Báo cáo th cđbtv chiều thứ 4 nhóm 4

Cơ chế gây bệnh trên mít của vi khuẩn Pantoea stewartii subsp... Tuy nhiên, hiện tượng đen xơ xuất hiện trên trái mít Thái trong những năm gần đây đã làm giảm nghiêm trọng giá trị thương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

Mã môn học : 211337

Niên khóa : 2024 -2025

TP Thủ Đức, 12/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG

SINH HỌC PHÂN TỬ

BÁO CÁO THỰC HÀNH

Trượng Hoàng Minh Yến 21126260

TP Thủ Đức, 12/2024 CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG

SINH HỌC PHÂN TỬ

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮC v

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về bệnh đen sơ mít 3

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Pantoea stewartii subsp Stewartii 4

2.2.1 Phân loại vi khuẩn Pantoea stewartii subsp Stewartii 4

2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh học 5

2.2.3 Cơ chế gây bệnh trên mít của vi khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii 6

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 7

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 7

3.2 Vật liệu nghiên cứu và thiết bị 7

3.2.1 Vật liệu 7

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 7

3.2.3 Hóa chất 7

3.3 Phương pháp nghiên cứu 7

3.3.1 Ly trích DNA vi khuẩn Pantoea tewwartii và điện di tổng số DNA 7

3.3.1.1 Thực hiện quá trình ly trích DNA của vi khuẩn 7

3.3.1.2 Điện di DNA 8

3.3.2 Thiết kế phản ứng PCR 16S và điện di sản phẩm PCR 16S 8

3.3.2.1 Tiến hành khuếch đại đoạn gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi 16S 8

3.3.2.2 Tiến hành điện di sản phẩm PCR 9

3.3.3 Phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea tewartii, điện di sản phẩm PCR 10

3.3.3.1 Phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea tewartii 10

3.3.3.2 Điện di sản phẩm PCR 10

3.3.4 Phản ứng PCR với mồi tham khảo bài báo khoa học đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea tewartii, điện di sản phẩm PCR 11

3.3.4.1 Phản ứng PCR với mồi tham khảo bài báo khoa học đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea tewartii 11

3.3.4.2 Điện di để kiểm tra phản ứng PCR với mồi tham khảo 12

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13

4.1 Kết quả 13

4.1.1 Kết quả điện di tổng số DNA vi khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii 13

4.1.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 16S 13

4.1.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea stewartii 14

4.1.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi tham khảo 14

4.2 Thảo luận 15

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.2 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Pantoea stewartii subsp Stewartii. 5

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 16S. 13

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu. 14

Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi tham khảo bài báo khoa học 14

DANH SÁCH CÁC BẢNG

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮC

PCI Buffer : Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1);

CI : Chloroform/Isoamylalcohol (24:1);

TE Buffer : Tris – EDTA buffer;

STE buffer : Sodium Tris(hydroxymethyl)aminomethane-EDTA buffer;

PCR : Polymerase Chain Reaction;

Ctv : Cộng tác viên

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Mít (Artocarpus heterophyllus Lam.) là một trong những loại cây ăn trái có giá trị

kinh tế cao, đặc biệt là giống mít Thái, được trồng rộng rãi tại Việt Nam Với hương vị thơm ngon và tiềm năng xuất khẩu lớn, mít Thái đã trở thành cây trồng chủ lực ở nhiều tỉnh như Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai, TP Hồ Chí Minh, Long An, Tiền Giang và Hậu Giang Tuy nhiên, hiện tượng đen xơ xuất hiện trên trái mít Thái trong những năm gần đây đã làm giảm nghiêm trọng giá trị thương mại của loại trái cây này Trái mít bị đen xơ thường chỉ có thể bán với giá trị bằng 50% so với trái khỏe mạnh, hoặc thậm chí không thể tiêu thụ nếu tình trạng bệnh quá nặng Các khảo sát trước đây tại Hậu Giang (2015) cho thấy bệnh đen xơ thường xảy ra vào mùa mưa và chủ yếu xuất hiện trên những trái dị dạng hoặc méo mó, nhưng trái mít đẹp cũng có thể bị ảnh hưởng, gây khó khăn trong việc xác định thời điểm phát sinh và triệu chứng của bệnh Hiện tượng này không chỉ xuất hiện tại Việt Nam mà còn được ghi nhận lần đầu tiên tại Nam và Trung Mỹ vào năm

