Khóa luận tốt nghiệp Sinh học: Phân lập tìm hiểu đặc điểm của các chủng nấm mốc sử dụng trong sản xuất nước chấm lên men

Qua nghiên cứu tài liệu và tìm hiểu thực tế tại các cơ sở sản xuất nước chấm ở thành phố Hé Chí Minh cho thấy một số đông các cơ sở sảnxuất nước chấm bằng phương pháp hoá học: thủy phân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC SU PHAM THÀNH PHO HỒ CHÍ MINH

KHOA SINH+TP HỖ CHÍ MINH

NGUYEN THỊ TUYẾT MAI

PHAN LẬP TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM CUA CAC

CHUNG NAM MOC SỬ DUNG TRONG SAN

XUẤT NƯỚC CHAM LEN MEN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGÀNH SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THỊ THANH

TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2004

Em xin chdn thank cả» om các thdy cô gidng day thube hhoa sinh trating Dai hoc Su pham Thanh phi Wi Chi Wink đã trang 6: che em

uhing bitin thie đây đẻ vd sdu sắc dé vdn dung va (Ác điệu tất đề tad.

Đặc bet, rin chan think chm om cô 7S “Indu Tht Thanh da tan tink

dia dat em trong thodug thit gian dad lim dé tat, cing ud dự gifs đỡ cia

các thdy cả ud cin 64 phang thi nghiim vi dink - sinh hod — dink li thee cia

thea 4ã tạo mọc diéu hiin thudn lei nhdt che em hodu thank tất pldn cáyt

ughiim của dé tad.

Mục lục

TH HE eT PHẦN 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU esis TẾ

2.1 - MỘT SỐ HIỂU BIẾT VE NƯỚC CHAM LÊN MEN 10

2.1.1 TIÊU CHUAN VỀ CHẤT LƯỢNG CUA NƯỚC CHAM LÊN MEN

Te sai 10 2.1.1.1 Tiểu chuẩn C4 Wi Qtet ssc esis 10

2.1.1.3 Chỉ tiêu vi sinh vật và độc tỐ : oe c c .ccccc-co.cc H2.1.2 QUY TRÌNH SAN XUẤT NƯỚC CHAM LEN MEN 12

2.1.2.1 Nguyên liệu quá trình sản xuất nước chấm lên men 12

2.1.2.2 Quy trình sản xuất nước chấm lên men lên men nhờ vi sinh vật

XS Si =—eeieeseeeieeeseeeeeseteerzree l6

2.2 - TÁC NHÂN LEN MEN TRONG SAN XUẤT NƯỚC CHẤM 21

2.2.1 VI SINH VAT DUNG TRONG LÊN MEN SAN XUẤT NƯỚC

Cl"(.$3.£$[$—_ an 21

2.2.1.1 Đặc điểm hình thái 5555 55525259 S55 5125 52557 22

12-12 ấn trnẾ VAN BỒN en 22

2.2.2 HỆ ENZYMES CUA NAM MOC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ

VAI TRO CUA CHUNG TRONG QUA TRINH SAN XUAT NUGC CHAM LEN

MEN: aaceetoiattii0igii0020G264334/G0v0ii0ả4kiải2406caeai 23

2.2.2.1 Hệ enzyme nấm mốc Aspergillus ory‡e 5-5522 23

2.2.2.2 Vai trò của enzyme ptoteaza và amilaza 5 24

2.2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp proteaZa 27

22.4 NUÔI CẤY VI SINH VAT ĐỂ SAN XUẤT ENZYME BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY BE MẶT 222-222 2211111122122212203251223227<17 30 PHẦN3 - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 888 eee ee ee REE EEE EEE E SESE EEE E ESE EEE SESE ESS ESET ESE ES ESEESESEEEESENE ESSER ESE EEEEEEREETEETEEEETESEEE ESTE EEEEEEEEEEEEETEEEEEES ng 32 3.1 - ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CUU ccssssssessesssssssssseeesennssessssvonneennnnssnsnsonnenness 32 ` uy) 1| i01 3.I::., (- ¡13 RA 32 Be BING VOTE LIỀU 0 vossnseosesregnseypyXisexiiay inasavviongavegoensonaiens cepiderreeersinrnmvepnsrE 32 DL | | ae 32 TH TẾ ekakeokoenuosonoeoinoveeeoiaaeeanesaeeserese 35 Tà MAG GG: IS gktdaaaaoganoaeeormonnesanassee 36 3.3 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .5<-cssx.secrvee 36 3.3.1 PHƯƠNG PHÁP PHAN LẬP VI SINH VẬT - 36

3.3.2 PHƯƠNG PHAP QUAN SAT ĐẠI THỂ NAM MỐC 37

3.3.3 PHƯƠNG PHAP QUAN SAT VI THỂ NAM MỐC 38

3.3.4 PHƯƠNG PHAP KHẢO SÁT KHẢ NANG PHAN GIẢI CAC HỢP GHAT GAO PHAN TỪ:5:1<cGS620 0A 0L0:0tii00/2 650A GGGELGdfcsbse 39 3.3.4.1 Phương pháp khảo sát khả năng phân giải protein 39

