Điện di là một quá trình điện động học tách các hạt mang điện trong chất lỏng bằng cách sử dụng điện trường.. Các phân tử sinh học trong dung dịch ở độ pH nhất định sẽ tồn tại dưới dạng
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CNSH Ngành học : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Mơn học : THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CNSH Nhóm sinh viên thực : NHĨM Niên khóa : 2021 – 2025 Tháng 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI TRONG CNSH Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS.HUỲNH VĂN BIẾT LÊ BÙI THUỲ DƯƠNG_21126311 ThS.TRƯƠNG QUANG TOẢN PHẠM NGUYỄN THUÝ HIỀN_21126338 Tháng 10/2023 MỤC LỤC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI Error! Bookmark not defined Giới Thiệu Chung 1.1 Điện di ? 1.3 Các loại điện di 1.3.1 Điện di gel – Gel Electrophoresis 1.3.2 Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE) 1.3.3 Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis – CE) 1.3.4 Điện di miễn dịch (Immunoelectrophoresis) 1.3.5 Điện di lực (Affinity Electrophoresis) Phân Tích Kỹ Thuật Điện Di Trên Gel 2.1 Giới thiệu phương pháp điện di gel 2.2 Định nghĩa Gel 2.3 Vật liệu 2.4 Giới thiệu loại máy điện di 2.4.1 Máy điện di đứng 2.4.2 Máy điện di ngang 2.4.3 Máy chụp ảnh gel Kỹ Thuật Điện Di Phân Tích Mẫu DNA Tổng Số Và DNA Plasmid Vi Khuẩn 10 3.1 Quy Trình Thực Hiện Error! Bookmark not defined 3.2 Kết Quả Và Giải Thích 12 THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI Giới Thiệu Chung • Kỹ thuật điện di phương pháp phân tách DNA với kích thước khác nhau, sau phân tích , định tính định lượng DNA 1.1 Điện di ? Điện di trình điện động học tách hạt mang điện chất lỏng cách sử dụng điện trường Đây phương pháp để phân tích phân tử protein, DNA, RNA polysaccharide thông qua số cách thức điện di khác tùy thuộc vào loại kích thước phân tử 1.2 Nguyên lí điện di Điện di hoạt động dựa nguyên lý phân tử sinh học tồn dạng hạt mang điện, sở hữu nhóm chức ion hóa Các phân tử sinh học dung dịch độ pH định tồn dạng ion tích điện dương âm Khi chịu tác động điện trường, phần tử sinh học bị ion hóa di chuyển với tốc độ khác nhau, tùy thuộc vào khối lượng điện tích hạt dung dịch – hạt mang điện tích âm (anion), di chuyển phía điện cực dương, hạt mang điện tích dương (cation), bị kéo phía điện cực âm 1.3 Các loại điện di 1.3.1 Điện di gel – Gel Electrophoresis Điện di gel dạng điện di sử dụng gel, mạng lưới polyme liên kết ngang không chất lỏng, làm môi trường hỗ trợ để trì giá trị pH ổn định dung dịch đệm, hoạt động chất ổn định chống đối lưu Nó đóng vai trị chất phân tách, tính chất xốp có tác dụng lọc hạt lớn cản trở hạt nhỏ trình phân tách điện di 1.3.2 Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE) Điện di gel trường xung (PFGE) biến thể điện di gel, hai điện trường áp dụng định kỳ, xoay vòng, vào điện di gel góc độ khác Loại điện di thiết kế đặc biệt để tách nhiễm sắc thể, phân tử DNA có trọng lượng phân tử cao 20 kilobase 1.3.3 Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis – CE) Điện di mao quản, gọi Điện di mao quản hiệu suất cao (HPCE), loại điện di thực ống mao dẫn hẹp ngâm dung dịch đệm điện phân Đây loại điện di có khả thực bốn loại điện di Mao mạch thường dài 20-30 cm có đường kính 25-75 micromet 1.3.4 Điện di miễn dịch (Immunoelectrophoresis) Điện di miễn dịch loại điện di có kháng nguyên riêng biệt, bao gồm protein peptit, dựa phản ứng tính đặc hiệu chúng kháng thể, globulin miễn dịch (Ig) Sự gắn kết kháng nguyên với kháng thể tương ứng tỷ lệ kháng nguyên / kháng thể cụ thể, điểm tương đương, dẫn đến