2011, sau đó lan rộng đến Philippines, Mexico và Malaysia Tại Việt Nam, vi khuẩn

Pantoea stewartii subsp stewartii đã được xác định là tác nhân gây bệnh đen xơ trên mít

Thái tại TP Hồ Chí Minh Tuy nhiên, hiểu biết về cơ chế gây bệnh, điều kiện phát sinh

và các biện pháp kiểm soát bệnh còn nhiều hạn chế, gây khó khăn trong công tác chẩn đoán và quản lý bệnh Vì vậy, nghiên cứu nhằm xác định nguyên nhân, điều kiện phát sinh và đề xuất giải pháp chẩn đoán và kiểm soát bệnh đen xơ trên mít Thái là hết sức cần thiết Đây không chỉ là vấn đề cấp bách để giảm thiểu thiệt hại kinh tế mà còn góp phần bảo đảm phát triển bền vững ngành trồng mít tại Việt Nam

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Để chẩn đoán chính xác bệnh đen xơ, có thể áp dụng các phương pháp như phân tích mô bệnh học, chẩn đoán sinh học phân tử (PCR), nuôi cấy và phân lập vi sinh vật, cũng như quan sát các triệu chứng bệnh trên cây Những phương pháp này giúp xác định tác nhân gây bệnh và phát hiện bệnh từ giai đoạn sớm, từ đó đưa ra biện pháp phòng ngừa

và điều trị hiệu quả

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Ly trích DNA vi khuẩn Pantoea tewwartii và điện di tổng số DNA

Nội dung 2: Thiết kế phản ứng PCR 16S và điện di sản phẩm PCR 16S

Nội dung 3: Phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea tewartii, điện di

sản phẩm PCR

Nội dung 4: Phản ứng PCR với mồi tham khảo bài báo khoa học đặc hiệu cho vi

khuẩn Pantoea tewartii, điện di sản phẩm PCR

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về bệnh đen sơ mít

Bệnh đen sơ mít, hay còn gọi là bệnh thối sơ mít Bệnh này do một số loại nấm hoặc

vi khuẩn gây ra, phổ biến nhất là các loài thuộc chi Phytophthora hoặc Colletotrichum c

hủ yếu do vi khuẩn Pantoea stewartii gây ra Vi khuẩn này xâm nhập vào trái mít qua hai

con đường: qua nướm hoa cái khi mở ra nhận phấn, hoặc qua các khe hở giữa các múi mít, đặc biệt trong điều kiện mưa ẩm Triệu chứng đặc trưng là phần sơ của quả mít chuyển màu đen, thối rữa, làm mất giá trị thương mại và ảnh hưởng đến chất lượng quả Nguyên nhân gây bệnh thường liên quan đến môi trường ẩm ướt kéo dài, vệ sinh vườn kém hoặc tổn thương trên quả tạo điều kiện cho mầm bệnh xâm nhập Ngoài ra, việc thiếu hụt canxi trong đất cũng có thể góp phần làm xơ mít bị đen Trong mùa mưa, đất thường thiếu canxi, dẫn đến cây mít không hấp thụ đủ dưỡng chất này, làm xơ mít chuyển màu đen Bệnh thường xuất hiện quanh năm, nhưng phổ biến và nghiêm trọng hơn trong mùa mưa, ảnh hưởng đến chất lượng và giá trị thương mại của trái mít Biện pháp phòng ngừa bao gồm đảm bảo thông thoáng vườn cây, tránh làm tổn thương quả trong quá trình chăm sóc, và xử lý hóa chất bảo vệ thực vật phù hợp khi bệnh xuất hiện Bệnh đen xơ mít đã được ghi nhận là một vấn đề phổ biến tại các khu vực trồng mít nhiệt đới, đặc biệt ở Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Indonesia và cả Ấn Độ Hiện tượng này thường xảy ra trong điều kiện thời tiết nóng ẩm, đặc biệt vào mùa mưa Tại Việt Nam, nông dân thường gặp phải bệnh đen xơ ở các vùng có độ ẩm cao hoặc khi quả mít bị tổn thương trong quá trình vận chuyển Tương tự, ở Thái Lan và Ấn Độ, bệnh này