3.3.4.2 Phương pháp khảo sát khả năng phân giải tinh bột 39

3.3.4.3 Phương pháp khảo sát khả năng phân giải cellulose 39

3.3.5 PHƯƠNG PHÁP LI TRÍCH DICH ENZYMES THÔ 40

3.3.6 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PHAN GIẢI PROTEIN CUA DỊCH EZYME PROTEAZA THEO PHƯƠNG PHAP ANSON - 40

Luận văn Tốt nahilp ik ERR ORE SM EMS AOE COR

3.3.6.2 Xác định hoạt độ enzyme proteaza của dich enzyme proteaza

tiộ dựa trên độ tị chante ists eee iii decease aa 41

3.3.7 KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ANH HUGNG ĐẾN HOẠT LUC

ENZYME PROTEAZA 22s 0 01921111111021112111301100102110111211121121211017212000 43

3.3.7.2 Độ thoáng KM cscccscccsccssesssconsrssunssvsvesssessscersensenessessnneeneesesensne 44

Li LH ee 44

3.3.8 PHƯƠNG PHAP NUÔI MOC TREN NGUYEN LIEU GIAU DAM(

U MOC) TRONG LEN MEN SAN XUẤT NƯỚC CHẤM - 44

PHAN 4- KET QUA VA BIEN LUẬN ‹ sai

4.1 - KẾT QUA PHAN LẬP - 66 tÉE2211601111722031100211753 721127 46

4.2 - KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CÁC CHỦNG PHẦN

DAR II sss ccnp sna 06600016001064010006.0 56668332 8568xxenl 46

4.3 - KET QUA KHẢO SÁT KHẢ NANG PHAN GIẢI CÁC HỢP CHAT

CRC ERIN I ác S2 Ặ 22 outa patch ae eos henna ie eammnapmemoNeRNeNeeOSE 52

4.3.1 KẾT QUÁ KHẢO SÁT KHẢ NANG PHAN GIẢI PROTEIN 53 4.3.2 KET QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NANG PHAN GIẢI TINH BỘT 54 4.3.3 KẾT QUA KHẢO SÁT KHẢ NANG PHAN GIẢI CELLULOSE.57

4.4 - KẾT QUA DUNG ĐỒ THỊ CHUAN TYROXIN - 61 4.5 - KET QUA KHAO SÁT MỘT SO YẾU TỐ ANH HUGNG HOẠT TÍNH

ENZYME PROTEAZA CUA CHUNG NAM MỐC N5 - occc-cc2 63

4.5.1 KET QUÁ KHAO SÁT HOẠT TINH ENZYME PROTEAZA CUA

CHỦNGN5 THUG TEMS EAI cakes hss seen ici cach abc 63

Lain Văn TE sgWP.;/%zes.9/1:2.9163/&:28%444904(ˆ2WBj4 ðiWMlW

4.5.3 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH PROTEAZA CUA CHUNG NS THEO

lS, | hh a rT 66

4.6 - UNG DUNG CHUNG N5 VÀO GIAI DOAN U MOC TRONG QUA

TRINH SAN XUẤT NƯỚC CHAM LÊN MEN 5s 620000 68

PHAN § - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ S809 066g ull

PHU LUC BANG, ĐỒ THỊ VA HÌNH ANH

*BANG:

Bảng 2.1.1-1 Các yêu cầu về cảm quan của nước chấm lên men 222 10

Bảng 2.1,2-1 Thành phan dinh dưỡng nước chấm từ đậu nành - 12

Bảng 2.1.2-2 Thành phần acid amin trong protein hat đậu nành s- 13 Bảng 2.1.2-3 Thành phần hydratcacbon của đậu nành 2 2255252 soyY2 14

Bảng 2.1.2-4 Thanh phần khống hạt đậu nành 22 5 St E111 11 112, 14

Bảng 2.1.2-5 Thành phần vitamin trong hạt đậu nành sàn l5

Bảng 2.1.2-6 Thành phần hố học bột mì - ác no sssceevesrsrssvse 15

Bảng 4.3.1-1 Khả năng phân giải protein của các chủng nấm mốc - 53

Bảng 4.3.2-1 Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc - 55 Bảng 4.3.3-1 Khả năng phân giải cellulose của các chủng nấm mốc 57 Bảng 4.3.3-1; Sự tương quan giữa lượng tyroxin và gid trị ODg«oà 6l

Hình 4.2-1; khuẩn lạc khổng 16 chủng N1 sau 7 ngày nuôi cấy -‹- 50

Hình 4.2-2 :khuẩn lạc khổng 16 chủng N2 sau 7 ngày nuôi cấy 50

Hình 4.2-3 : khuẩn lạc khổng 16 chủng N3 sau 7 ngày nuôi cấy 5I Hình 4.2-4 : khuẩn lạc khổng Id chủng N4 sau 7 ngày nuôi cấy 5I Hình 4.2-5 : khuẩn lạc khổng Id chủng N5 sau 7 ngày nuôi cấy 52

Hình 4.3-] Khả năng phân giải protein sữa gẩy của các chủng nấm mốc sau 4 ngày TÔ CER i aaa cacao an 54 Hình 4.3-2 Khả nang phân giải tinh bột của chủng N1 và N2 sau 5 ngày 55

