3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 07/2022 đến 02/2023, tiến hành xử lý số liệu sau nghiên cứu từ tháng 02/2023 đến 03/2022, tiến hành hoàn chỉnh nội dung khóa luận tốt
nghiệp từ tháng 03 - 08/2023.
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm BIO313 - Công nghệ Gene, Tòa nhà AI, Khoa Khoa học Sinh học, trường Dai học Nông Lâm Thanh phó Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Các đối chứng và mẫu thực địa
DNA của 6 subtypes È. coli mang gen độc lực là EIEC (chủng M90T), EAEC (chủng 17.2), DAEC (chủng A30), ETEC (chủng 440 LT), EPEC (chủng E2348/69) và
EHEC (chủng 0157:H7) được cung cấp từ Viện Pasteur Thành phố Hồ Chi Minh.
Đối chứng âm là DNA của các chủng vi khuẩn thường được tìm thay trong môi trường nhà nuôi chim yến và được dùng trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp môi dùng trong phản ứng mPCR. Các chủng vi khuẩn bao gồm: Staphylococcus
aureus (ATCC 6338), Streptococcus spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Bacillus spp..
được cung cap từ phòng thí nghiệm chan đoán Thú y Biomin, Thành phó Hồ Chi Minh.
Các chủng vi khuẩn này được ly trích DNA bằng phương pháp sốc nhiệt, sau đó
lưu trữ ở nhiệt độ -20 °C cho các phản ứng PCR.
Mau thực địa, có tổng cộng 90 mẫu bao gồm 67 mẫu phân và 23 mẫu phết bề mặt tổ yến được thu thập từ 30 nhà nuôi chim yến ở ba tỉnh: Đồng Nai, Bình Dương, Thành phó Hồ Chí Minh.
3.2.2. Các hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Cặp môi dùng dé phát hiện subtype ETEC được thiết kế trên gen elf (eltF: 5’-
AGGCGTATACAGCCCTCACCCA-3’ va eltR: bà ACCTGAAATGTTGCGCCGCTCT-3') với kích thước mục tiêu là 629 bp. Trình tự cặp
moi được tham khảo trong bài nghiên cứu “Novel multiplex PCR for detection of
diarrheagenic Escherichia coli strains isolated from stool and water samples” được thực hiện bởi Vendruscolo va ctv (2017) và đăng bởi tap chi Genetic and Molecular Research.
15
Cặp mồi dùng dé phát hiện subtype DAEC được thiết kế trên gen daaE (GenBank
Accession No. M27725.1), daaEF: 5’°-ATGAAAAAATTAGCGATAATGGCCG-3’ và daaER: 5’- TTAGTTCGTCCAGTAACCCC-3’) với kích thước mục tiêu là 480 bp, mã
hóa cho F1845 adhesin và chỉ hiện diện trên kiêu bệnh này.
Cặp môi dùng dé phát hiện EAEC được thiết kế trên gen aatA (GenBank
Accession No. CU928159.2), (aataF: 5’-CTGGCGAAAGACTGTATCAT-3’ và aatAR: 5’- AGTTAATGATTTCCGAGAACAAAT-3’), với kích thước mục tiêu là 340 bp và mã hóa cho protein aggregative adherence.
Hóa chất ding trong PCR: DreamTag Green PCR Master Mix 2X (Cat#K1081, Thermo ScientificTM), Nuclear free water, thang tiêu chuẩn 1 Kb Plus DNA Ladder
(Cat#10787018, InvitrogenTM), gel TopVision Agarose (Cat#R0491, Thermo ScientificTM), TAE (Tris-Acetate-EDTA) 50X buffer (Cat#B49, Thermo ScientificTM), dung dich nhuộm mau Midori Green Advance DNA Stain (Cat#MG04, NIPPON Genetics Europe, Germany).