kết tủa phức hợp kháng nguyên-kháng thể Do đó, kháng nguyên mẫu quan tâm tách dựa khả liên kết chúng với kháng thể định 1.3.5 Điện di lực (Affinity Electrophoresis) Điện di lực loại điện di phân tách phân tử sinh học tương tác với liên kết với phân tử khác mà có lực Nó sử dụng tượng mà độ linh động điện (µ) thay đổi phân tử sinh học, bao gồm axit nucleic, protein, peptit polysaccharid, liên kết với phân tử khác, thay đổi độ linh động điện phản ánh dạng điện di Phân Tích Kỹ Thuật Điện Di Trên Gel 2.1 Giới thiệu phương pháp điện di gel - Tách phân tử sinh học (DNA, RNA, Protein) cách cho qua chất nề gel điện trường Người ta thường sử dụng loại gel agarose hay polyacrylamide - DNA hay RNA thường mang điện tích âm Trong điện di gel, mẫu cho vào giếng nằm gần cực âm DNA/RNA di chuyển phía cực dương Sự di chyển tỷ lệ nghịch với kích thước phân tử, phân tử nhỏ di chuyển nhanh - Sự di chuyển phần tử mang diện diện trường gọi Điện di (Electrophoresis) - Một phân tử có điện tích q điện trường E tạo lực F=q.E - Điện di gel phương pháp phân tích hữu dụng phép phân tích sinh-hố học - Tốc độ di chuyển protein điện trường: V= Ez/f V: Tốc độ di chuyển E: Lực điện trường z: Điện tích protein f: Hệ số ma sát, tùy vào khối lượng hình dạng protein độ nhớt môi trường 2.2 Định nghĩa Gel - Gel: trạng thái trung gian hai pha rắn lỏng - Các vật liệu dùng làm gel: Starch, Agarose, Acrylamide - Gel agarose (polymer polygalactose) sử dụng phổ biến, đặc biệt ứng dụng với đa phân tử acid nucleic, lipoprotein v.v 2.3 Vật liệu - Thiết bị điện di Agarose gồm: + Bộ cung cấp nguồn điện (power source) + Bồn điện di (gel box) + Khay gel (casting tray), lược gel (combs) - Agarose + Để DNA di chuyển dễ dàng Gel cần sử dụng Gel Agarose + Agarose thành phần Agar Agarose thu cách tinh Agar Chúng sử dụng để phân tách phân tử lớn khoảng 100bp ma trận gồm lỗ phân tử DNA có kích thước nhỏ di chuyển qua dễ dàng phân tử có kích thước lớn - Dung dịch đệm điện di (TAE TBE) + Để điện di, cần phải có dung dịch điện di TAE TBE • TAE gồm: o Tris: Ổn định độ pH = 8, dung dịch đệm tạo môi trường có pH=8 độ pH tối ưu cho DNA tồn o Acetate: Chất dẫn điện o EDTA: Hấp thụ ion kim loại, làm bất hoạt enzyme giúp bảo vệ DNA • TBE gồm: o Tris: Ổn định độ pH = 8, dung dịch đệm tạo mơi trường có pH=8 độ pH tối ưu cho DNA tồn o Borate: Chất dẫn điện o EDTA: Hấp thụ ion kim loại, làm bất hoạt enzyme giúp bảo vệ DNA Khi điện di, nên sử dụng TAE làm dung dịch đệm điện di Tuy dung dịch đệm điện di điện di thời gian ngắn, điện di lâu miếng gel chảy nóng TAE rẻ, độc tạo di chuyển điện trường nhanh cho DNA mạch thẳng độ phân giải tốt cho DNA siêu xoắn nên sử dụng phổ biến Cịn TBE, có khả đệm mạnh cho trình điện di với thời gian dài với hiệu điện cao hơn, làm mát mắc độc, gây vô sinh nên hạn chế sử dụng - Loading dye + Giúp cho DNA chìm xuống giếng khơng bị tràn ngồi + Trong Loading Dye gồm: • Glycerol 50%: Chất có tỉ trọng lớn nên trộn DNA với Loading Dye có chứa Glycerol làm tỉ trọng hỗn hợp tăng lên Khi đó, bơm DNA vào giếng bị chìm xuống • Bromophenol blue 0,25% (màu xanh): Là chất hoàn toàn độc lập với DNA chất tạo màu giúp: o Quan sát DNA bơm vào bị chìm xuống hay trào o Kiểm tra giếng bơm rồi, giếng chưa bơm o Bromophenol blue nhiễm điện tích âm nên đưa vào bật điện lên, di chuyển theo DNA từ cực âm sang cực dương => giúp kiểm sốt q trình điện di - Chất nhuộm GelRed + Đây chất nhuộm DNA phổ biến rẻ an tồn => giúp thấy DNA trình điện di bắt màu với DNA GelRed phát màu đỏ cam 2.4 Giới thiệu loại máy điện di 2.4.1 Máy điện di đứng - Bộ điện di đứng thiết kế cho kiểm tra