Báo cáo thiết bị và kỹ thuật cnsh nhóm 8

Điện di là một quá trình điện động học tách các hạt mang điện trong chất lỏng bằng cách sử dụng điện trường.. Các phân tử sinh học trong dung dịch ở độ pH nhất định sẽ tồn tại dưới dạng

Tháng 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO

THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CNSH

Nhóm sinh viên thực hiện : NHÓM 8

Tháng 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO

THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI TRONG CNSH

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS.HUỲNH VĂN BIẾT

ThS.TRƯƠNG QUANG TOẢN

LÊ BÙI THUỲ DƯƠNG_21126311 PHẠM NGUYỄN THUÝ HIỀN_21126338

MỤC LỤC

THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI Error! Bookmark not defined.

1 Giới Thiệu Chung 4

1.1 Điện di là gì ? 4

1.3 Các loại điện di 4

1.3.1 Điện di trên gel – Gel Electrophoresis 4

1.3.2 Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE) 4

1.3.3 Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis – CE) 4

1.3.4 Điện di miễn dịch (Immunoelectrophoresis) 5

1.3.5 Điện di ái lực (Affinity Electrophoresis) 5

2 Phân Tích Kỹ Thuật Điện Di Trên Gel 5

2.1 Giới thiệu phương pháp điện di trên gel 5

2.2 Định nghĩa Gel 6

2.3 Vật liệu 6

2.4 Giới thiệu các loại máy điện di 7

2.4.1 Máy điện di đứng 7

2.4.2 Máy điện di ngang 8

2.4.3 Máy chụp ảnh gel 9

3 Kỹ Thuật Điện Di Phân Tích Mẫu DNA Tổng Số Và DNA Plasmid Vi Khuẩn 10

3.1 Quy Trình Thực Hiện Error! Bookmark not defined 3.2 Kết Quả Và Giải Thích 12

THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI

• Kỹ thuật điện di là phương pháp phân tách DNA với kích thước khác nhau, sau đó phân tích , định tính và định lượng DNA

1.1 Điện di là gì ?

Điện di là một quá trình điện động học tách các hạt mang điện trong chất lỏng bằng cách sử dụng điện trường Đây là phương pháp để phân tích các phân tử protein, DNA, RNA hoặc polysaccharide thông qua một số cách thức điện di khác nhau tùy thuộc vào loại và kích thước của phân tử

1.2 Nguyên lí điện di

Điện di hoạt động dựa trên nguyên lý các phân tử sinh học tồn tại dưới dạng các hạt mang điện, sở hữu các nhóm chức có thể ion hóa Các phân tử sinh học trong dung dịch ở

độ pH nhất định sẽ tồn tại dưới dạng các ion tích điện dương hoặc âm

Khi chịu tác động của điện trường, các phần tử sinh học bị ion hóa sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, tùy thuộc vào khối lượng và điện tích của mỗi hạt trong dung dịch – hạt mang điện tích âm (anion), sẽ di chuyển về phía điện cực dương, và các hạt mang điện tích dương (cation), sẽ bị kéo về phía điện cực âm

1.3 Các loại điện di

1.3.1 Điện di trên gel – Gel Electrophoresis

Điện di trên gel là một dạng điện di sử dụng gel, một mạng lưới polyme liên kết ngang không chất lỏng, làm môi trường hỗ trợ để duy trì giá trị pH ổn định trong dung dịch đệm, hoạt động như một chất ổn định chống đối lưu Nó cũng đóng vai trò như một chất nền phân tách, do tính chất xốp của nó có tác dụng lọc các hạt lớn và cản trở các hạt nhỏ hơn trong quá trình phân tách điện di

1.3.2 Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE)

Điện di gel trường xung (PFGE) là một biến thể của điện di trên gel, trong đó hai điện trường được áp dụng định kỳ, xoay vòng, vào điện di gel ở các góc độ khác nhau Loại điện di này được thiết kế đặc biệt để tách nhiễm sắc thể, là các phân tử DNA có trọng lượng phân tử cao trên 20 kilobase

1.3.3 Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis – CE)