Các loại thiết bi, bộ kit sử dụng trong nghiên cứu: bộ kit TopPURE ® Tissue
Viral Extraction, tủ an toàn sinh học, máy Spin down, máy PCR (Model TC - 24H() va Bioer Technology), máy ủ nhiệt khô (Thermo Scientific), máy ly tâm, máy vortex, bộ điện di (Cat#MINI - 300, Major Science, USA), ban soi gel (CatWUV - L50, DaiHan
Scientifics, Hàn Quốc), lò vi sóng, tủ lạnh (Cat#ECEN209-24, MRC Laboratory Instruments), tủ đông (-20 °C, -80 °C), máy đo quang phô BioDrop LITE (Biochrome, UK) và các dụng cụ chuyên dùng cho sinh học phân tử như pipet, đầu tip, tube, các dụng cụ cần thiết khác.
3.2.3. Phương pháp nghiên cứu
3.2.3.1. Ly trích DNA của các mẫu đối chứng
Quy trình ly trích DNA của các mẫu đối chứng, mẫu thực địa được tiến hành theo
quy trình của bộ kit TopPURE ® Tissue Viral Extraction.
Bước 1: Lấy lượng mau không qua 0,5 g cho vào tube 1,5 mL. Thêm vào 350 pL SRD buffer va 20 L dung dich proteinase K. Lắc đều tube dé mẫu và dung dich được hòa tan, tránh làm xuất hiện bọt khí. U ở 72 °C trong khoảng 15 phút.
Bước 2: Thêm 350 pL Ethanol (99 %), lắc đều tube và chuyển dịch nổi sang cột silica đặt sẵn trong tube 2 mL. Ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút. Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới.
16
Bước 3: Đặt cột vào tube 2 mL cũ, thêm 500 uL WBI buffer và ly tâm ở 13000
rpm trong 1 phút. Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới.
Bước 4: Đặt cột vào tube 2 mL cũ, thêm 500 pL WB2 buffer va ly tâm ở 13000
rpm trong 1 phút. Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới.
Bước 5: Làm khô cột bằng cách ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút.
Bước 6: Chuyên cột sang tube 1,5 mL mới. Thêm 50 pL EB buffer và u 1 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 2 phút, thu phan dịch chứa DNA bên dưới.
Bước 7: Bảo quản DNA được ly trích ở nhiệt độ -20 °C.
3.2.3.2. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp của các phản ứng sPCR
Trước khi tiến hành các thí nghiệm cần kiểm tra các thông tin cơ bản về các cặp môi dùng trong PCR được kiểm tra trên các công cụ NCBI Primer Blast, Thermo Fisher Scientific. Dựa trên những thông số đã kiểm tra, tiễn hành thiết lập dãy nhiệt độ cho việc thực hiện tối ưu hóa phan ứng sPCR là 52 °C, 54 °C, 56 °C, 58 °C.
Các phản ứng sPCR được thực hiện với thành phần phản ứng được trình bày ở Bang 3.1 lần lượt ở bốn điểm nhiệt độ 52 °C, 54 °C, 56 °C, 58 °C nhằm xác định nhiệt độ tối ưu nhất đề các phản ứng sPCR khuếch đại chính xác. Phản ứng sPCR được thực hiện trong tube phản ứng sẽ tiến hành chạy PCR với chu trình nhiệt như sau: tiền biến tính ở 95°C/5 phút, biến tính 95°C/30 giây, bat cặp 52 - 58°C/40 giây, kéo dài 72°C/40 giây và hậu kéo dai 72°C/5 phút. Các thành phan trong phản ứng sPCR được trình bay ở Bảng 3.1. Sau khi phản ứng sPCR hoàn tất, sản phẩm sPCR được điện di trên gel agarose với nồng độ là 1,5 %, quá trình điện di gồm 2 giai đoạn: 80V - 25 phút, 60V - 20 phút với ladder 1 Kb Plus DNA. Kết quả được ghi nhận và phân tích dưới ánh sáng UV.