Hình 4.3-3 Khả nang phân giải tinh bột của chủng N3 và N4 sau 5 ngày 56

Hình 4.3-4 Khả năng phân giải tinh bột của chủng N5 sau 5 ngày %6

Hình 4.3-5 Khả năng phân giải cellulose của chủng NI và N2 sau 5 ngày 38

Hình 4.3-6 Khả năng phân giải cellulose của chủng N3 và N4 sau 5 ngày 58

Hình 4.3-7 Khả năng phân giải cellulose của chủng N5 sau 5 ngày 59

Hình 4.6-1 Nguyên liệu được ủ mốc là chủng N5 (ảnh bên trái) Nguyên liệu được nhiễm mốc tự nhiên (ảnh bên phải) - ccccccciccscssireericve ANG )

*ĐỒ THE

Đồ thi 4.3.3-1; Đường chuẩn tyroxin cccsseseeceeerrrrirrrrrrrrer 62

pr0fpeze của chững Nỗ(xtïuáG00060010011001.2100 (0102860220) 64

Biểu đổ 4.5.2-1: Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hoạt lực enzyme

protbsza của chững Nhac Gt0ti0i0 00 0000020 coagudGadcaoi 65

Đồ thị 4.5.3-1 : Ảnh hưởng của pH môi trường lên hoạt lực enzyme

ĐẶT VẤN ĐỀ

Qua nghiên cứu tài liệu và tìm hiểu thực tế tại các cơ sở sản xuất nước chấm ở thành phố Hé Chí Minh cho thấy một số đông các cơ sở sản

xuất nước chấm bằng phương pháp hoá học: thủy phân protid thực vật và

động vật bằng acid mạnh ở nồng độ cao, một số nơi khác quá trình sản xuất được thực hiện bằng phương pháp vi sinh nhưng chỉ ở qui mô truyền

thống sử dụng các chủng nấm mốc tự nhiên Với 2 phương thức này thường

cho sản phẩm có chất lượng không ổn định đồng thời chứa các độc tố Để khắc phục nhược điểm này các nước trên thế giới đã sử dụng giống thuần

chủng trong quá trình sản xuất nước chấm lên men Tuy nhiên ở Việt Nam

chưa được áp dụng rộng rãi Để phổ biến phương pháp này đến các cơ sở

sản xuất nước chấm, một trong những nhiệm vụ đặt ra là chọn được các

chủng nấm mốc phù hợp Giống nấm mốc phù hợp với việc lên men sản

xuất nước chấm phải đảm bảo những yêu cẩu:

+Có hoạt lực enzyme proteaza cao

+Không sản sinh độc tố aflatoxin

+Sức phát triển mạnh và chống tạp khuẩn tốt

+Có ảnh hưởng tốt đến sự tạo hương thơm cho sản phẩm

Trong các đặc điểm trên, họat lực enzyme proteaza là vấn dé đặt lên

hàng đầu khi chọn lựa các chủng nấm mốc phù hợp với việc sản xuất nước

điểm nêu trên phục vụ cho việc sản xuất nước chấm lên men Chúng tôi

tiến hành để tài : “phân lập tìm hiểu đặc điểm một số chủng nấm mốc

sử dụng trong sản xuất nước chấm lên men ”

Với các nhiệm vụ chủ yếu sau:

* Phân lập các chủng nấm mốc từ các nguyên liệu giàu đạm hay tỉnh bột vì nguyên liệu của quá trình sản xuất nước chấm lên men là những nguyên liệu giàu đạm có bổ sung tinh bột.

*Quan sát hình thái đại thể và vi thể để chọn ra những chủng nấm

mốc thuộc giống Aspergillus.

*Khảo sát khả năng phân giải một số hợp chất cao phân tư trong nguyên liệu nuôi cấy như protein, tinh bột, cellulose của các chủng phân

lập được.

*Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực enzyme proteaza

như: thời gian, nhiệt độ, độ ẩm, pH, độ thoáng,

Nhằm tuyển chọn các chủng nấm mốc, cũng như các diéu kiện nuôi

cấy đáp ứng các yêu cầu của một giống dùng cho quá trình lên men sản

xuất nước chấm có khả năng cho sản phẩm chất lượng cao.

*Sử dụng chủng nấm mốc tuyển chọn được vào nuôi cấy bể mặt (lên

Luận Văn TẾ nell aby 6y ig) A NU,

PHẦN 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 - MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ NƯỚC CHAM LÊN MEN

Nước chấm là tên gọi chung chỉ các loại gia vị dạng lỏng chứa

chủ yếu acid amin, muối ăn và có hương vị đặc trưng Nước chấm lên men

được sản xuất từ các nguyên liệu giàu đạm theo 2 phương pháp: vi sinh

học và hoá học.

2.1.1 TIÊU CHUẨN VỀ CHẤT LƯỢNG CỦA NƯỚC CHẤM LÊN

MEN

Do sự phát triển mạnh mẽ của nước chấm và nhu cẩu của

nhân dân, đến nay nước ta đã đưa ra một số tiêu chuẩn về chất lượng nước

chấm lên men như sau:

2.1.1.1 Tiêu chuẩn cảm quan

Bảng 2.1.1-1 Các yêu cầu về cảm quan của nước chấm lên men

Tên chỉ tiêu Yêu cầu

Thơm đặc trưng của nước chấm lên men,

Ngọt dịu, không có vị lạ

Trong, không có váng.