Điện di mao quản, còn được gọi là Điện di mao quản hiệu suất cao (HPCE), là một loại điện di được thực hiện trong một ống mao dẫn hẹp được ngâm trong dung dịch đệm điện phân Đây là loại điện di duy nhất có khả năng thực hiện cả bốn loại điện di Mao mạch thường dài 20-30 cm và có đường kính trong 25-75 micromet

1.3.4 Điện di miễn dịch (Immunoelectrophoresis)

Điện di miễn dịch là một loại điện di có các kháng nguyên riêng biệt, bao gồm protein

và peptit, dựa trên phản ứng và tính đặc hiệu của chúng đối với kháng thể, hoặc globulin miễn dịch (Ig) Sự gắn kết của kháng nguyên với kháng thể tương ứng của nó ở một tỷ lệ kháng nguyên / kháng thể cụ thể, hoặc điểm tương đương, sẽ dẫn đến sự kết tủa của phức hợp kháng nguyên-kháng thể Do đó, các kháng nguyên trong một mẫu quan tâm có thể được tách ra dựa trên khả năng liên kết của chúng với một kháng thể nhất định

1.3.5 Điện di ái lực (Affinity Electrophoresis)

Điện di ái lực là một loại điện di phân tách một phân tử sinh học tương tác với hoặc liên kết với một phân tử khác mà nó có ái lực Nó sử dụng hiện tượng mà độ linh động điện (µ) thay đổi khi một phân tử sinh học, bao gồm axit nucleic, protein, peptit và polysaccharid, liên kết với một phân tử khác, và sự thay đổi về độ linh động điện này sẽ được phản ánh trong dạng điện di

2.1 Giới thiệu phương pháp điện di trên gel

- Tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, Protein) bằng cách cho đi qua chất nề là gel trong một điện trường Người ta thường sử dụng các loại gel agarose hay polyacrylamide

- DNA hay RNA thường mang điện tích âm Trong điện di trên gel, mẫu được cho vào những giếng nằm gần cực âm và DNA/RNA sẽ di chuyển về phía cực dương Sự di chyển

tỷ lệ nghịch với kích thước phân tử, phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh

- Sự di chuyển của các phần tử mang diện trong diện trường được gọi là Điện di (Electrophoresis)

- Một phân tử có điện tích q trong một điện trường E tạo ra một lực

F=q.E

- Điện di trên gel đã là phương pháp phân tích hữu dụng trong các phép phân tích sinh-hoá học

- Tốc độ di chuyển của protein trong điện trường:

V= Ez/f

V: Tốc độ di chuyển

E: Lực điện trường

z: Điện tích của protein

f: Hệ số ma sát, tùy vào khối lượng và hình dạng protein và độ nhớt của môi trường

2.2 Định nghĩa Gel

- Gel: trạng thái trung gian giữa hai pha rắn và lỏng

- Các vật liệu dùng làm gel: Starch, Agarose, Acrylamide

- Gel agarose (polymer polygalactose) được sử dụng khá phổ biến, đặc biệt là trong ứng dụng với những đa phân tử như acid nucleic, lipoprotein v.v

2.3 Vật liệu

- Thiết bị điện di Agarose gồm:

+ Bộ cung cấp nguồn điện (power source)

+ Bồn điện di (gel box)

+ Khay gel (casting tray), lược gel (combs)

- Agarose

+ Để DNA di chuyển dễ dàng trên Gel cần sử dụng Gel Agarose

+ Agarose là một thành phần trong Agar và Agarose thu được bằng cách tinh sạch Agar Chúng được sử dụng để phân tách các phân tử lớn hơn khoảng 100bp và là một ma trận gồm các lỗ và các phân tử DNA có kích thước nhỏ sẽ di chuyển qua dễ dàng hơn các phân tử có kích thước lớn hơn

- Dung dịch đệm điện di (TAE hoặc TBE)