Bảng 3.1. Các thành phần trong các phản ứng sPCR
Thành phần Nông độ banđầu Nôồngđộcuối Thêtích
DreamTaq Green PCR Mastermix 2X 2X 1X 10 pL
Môi xuôi 10 uM 0,5 uM 1 uL Môi ngược 10 uM 0,5 uM 1 ul
DNA template - - 2L DEPC “ “ 6L
17
3.2.3.3. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp của phản ứng mPCR
Phản ứng mPCR được thực hiện nhằm kiểm tra sự hoạt động và tương tác giữa các cặp môi với nhau. Từ đó chọn ra nhiệt độ tối ưu nhất cho phan ứng mPCR cũng như là dãy nồng độ phù hợp cho quy trình tối ưu sau này.
Tương tự như các phản ứng sPCR, mPCR được thực hiện với trình nhiệt như
sau: tiền biến tính ở 95°C/5 phút, biến tính 95°C/30 giây, bắt cặp 52 - 58°C/40 giây, kéo đài 72°C/40 giây và hậu kéo dài 72°C/5 phút. Các thành phần trong phản ứng mpCR được trình bày ở Bảng 3.2. Sau khi phản ứng mPCR hoàn tat, san phim mPCR được điện di trên gel agarose với nồng độ là 1,5 %, quá trình điện di gồm 2 giai đoạn:
80V - 25 phút, 60V - 20 phút với ladder 1 Kb Plus DNA. Kết quả được ghi nhận và
quan sát dưới ánh sáng UV.
Bang 3.2. Các thành phan trong phản ứng mPCR
Thành phần Nông độ ban dau Nông độcuối Thếtích
DreamTaq Green PCR Mastermix 2X 2X 1X 10 pL elt (F/R) 10 uM 0,5 uM 1 pL (x2) daaE (F/R) 10 uM 0,5 uM 1 pL (x2) aatA (F/R) - 0,5 uM 1 pL (x2) DNA template - - 2 pL DEPC - - 2 pL
3.2.3.4. Tối ưu nồng độ các cặp mỗi trong phản ứng mPCR
Sau khi xác định được nhiệt độ tối ưu cho phản ứng mPCR, tiến hành khảo sát các phản ứng mPCR với chu trình nhiệt như sau: tiền biến tinh ở 95°C/5 phút, biến tính 95°C/30 giây, bat cặp tại điểm nhiệt độ được tối ưu ở thí nghiệm trước/40 giây, kéo dai 72°C/40 giây và hậu kéo dài 72°C/5 phút. các phản ứng được thực hiện lần lượt với các nồng độ các cặp môi được trình bày ở Bảng 3.3. Sau khi phản ứng mPCR hoàn tat, sản phẩm mPCR được điện di trên gel agarose với nồng độ là 1,5 %, quá trình điện di gồm 2 giai đoạn: 80V - 25 phút, 60V - 20 phút với ladder 1 Kb Plus DNA. Kết quả được ghi
nhận và phân tích dưới ánh sáng UV.
Dựa vào kết quả điện di các sản phẩm của phản ứng mPCR ở nồng độ ba cặp môi elt, daaE, aatA cho mỗi trình tự mỗi xuôi, mỗi ngược là 1: 1: 1 (0,2 uM: 0,2 uM: 0,2 uM), sau đó tiến hành tăng và giảm tỷ lệ nồng độ của ba cặp môi dé đạt được kết quả mong
18
muốn. Mục tiêu của nội dung này là xác định được tỷ lệ của ba cặp môi sao cho ba sản phẩm khuếch đại (band) cho độ tương đồng và tối ưu nhất.