Hàm lượng nitơ toàn phần không nhỏ

hơn

Hàm lượng nitơ amin không nhỏ hơn

Hàm lượng nitơ amoniac không lớn hơn

Hàm lượng NaCl không nhỏ hơn (g/) PB

2.1.1.3 Chi tiêu vi sinh vật và độc tố

e - Không có nấm men và nấm mốc

« Tổng số vi khuẩn hiếu khí không lớn hơn 20000

CFU/ml.

® Coliform nhỏ hơn 10 CFU/ml.

e Escherichia coli không được có.

s Cl perfringen không lớn hơn 2 CFU/ml.

se Salmonella không được có.

© Staphylococcus aureus không được có.

2.1.2.1 Nguyên liệu quá trình sản xuất nước chấm lên men

Trên thế giới, nước chấm lên men rất đa dạng và phong phú.

Nguyên liệu chính để sản xuất các sản phẩm này cũng rất đa dạng như các

hạt giàu đạm: đậu nành, đậu phộng, khô lạc, phối hợp với các nguyên liệu giàu tinh bột như bột mì, bột gạo, bột sắn, lúa mach và các gia vị như

muối, đường, gừng, tỏi, ớt Tuy nhiên nước chấm được làm từ đậu nành

và bột mì rất giàu dinh dưỡng vì hàm lượng đạm cao, đẩy đủ các chấtprotid, lipit, gluxit, chất khoáng ngoài ra còn có các vitamin đặc biệt làvitamin nhóm B, và một năng lượng tương đối cao khoảng 1100 đến 1200calo/lít Thành phần dinh dưỡng của nước chấm lên men từ đậu nành được

trình bay trong bảng sau:{ 15]

Bảng 2.1.2-1 Thành phần dinh dưỡng nước chấm từ đậu nành

ee — ret | om

ee

-——.¬

300-545 mg %

Với đặc điểm trên chúng tôi sẽ đi sâu tìm hiểu về thành phần hoá học của của 2 loại nguyên liệu này để làm cơ sở nghiên cứu cho để tài.

a- Thành phần hoá học của hạt đậu nành

Đậu nành có tên khoa hoc là: Glycine max Merrills

Thành phần hoá học chính của hạt đậu nành chủ yếu là protein, lipit

và một hàm lượng hydratcacbon Trong đó protein chiếm một tỉ lệ lớn 40

-45% Thanh phan aid amin trong protein đậu nành ngoài 2 thành phan

chính methionin và tryptophan còn có các acid amin khác tương đương

lượng acid amin trong thịt.{ I I ]{ 10]

Leuine 2 Treonin

Lysine ` Tryptophan

Methionin y Valin Cystein : Histidine

Hydratcacbon chiếm khoảng 34% hat đậu nành gồm 2 loại: loại tan trong nước chiếm 10%, còn lại là loại không tan trong nước Thành phần

hydratcacbon gồm:

Bảng 2.1.2-3 Thành phần hydratcacbon của đậu nành

Bảng 2.1.2-5 Thành phần vitamin trong hạt đậu nành

Loại vitamin Loại vitamin

Thiamin 11.0-17.5 Acid folic 1.9

Protein của bột mì có 4 loại: anbumin, globulin, prolamin, glutelin chủ yếu là: prolamin, glutelin.

Bột mì có vai trò không nhỏ trong việc quyết định chất lượng sản

phẩm nước chấm lên men Khi tiến hành lên men có bổ sung bột mì đều có

quá trình rang Quá trình rang bột mì góp phần tạo hương cho nước chấm vì

các hợp chất tạo thành do sự xử lý nhiệt gồm nhiều hợp chất guaiacyl như

vanilin, vanilic acid, ferulic acid và 4-ethylguiacol, hàm lượng các hợp chất

phenol tự do cũng tăng lên, Quá trình rang cũng tạo màu cho sản phẩm [ 10]

2.1.2.2 Quy trình sản xuất nước chấm lên men lên men nhờ vi

sinh vật

Đối với phương pháp sản xuất nước chấm lên men, cơ sở khoa học là

sử dụng hệ enzymes của vi sinh vật để thủy phân nguyên liệu giàu đạm.

Nguồn enzymes có thể tạo ra bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trên môi

trường riêng rồi đưa vào nguyên liệu giàu đạm hay nuôi trực tiếp trên môi

trường giàu đạm Gồm các giai đoạn sau:

a-Giai đoan làm mốc giống:

Trong sản xuất qui mô gia đình theo phương pháp truyền thống

giống được sử dụng cho lên men là nấm mốc nhiễm tự nhiên Trong không gian nhà làm tương bào tử nấm mốc nhiều và người sản xuất chỉ cần cho

quan tâm với mục đích tạo được lượng giống đủ cho sản xuất với lượng bào tử đạt được là cao nhất Giống mốc được chuẩn bị gồm các bước sau:

-Giai đoạn giữ giống: Giống nấm mốc được giữ trong các ống

thạch nghiêng.

-Nuôi cấy nấm mốc giống trong các bình tam giác: Thường sử

dung các bình tam giác 0,25-0,5 lít hoặc | lít Có thể dùng cơm nấu chín

bóp rời thành từng hạt hoặc dùng mảnh ngô, gạo được xay vỡ có bổ sung

trấu và nước Tron đều trong khay để 1-2 giờ rồi bóp thật tơi Sau đó cho

vào các bình tam giác Dem khử trùng ở | atm trong vòng 30-45 phút (đối với cơm, cám) và 60 phút (đối với ngô) Cho 5 ml nước cất vào các ống

nghiệm giống lắc cho bào tử hoà trong nước rồi cấy truyền sang bình tam

giác Một ống giống có thể cấy truyền sang 2-3 bình có dung tích 1 lít.