+ Để có thể điện di, cần phải có dung dịch điện di TAE hoặc TBE

• TAE gồm:

o Tris: Ổn định độ pH = 8, dung dịch đệm tạo môi trường có pH=8 là độ pH tối

ưu cho DNA tồn tại

o Acetate: Chất dẫn điện

o EDTA: Hấp thụ ion kim loại, làm bất hoạt enzyme giúp bảo vệ DNA

• TBE gồm:

o Tris: Ổn định độ pH = 8, dung dịch đệm tạo môi trường có pH=8 là độ pH tối

ưu cho DNA tồn tại

o Borate: Chất dẫn điện

o EDTA: Hấp thụ ion kim loại, làm bất hoạt enzyme giúp bảo vệ DNA

Khi điện di, nên sử dụng TAE làm dung dịch đệm điện di Tuy dung dịch đệm điện di kém và điện di trong thời gian ngắn, nếu điện di lâu thì miếng gel sẽ chảy ra vì nóng nhưng TAE rẻ, ít độc hơn và tạo sự di chuyển trong điện trường nhanh hơn cho DNA mạch thẳng

và độ phân giải tốt hơn cho DNA siêu xoắn nên được sử dụng phổ biến Còn TBE, tuy có khả năng đệm mạnh hơn cho quá trình điện di với thời gian dài hoặc với hiệu điện thế cao hơn, làm mát hơn nhưng nó mắc và độc, có thể gây vô sinh nên hạn chế sử dụng

- Loading dye

+ Giúp cho DNA chìm xuống dưới giếng và không bị tràn ra ngoài

+ Trong Loading Dye gồm:

• Glycerol 50%: Chất có tỉ trọng rất lớn nên khi trộn DNA với Loading Dye có chứa Glycerol làm tỉ trọng hỗn hợp đó tăng lên Khi đó, bơm DNA vào giếng sẽ bị chìm xuống

• Bromophenol blue 0,25% (màu xanh): Là chất hoàn toàn độc lập với DNA và là chất tạo màu giúp:

o Kiểm tra giếng nào đã bơm rồi, giếng nào chưa bơm

o Bromophenol blue nhiễm điện tích âm nên khi đưa vào và bật điện lên, nó sẽ

di chuyển theo DNA từ cực âm sang cực dương => giúp kiểm soát quá trình điện di

- Chất nhuộm GelRed

+ Đây là chất nhuộm DNA phổ biến vì nó rẻ và an toàn => giúp thấy được DNA trong quá trình điện di và khi bắt màu với DNA thì GelRed sẽ phát ra màu đỏ cam

2.4 Giới thiệu các loại máy điện di

2.4.1 Máy điện di đứng

- Bộ điện di đứng được thiết kế cho kiểm tra các mẫu gel tự đỗ và gel sẵn Hệ thống điện di đứng hoàn chỉnh với bồn chứa và thuốc thử – để đáp ứng nhiều ứng dụng và kỹ thuật khác

nhau ở các kích thước và thông lượng gel khác nhau Mỗi hệ thống đều có niêm phong chống rò rỉ đảm bảo giúp đúc gel nhanh và không gặp sự cố

- Các hệ thống này lý tưởng để chạy gel sẵn hoặc gel tự đỗ Hệ thống có thể sử dụng nhiều loại gel đúc sẵn có sẵn trên thị trường từ tất cả các nhà sản xuất lớn

- Chức năng chính của bộ điện di đứng:

+ Tương thích với cả gel tự đỗ và gel sẵn

+ Kẹp trượt đảm bảo thao tác nhanh và không bị rò rỉ trong khi hoạt động

+ Sử dụng cho quá trình đỗ và chạy gel giúp loại bỏ thời gian chuyển các gel dễ vỡ

+ Thiết kế mô-đun để quay vòng dữ liệu nhanh chóng, cho phép thực hiện phương pháp PAGE, 2-D và blotting trong vòng một ngày làm việc

- Ưu điểm:

+ Tương thích với tất cả các loại gel sẵn

+ Đỗ và nạp mẫu gel nhanh chóng

+ Thể tích đệm sử dụng ít

+ Thiết lập nhanh chóng chế độ làm mát

2.4.2 Máy điện di ngang

- Được thiết kế dành cho thí nghiệm với số lượng nhỏ đến trung bình

- Các hệ thống điện di của máy điện di ngang cung cấp một nền tảng dễ sử dụng và linh hoạt cho tất cả các yêu cầu điện di ngang với nhiều tùy chọn, các hệ thống này có thể xử lý

tất cả các cách thí nghiệm điện di Bộ điện di ngang cung cấp sự kết hợp vượt trội giữa gel

và thể tích đệm, với kích thước gel và số lượng mẫu linh hoạt

- Ưu điểm của bộ điện di ngang:

+ Lựa chọn cho các khay gel theo nhiều kích thước

+ Thể tích dung dịch đệm ít và tính kinh tế cao

+ Khả năng chạy được nhiều mẫu khác nhau

+ Nhỏ gọn thích hợp cho phòng thí nghiệm nhỏ

2.4.3 Máy chụp ảnh gel

- Máy chụp ảnh gel là hệ thống chụp ảnh gel độc lập, là sự lựa chọn hoàn hảo cho một hệ thống chụp ảnh gel siêu nhỏ gọn, đơn giản, đáp ứng các hạn chế về cả không gian và giá cả Thiết bị đi kèm theo bộ chuyển đổi tia cực tím và máy ảnh

- Tính năng của máy chụp ảnh gel:

+ Máy ảnh kỹ thuật số đáp ứng đủ mọi yêu cầu về các thông số

+ Màn hình TFT hiển thị hình ảnh bao gồm cả agarose gel và huỳnh quang, gel so màu, phim autoradiography và màng lai, được chụp rõ nét và dễ dàng

+ Máy hút mùi nhỏ gọn nhẹ và đèn tích hợp bên trong

+ Công tắc vi mô tích hợp tắt bộ chiếu tia cực tím và bật đèn bên trong máy chụp gel + Có thể sử dụng mà không cần máy tính

- Ứng dụng:

+ Chụp gel điện di DNA

+ Chụp gel điện di Protein

+ Chụp huỳnh quang

+ Phát hiện đo màu

3 Kỹ Thuật Điện Di Phân Tích Mẫu DNA Tổng Số Và DNA Plasmid Vi Khuẩn

3.1 Quy Trình Thực Hiện

❖ Bước 1: Chuẩn bị gel

• Pha 50mL agarose 1% cần 0,5(g) agarose

• Thêm lượng agarose thích hợp vào bình chứa

• Cho dung dịch gel vào lò vi sóng và đun sôi cho đến

khi các hạt agarose tan hoàn toàn Ngưng microwave

sau 30 giây và lắc đều sẽ làm agarose tan nhanh hơn

• Làm nguội agarose xuống khoảng 60oC trước khi đổ

gel vào khay có mang lược gel

❖ Bước 2: Chuẩn bị bồn điện di

• Khi gel nguội và đặc lại, khay gel được đặt vào bồn

điện di, ngập trong dung dịch đệm điện di Lược gel

được tháo ra tạo nên các “giếng” rỗng dành để cho

mẫu điện di vào Mẫu được bơm vào giếng bằng

micropipette

❖ Bước 3: Chuẩn bị mẫu

• Mẫu DNA tinh sạch được ly trích từ cây xà lách không

lẫn các tạp chất khác

• Mẫu DNA plasmid tinh sạch được ly trích từ huyền

phù tế bào vi khuẩn không lẫn các tạp chất khác

• Lượng mẫu sử dụng phụ thuộc vào dạng lược sử dụng (độ dày và chiều dài) và độ dày của gel

• Khi lượng mẫu sử dụng để chạy gel được xác định,

thêm loading dye vào với nồng độ cuối là 1X Chất

nhuộm này có tác dụng giữ mẫu ở đáy giếng điện di và

giúp theo dõi sự di chuyển của mẫu trong quá trình điện

di

• Bơm mẫu vào giếng bằng pipette

Bước 4: Điện di

• Đậy nắp bồn điện di cẩn thận Không chạm vào mẫu Thường các nắp bồn điện di chỉ

có thể lắp vào bồn theo 1 hướng dựa vào vị trí đánh dấu các điện cực

• Nguồn điện cung cấp thay đổi tùy theo độ dày, chiều dài

và nồng độ của gel, dạng dung dịch đệm điện di sử dụng

Hiệu điện thế từ 20 – 110 V được sử dụng cho hầu hết

các mục đích

3.2 Kết Quả Và Giải Thích

➢ Số 1 là DNA tổng số, ta thấy được một vạch sáng rõ chứng tỏ quá trình làm đã hạn chế được việc đứt gãy DNA

➢ Số 2 là DNA plasmid, ta thấy vạch mờ chứng tỏ mẫu làm vẫn còn Ecoli trong dung

dịch