Bang 3.3. Day các nồng ba cặp mỗi dùng trong phản ứng mPCR được khảo sat
elt: daaE: aatA
: À 1;2:1 12:2 2:2:2 2022052: 23:2 23:25
Thanh phan
0,2:0,4:0,2 0,2:0,4:0,4 0,4:0,4:0,4 0,4:0,5:0,4 0,4:0,6:0,4 0,4:0,6:0,5
(uM) (uM) (uM) (uM) (uM) (uM)
DreamTaq
Green PCR 10nL 10 pL 10 pL 10 pL 10 pL 10 nL Mastermix 2X
elt (F/R) 0,4uL (x2) 0,4 pL 0,8 uL 0,8 uL 0,8 HL 0,8 uL daaE (F/R) 0,8pL (x2) 08L 084L 1 pL 12nL — 12pL aatA (F/R) 0,4 uL (x2) 0,8 nL 0,8 wL 0,8 uL 0,8 wL 1 pL
3 wh 3 nL 3 nL 3 pL 3 wh 3 pL
DNA template p " " "
(1:1:1) (1:1:1) (1:1:1) (1:1:1) (1:1:1) (1:1:1) DEPC 3,8 nL 3 pL 2,2 pL 1,8 nL 1,4 nL 1L
3.2.3.5. Kiếm tra độ đặc hiệu các cặp mồi trong phản ứng mPCR
Các cặp môi dùng trong phản ứng PCR là yếu tố quan trọng quyết định đến việc sản phâm PCR có đúng như mục đích thực hiện, việc các cặp mỗi không đặc hiệu sẽ dẫn đến xuất hiện các sản phẩm phụ ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
Đề chứng minh các cặp mồi elt, daaE, aatA khuếch đại đặc hiệu cho các subtypes ETEC, DAEC, EAEC mà không khuếch đại được trên các subtypes mang gen độc lực còn lại của È. coli như: EIEC, EHEC, EPEC, STEC hay các chủng vi khuẩn khác hiện diện trong nhà nuôi chim yến như: Staphylococcus spp., Bacillus spp., Streptococcus spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Salmonella spp., Clostridium perfringens, việc kiêm tra độ đặc hiệu của các cặp môi được tiến hành với quy trình mPCR đã được tối ưu ở nội dung trước trên các đối chứng đã được trình bày.
19
3.2.3.6. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng mPCR
Giới hạn phát hiện (LOD) của phản ứng mPCR là nồng độ DNA nhỏ nhất mà phản ứng mPCR có thể phát hiện được sự hiện diện của các tác nhân mục tiêu, mặt khác
giới hạn phát hiện còn phản ứng độ nhạy cũng như khả năng tin cậy của phản ứng mPCR.
Có nhiều phương pháp được áp dụng cho việc xác định giới hạn phát hiện như dựa trên hệ số copy, thu hồi gel,...Trong nghiên cứu nay được thực hiện bằng phương pháp thu hồi gel thực hiện bằng bộ kit TopPURE ® Tissue Viral Extraction.
Quy trình chi tiết các bước được trình bay ở Hình 3.1.
Tiến hành thu hồi DNA ở các sản phẩm sPCR, gel nồng độ agarose 0,8 %
`⁄
Ly trích bằng kit
iva
Khao sát phan ứng sPCR trên DNA vừa được thu hồi và ly trích
ed
Tiến hành do OD va ghi nhận kết qua
`⁄
Pha loãng ở nồng độ 1 ng/uL
k4
Pha loãng lần lượt ở 9 nồng độ từ 107 ng/pL đến 10° ng/pL
`⁄
Khảo sát phản ứng mPCR trên các nồng độ được pha loãng
`⁄
Lặp lại thí nghiệm 3 lần
`⁄
Ghi nhận kết quả
Hình 3.1. Quy trình xác định giới hạn phát hiện của phản ứng mPCR.
3.2.3.7. Ứng dụng mPCR để khảo sát các tác nhân trên nền mẫu thực địa
Sử dụng quy trình mPCR được tối ưu ở trên dé khảo sát trên 90 mẫu thực địa
được thu thập từ 30 nhà nuôi yến ở ba tỉnh: Thành phố Hồ Chí Minh, Bình Dương và Đồng Nai. Các mẫu thực địa được ly trích thu nhận DNA bằng bộ kit TopPURE ®
20
Tissue Viral Extraction và sử dụng quy trình mPCR đã tối ưu hóa cho việc khảo sát sự hiện diện của các subtypes ETEC, DAEC và EAEC trên các mẫu thực địa.
3.3. Xử lý số liệu
Số liệu các thành phan phản ứng sPCR, mPCR, mẫu thực địa được thống kê và ghi nhận trên phần mềm Microsoft Excel 2016.
21