Tiến hành nuôi trong vòng 5-6 ngày.

b- Nhân giống trên mành sing (nhân giống lớn):

Môi trường để nhân giống trong giai đoạn này là ngô mảnh hay gạo

ra với lớp dày 1,5-2 cm, sau khi nuôi 34-36 giờ nhiệt độ trong khay bắt đầu giảm dẫn cần điều chỉnh nhiệt độ để duy trì sự hình thành bào tử

Sau khi nuôi mốc giống xong có thể sử dụng để sản xuất ngay,

nhưng cũng có thể sấy khô tới độ ẩm 8% ở nhiệt độ 40°C trong các bọc

nylon để chống ẩm và tránh lây nhiễm của loài khác để bảo quản dùng lâu

dai.

c-Giai đoan làm nước đâu: Thường trai qua 2 khâu :

Rang đâu: Đậu để nguyên hạt rang trên bếp được áp dụng ở

các cơ sở sản xuất qui mô nhỏ, hộ gia đình hay sấy 180-200°C trong 45-60phút ở qui mô công nghiệp.

Ngâm đậu: Đậu nành được ngâm trong khoảng 4-8 giờ, lượng

nước ngâm thường gấp 2,5 lần lượng đậu Hoặc có thể bỏ qua giai đoạn

ngâm đậu mà thủy phân đậu luôn bằng cách trộn với mốc nuôi.| 17]

Đậu sau khi ngâm để cho ráo nước đem hấp chín ở | atm trong | giờ

Theo phương pháp truyền thống thì hỗn hợp đậu nguyên hạt

và bột mì sau khi hấp chín cho vào các khay nhỏ, cấy mốc nuôi, nuôi ủ 3-4 ngày Trong suốt quá trình nuôi thường xuyên đảo trộn bằng các dụng cụ

cẩm tay để tránh nhiệt độ quá nóng làm nấm mốc chết.

Trong công nghiệp việc nuôi mốc tiến hành trong các phòng

nuôi được diéu chỉnh nhiệt độ 30-32°C, các thiết bị nuôi ủ tự động, trộn

đảo tự động, kiểm soát nhiệt độ một cách tự động Sau 16-24 giờ nuôi cấy

6 <a " de. ikRiba Bee

có thể hạ nhiệt độ xuống 28-30°C Thời gian nuôi mốc có thể nhanh gấp

hai lần so với phương pháp thủ công.

e-Giai đ

Nguyên liệu sau khi mọc nấm mốc tốt và đều thì tiến hành

ngả tương ngay bằng cách cho vào chum hay vại để chín Ở qui mô sản xuất công nghiệp nguyên liệu được nghiền nhỏ rồi mới cho vào chum hay

vại.

Việc ngả tương được tiến hành nhanh để tận dụng thời điểm

hoạt động của men amlilaza bằng cách trộn với nước muối theo t lệ

17-19% Nếu néng độ thấp hơn có thể có một số vi sinh vật khác phát triển nếu cao hơn thì làm ức chế hoạt động của enzymes Thời gian ủ có thể là 12- 14 tháng nếu diéu chỉnh nhiệt độ 35-40°C thì thời gian có thể rút ngắn

lại còn khoảng 2 - 4 tháng Trong quá trình thủy phân va ủ chín thường

xuyên khuấy đảo để phóng thích CO;, hạn chế sự phát triển vi sinh vật không mong muốn và tạo hương vị không tốt cho sản phẩm.{9}

f-Trích ly nước chấm:

Sau khi nguyên liệu đã chín người ta mở van ở đáy thùng,

khạp để rút nước chấm hay dùng các máy lọc ép đơn giản, máy ép thủy

lực (trong công nghiệp) để rút nước chấm ra sau đó cho thêm nước muối

trong 30 phút Caramen được bổ sung vào để tạo thêm màu, mùi vị và độ

sánh cho sản phẩm Sau đó để lắng và đóng chai

Nguyên liệu Mốc ở ống thạch nghiêng

(đậu tương, ngô)

xy mewentiew ` Nhân giống (bình tam giác, khay)

Thành phẩm

Sơ dé: Quy trình công nghệ sản xuất nước chấm lên men [!7]|7]

2.2.1 VI SINH VAT DUNG TRONG LEN MEN SAN XUẤT NƯỚC

CHAM

Khi tiến hành lên men theo phương pháp cổ truyền người ta thấy có

tất nhiều loài nấm mốc khác nhau như: Mucor, Mucedor, Rhizopus

nignicans, Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus niger,

Penicillum notatum, P prolatum, P expanxum, Monilia sitofila, Tricoderma

lignolum, Trong các chủng nấm mốc đó thì giống nấm mốc Aspergillus

oryzae đã có những ưu điểm phù hợp với việc lên men cho nước chấm có chất lượng cao và ổn định và không sinh độc tố Chính vì vậy trong phan

này chúng tôi sẽ để cập nhiều về chủng Aspergillus oryzae

*Vị trí phân loại của loài Aspergillus oryzae:.[ 10]

2.2.1.1 Đặc điểm hình thái

Aspergillus oryzae khi nuôi cấy trên môi trường czapeck ở nhiệt độ

phòng khoảng 10 ngày tuổi có đặc điểm hình thái vi thể và đại thể như

sau:

Đường kính khuẩn lạc khoảng 5-6 cm.