thường liên quan đến sự xâm nhiễm của nấm và vi khuẩn như Phytophthora spp.,

Rhizopus spp., và Erwinia spp Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng vi

khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii, tác nhân gây bệnh khảm lá trên ngô, là nguyên

nhân chính gây ra hiện tượng đen xơ trên mít Vi khuẩn này xâm nhập vào cây mít, một quá trình được cho là kết quả của sự thích nghi và chuyển giao của vi khuẩn dưới tác

động của điều kiện môi trường nhiệt đới thuận lợi Pantoea stewartii đã phát triển khả

năng xâm nhiễm trên cây mít, mặc dù cây mít không phải là vật chủ ban đầu của vi khuẩn Đây là một ví dụ điển hình về khả năng tiến hóa và thích nghi của vi sinh vật gây bệnh trong các hệ sinh thái mới Do đó, bệnh đen xơ mít được coi là một bệnh mới, có

nguồn gốc từ Pantoea stewartii subsp stewartii, và nó phản ánh sự thay đổi trong điều

kiện canh tác nông nghiệp cũng như tác động của biến đổi khí hậu đối với sự phát triển và lan truyền của các bệnh hại cây trồng (Kadir và ctv, 2018)

Bệnh đen xơ mít phát triển qua ba giai đoạn chính Giai đoạn đầu là khi mầm bệnh,

thường là vi khuẩn Pantoea stewartii hoặc các tác nhân khác, xâm nhập vào quả qua các tổn thương hoặc khe hở Dấu hiệu ban đầu có thể chưa rõ ràng, nhưng quả mít có thể bắt đầu bị mềm và xuất hiện các vết đen nhỏ Giai đoạn phát triển là khi bệnh lan rộng, gây thối xơ và làm quả mít bị đen dần Các vết đen mở rộng, ảnh hưởng đến cấu trúc quả và làm giảm chất lượng, khiến quả mất độ ngọt và không còn giá trị thương phẩm Cuối cùng, trong giai đoạn thối rữa, quả mít bị hư hỏng hoàn toàn, các múi và xơ dính chặt lại với nhau, và quả không thể tiêu thụ được Việc phát hiện bệnh sớm và can thiệp kịp thời

là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây lan và bảo vệ chất lượng quả

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Pantoea stewartii subsp Stewartii

2.2.1 Phân loại vi khuẩn Pantoea stewartii subsp Stewartii

Ngành: Pseudomonadota

Lớp: Gammaproteobacteria

Bộ: Enterobacterales Họ: Erwiniaceae

Chi: Pantoea Loài: P stewartii

Hình 2.1 Mít bị đen sơ

Pantoea stewartii subsp stewartii là một loại vi khuẩn gây bệnh thực vật thuộc họ Enterobacteriaceae, được biết đến là tác nhân gây bệnh khảm lá trên cây ngô Vi khuẩn

này cũng có khả năng xâm nhập và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác, bao gồm cây mít, dẫn đến bệnh đen xơ mít Chúng thường xâm nhập vào cây qua các vết thương cơ học hoặc các lỗ mở tự nhiên như vết nứt hoặc lỗ thủng trên quả (Xu và ctv, 2010) Loại vi khuẩn này phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là ở môi trường có độ ẩm cao và nhiệt độ cao, rất thuận lợi cho sự phát triển và lây lan Khi điều kiện môi trường thích hợp, vi khuẩn sinh trưởng nhanh chóng và tấn công mạnh mẽ vào cây trồng (Chalupowicz và ctv, 2010)

