cấy xạ khuẩn vào ống nghiệm thủy tinh chứa 10mL môi trườngGause I lỏng, nuôi cay ở 30°C trong 7 ngày rồi nhẹ nhàng đồ bỏ dịch nuôi cay Rửa ốngnghiệm với nước cat, dé khô rồi nhuộm với dung dịch Crystal Violet 0,1% trong 30 phút

ở nhiệt độ phòng Đồ bỏ thuốc nhuộm, rửa bằng nước cat 3 lần

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi chủng

xạ khuẩn là một nghiệm thức được thực hiện trên hai ống nghiệm, lặp lại ba lần

Chỉ tiêu theo dõi: Sự hình thành biofilm trên thành ống được phát hiện khi có mộtvạch hoặc các mảng bắt mau thuốc nhuộm bám trên thành hoặc đáy ống nghiệm

3.3.1.6 Khảo sát khả năng sinh GAs

Tiến hành: Các chủng xạ khuẩn đã phân lập được nuôi tăng sinh trong 100 mL môitrường dịch ISP9 cho vào trong máy lắc 6n nhiệt ở tốc độ 150 vòng/phút, trong thời gian

từ 7-10 ngày, nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C dé đạt mật độ 105 CFU/mL Dùng một pipet

vô trùng lấy 1 mL dung dịch từ bình tăng sinh cho vào bình tam giác chứa 100 mL môitrường dịch thể ISP9 Nuôi tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày Ly tâm 20mL môi trườngdịch thể ISP9 trong 15 phút với tốc độ 2000 vòng/phút Lấy 15 mL phần dung dịch trên

bề mặt (phần nước trong), thêm 2 mL dung địch kẽm acetate và 2 mL kali ferrocyanidevào Sau đó mang đi ly tâm trong 15 phút ở tốc độ 2000 vòng/phút

Lay 5 mL phần nổi thêm vào 5 mL acid Chlo hydric 30% và ủ ở 27°C trong 75 phút

Do độ hap thụ sử dụng máy quang phổ ở bước sóng 254 nm So sánh hàm lượng GAstạo thành của các chung vi sinh vật với đường chuẩn đã dựng (Gusmiaty và ctv., 2019)

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi

12

nghiệm thức là một chủng xạ khuẩn được thực hiện trên hai ống nghiệm, thí nghiệmđược lặp lại hai lần.

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ GAs được xác định dựa trên đường tương quan giữa nồng

độ GAs chuẩn với giá trị OD2s4 am

3.3.2 Khảo sát khả năng thúc đấy tăng trưởng thực vật của xạ khuẩn trong điều

Tiến hành: Hạt cà chua khử trùng Javel 5% (v/v) và triton 0,1% trong 10 phút, sau

đó rửa lại 5 lần với nước cất khử trùng Ngâm hạt trong dịch xạ khuẩn 2 giờ trước khicấy lên môi trường WA, ở nghiệm thức đối chứng, hạt được xử lí với nước cất Tỉ lệ nảymầm được ghi nhận sau 48 giờ, 72 giờ

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗinghiệm thức là một chủng xạ khuẩn, mỗi lần lặp lại cho một nghiệm thức là 100 hạt càchua, thí nghiệm được lặp lại ba lần

Chỉ tiêu theo dõi:

Tỉ lệ nảy mam (%) = hạt nay mam / tong số hạt, chiều đài mầm (mm)

3.3.2.2 Thử nghiệm khả năng kích thích tăng trưởng của xạ khuẩn trên cây càchua trong điều kiện in vitro

Tiến hành: Chọn các hạt cà chua khỏe mạnh và đồng đều, khử trùng Gieo trên môitrường WA cho tới 2 ngày tuôi các cây con đồng nhất về kích thước khoảng 5 mm được

13

chuyền sang đĩa môi trường MS1/4 dùng các đĩa giấy được đặt cách hạt 2,5 cm sau đócho 20 wL dịch vi khuẩn nuôi cấy qua lọc, được cho lên đĩa giấy Đồng nuôi cấy ở điềukiện 16 giờ sáng/§ giờ tối, nhiệt độ 25°C Ghi nhận kết quả sau 5 ngày, đánh giá sự pháttriển của cây.

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoan toàn ngẫu nhiên, mỗinghiệm thức là một chủng xạ khuẩn và một nghiệm thức đối chứng được Thí nghiệmđược lặp lại hai lần Thí nghiệm được bồ trí giống nhau ở ba chủng xạ khuẩn

Chỉ tiêu theo dõi: đánh giá sự phát triển của cây dựa trên chiều dài của rễ và chồi,

với đơn vi là mm.

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các dòng xạ khuẩn Streptomyces spp đến sự sinh

trưởng của cây cà chua trong nhà lưới

Xa khuẩn được nuôi tăng sinh trên môi trường Gause I, tốc độ lắc 100 vòng/phút,28°C Lắc 7 - 10 ngày, pha loãng dịch tăng sinh cấy trải rồi đếm khuẩn lạc xạ khuẩn sao

cho mật độ đạt 10? CFU/mL.

Tiến hành: Ngâm giống và ủ giống: Hạt giống cà chua F1, được ngâm trong nước

ấm với tỉ lệ 3 sôi 2 lạnh trong 3 - 4 giờ, sau đó ủ hạt giống bằng cánh trải đều hạt giống

đã ngâm trên khăn giấy thâm nước được đặt trong thùng xốp, khi hạt giống nứt vỏ naymầm ươm trong chậu chứa đất mùn khử trùng

Tưới 4 mL xạ khuẩn (10° CFU/mL) vào gốc cây theo các nghiệm thức Tưới khi cây

có 3 lá thật, tưới 1 tuần/lần, liên tục trong 4 tuần Cây cà chua trong thời gian thí nghiệmđược chăm sóc, tưới tiêu theo chế độ chăm sóc cây ca chua bình thường

Bồ trí thí nghiệm: trồng cà chua trong chậu, bé trí thí nghiệm theo kiêu hoàn toànngẫu nhiên, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 chậu, lặp lại 3 lần

NTI1: Đối chứng H2O

NT2: Đối chứng môi trường Gause I

NT3: Tưới xạ khuẩn Streptomyces spp (BT06)

NT4: Tuoi xạ khuẩn Streptomyces spp (BT07)

NT5: Tuoi xạ khuẩn Streptomyces spp (BT013)

Chỉ tiêu theo dõi:

Chiều cao cây (mm): Do chiều cao cây sau 7 ngày đo từ gốc sát mặt đất đến dot caonhất trên thân chính

Số lá (1á/cây): Đếm toàn bộ số lá trên cây

14

15