Màu vàng lục của khuẩn lạc sau chuyển thành lục nâu và sau thành

mau nâu lục.

Khối bào tử trần đỉnh bong hình tia tod tròn, phần lớn có đường kính

150-500 j: m Giá bào tử trần nhấn hoặc ráp, thường dài 2,5 cm, có thể 4-5

em Bong đỉnh giá hình gần cầu có đường kính 40-50 p m

Cuống sinh bào tử mang một hay hai lớp thể bình có đường kính 4-5

x 8-12 pm.

Bào tử trần phần lớn hình cầu, đôi khi hình elip có đường kính 4,5-7 uum hoặc 8-10 m trục lớn, bể mặt bào tử nhẩn hoặc ráp có gai min.[6]

2.2.1.2 Đặc điểm sinh lí sinh hóa

Nấm mốc thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nghĩa là không thể phát

triển được khi môi trường không có oxi nhưng sự hiếu khí mạnh cũng ảnh

hưởng đến khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm của quá trình trao đổi

chất của chúng.

Nấm mốc thường phát triển trong môi trường có pH trung tính, một

số nấm mốc thích nghi với pH acid hoặc môi trường hơi kiểm Tuy nhiên

Nấm mốc phát triển thích hợp với nhiệt độ 20°C-30°C [3]

32.2 HỆ ENZYMES CUA NAM MOC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ VAI TRO CUA CHUNG TRONG QUA TRINH SAN XUẤT NƯỚC

CHAM LEN MEN

2.2.2.1 Hệ enzyme nấm mốc Aspergillus oryzae

Theo Tauber 1949: Hệ enzymes nấm mốc Aspergillus oryzae gồm

các enzymes | I3]

œ-amilaza Xellulaza

B-amilaza Piophosphataza Mantaza Phosphonoesteraza

Lactaza Tannaza Proteaza Catalaza Peptidaza Nucleaza

Reninaza Fitaza

Pectidaza Tehalaza

Pectonaza Amidaza Lipaza sulfataza

phức hệ enzymes như nhau Ngay cùng | loài cũng khác nhau vé lượng

enzymes được tổng hợp Vì vậy việc tuyển chọn các chủng vi sinh vật có

hệ enzymes phù hợp với nhu cầu nào đó của sản xuất là vấn để khó khăn

và phức tạp Trong phạm vi để tài nhằm tuyển chọn các nấm mốc sử dụng

phù hợp trong quá trình sản xuất nước chấm lên men với nguồn nguyên

liệu chủ yếu là protein và tinh bột, chúng tôi sẽ đi sâu tìm hiểu vai trò của

enzyme proteaza và amilaza trong việc thủy phân các nguyên liệu.{ I7 |{5 |

2.2.2.2 Vai trò của enzyme ptoteaza và amilaza

a-Enzyme amilaza

Thuộc nhóm enzyme thủy phân tỉnh bột và các sản phẩm trung gian

của sự thủy phân Amilaza là enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong kĩthuật vì trong quá trình chế biến các loại nguyên liệu chứa tinh bột nhất

thiết phải thủy phân tỉnh bột đến một mức độ nhất định nào đó Tinh bột

dù có nguồn gốc từ đâu cũng có thể xem là phức hợp gồm amiloza và

amilopectin Khi tác dụng với iốt amiloza cho màu xanh còn amilopectin

cho màu tím đỏ Trong quá trình thủy phân tỉnh bột có sự tham gia của nhiều Amilaza khác nhau, đóng vai trò tích cực là các enzyme:

- a-amilaza làm cho amiloza bị phân cất một cách bắt kì

tạo thành các poliglucoza cứ ngắn din và nếu chịu tác dụng lâu có thể bị

chuyển thành phan lớn là mantoza (87%) và một ít glucoza( 13%) Đối với

amilopectin thì œ-amilaza cũng tác dụng tương tự nhưng sản phẩm cuối

cùng ngoài các đường nói trên còn có dextrin phân tử lượng thấp và

izomantoza.

- B-amilaza thủy phân tinh bột tao thành chủ yếu là

mantoza và một ít dextrin có khối lượng phân tử cao Nếu a-amilaza tiếptục tác dụng thi dextrin nay có thể chuyển thành các dextrin có khối lượng

phân tử nhỏ.

- Glucoamilaza có thể một mình thủy phân 100% tinh

bột thành glucoza mà không cần có mặt của bất cứ enzyme Amilaza nào

khác

- Oligo 1,6 glucozidaza thủy phân izomantoza, panoza

và dextrin thành các đường lên men được.

- a-glucozidaza chủ yếu thủy phân montoza đến glucoza

b-Enzyme proteaza:

Là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid trong phân tử

protein và các polipeptid khác.Theo hội đồng hoá sinh quốc tế năm 1961,

diva vào đặc tính tác dụng của nó mà chia thành 2 loại:

-Proteinaza chủ yếu phân hủy các liên kết peptid bên trong

phân tử protein vì vậy mà nó có tên là endopeptidaza hay peptidaza nội

bào Chúng phân cắt protein thành các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ

(pepton hay polipeptid).

polipeptid tách các gốc axit amin thành các axit amin tự do Nên nó còn có

tên là exopeptidaza hay peptidaza ngoai bao.