Các triệu chứng của bệnh do Pantoea stewartii subsp stewartii gây ra trên mít bao

gồm hiện tượng thối rữa xơ và múi quả, làm giảm chất lượng và giá trị thương mại Sự thích nghi của vi khuẩn này trên cây mít, một vật chủ không phải mục tiêu ban đầu, là một minh chứng cho khả năng tiến hóa và mở rộng phạm vi ký chủ của vi sinh vật gây bệnh trong các hệ sinh thái mới (Claflin, 1999)

2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh học

Pantoea stewartii subsp stewartii là một loại vi khuẩn gram âm, hình que, không

sinh bào tử, và có khả năng di động nhờ các tiêm mao ngoại bào Khuẩn lạc của vi khuẩn này trên môi trường thạch dinh dưỡng thường có màu vàng đặc trưng, do sự sản xuất sắc

tố carotenoid, một đặc điểm sinh học nổi bật giúp bảo vệ chúng khỏi stress oxy hóa trong môi trường tự nhiên (Chalupowicz và ctv, 2010)

Vi khuẩn này là vi khuẩn kị khí tùy nghi, có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí lẫn yếm khí, và có khả năng lên men glucose Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của P stewartii subsp stewartii dao động từ 25°C đến 30°C, với sự phát triển bị ức chế ở nhiệt

độ cao hơn 40°C Chúng có khả năng tồn tại và phát triển tốt trong môi trường ẩm, đặc biệt ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nơi điều kiện nóng ẩm thuận lợi cho sự lây lan (Xu và ctv, 2010)

Về khả năng gây bệnh, vi khuẩn này sử dụng hệ thống tiết Type III (T3SS) để tiêm các protein độc tố vào tế bào chủ, làm gián đoạn các quá trình sinh lý của cây Đặc điểm này không chỉ giúp chúng xâm nhiễm mà còn lấn át hệ miễn dịch của vật chủ, gây ra các triệu chứng điển hình như thối rữa và làm suy giảm chất lượng cây trồng(Claflin,1999)

Hình 2.2 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Pantoea

stewartii subsp Stewartii (A) Chủng Pantoea stewartii subsp stewartii trên môi trường King's B;(B) Chủng Pantoea stewartii subsp stewartii trên môi trường NBY. (Nguồn:

Müller, P, 2016)

2.2.3 Cơ chế gây bệnh trên mít của vi khuẩn Pantoea stewartii subsp stewartii

Pantoea stewartii subsp stewartii gây bệnh trên cây mít thông qua một loạt cơ chế

xâm nhập và tấn công phức tạp Vi khuẩn này sử dụng các vết thương cơ học hoặc lỗ mở

tự nhiên trên quả mít, như vết nứt trên cuống trái hoặc các tổn thương do côn trùng gây

ra, để xâm nhập vào bên trong mô cây Sau khi xâm nhập, vi khuẩn lan rộng thông qua mạch dẫn và mô xơ của quả Chúng sản sinh enzyme và độc tố làm suy giảm cấu trúc tế bào, gây thối rữa phần xơ và làm cho múi và xơ quả dính chặt vào nhau, dẫn đến giảm chất lượng thương phẩm Đặc biệt, vi khuẩn này sử dụng hệ thống tiết Type III (T3SS) để tiêm các protein độc hại vào tế bào vật chủ, làm gián đoạn các quá trình sinh lý và hệ miễn dịch của cây T3SS là một trong những yếu tố quyết định khả năng gây bệnh, giúp

vi khuẩn lấn át cơ chế phòng vệ tự nhiên của cây mít và tạo điều kiện cho chúng sinh trưởng mạnh mẽ trong môi trường giàu độ ẩm và dinh dưỡng từ quả (Chalupowicz và ctv, 2010; Xu và ctv, 2010)