mẫu gel tự đỗ gel sẵn Hệ thống điện di đứng hoàn chỉnh với bồn chứa thuốc thử – để đáp ứng nhiều ứng dụng kỹ thuật khác kích thước thơng lượng gel khác Mỗi hệ thống có niêm phong chống rị rỉ đảm bảo giúp đúc gel nhanh không gặp cố - Các hệ thống lý tưởng để chạy gel sẵn gel tự đỗ Hệ thống sử dụng nhiều loại gel đúc sẵn có sẵn thị trường từ tất nhà sản xuất lớn - Chức điện di đứng: + Tương thích với gel tự đỗ gel sẵn + Kẹp trượt đảm bảo thao tác nhanh khơng bị rị rỉ hoạt động + Sử dụng cho trình đỗ chạy gel giúp loại bỏ thời gian chuyển gel dễ vỡ + Thiết kế mô-đun để quay vịng liệu nhanh chóng, cho phép thực phương pháp PAGE, 2-D blotting vòng ngày làm việc - Ưu điểm: + Tương thích với tất loại gel sẵn + Đỗ nạp mẫu gel nhanh chóng + Thể tích đệm sử dụng + Thiết lập nhanh chóng chế độ làm mát 2.4.2 Máy điện di ngang - Được thiết kế dành cho thí nghiệm với số lượng nhỏ đến trung bình - Các hệ thống điện di máy điện di ngang cung cấp tảng dễ sử dụng linh hoạt cho tất yêu cầu điện di ngang với nhiều tùy chọn, hệ thống xử lý tất cách thí nghiệm điện di Bộ điện di ngang cung cấp kết hợp vượt trội gel thể tích đệm, với kích thước gel số lượng mẫu linh hoạt - Ưu điểm điện di ngang: + Lựa chọn cho khay gel theo nhiều kích thước + Thể tích dung dịch đệm tính kinh tế cao + Khả chạy nhiều mẫu khác + Nhỏ gọn thích hợp cho phịng thí nghiệm nhỏ 2.4.3 Máy chụp ảnh gel - Máy chụp ảnh gel hệ thống chụp ảnh gel độc lập, lựa chọn hoàn hảo cho hệ thống chụp ảnh gel siêu nhỏ gọn, đơn giản, đáp ứng hạn chế không gian giá Thiết bị kèm theo chuyển đổi tia cực tím máy ảnh - Tính máy chụp ảnh gel: + Máy ảnh kỹ thuật số đáp ứng đủ yêu cầu thơng số + Màn hình TFT hiển thị hình ảnh bao gồm agarose gel huỳnh quang, gel so màu, phim autoradiography màng lai, chụp rõ nét dễ dàng + Máy hút mùi nhỏ gọn nhẹ đèn tích hợp bên + Cơng tắc vi mơ tích hợp tắt chiếu tia cực tím bật đèn bên máy chụp gel + Có thể sử dụng mà khơng cần máy tính - Ứng dụng: + Chụp gel điện di DNA + Chụp gel điện di Protein + Chụp huỳnh quang + Phát đo màu Kỹ Thuật Điện Di Phân Tích Mẫu DNA Tổng Số Và DNA Plasmid Vi Khuẩn 3.1 Quy Trình Thực Hiện ❖ Bước 1: Chuẩn bị gel • Pha 50mL agarose 1% cần 0,5(g) agarose • Thêm lượng agarose thích hợp vào bình chứa • Cho dung dịch gel vào lị vi sóng đun sơi hạt agarose tan hoàn toàn Ngưng microwave sau 30 giây lắc làm agarose tan nhanh • Làm nguội agarose xuống khoảng 60oC trước đổ gel vào khay có mang lược gel 10 ❖ Bước 2: Chuẩn bị bồn điện di • Khi gel nguội đặc lại, khay gel đặt vào bồn điện di, ngập dung dịch đệm điện di Lược gel tháo tạo nên “giếng” rỗng dành mẫu điện di vào Mẫu bơm vào giếng micropipette ❖ Bước 3: Chuẩn bị mẫu • Mẫu DNA tinh ly trích từ xà lách khơng lẫn tạp chất khác • Mẫu DNA plasmid tinh ly trích từ huyền phù tế bào vi khuẩn không lẫn tạp chất khác • Lượng mẫu sử dụng phụ thuộc vào dạng lược sử dụng (độ dày chiều dài) độ dày gel • Khi lượng mẫu sử dụng để chạy gel xác định, thêm loading dye vào với nồng độ cuối 1X Chất nhuộm có tác dụng giữ mẫu đáy giếng điện di giúp theo dõi di chuyển mẫu trình điện di • Bơm mẫu vào giếng pipette Bước 4: Điện di 11 • Đậy nắp bồn điện di cẩn thận Không chạm vào mẫu Thường nắp bồn điện di lắp vào bồn theo hướng dựa vào vị trí đánh dấu điện cực • Nguồn điện cung cấp thay đổi tùy theo độ dày, chiều dài nồng độ gel, dạng dung dịch đệm điện di sử dụng Hiệu điện từ 20 – 110 V sử dụng cho hầu hết mục đích 3.2 Kết Quả Và Giải Thích ➢ Số DNA tổng số, ta thấy vạch sáng rõ chứng tỏ trình làm hạn chế việc đứt gãy DNA ➢ Số DNA plasmid, ta thấy vạch mờ chứng tỏ mẫu làm Ecoli dung dịch 12