Hoạt tính proteaza của vi sinh vật rất khác nhau Nếu như trong cácchế phẩm proteaza từ động vật hay thực vật chỉ chứa một vài proteaza thìtrong các chế phẩm từ vi sinh vật thì chứa cả endopeptidaza và

exopeptidaza Điều đáng chú ý là các proteaza của vi sinh vật có tính đặc

hiệu khác thường có thể thủy phân đến 80% liên kết peptid trong phân tử

protein Sự thủy phân protein bằng enzymes là một quá trình có ý nghĩa

lớn trong nhiều ngành công nghiệp vì có nhiều điểm ưu việt hơn, tránh những hao phí khi dùng axit hay bazo, không đòi hỏi thiết bị phức tạp như chịu áp suất cao và không bị axit ăn mòn Trong dịch thủy phân tất cả các

axit amin đều được bảo toàn không bị phá hủy bởi axit, ngoài ra dịch thủy

phân không chứa một lượng muối quá lớn như trong dịch thủy phân bằng

Một quá trình sinh tổng hợp enzyme được gọi là cảm ứng, nếu nó chỉ xảy ra với mức độ đáng kể khi môi trường có cơ chất đặc hiệu của enzyme này hay các chất trao đổi có cấu trúc tương tự cơ chất Các enzyme loại

này được gọi là enzyme cảm ứng và cơ chất kích thích quá trình này gọi là

chất cảm ứng.

Sự tạo thành enzyme dưới tác dụng của chất cảm ứng gọi là quá

trình tổng hợp protein De novo Muốn tổng hợp enzyme cảm ứng cần có 4

điểu kiện sau:

I.Có gen tương ứng trên nhiễm sắc thể của tế bào.

2.Có đầy đủ các nguyên liệu để xây dựng các phân tử protein

3 Năng lượng cần thiết cho việc sinh tổng hợp.

4.Chất cảm ứng [ I |

2.2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp proteazaa- i trườn

Các cấu tử của môi trường có thé là chất cảm ứng hoặc kim

him sự sinh tổng hợp enzyme Nếu như trong môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm của nó có tác dụng phong toả chất kìm hãm

nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị can trở.

ứng là hemixelluloza Còn đối với proteaza thì chất cảm ứng là protein cóthể là bột đậu nành, lông, sừng nghiền nhỏ, hay bột cá,

b-Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp

các enzyme cũng như tính chất của enzyme Việc tăng nhiệt độ lên trong

quá trình hô hấp phát triển mạnh của nấm mốc sẽ ảnh hưởng đến việc tân

tạo các enzyme Ví dụ như nhiệt độ trong canh trường nuôi nấm mốc tăng

lên 40-45°C kéo dai 10-12 giờ thì việc tạo enzyme œ-amilaza không bị ảnh hưởng Ngược lại để tạo proteaza thì không cho phép nhiệt độ tăng lên quá 30°C.

c-Thời gian

Trong quá trình nuôi nấm mốc để tiến hành quá trình lên men

thì thời gian nuôi mốc rất được quan tâm vì phải tìm được thời gian thích

hợp nhất mà ở đó lượng enzyme được nấm mốc tiết ra môi trường là tối đa.

Ở một số loài nấm mốc aspergillus sự tạo thành lượng enzyme tối đa sẽ

trùng với sự bất đầu tạo thành đính bào tử, do đó cho ngừng quá trình phát

triển vào lúc này là thích hợp Trong một số trường hợp khác sự tạo thành enzyme còn có thể kéo đài trong suốt quá trình thời gian tạo ra bào tử đính một cách mạnh mẽ Thường thời gian thích hợp là từ 35 đến 48 giờ.

e-Đô ẩm môi trường

Độ ẩm môi trường cũng có ý nghĩa quan trọng trong quá trình

cũng làm hàm lượng enzyme tao ra cũng ít đi Vì vậy cần chú ý tính toán

bố trí các ngăn, giá trong phòng nuôi cấy sao cho hợp lí để đảm bảo độ ẩm

của canh trường.

f- Dé thông khí của môi trường

Vì nấm mốc là vi sinh vật hiếu khí nên độ thông khí ảnh

hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp proteaza Trong một số trường

hợp thiếu oxy tuy có kìm hãm sự sinh trưởng nhưng lại làm tăng quá trình

sinh tổng hợp proteaza Một số trường hợp sự hiếu khí mạnh kìm hãm sinh

tổng hợp proteaza

Trong quá trình nuôi cấy các chủng nấm mốc để sự tổng hợp

enzyme proteaza thích hợp cải thiện bằng cách chú ý đến độ dày của canh

trường nấm mốc Thường độ dày canh trường tốt nhất vào khoảng 1,5-2,5

cm.