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian: 12 giờ 30 phút, chiều ngày 23 tháng 10 năm 2024

Địa điểm: phòng 306 Sinh học phân tử, nhà A1 Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và môi trường (RIBE), trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu và thiết bị

3.2.1 Vật liệu

Dịch tăng sinh vi khuẩn (Mẫu số 3)

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ

Bảng 3.1 Danh mục thiết bị và dụng cụ sử dụng

3.2.3 Hóa chất

Bảng 3.2 Danh mục hóa chất sử dụng

6 Lysis Buffer

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Ly trích DNA vi khuẩn Pantoea tewwartii và điện di tổng số DNA

3.3.1.1 Thực hiện quá trình ly trích DNA của vi khuẩn

Bước 1 Thu cặn khuẩn, hút 1 mL dịch tăng sinh khuẩn vào tube 1,5 mL Thực hiện

ly tâm 10.000 rpm/3 phút Loại bỏ dịch nổi và lặp lại 2 lần

Bước 2 Thêm vào tube 400μL dung dịch STE vào tube Đem hỗn hợp đi Vortex cho đến khi đều Sau đó, ly tâm 10000rpm/6 phút Lặp lại bước 2 lần nữa

Bước 3 Thêm 400 μL Lysis Buffer, vortex đều Ủ ở 65oC trong 1 giờ

Bước 4 Thêm 300 μL CI, sau đó đảo đều Ly tâm 13000 trong 10 phút

Bước 5 Hút 300 μL dịch nổi qua tube mới Sau đó, thêm 100 μL Chloroform (tỉ lệ

3 :1) Ly tâm 13000rpm/ 8 phút

Bước 6 Hút 200 μL dịch nổi qua tube mới Thêm 100 μL Isopropanol vào tube, đảo nhẹ cho đồng nhất mẫu Ủ lạnh 30 phút, ly tâm 13.000 vòng/13 phút Tiến hành đổ dịch nổi, thu cặn

Bước 7 Rửa tủa bằng 480 μL Ethanol 70% 2 lần, tráng quanh tube Ly tâm 13.000 vòng/ 10 phút Loại bỏ dịch nổi Để khô tự nhiên

Bước 8 Thêm 50 μL dịch đệm TE để bảo quản DNA, bảo quản trong -20oC Sau khi hoàn thành ly trích DNA vi khuẩn, tiến hành điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 1%, và điện di ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút

3.3.1.2 Điện di DNA

Bước 1 Chuẩn bị gel agarose 1%, cho 0,2 g Agarose vào 20 mL dung dịch TBE 0,5X đun hỗn hợp trên trong lò vi sóng cho tới khi agarose tan hoàn toàn

Bước 2 Làm nguội gel agarose sau khi đun đến khoảng 60ºC, sau đó đổ vào khuôn

đã được đặt lược vào trước, đợi đến khi gel đông hoàn toàn Lưu ý không đổ quá dày hoặc quá mỏng

Bước 3 Lấy lược ra, đưa gel vào bồn điện di

Bước 4 Trộn 3 µL DNA đã được ly trích và vortex với 1 µL GelRed và 0,5µL Loading dye Cho vào giếng toàn bộ hỗn hợp trên

Bước 5 Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 100 V trong 25 phút

Bước 6 Đọc kết quả dưới tia UV

3.3.2 Thiết kế phản ứng PCR 16S và điện di sản phẩm PCR 16S

3.3.2.1 Tiến hành khuếch đại đoạn gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi 16S Bước 1 Hút các thành phẩn phản ứng PCR như trong bảng 3.3.

Bảng 3.3 Thành phần và thể tích phản ứng PCR.