&- pH môi trường

Khi ding phương pháp nuôi cấy bể mặt pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy nấm mốc, tuỳ theo thành phần môi trường và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật mà pH chuyển về acid

nuôi cấy vi sinh vật sẽ tạo thành mạnh mẽ một dạng proteaza nhất định

chiếm ưu thế trong môi trường [1]

2.2.4 NUÔI CẤY VI SINH VAT DE SAN XUẤT ENZYME BẰNG

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY BỀ MẶT

Trong phương pháp nuôi cấy bể mặt, người ta cho vi sinh vật phát

triển và bao phủ trên bể mặt các hạt chất dinh dưỡng rắn, đã được làm ẩm,

dùng làm môi trường (cám gạo, cám mì, mảnh bắp ) Người ta nuôi vi sinh

vật trực tiếp trên bể mặt của hạt gạo, hạt đậu đã được hấp chín Môi

trường để nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn bằng phương pháp bể mặt

thường dùng là cám mì, cám gạo vì chứa nhiều chất dinh dưỡng nhưng

chủ yếu là tạo cho môi trường được cấu trúc cần thiết ở trong trạng thái ẩm tơi xốp Trong điều kiện đó thì hệ sợi nấm của vi sinh vật sẽ phát triển

nhanh chóng và đổng bộ, nhưng nấm mốc sẽ không được sự nuôi dưỡng

quá đổi dao do đó sự tạo thành enzymes ở chúng sẽ được hoàn thành một

cách nhanh chóng sau 36-48 giờ Dé tang hoạt độ của enzyme, người ta còn thêm vào cám những vật liệu chứa những chất cảm ứng cần thiết.

Muốn cho cấu trúc của môi trường tạo được độ thoáng khí tốt người ta

có thể thêm trấu hay mùn cưa nhất là khi dùng cám mịn làm môi trường.

Tiệt trùng môi trường với áp suất I-l,5 atmotphe trong thời gian 45-60

phút Nguội xuống 38-40°C thì gieo cấy vi sinh vat,

Toàn bộ chu trình phát triển của nấm mốc trên cám có thể chia làm 3

mọc nấm Trong thời kỳ này phòng nuôi cấy cẩn giữ ở nhiệt độ

không dưới 28-30°C để không kìm hãm sự phát triển ban đâu của

chúng.

b) Qua thời gian trên hệ soi nấm bắt đầu phát triển nhanh Thời

kỳ này kéo dài 14-18 giờ Nấm mốc phát triển mạnh mẽ sử dụng một lượng lớn các chất dinh dưỡng, hô hấp mạnh và lượng nhiệt thoát ra nhiều Vì vậy trong lớp canh trường nhiệt độ tăng lên 37-

40°C và có thể cao hơn phụ thuộc vào độ dày của lớp môi trường

c) Thời kỳ thứ 3 kéo dài trong 10-20 giờ Trong thời kỳ này quá

trình trao đổi chất diễn ra không mạnh mẽ lắm và dần yếu đi, lượng

nhiệt thoát ra ít hơn, nhưng sự tạo thành enzymes vẫn còn có thể

xảy ra và tiếp diễn.

Canh trường bể mặt của nấm mốc sau đó đem nghiền nhỏ và

sấy khô ở nhiệt độ 40°C đến độ ẩm 8-12% để sử dụng lâu dài Chế

phẩm enzymes dưới dạng này gọi là chế phẩm thô.

Văn Tốt nghiệp

ĐỔI TƯỢNG

VẬT LIỆU NỘI DUNG

PHƯƠNGPHÁP

Luận Văn Tết nghiệp

PHẦN 3- ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

3.1 - ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Các chủng nấm mốc phân lập được từ:

s Đậu phộng bị nhiễm mốc tự nhiên.

® Com nguội bị lên mốc.

s Đậu nành bị nhiễm mốc ở cơ sở sản

xuất nước tương

3.2- VAT LIEU NGHIÊN CỨU

3.2.1 Nguyên liệu:

Đậu nành Cám gạo

Bột mì Trấu

3.2.2 Môi trường

*Môi trường czapeck-dox (MT):

NaNO; _ wil 3.5E

MS .————-———r 0.5g

KẾ k6 tpitir2unsia2aue 0.5g

—

Trang 32

Luận Văn Tốt nghiệp

MS CNtieiietiicaoioiduo¿oeeco 0.5g ta IEBBBRDRE ae 0.5g

Cách làm: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, thái hat lựu, cân 300g cho vào

500 ml nước cất đun sôi 30 phút Lọc lấy nước trong bổ sung nước cất cho

đủ 1000 ml, cho thêm 50 g đường kính và 20g agar đun sôi lại lần nữa.

*Môi trường đậu nành và bột mì (MT6):

Đậu nành được mua về rửa sạch, loại bỏ những hạt hư xấu,

mốc, lép Dem ngâm nước khoảng 3-4 giờ Vớt ra để ráo nước

Bột mì đem rang đến chín vàng

Phối trộn bột mì theo tỉ lệ 9:1 (theo trọng lượng khô), trộn đều

Luận Văn Tốt nghiệp

*Môi trường cám trấu (MT7):

GIN DỤ Ôn To TU VU 20g

TÌNH lục: 2624610006 10g

CC | 25 ml

Bổ sung 6% bột cá ( làm cơ chất cảm ứng cho enzymes ).Với tỉ lệ

cám trấu như trên, môi trường có độ ẩm khoảng 40%.

3.2.3 Hoá chất

-Xanh metylen

-Lactophenol

-Dẫu soi kính

-Triclo acetic acid (TCA) 5%

-Dung dich tween 10%

-Thuốc thử folin

-Tyroxin

_HCI 0.2 N -NaOH 0.5 N

-Lugol: _lot 2.5 g

KI 5g

nước cất I000ml